vektor-vektor kloning untuk e. coli

8/10/2019 Vektor-vektor Kloning Untuk E. Coli

1/11

Vektor-vektor Untuk Escheria coli1

Vektor-vektor Kloning Untuk Escheria coli

AMIRAH AMATULLAH

1206262071, Teknologi Bioproses,Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Indonesia

ABSTRAK

Dalam melakukan kloning terhadap suatu sel organisme dibutuhkan vektor. Vektor adalahmolekul DNA yang berfungsi sebagai wahana atau kendaraan yang akan membawa suatufragmen DNA masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya replikasi danekspresi DNA asing tersebut. Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot sepertiE. coli(selain plasmid) adalah bakteriofage dan kosmid.

Kata Kunci

vektor, kloning, BAC, bakteriofage, kosmid, sisipan, restriksi, lisogenik, genom

1. PENDAHULUANSejauh ini, penggunaan plasmid kecilsebagai vektor kloning untuk E. coli telahdipertimbangkan. Namun, plasmid kecilbukanlah satu-satunya molekul yang dapatbereplikasi dalam sel bakteri. Contohnya, E.colifaktor F (fertilitas) adalah plasmid besaryang dapat bereplikasi secara independenterhadap kromosom bakteri, seperti plasmidlain. F faktor digunakan sebagai dasarvektor bakteri kromosom buatan (BAC),

untuk kloning potongan yang sangat besardari DNA. Virus bakteriofage juga dapatbereplikasi dalam sel bakteri, dan beberapadari mereka telah dikembangkan untukdigunakan sebagai vektor kloning. Ini

termasuk fage M13, lamda, Miu dan P1.Vektor M13 memiliki banyak kesamaandengan vektor pUC. Vektor-vektor tersebutdapat digunakan untuk menghasilkan DNAuntai tunggal dan mereka sangat bergunadalam penentuan urutan DNA, meskipunsekarang mereka kurang banyak digunakanuntuk ini. Vektor lamda digunakan untuktujuan kloning yang lebih umum. Fage Miusering dimanfaatkan karena kemampuannyauntuk bertindak sebagai elemen genetikyang dapat ditranspose, dan fage P1 sangat

berguna untuk memproduksi fage kromosombuatan (PAC). Seperti BAC, fage ini dapatdimanfaatkan untuk kloning potongan yangsangat besar dari DNA. Ada juga pilihan

Tabel 1. Jenis-jenis vektor beserta jumlah DNA yang dapat disisipkan vektor

(Sumber:http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdf)
http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdfhttp://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdfhttp://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdfhttp://digilib.itb.ac.id/files/disk1/628/jbptitbpp-gdl-tinadewiro-31390-3-2008ts-2.pdf


2/11


vektor yang merupakan hibrida antaraplasmid dan fage.

2. VEKTOR BAC

Vektor BAC (Bacterial ArtificalChromosome) didasarkan pada faktor F(fertilitas) yang diidentifikasi pada E. colisebagai katalisator pertukaran genetik antarsel. Faktor F adalah plasmid yang dapatmengarahkan transfernya sendiri ke dalamsel yang belum mengandung plasmid. Selyang mengandung plasmid F kadang-

kadang disebut sebagai sel jantan. Transferini dimediasi oleh filamen protein pilus seks.Selain merupakan molekul yang terpisah,faktor F dapat berintegrasi ke dalamkromosom inang untuk membentuk strainHfr (rekombinasi frekuensi tinggi). Eksisimenyimpang dari kromosom inang in-vivodapat menghasilkan bentuk plasmid F yangmengandung potongan tambahan DNAkromosom. Ini disebut plasmid F '. Karenaplasmid F mampu menampung urutan DNAtambahan, yang bisa sangat besar, ia jugadapat digunakan sebagai dasar vektorkloning yang dapat menyebarkan sisipan

Gambar 1. Prosedur penggunaan vektor BAC(Sumber:http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/)
http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/http://www.scq.ubc.ca/the-big-bad-bac-bacterial-artificial-chromosomes/


3/11


DNA besar. Plasmid F biasanya tersediadalam jumlah salinan yang rendah, biasanyasatu atau dua molekul per sel. Jumlahsalinan yang rendah meningkatkan stabilitasdari molekul, karena ada salinan lebihsedikit untuk bertindak sebagai substratpotensial untuk penghapusan rekombinasi-dimediasi. Hal ini bermanfaat ketika vektorBAC digunakan untuk mengkloningpotongan yang sangat besar dari DNA,ketika ketidakstabilan dapat menjadimasalah.

Kerugiannya adalah yield DNA dariekstraksi sel rendah tetapi stabilitas yangmeningkat ketika kloning potongan besarDNA biasanya menutupi hal ini. Vektor BAC

dapat dengan mudah digunakan untukmenerima sisipan dari 100-300 kbp. Contohdari vektor BAC ditunjukkan pada Gambar4.1. Urutan repE dan oriSdiperlukan untukreplikasi, dan urutan parA--C mengaturjumlah salinan. Ada penanda yang dipilih,untuk ketahanan terhadap kloramfenikol(camR), dan urutan lacZ' mempunyai situskloning dan memungkinkan identifikasikeberadaan sisipan. rekombinan vektor BACdapat dengan mudah dimasukkan ke E. colidengan elektroporasi.

3. VEKTOR BAKTERIOFAGE M133.1 Biologi Umum

Bakteriofage M13 sangat bergunakarena siklus hidupnya yang agak tidakbiasa, yang memberi kita cara untukmendapatkan DNA beruntai tunggal daridsDNA. Fage ini termasuk dalamkelompok yang disebut fage 'kurus' ataumenyerupai filamen, dikarekan olehukurannya. Salah satu contoh tipikal fage

yang menyerupai filamen, fd, memilikidimensi 850nm x 6nm x 6nm. Partikelyang menginfeksi mengandung DNAberuntai tunggal yang terkandung dalammantel protein terdiri dari sebuah subunitdari spesies protein tunggal yangmerupakan produk dari gen VIII fage.

Ada juga beberapa molekul produkgen III fage. Fage dapat masuk ke dalamsel bakteri dengan menempe ke pilusseks sebelum mengirimkan DNA-nya kedalam sel. Oleh karena itu, fage ini hanya

akan menginfeksi sel jantan (yang

membawa F atau faktor F ', atau Hfrstrain). Begitu berada di dalam sel,molekul beruntai-tunggal (disebut sebagaiuntai plus, ) diubah menjadi molekuluntai ganda yang disebut bentuk replikatif(RF). Hal ini dilakukan dengan cara yangmirip dengan proses replikasi normal E.coli, menggunakan originspesifik sintesisDNA pada molekul untai tunggal untuksintesis untai minus komplementer. Untaiminus kemudian dapat ditranskripsi untukmenghasilkan protein virus. DNA RF jugadapat direplikasi dengan model replikasilingkaran bergulir.

Pada replikasi lingkaran bergulir,produk gen II akan berikatan dengansitus tertentu pada genom beruntai ganda

dan menciptakan torehan pada untai,sehingga terdapat sebuah gugus 3'-hidroksil yang bebas. Untai inidiperpanjang oleh DNA polimerase,menggusur untai asli. Setelah saturonde sintesis, untai yang telahdipindahkan dapat dipisahkan dari untaiyang baru disintesis pada torehan lainoleh protein gen II. Ini menghasilkanuntai terpisah, dan ditutup oleh proteingen II untuk menghasilkan molekulmelingkar. Untai ini dapat lagi dikonversi

ke RF, yang dapat menumpuk sampai100 atau lebih eksemplar per sel. SelagiRF terakumulasi, begitu pula protein fagelain, produk dari gen V. Hal inimenghentikan tidak hanya sintesisprotein gen II (mengurangi sintesis untaitunggal), tetapi juga konversi untai menjadi RF. Untaian tunggalterenkapsidasi dalam protein mantel danmeninggalkan sel. Tidak sepertikebanyakan fage, virion dapatdisekresikan dari sel tanpa menyebabkan

lisis.Sebuah fungsi yang berguna adalah

bahwa tidak ada kendala pada ukuranmolekul DNA yang dapat dikemasdengan protein mantel. Jika biasanyamolekul DNA harus dikemas lebih lama,maka lebih banyak protein mantel yangmenempel. Ini berbeda dengan fagelamda, misalnya, yang memiliki kendalayang jelas pada jumlah DNA fage yangdapat dikemas ke dalam setiap partikelfage. Yang paling penting, bakteriofageM13 menawarkan kita cara menghasilkan


4/11


DNA rekombinan untai tunggal.Endonuklease restriksi akan bekerjahanya pada molekul beruntai ganda, danplasmid yang ditemui sejauh ini jugaberuntai gada; cara terbaik untukmendapatkan kloning DNA untai tunggaladalab mencairkan dua helai terpisah danmenggunakan mereka sebelum merekamenyatu kembali.

Namun, jika molekul beruntai gandadapat dibuat menggunakan M13 RFsebagai vektor dan digunakan pada E.coli melalui transformasi, maka merekaakan berperilaku di sana seperti DNA RFnormal dan menghasilkan salinan untaitunggal dari molekul yang sama, yangakan dikemas dan dilepaskan dari sel.

Jadi M13 menawarkan cara mengubahdsDNA menjadi DNA untai tunggal. Halini biasanya jauh lebih mudah dan lebihdapat diandalkan untuk menggunakanM13 daripada untuk mempersiapkanDNA untai tunggal dari plasmid untaiganda dengan denaturasi mereka.

3.2 Desain Vektor M13

Prinsip-prinsip yang sama yang kitalihat dalam Bab 3 diterapkan pada desain

vektor plasmid juga berlaku untuk desainvektor M13. Kita membutuhkan originreplikasi. Fage memiliki originnya sendiri,sehingga tidak menimbulkan kesulitan.Tidak ada masalah juga selama penandadipilih, sebagai fage adalah penandayang telah dipilih sendiri. Sel yangmengambil DNA fage akan menghasilkanlebih banyak fage dan menjadi fokusuntuk infeksi sel-sel lain. Penadahan seldari transformasi akan, oleh karena itu,menghasilkan rumput (lapisan seragam

sel) yang bertabur lubang (plak) yangtimbul dari sel yang terinfeksi yang telahmengambil molekul DNA fage danmenghasilkan lebih banyak fage, yangtelah menginfeksi sel-sel di sekitarnya.Meskipun M13 tidak benar-benar melisissel yang terinfeksi, itu menghambatpertumbuhan mereka; sehingga plakyang terlihat bukan merupakan plak yangsebenarnya (yang timbul dari lisis sel),tetapi daerah pertumbuhan yang lambat.Waktu pembelahan sel dari terinfeksi E.

coli meningkat dari 20 menit dalam

kondisi optimum untuk lebih dari 2 jamsetelah infeksi M13. Karena plak hasildari pertumbuhan yang lambat daripadalisis asli, mereka kadang-kadang dikenalsebagai pseudoplak. Kemampuan fagemenginfeksi sel, menghasilkan lebihbanyak fage dan, akibatnya,menghasilkan plak tergantung padamasuknya DNA tanpa mempengaruhigen fage yang diperlukan untuk replikasi.genom M13 dikemas cukup erat. Olehkarena itu, ada lebih sedikit tempat yangtersedia untuk memasukkan DNA. Salahsatu yang tersedia, situs dalam spacerintergenik antara gen II dan IV. MinigenlacZ' dan beberapa daerah kloning telahdimasukkan di sini. Modifikasi ini

membawa serta semua keuntungan daribeberapa situs kloning (sepertikemampuan untuk menerima berbagaifragmen restriksi dan memaksa kloningdalam orientasi tertentu) sertakeuntungan tambahan dari skriningwarna langsung untuk keberadaansisipan yang dilakukan oleh sistemkloning lacZ.

Agar sistem lacZ untuk bekerja, sisagen beta-galaktosidase harus hadirdalam inang. Setelah transformasi, sel-

sel inang dicampur dengan X-gal danIPTG sebelum plating dan inkubasi untukmembentuk rumput. Sel yang telahmengambil DNA fage akan menimbulkanplak, dan jika urutan coding lacZ' dalamfage tersebut utuh, maka plak akanmemiliki warna biru dibedakan daribackground putih gading. Gambar 4.4menunjukkan organisasi dari beberapafage M13 yang digunakan untuk kloning.Sama seperti dengan plasmid pUC, adaserangkaian fage, yang ditunjuk sebagai

'mp'. Wilayah kloning M13mp18 identikdengan yang di pUC18, dan sebagainya.Persyaratan untuk inang M13 adalahsama dengan yang digunakan untukplasmid pUC (memang strain yang samabiasanya digunakan). Daerah lain untukpenggabungan DNA, misal antara genVIII dan III, juga telah dimanfaatkan,tetapi vektor ini kurang banyakdigunakan. Persyaratan lain untuk vektorjuga puas dengan M13; 7,3 kb, vektorcukup kecil untuk ditangani denganmudah, dan RF memiliki sejumlah salinan


5/11


yang tinggi di dalam sel. Bilamenggunakan M13 untuk membuat DNAuntai tunggal, jumlah salinan intraselulerkurang penting dibandingkan denganvektor plasmid, seperti kita biasanyatertarik pada DNA untai tunggal dalamfage yang dikeluarkan dari sel yangterinfeksi. Sedangkan DNA plasmidintraseluler dikumpulkan oleh lisis sel(dan ini adalah pendekatan yang diambiluntuk mempersiapkan RF DNA untuktujuan kloning), DNA beruntai tunggalharus dikumpulkan agak berbeda.Sebuah kultur yang telah terinfeksi sudahdiatur dan setelah beberapa saat sel-selyang dihapus oleh sentrifugasi,meninggalkan fage di supernatan. Fage

tersebut kemudian diendapkan, misalnyadengan penambahan polietilen glikol dansodium klorida (meskipun metode lainjuga mungkin), diikuti dengansentrifugasi.Pelet fage disuspensikan danprotein dihilangkan dengan fenol,meninggalkan DNA beruntai tunggaldalam larutan. Kemudian dikumpulkankembali dengan presipitasi. Pada kondisistandar, beberapa mikrogram DNAberuntai tunggal dapat diperoleh daribeberapa mL kultur sel yang terinfeksi.

3.3 Penggunaan Bakteriofage M13

Pengurutan DNA. Untuk waktu yanglama aplikasi yang paling penting darikloning M13 adalah dalam penentuanurutan DNA dengan metode Sanger,disebut juga metode deoksi atauterminasi rantai. Hal ini bergantung padasintesis DNA dengan adanya inhibitorpemutus rantai, 2', 3' - dideoksinukleosidatrifosfat (ddNTP). Metode ini sekarang

menjadi alat yang sangat standar dalambiologi molekuler dan tidak akan dibahassecara rinci di sini. Seperti yangdikembangkan pada awalnya, metode inimengandalkan DNA untai tunggalsebagai template; Oleh karena itu,bakteriofage M13 secara rutin digunakanuntuk waktu yang lama sebagai vektoruntuk memberikan seperti DNA untaitunggal untuk pekerjaan sequencing.Namun, dengan perbaikan teknologi,urutan materi beruntai ganda sekarang

rutin, menghindari kebutuhan untuk

langkah tambahan kloning ke dalamvektor M13.

Vektor tampilan. Penggunaanpenting dari fag berserabut dalam sistemlayar fag. Di sini, coding urutandimasukkan ke salah satu gen proteinmantel, sering gen III. Hasilnya adalahbahwa fag dihasilkan dengan bentukhybrid dari protein ini, yang merupakanperpaduan dari urutan protein normal danproduk protein dari urutan dimasukkan(dengan asumsi urutan dimasukkanmemiliki kerangka baca sama dengangen III). Fag yang disekresikan dari sel,dengan bahan ini ekstra 'ditampilkan' diluar. Fusions dengan VIII gen juga bisadirekayasa, sehingga tampilan lebih

banyak salinan peptida ekstra daripadadengan gen III, sebagai mantan hadir dilebih eksemplar per fag partikel. Vektordisplay ini memiliki banyak kegunaan,misalnya dalam skrining perpustakaandengan panning dan untuk produksivaksin.

Aplikasi lain. Beberapa protokoluntuk situs-diarahkan mutagenesis jugamenggunakan untai tunggal DNA, yangdapat diperoleh dengan vektorberdasarkan fag berserabut. DNA untai

tunggal juga penggunaan tertentu dalammenghasilkan probe untuk analisis RNA.Probe dapat dibuat yang khusus untuktranskrip RNA dari salah untai DNA.Aplikasi yang terakhir berada di luarcakupan buku ini, tetapi informasi lebihlanjut dapat diperoleh dari manuallaboratorium khusus.

3.4 Turunan M13

Persyaratan untuk molekul dapat

direplikasi sebagai DNA beruntai tunggaldan dikemas ke dalam mantel fagsederhana. Semua yang diperlukanadalah untuk molekul mengandung asalsintesis DNA virus, asalkan fungsi lainnyadapat disediakan oleh molekul DNA laindalam sel, bertindak di trans. Fakta inimemungkinkan pembangunan vektorhibrida M13_plasmid, kadang-kadangdisebut phagemid, phasmid atau plage(meskipun phasmid Istilah ini seringdigunakan untuk derivatif fag lambda).

Plasmid yang membawa M13 replikasi


6/11


asal selain asal konvensional dsDNAsintesis dapat direplikasi baik sebagaidsDNA dari yang terakhir atau sebagaiDNA untai tunggal dari asal M13.Replikasi dari asal M13 membutuhkanprotein yang sesuai (seperti gen proteinII) yang akan diberikan dari fag pembantujuga mereplikasi dalam sel. Replikasimenghasilkan DNA untai tunggal yangkemudian dapat dikemas ke dalammantel fag. Contoh phagemids adalahvektor pUC118, 119 dan 120 Merekadireplikasi sebagai plasmid sampai selyang berisi mereka adalah koinfeksidengan fag pembantu, seperti M13KO7,yang menyediakan protein untuk sintesisDNA beruntai tunggal dan kemasan.

M13KO7 adalah fag M13 yang telahdimodifikasi, yang paling penting denganpenggabungan asal replikasi plasmid.Replikasi dari asal ini memungkinkan fagpenolong untuk hadir di sejumlah salinanyang tinggi per sel dan, karena itu, untukmemberikan jumlah yang lebih besar dariprotein yang diperlukan untuk mereplikasidan paket molekul phagemid. M13KO7juga mengandung gen resistensikanamisin untuk memungkinkan seleksiuntuk kehadiran fag pembantu. (Tentu

saja, adalah mungkin bahwa M13KO7pembantu fag dapat dikemas juga, tetapidalam prakteknya molekul phagemidyang dikemas ditemukan berada dikelebihan 100 kali lipat selama fagpembantu.) Contoh lain dari vektor iniadalah seri pBluescript, sepertipBluescriptIIKS. Rangkaian plasmidmengandung, selain fitur yang sudahdijelaskan, promotor dari E. colibakteriofage T3 atau T7, yang bergunauntuk mengekspresikan urutan cloning.Keuntungan utama dari sistem fagemidadalah bahwa hal itu dapat digunakanuntuk menyediakan bahan tunggal atauuntai ganda tanpa kloning ulang.

4. BAKTERIOFAGE LAMDADi antara bermacam-macam virus, virus

lamda bakteriofage (untuk selanjutnyadisebut bakteriofage saja) merupakan jenisvirus yang berkembang biak di dalam selbakteri Eschericia coli dan kemudianmerusaknya (Muladno, 2010)

Bakteriofage (atau sederhananya fage),yaitu virus yang menginfeksi bakteri,ditemukan secara terpisah oleh Frederick W.Twort di Inggris pada 1915 dan oleh felix

Gambar 2. Siklus lisogenik bakteriofage lamda(Sumber: http://cronodon.com/images/Lambda_cycle.jpg)


7/11


dHerelle di Institut Pasteur di Paris pada1917. Twort mengamati bahwa koloni-kolonibakteri kadang-kadang mengalami lisis(menjadi larut dan lenyap) dan bahwa efeklitik ini dapat ditularkan dari koloni ke koloni.Bahkan bahan yang sangat encer dari suatukoloni dapat menularkan efek litik. Namun,bila filter tersebut dipanaskan maka sifatlitiknya rusak. Dari pengamatannya, Twortdengan hati-hati mengusulkan bahwaunsure litik itu mungkin virus. DHerellemenemukan kembali fenomena ini pada1917, karena itu disebut fenomena Twort-dHerelle dan menciptakan kataBakteriofage, yang berarti pemakanbakteri(Pelczar dan Chan. 1986).

Virus yang menginfeksi bakteri disebut

bakteriofage atau fage saja. Walaupunspectrum bakteri yang dapat diinfeksi satufage itu terbatas, banyaknya fage yangdapat tak terhitung jumlahnya itu makasangat mungkin bahwa paling sedikitterdapat satu fage untuk setiap tipe bakteri(Volk dan Wheeler. 1988).

Beberapa kelompok bakteriofage yangditeliti paling ekstensif ialah fage-koli,dinamakan demikian karenamenginfeksi Eschericia coli. Mereka diberinama T1 sampai T7. Ada bakteriofage lain

untuk E. coli selain fage T, yaitu fage f2, fd,fl dan lainlain (Pelczar dan Chan. 1986).

Karena virus bakteriofage ini berkembangbiak pada sel Eschericia coli(makhluk hidupyang sangat sederhana pula), maka virusbakteriofage merupakan virus pertama yangdirancang oleh manusia untuk digunakansebagai biotranspor (Muladno, 2010).

5. KOSMID

Sebagaimana yang telah dilihat,

konkatemer satuan panjang molekul DNA dapat dikemas dengan efisien jika situs cos,substrat untuk pembelahan bergantungkemasan, terpisah dengan jarak 37-52 kb(75-105% ukuran + DNA). Bahkan, hanyadaerah kecil di dekat situs cos yangdiperlukan untuk pengenalan oleh sistemkemasan (Hohn 1975). Plasmid telah dibuatmengandung fragmen DNA termasuk situscos (Collins & Bruning 1978, Collins & Hohn1979, Wahl et al. 1987, Evans et al. 1989).Plasmid ini telah disebut kosmid dan dapat

digunakan sebagai vektor kloning gen dalamhubungannya dengan sistem kemasan in-

vitro. Gambar 5.1 menunjukkan skema gen-kloning menggunakan kosmid a. Kemasanrekombinan kosmid ke mantel fagemenekankan pilihan yang diinginkan padaukuran mereka. Dengan vektor kosmid dari5 kb, penyisipan 32-47 kb DNA asing - lebihdari yang dapat ditampung oleh vektor fage-. Yang harus diperhatikan adalah, setelahkemasan in-vitro, partikel digunakan untukmenginfeksi inang yang cocok. DNA kosmidrekombinan disuntikkan dan bersirkulasiseperti DNA fag etetapi bereplikasi sebagaiplasmid normal tanpa ekspresi apapunfungsi fage. Sel yang berubah dipilihberdasarkan penanda vektor yang memilikiresistensi terhadap obat.

Kosmid merupakan wadah yang efisiendalam mengkloning potongan besar DNAasing. Karena kapasitas mereka untukfragmen besar DNA, kosmid adalah vektoryang sangat menarik untuk membangunperpustakaan fragmen genom eukariotik.Pencernaan parsial dengan endonukleaserestriksi memberikan fragmen sesuai besar.Namun, ada masalah potensial yang terkaitdengan penggunaan mencerna parsialdengan cara ini. Hal ini disebabkankemungkinan dua atau lebih fragmen genom

bergabung bersama dalam reaksi ligasi,sehingga menimbulkan kloning yangmengandung fragmen yang awalnya tidakberdekatan dalam genom. Hal ini akanmemberikan gambaran yang salahorganisasi kromosom mereka. Masalah inidapat diatasi dengan fraksinasi ukuranpencernaan parsial.

Bahkan dengan DNA yang ukurannyaasing, dalam prakteknya dapat dihasilkankloning kosmid yang mengandung fragmen

DNA non-contiguous terligasi untukmembentuk sisipan tunggal. Masalahnyadapat diatasi dengan defosforilasi fragmenDNA asing sehingga mencegah ligasimereka bersama-sama. Metode ini sangatsensitif terhadap rasio sasaran terhadapvektor DNA yang tepat (Collins & Bruning1978) karena ligasi vektor--vektor dapatterjadi. Selain itu, rekombinan dengan vektordigandakan tidak stabil dan runtuh di dalaminang oleh rekombinasi, sehinggapenyebaran vektor kosmid non-rekombinan.

Kesulitan tersebut telah diatasi dalamprosedur kosmid-kloning dirancang oleh Ish-


8/11


Horowicz dan Burke (1981). Denganperawatan yang tepat dari pJB8 vektorkosmid, kiri dan kanan vektor ujungnyadimurnikan yang tidak mampu ligasi sendiritapi yang menerima DNA asing yag terdefosforilasi. Dengan demikian metodemenghilangkan kebutuhan untuk ukuranfragmen DNA asing dan mencegahpembentukan klon yang mengandung DNAasing pendek atau beberapa urutan vektor.

Sebuah solusi alternatif untuk masalah initelah dirancang oleh Bates dan Swift (1983)yang telah membangun kosmid c2XB.Kosmid ini membawa situs penyisipanBamHI dan dua cos situs dipisahkan olehtumpul-end pembatasan situs. Penciptaan

ini ujung-ujung tumpul, yang ligasinyasangat tidak efisien hanya di bawah kondisi

yang digunakan, efektif mencegah vektor diriligasi dalam reaksi ligasi. Kosmid moderndari PWE dan SCOs seri (Wahl et al 1987,Evans et al 1989) berisi fitur seperti: (Bates& Swift 1983, Pirrotta et al 1983, Breter et al1987) (i) beberapa situs kloning untukkloning sederhana menggunakan DNA non-size yang dipilih; (ii) promotor fag mengapitsitus kloning; dan (iii) situs NotI, SacII atauSFIL unik mengapit situs kloning untuk

memungkinkan penghapusan insert darivektor sebagai fragmen tunggal. Modulekspresi koding penanda dominan yangdipilih pada mamalia juga dapat disediakan,untuk transfer gen ke sel mamalia jikadiperlukan.

6. BAKTERIOFAGE MU

Gambar 3. Pembentukan fage pentransduksi melalui kosmid(Sumber: Schaums Outlines, 2006)


9/11


Bakteriofage Mu, atau fage Mu, adalahbakteriofage temperate (mempunyai siklushidup lisogenik), sejenis virus yangmenginfeksi bakteri. Ia termasuk keluargaMyoviridae, dan terdiri dari kepalaikosahedral, ekor kontraktil, dan enam seratekor.

Myoviridae Gambaran struktur dari fagT4, dari keluarga yang sama (Myoviridae)sebagai bakteriofage Mu.

Semua fage temperate diketahuimenggunakan salah satu dari hanya tigasistem yang berbeda untuk siklus lisogenikmereka: integrasi / eksisi mirip lamda,transposisi mirip Mu, atau partisi fage N15seperti pada plasmid.

Bakteriofage Mu menggunakan

transposisi berbasis DNA untukmengintegrasikan genom ke dalam genomsel inang yang menginfeksi. Kemudiandapat menggunakan transposisi untukmemulai replikasi virus DNA-nya. SetelahDNA virus dimasukkan ke dalam bakteri,protein/enzim transposase Mu dalam selmengenali situs rekombinasi di ujung DNAvirus (gix-L dan situs gix-R) dan mengikatmereka, yang memungkinkan prosesreplikasi DNA virus atau embedding kedalam genom inang. Unsur transposabel

(TE) adalah urutan DNA yang dapatmengubah posisi relatif (self-transpose)dalam genom dari sel tunggal. Mekanismetransposisi dapat berupa "copy dan paste"atau "memotong dan menyisipkan."Transposisi dapat membuat mutasi fenotipsignifikan dan mengubah ukuran genom sel.

Transposisi Fage Mu adalah contohterbaik dari transposisi replikatif. Mekanismetransposisi Its agak mirip denganrekombinasi homolog. Transposisi replikatifadalah mekanisme transposisi dalam biologi

molekuler, diusulkan oleh James A. Shapiropada tahun 1979, di mana elementransposabel diduplikasi selama reaksi,sehingga entitas transposing adalah salinandari elemen asli. Dalam mekanisme ini,urutan donor dan reseptor DNA membentukkonfigurasi karakteristik intermediet thetayang terkadang disebut intermediet Shapiro.Transposisi replikatif adalah karakteristikuntuk retrotransposon dan terjadi dari waktuke waktu pada transposon kelas II.

7. BAKTERIOFAGE P1

Bakteriofage P1 atau fage P1 diisolasipada tahun 1951 oleh Giuseppe Bertani dariEscherichia coli strain Lisbonne danCarrere. P1 telah banyak digunakan untukmembangun strain bakteri baru dandigunakan secara luas untuk memetakankromosom Escherichia Coli. P1 telahdigunakan sebagai model organisme untukaspek yang berbeda dari fage dan biologiseperti pembatasan modifikasi DNA,rekombinasi spesifik terhadap situs, replikasiplasmid, partisi, ketidakcocokan dankecanduan.

Fage P1 menunjukkan morfologi klasikbakteriofage dengan kepala ikosahedral,ekor infleksibel sepanjang 220nm lengkapdengan tabung yang dikelilingi oleh

selubung kontraktil, baseplate dan enamserat ekor tertekuk. Kepala ikosahedralberisi genom fage. Bagian variabel(dikodekan oleh segmen P1 DNA yangdapat diinvers) dari serat ekor (denganketebalan 1-2nm) menentukan kekhususanadsorpsi P1 pada inang yang berbeda-beda.

Ujung glukosa pada inti lipopolisakaridadari membran luar bakteri bertindak sebagaireseptor P1. Serat ekor fage P1mempromosikan identifikasi bakteri inang.Setidaknya tiga dari enam serat ekor

dengan molekul reseptor spesifik cukupuntuk memicu mekanisme injeksi.Mekanisme yang tepat dari mekanismepenetrasi tidak diketahui tetapi modelmenunjukkan bahwa kontrak ekor fage,tabung ekor didorong melalui baseplatemenusuk membran sel luar bersama dengandinding sel bakteri. Sebuah proses lisistransglikosilase memfasilitasi penusukandinding sel bakteri. Isi kepala fage kemudiandisuntikkan ke dalam periplasma sel inangyang dimediasi oleh pori-pori. Mekanisme

lain yang menarik adalah sistempengecualian superinfeksi sim. Sim dengancepat diekspresikan segera setelah infeksipada membran dalam atau ruangperiplasma dari sel inang yang terinfeksi.Hipotesis yang diajukan adalah bahwa Simprotein perangkap superinfecting genom P1di periplasma, sehingga tidak mengganggusiklus infeksi P1 yang sedang berlangsung.Karena genom P1 adalah linear, perlu cepatdiedarkan setelah memasuki sitoplasmatuan rumah sebelum degradaded olehnucleases seluler. Mekanisme ini masih


10/11


belum diketahui tetapi diusulkan bahwa itudimediasi oleh situs-spesifik Cre-tergantungrekombinasi menggunakan kehadiran duasitus asap-Cre dalam beberapa genom fag.Daftar mekanisme uncharacterized yangbisa invovled. Sebuah kertas baru-baru iniyang direkayasa sel inang E.coli kecil telahmenunjukkan tiga konfigurasi: tahap ekordiperpanjang dengan DNA pada kepala fag,tahap ekor kontrak dengan DNA dan tahapekor dikontrak tanpa DNA. Mereka jugatelah menunjukkan bahwa ada penetrasiseragam dari tabung ekor bagian dalam keperiplasma E.coli dan pergerakan signifikanbaseplate dari membran luar selama ekorkontraksi.

Replika P1 minimalnya memiliki kerangka

terbuka untuk replikasi protein RepA, diapitoleh dua set 19 pasang basa urutanberulang, incA dan incC bersama denganasal replikasi plasmid. Pengikatan RepA keiteron di incC diperlukan untuk inisiasisementara pengikatan RepA ke iteron incAyang berfungsi untuk mengontrol jumlahsalinan plasmid. Faktor tuan rumahberkontribusi pada inisiasi oriR dan empat

lokasi bendungan metilasi GATC dalam asalitu sendiri perlu termetilasi. Leleh DNAterjadi melalui tindakan bersama dari Repadan tuan rumah faktor: DnaA dan HU.Promotor RepA terletak di incC dandiekspresikan ketika RepA berikatan denganinteron. Protein RepA ada sebagai dimerketika baru disintesis tapi perlu menjadimonomer memiliki aktivitas DNA-mengikat.DnaK, DnaJ dan GrepE pendamping yangdiperlukan untuk mengkonversi dimermenjadi monomer aktif.

Pengemasan bakteriofage ke kapsid virusterjadi melalui proses yang memilihkromosom virus untuk enkapsidasi dari poolDNA yang sebagian besar terdiri dari urutan

DNA inang. Sebuah fitur umum darikemasan DNA adalah rangka proteinkosong yang berinteraksi dengan DNA virusyang dimediasi oleh identifikas DNA yangdikoding oleh fage dan pengolahan protein.'pac' adalah situs pada DNA virus yangmengikat protein.

10. KESIMPULAN

Ada tiga macam vektor yang telah dikembangkan untuk kloning DNA dalam Escheriacoli, yaitu plasmid, fage, dan kosmid. Sebagian besar DNA fage tidak penting untuk infeksidan dapat diganti dengan DNA asing. Mutan-mutan fage yang dirancang untuk kloning DNAtelah dikonstruksi. Hampir semua partikel-partikel fage yang dibentuk akan mengandungDNA asing yang disisipkan. Kelebihan penggunaan virion-virion ini sebagai vektor ialahbahwa virion akan memasuki bakteri dengan frekuensi lebih tinggi dari plasmid. Molekul-molekul DNA rekombinan dapat dikemas in vitrountuk membawa virion-virion yang infektif.Kosmid adalah vektor lain yang dikonstruksikan dari plasmid normal dan tempat cos (ujungkohesif) dari fage .

REFERENSI

Anonim, 2011. Phage P1. [online] http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Phage_P1[diakses pada 5 Oktober 2014].

Anonim, 2012 Bacterial Artificial Chromosomes (BAC). [online] .http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC) [diakses pada 3 Oktober2014].

Anonim, 2012. Mu: A Double-Stranded Transposable DNA Bacteriophage. ). [online]https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/[diakses pada 5 Oktober 2014].
http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Phage_P1http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Phage_P1http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/https://www.boundless.com/microbiology/textbooks/boundless-microbiology-textbook/viruses-9/viral-diversity-123/mu-a-double-stranded-transposable-dna-bacteriophage-635-52/http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/DNA_recombinant_techniques/Artificial_Chromosomes/Bacterial_Artificial_Chromosomes_(BAC)http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/Phage_P1


11/11


Howe, C. J. 1995. Gene Cloning and Manipulation, New York: Cambridge

Primrose, S.B and Twyman, R.M., 2006. Principles of Gene Manipulation and Genomics.Seventh Edition. Blackwell Publishing.

Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al., 2008. Molecular Cell Biology. New York: W. H.

Freeman.

Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: IPB Press.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning:. A Laboratory Manual.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Susan L.Elrod.,Ph.D and William D.,Ph.D, 2006. Schaums Outlines GENETIKA, EdisiKeempat. Erlangga:Jakarta

Yuwono, Triwibowo, 2007. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga.

vektor-vektor kloning untuk e. coli

Documents