Kloning Gen

Pendahuluan: BioteknologiBiotechnology

Dolly and surrogate Mom

Embryonic stem cells and gene therapy Genetically modified rice.

BiotechnologyBioteknologi secara luas didefinisikan sebagai rekayasa organisme untuk mendapatkan kemanfaatan tertentu.

Bioteknologi seringkali melibatkan modifikasi dan hibridisasi gen dan pemasukan pada organisme tertentu, dimana secara normal gen tersebut tidak ditemukan dalam organisme tersebut.

Fourteen month-old genetically engineered (“biotech”) salmon (left) and standard salmon (right).

Aplikasi Biotechnology

Kloning binatang

Kloning gen untuk produksi hormon

Pengembangan stem sel DNA fingerprinting

Perdebatan etik?

Kloning untuk reproduksi

Even under the best of circumstances, the current technology of cloning is very inefficient.

Cloning provides the most direct demonstration that all cells of an individual share a common genetic blueprint.

The Stem Cell Concept

A stem cell is an undifferentiated, dividing cell that gives rise to a daughter cell like itself and a daughter cell that becomes a specialized cell type.

Stem Cells are Found in the Adult, but the Most Promising Types of Stem Cells for Therapy are Embryonic Stem Cells

The Inner Cell Mass is the Source of Embryonic Stem Cells

The embryo is destroyed by separating it into individual cells for the collection of ICM cells.

In order to obtain self-derived stem cells, adult cell nuclei are transferred to human oocytes, obtained as excess material from in-vitro fertilization.This procedure was used to create the sheep “Dolly”, and is at present highly controversial, and ethically debated, as the resulting blastula from the procedure could be transferred to a human foster mother, and give rise to a complete human being. Figure reproduced by permission from Solter et al. ScienceMag.

Human therapeutic cloning.

Kloning - definisi Dari Bahasa Yunani - klon, ranting Kumpulan turunan suatu individu yang

dihasilkan tanpa melalui perkawinan; kumpulan replika sebagian atau seluruh makromolekul (contoh, DNA atau antibodi)

Suatu individu yang tumbuh dari satu sel somatik induknya serta memiliki identitas genetik yang sama dengan induknya

Klon: Koleksi molekul atau sel yang semua identitasnya sama dengan molekul atau sel penurunnya

Kloning DNA

Metoda untuk memurnikan atau mengidentifikasi dan memperbanyak suatu potongan DNA tertentu (klon) yang dikehendaki dari campuran potongan-potongan DNA yang kompleks.

Kloning Gen

Ketika keseluruhan DNA dari suatu organisme diekstraksi, akan diperoleh seluruh gen yang dimiliki organisme tersebut

Pada kloning gen, hanya gen (DNA) tertentu yang diisolasi, dimurnikan, dan diperbanyak (diklon)

Tujuan mengklon Gen Menentukan urutan basa nukleotida penyusun gen tersebut

Menganalisis atau mengidentifikasi urutan basa nukleotida pengendali gen tersebut

Mempelajari fungsi RNA / protein/enzim yang disandi gen tersebut

Mengidentifikasi mutasi yang terjadi pada kecacatan gen yang mengakibatkan penyakit bawaan

Merekayasa organisme untuk tujuan tertentu, misalnya memproduksi insulin, ketahanan terhadap hama, dll.

Sumber DNA untuk diklon DNA kromosom cDNA (complementary DNA) yang

disintesis menggunakan mRNA sebagai cetakan (template)

DNA yang dihasilkan dari perbanyakan menggunakan PCR

Mensintesis cDNA

Perbanyakan DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bahan / Alat untuk Mengklon

Enzim endonuklease restriksi Enzim ligase Vektors Inang (Host) Metoda untuk memasukkan DNA ke dalam

sel inang

Memotong DNA Menggunakan enzim

endonuklease restriksi Ujung “lengket” (sticky

ends) Ujung “tumpul” (blunt

ends) Penamaan enzim

EcoRI E = genus (Escherichia) co = species (coli) R = strain I = # of enzyme

Ujung “lengket” dan “tumpul” (Blunt & Sticky ends)

Penyambungan (pasting) DNA

Pembentukan ikatan-H pada ujung-ujung yang komplemen (sticky ends)

Ligase membentuk ikatan fosfodiester untuk merekatkan benang-benang DNA

Vektor untuk MengklonDiperlukan suatu wahana (vehicle) untuk memasukkan suatu potongan DNA ke dalam sel agar DNA tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di dalam sel tersebut

PlasmidDNA bukan kromosom (extrachromosomal

DNA) yang secara alami dimiliki suatu jasad

Bentuknya benang ganda (double strands DNA, dsDNA) sirkular

Plasmid buatan (Artificial plasmids) dapat dibuat dengan menambahkan potongan-potongan DNA lain

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki:

Replikator (origin of replication) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi

(misalnya gen ketahanan terhadap antibiotik)

Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di dalam daerah replikator atau penanda

Vektor untuk Mengklon

Plasmid yang Dimiliki oleh Escherichia coli

Berasal dari plasmid alami E. coli

Potongan DNA tambahan

Potongan DNA tambahan

Plasmid Khimera (Chimeric Plasmids)

Khimera berasal dari mitologi Yunani, makhluk dengan tubuh gabungan dari bagian-bagian makhluk binatang lain

Setelah pemotongan plasmid menggunakan suatu enzim restriksi, potongan DNA asing yang memiliki ujung pemotongan yang sama dapat disisipkan

Setelah ujung-ujung plasmid dan potongan DNA asing disambung, akan dihasilkan "plasmid rekombinan"

Plasmid rekombinan dapat bereplikasi dalam sel inang yang sesuai

Kloning TerorientasiBila diinginkan untuk

menginsersikan potongan DNA asing dengan orientasi tertentu

Dilakukan dengan memotong DNA vektor maupun DNA sumber gen yang dikehendaki menggunakan dua enzim restriksi yang berbeda

Vektor untuk Mengklon1 Vektor berupa plasmid 2 Vektor berupa bakteriofaga3 Cosmid 4 BACs (Bacterial Artificial

Chromosome) & YAC (Yeast Artificial Chromosome)

1. Memiliki origin of replication dari inang yang dituju, sehingga memungkinkan replikasi secara independen terhadap genom inang.

2. Memiliki penanda selektif: Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asingketahanan terhadap antibiotik ganda penapisan biru-putih

3. Memiliki banyak situs pengkloningan (multiple cloning sites, MCS)

4. Mudah diisolasi dari sel inang.

Vektor berupa Plasmid

Multiple Cloning Site (MCS)

Vektor berupa Plasmid

Vektor berupa Plasmid Keunggulan: Kecil, mudah pengerjaannya Strategi seleksi mudah Berguna untuk mengklon potongan

DNA ukuran kecil (< 10kbp) Kelemahan:

Kurang bermanfaat untuk mengklon potongan DNA ukuran besar (> 10kbp)

Memilih Vektor Ukuran DNA yang

disisipkan Ukuran vektor Situs enzim

restriksi yang tersedia

Jumlah salinan (copy number)

Efisiensi kloning Kemampuan untuk

menapis DNA sisipan

Rencana penelitian selanjutnya

Cara Mengklon DNA (1) Isolasi vektor kloning

(plasmid bacterial) & DNA sumber gen

Pemotongan DNA sumber gen & vektor kloning menggunakan enzim restriksi yang sama

Penyisipan potongan DNA sumber gen ke dalam vektor kloning yang telah dipotong menggunakan enzim restriksi yang sama; potongan disambung dengan bantuan enzim DNA ligase

Cara Mengklon DNA (2) Vektor kloning yang

telah tersisipi potongan DNA dimasukkan ke dalam sel inang (transformasi sel inang)

Penapisan sel pengklon (dan gen yang dimasukkan)

Identifikasi sel pengklon pembawa gen yang dikehendaki

Memudahkan seleksi sel pembawa plasmid tersisipi DNA asing

ketahanan terhadap antibiotik ganda

penapisan biru-putih

Penanda selektif

Penapisan Klon Medium pertumbuhan

diberi antibiotik yang sesuai dengan sifat ketahanan yang digunakan sebagai penanda, misalnya Kanamisin

Bakteri di paruh cawan petri sebelah kanan memiliki plasmid dengan penanda ketahanan terhadap Kanamisin(Kanr), yang di sebelah kiri tidak memilikinya

Penapisan warna koloni Biru/Putih

lacZ insert

Enzim tidak berfungsi

X-gal produk

lacZ

Enzim berfungsi

X-gal produk

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

Apakah problemnya?

DNA mamalia mengalami splicing pada proses transkripsi?

Bagaimana solusinya? Gunakan cDNA

Penelusuran melalui BLAST

We can enter the primary structure of insulin protein into a database (“BLAST” : [Basic Local Alignment Search Tool]) which will compare the protein sequence with the DNA sequence of the human genome. It will identify the DNA that is capable of coding the insulin protein and tell us which DNA molecule this is.

Primary structure of insulin protein :NMALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHL

CGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN -C

Urutan m-RNANM_000207 Reports Homo sapiens insu...[gi:109148525]Links>gi|109148525|ref|NM_000207.2| Homo sapiens insulin (INS), mRNA5’AGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGCAGATCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCAAAA3’*although this is a mRNA sequence, it is shown as having “T”s andnot “U”s. This is because the sequence information was generatedfrom a DNA molecule that was made in the laboratory by using theenzyme “Reverse Transcriptase”. This DNA was “complementary” tothe mRNA, and is called “complementary DNA” or “cDNA”.

NM_000207. Reports Homo sapiens insu...[gi:109148525]Links>gi|109148525|ref|NM_000207.2| Homo sapiens insulin (INS),

mRNA5’AGCCCTCCAGGACAGGCTGCATCAGAAGAGGCCATCAAGCAGA

TCACTGTCCTTCTGCCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCAGCCCCACACCCGCCGCCTCCTGCACCGAGAGAGATGGAATAAAGCCCTTGAACCAGCAAAA3’

5’-ATGGCCCTGT….. TACTGCAACTAG-3’ :is the ORF (protein coding region) of insulin cDNA and is theregion we need to make insulin protein in the laboratory

Amplifikasi cDNA

Before we can clone the insulin gene into the plasmid, wehave to make large quantities of the insulin gene (thesequence corresponding to the ORF of the insulin mRNA =cDNA) in the laboratory The method used for this purpose is called “PCR”:

“Polymerase Chain Reaction”PCR is the amplification of DNA chains using DNA polymerase using a method that has repeating cycles

Squence cDNA

5’ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGGCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACTAG-3’

’Insulin cDNA

5’ATGGCCCTGTGGATGCGC…………………GGAGAACTACTGCAACTAG-3’

DNA polymerase

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

A fermentor used to grow recombinant bacteria.

This is the step when gene cloning takes place.

The single recombinant plasmid replicates within a cell. Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene.

One cell with the recombinant plasmid

Route to the Production by Bacteria of Human Insulin

The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant

human insulin gene.

End

See ya ………