uin syarif hidayatullah jakartarepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · rachma...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI DARI KAPANG ENDOFIT DAUN

PARIJOTO (Medinilla speciosa Blume) TERHADAP

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli,

dan Shigella dysenteriae

SKRIPSI

RACHMA AYUNDA

NIM. 1111102000054

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI, SELEKSI, DAN UJI AKTIVITAS

ANTIBAKTERI DARI KAPANG ENDOFIT DAUN

PARIJOTO (Medinilla speciosa Blume) TERHADAP


dan Shigella dysenteriae

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

RACHMA AYUNDA

NIM. 1111102000054

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Rachma Ayunda

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antibakteri dari Kapang

Endofit Daun Parijoto (Medinilla speciosa Blume)

Terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae

Kapang endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan tumbuhan pada

periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan tumbuhan tanpa

membahayakan inangnya, bahkan seringkali bersimbiosis secara mutualistis.

Kapang endofit dapat menghasilkan metabolit sekunder yang berpotensi sebagai

senyawa antimikroba. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, menseleksi, dan

menguji aktivitas antibakteri dari kapang endofit daun parijoto (Medinilla

speciosa Blume) terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia

coli, dan Shigella dysenteriae. Tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume)

merupakan tanaman yang tumbuh di Desa Colo Kecamatan Dawe Kabupaten

Kudus Jawa Tengah yang secara tradisional yang digunakan sebagai obat diare,

sariawan, antiradang, dan antibakteri. Metode yang digunakan untuk uji aktivitas

antibakteri adalah metode difusi cakram atau Kirby-Baurer. Dari hasil penelitian

ini diperoleh 20 isolat kapang endofit yang didapat dari daun yang berwarna hijau

muda, hijau tua, dan hijau kekuningan. Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri

diperoleh 10 isolat kapang endofit, yaitu isolat DPU 1, DPU 3, DPU 4, DTE 1,

DTE 3, DTU 1, DTU 4, DTU 6, DTU 7, dan DTU 9 yang aktif terhadap bakteri

uji tertentu, yaitu Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan

Shigella dysenteriae. Penelitian ini memperlihatkan bahwa daun Medinilla

speciosa Blume mengandung kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri.

Kata kunci : Medinilla speciosa Blume, kapang endofit, difusi cakram, aktivitas

antibakteri

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Rachma Ayunda

Program Study : Pharmacy

Title : Isolation, Selection, and Antibacterial Activity from Mold

Endophytic of Medinilla speciosa Blume Leaves Against


and Shigella dysenteriae

Endophytic mold are microbes that live inside plant tissue at a certain period and

are able to form colonies in plant tissue without harming the host, often symbiotic

mutualism. Endophytic mold can produce secondary metabolites as a potential

antimicrobial compounds. This study aims to isolate, selecting, and antibacterial

activity from endophytic mold of leaves parijoto (Medinilla speciosa Blume)

against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Shigella

dysenteriae. Parijoto (Medinilla speciosa Blume) is a plant that grows in the

village of the District Dawe Colo Kudus, Central Java which has traditionally

been used as medicine for diarrhea, mouth sores, anti-inflammatory, and

antibacterial. The method used to the antibacterial activity was disc diffusion

method or the Kirby-Baurer. The results of this study was obtained 20 isolates of

endophytic mold that was obtained from young green, dark green, and yellowish

green leaves. Based on results antibacterial activity was obtained ten isolates of

endophytic mold, which is isolates DPU 1, DPU 3, DPU 4, DTE 1, DTE 3, DTU

1, DTU 4, DTU 6, DTU 7, and DTU 9 active against certain bacteria test, which is

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, and Shigella

dysenteriae. This study shows that the leaves of Medinilla speciosa Blume

containing endophytic mold that have a potential as an antibacterial.

Keywords : Medinilla speciosa Blume, endophytic mold, disc diffusion,

antibacterial activity

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT

atas segala nikmat, rahmat, dan karunianya-Nya sehingga penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi ini. Shalawat serta salam

senantiasa penulis sampaikan kepada Nabi Muhammad SAW yang memberikan

petunjuk bagi umat manusia, semoga kelak kita mendapat syafaatnya di hari

akhir.

Skripsi dengan judul “Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antibakteri dari

Kapang Endofit Daun Parijoto (Medinilla speciosa Blume) Terhadap

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Shigella

dysenteriae” ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak mendapat

doa, bantuan, bimbingan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,

penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Puteri Amelia, M,Farm., Apt selaku pembimbing pertama dan Bapak Saiful

Bahri, M.Si selaku pembimbing kedua yang senantiasa memberikan arahan,

dukungan, semangat, saran, dan solusi selama melaksanakan penelitian dan

penyelesaian skripsi ini. Semoga segala bantuan dan bimbingan Ibu dan Bapak

mendapatkan imbalan yang lebih baik di sisi Allah SWT.

2. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM., M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta.

4. Bapak dan Ibu Dosen serta karyawan Farmasi Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta yang telah memberikan motivasi, nasihat, bimbingan dan

ilmu kepada penulis selama menjalankan studi.

5. Ibu Puteri Amelia, M.Farm., Apt selaku pembimbing akademik yang telah

memberikan nasihat, motivasi, dan semangat selama penulis menjalani

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Semua laboran FKIK dan PLT yang telah membantu keseharian penulis selama

penelitian dan memberikan informasi tentang teknis pengerjaan di laboratorium

kepada penulis.

7. Ayahanda Alm. Eddyzal Zumartin, S.H dan Ibunda Diah Ernawati, M.M. yang

tiada hentinya memberikan dukungan, doa, nasihat, dan bantuan baik materil

maupun non materil selama penulis melaksanakan penelitian dan penyusunan

skripsi ini. Serta adikku Suci Rachmadani, Eyang Haryanti, H. Alpha

Nugerahajati, S.Kom yang telah memberikan keceriaan dan kebahagiaan dalam

kehidupan ini.

8. Teman-teman seperjuangan penelitian di bidang mikrobiologi Ambar, Ati,

Arini, Puput, Brasti, Meri, Adit, Bachtiar, Karimah, Sumiati, Syaima, Fitri,

Faradhilla, dan Mozer, teman-teman Farmasi 2011, dan terkhusus untuk

sahabat terbaik Fitri dan Happy yang selalu menyemangatiku ketika lelah dan

menjadi motivator bagiku serta memberikan keceriaan semasa perkuliahan

sehingga penulisan skripsi ini selesai.

9. Pihak-pihak lain yang terlibat dalam penulisan skripsi ini yang tidak dapat

ditulis satu persatu, penulis akan selalu mengingat atas kebaikan dan doa-

doanya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam skripsi ini.

Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih

terhadap kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini.

Saya berharap skripsi ini dapat bermanfaat dan dapat menjadi sumbangan

pengetahuan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan pembaca pada

umumnya.

Ciputat, 18 Juni 2015

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ...................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ iv

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... v

ABSTRAK ................................................................................................. vi

ABSTRACT .............................................................................................. vii

KATA PENGANTAR ................................................................................ viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH ............................ x

DAFTAR ISI ............................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xiii

TAFTAR TABEL ...................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN .............................................................................. xv

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang .......................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ..................................................................... 4

1.3 Tujuan Masalah ......................................................................... 4

1.4 Hipotesis ................................................................................... 4

1.5 Manfaat Penelitian ..................................................................... 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................. 5

2.1 Tumbuhan Parijoto (Medinilla speciosa Blume) ...................... 5

2.2 Mikroba Endofit ...................................................................... 7

2.3 Antimikroba ............................................................................. 11

2.4 Uji Aktivitas Antimikroba ....................................................... 14

2.5 Kapang .................................................................................... 16

2.6 Bakteri Gram Positif dan Negatif ............................................. 17

2.7 Bakteri Uji ................................................................................ 18

2.8 Fase pertumbuhan mikroorganisme .......................................... 22

BAB 3. METODE PENELITIAN .............................................................. 24

3.1. Tempat dan waktu penelitian ................................................... 24

3.2. Alat dan Bahan ....................................................................... 24

3.3. Prosedur Penelitian .................................................................. 25

3.3.1. Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba ........................ 25

3.3.2. Isolasi Kapang Endofit ................................................... 27

3.3.3 Pemurnian Kapang Endofit ............................................ 28

3.3.4 Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri ..................................................................... 28

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri ..................................................................... 29

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3.6. Fermentasi Kapang Endofit ............................................ 29

3.3.7. Cek Kemurnian Bakteri Uji ............................................ 30

3.3.8. Uji Aktivitas Antibakteri ............................................... 30

3.3.8.1. Peremajaan Bkateri Uji ...................................... 30



BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 33

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................... 66

5.1. Kesimpulan ............................................................................. 66

5.2. Saran ....................................................................................... 67

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 68

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1. Tumbuhan Parijoto (Medinilla speciosa Blume) ......................... 6

Gambar 4.1. Hasil Isolasi Kapang Endofit Daun Medinilla speciosa

Blume pada Daun Berwarna Hijau Muda ................................... 36

Gambar 4.2. Kontrol Sterilisasi Permukaan Daun Kapang Endofit Medinilla

speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau Muda .................... 36


Blume pada Daun Berwarna Hijau Tua........................................ 37

Gambar 4.4. Kontrol Sterilisasi Permukaan Daun Kapang Endofit

Medinilla speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau Tua ....... 37


Blume pada Daun Berwarna Hijau Kekuningan .......................... 37

Gambar 4.6. Kontrol Sterilisasi Permukaan Daun Kapang Endofit

Medinilla speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau

Kekuningan ................................................................................. 38

Gambar 4.7. Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Staphylococcus

aureus dan Bacillus .................................................................... 41

Gambar 4.8. Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Escherichia

coli dan Shigella dysenteriae ....................................................... 43

Gambar 4.9. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DPU 1 ....... 45

Gambar 4.10.Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DPU 3 ...... 46

Gambar 4.11. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DPU 4 ..... 47

Gambar 4.12. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTE 1 ..... 48

Gambar 4.13. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTE 3 ..... 49

Gambar 4.14. Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTU 1 ..... 50





Gambar 4.19. Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis Staphylococcus

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

aureus ....................................................................................... 56

Gambar 4.20. Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis Bacillus subtilis .... 56

Gambar 4.21. Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis Escherichia coli .... 57

Gambar 4.22. Identifikasi Makroskopis dan Mikroskopis Shigella

dysenteriae ................................................................................ 57

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 2.1. Ciri Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif ................................... 18

Tabel 4.1. Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Bakteri Uji ...................... 39

Tabel 4.2. Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Isolat Kapang Endofit .................... 61

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Alur Penelitian ....................................................................... 76

Lampiran 2. Determinasi Tumbuhan Parijoto (Medinilla speciosa Blume)

............................................................................................... 77

Lampiran 3. Bagan Kerja Isolasi Kapang Endofit ....................................... 78

Lampiran 4. Bagan Kerja Pemurnian Kapang Endofit ................................ 79

Lampiran 5. Bagan Kerja Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi

Sebagai Antibakteri ................................................................ 80

Lampiran 6. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit yang Berpotensi

Sebagai Antibakteri ................................................................ 81

Lampiran 7. Bagan Kerja Fermentasi Kapang Endofit ................................. 82

Lampiran 8. Bagan Kerja Identifikasi Bakteri Uji ........................................ 83

Lampiran 9. Kerja Peremajaan Bakteri Uji .................................................. 84

Lampiran 10. Bagan Kerja Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ........ 85

Lampiran 11. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri .................................... 86

Lampiran 12. Hasil Fermentasi Kapang Endofit .............................................. 87

Lampiran 13. Absorbansi Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji ............................. 89

Lampiran 14. Uji Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit ................................ 90

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan negara berkembang, dimana tingkat kesadaran

masyarakat untuk menjaga kesehatan masih sangat kurang. Hal ini menyebabkan

masyarakat mudah untuk terjangkit suatu penyakit terutama penyakit infeksi

(Sumampouw et al., 2010). Penyakit infeksi ini dapat disebabkan beberapa

mikroba patogen seperti virus, bakteri, dan fungi.

Mikroba patogen merupakan mikroba penyebab penyakit infeksi yang

sering terjadi di masyarakat. Pengendalian mikroba patogen penting dilakukan

untuk mencegah penyebaran penyakit infeksi (Liana, 2010). Penyakit infeksi

dapat ditangani dengan menggunakan antibiotik. Terapi antibiotik beberapa tahun

lalu dinyatakan berhasil dalam mengatasi penyebaran mikroba patogen. Akan

tetapi, maraknya penggunaan antibiotik yang tidak tepat dapat menyebabkan

resistensi terhadap mikroba patogen (Sjahrurrahman et al., 1999). Hal ini

menyebabkan pencarian obat antimikroba (senyawa bioaktif) yang baru terus

dilakukan. Senyawa bioaktif dapat diperoleh dari beberapa sumber, diantaranya

dari tumbuhan, hewan, mikroba dan mikroorganisme laut (Prihatiningtias, 2005).

Salah satu sumber senyawa bioaktif yang berasal dari mikroba adalah

mikroba endofit. Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup di dalam jaringan

tumbuhan pada periode tertentu dan mampu membentuk koloni dalam jaringan

tumbuhan tanpa membahayakan inangnya (Tan RX et al., 2001 dalam Radji,

2005). Tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang

menghasilkan metabolit sekunder (Rante et al., 2013). Mikroba endofit mampu

menghasilkan metabolit sekunder seperti alkaloid, terpen, steroid, flavonoid,

kuinon, fenol dan sebagainya. Senyawa-senyawa ini sebagian besar mempunyai

potensi besar sebagai senyawa bioaktif (Tan RX et al., 2001 dalam

Prihatiningtias, 2005). Mikroba endofit dapat berupa bakteri atau kapang, tetapi

saat ini yang lebih banyak dieksplorasi adalah kelompok kapang endofit (Sinaga

et al., 2009). Kapang endofit dapat menghasilkan senyawa yang berfungsi sebagai

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

antibiotik, antivirus, antimalaria, antikanker, antioksidan, antidiabetes, dan

imunosupresif (Radji, 2005).

Mikroba endofit dapat memproduksi senyawa-senyawa bioaktif, baik yang

sama dengan inangnya ataupun berbeda tetapi seringkali memiliki aktivitas

biologis yang serupa dengan senyawa bioaktif yang diproduksi inangnya (Sinaga

et al., 2009). Strobel dan Daisy (2003) dalam Sinaga et al, 2009 bahkan

menyatakan bahwa senyawa yang dihasilkan oleh mikroba endofit seringkali

memiliki aktivitas yang lebih besar dibandingkan dengan inangnya.

Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa bioaktif merupakan

peluang yang sangat menantang dalam penyediaan bahan baku obat. Pembiakan

atau kultur mikroba endofit dapat dilakukan dalam jumlah yang sangat besar

tanpa memerlukan lahan yang luas sebagaimana halnya tumbuh-tumbuhan.

Pemanfaatan mikroba endofit sebagai sumber bahan baku obat juga akan

mereduksi kerusakan alam yang disebabkan oleh penebangan tumbuhan obat

dalam jumlah besar (Sinaga et al., 2009).

Banyak kelompok kapang endofit yang mampu memproduksi senyawa

antibiotik yang aktif melawan bakteri maupun fungi patogen terhadap manusia,

hewan dan tumbuhan terutama dari genus Coniothirum dan Microsphaeropsis

(Petrini et al., 1992 dalam Prihatingtias, 2005). Penelitian Dreyfuss et al., (1986)

dalam Prihatingtias, 2005 menunjukkan bahwa aktivitas isolat-isolat endofit

Pleurophomopsis sp. dan Cryptosporiopsis sp. yang diisolasi dari tumbuhan

Cardamin heptaphylla mempunyai aktivitas antimikroba yang tinggi. Isolat-isolat

tersebut menghasilkan penisilin N, sporiofungin A, B, C. Suatu penelitian yang

dilakukan oleh Tscherter dan Dreyfuss (1982) dalam Petrini et al., (1992)

menghasilkan suatu kesimpulan bahwa galur-galur endofit Cryptosporiopsis pada

umumnya merupakan penghasil senyawa antibiotik berspektrum luas. Sebagai

contoh lain adalah phomopsikhalasin yang merupakan golongan sitokhalasin dan

merupakan senyawa metabolik kapang endofit Phomopsis sp. Dengan metode

difusi, senyawa ini mampu menghambat aktivitas bakteri Bacillus subtilis,

Salmonella gallinarium, dan Staphylococcus aureus (Horn et al., 1995 dalam

Prihatiningtias, 2005).

3


Salah satu kekayaan alam di Indonesia adalah Parijoto atau Medinilla

speciosa Blume. Medinilla merupakan genus yang berasal dari familia

Melastomataceae yang memiliki sekitar 418 spesies dan varietas genus. Medinilla

pertama kali ditemukan pada tahun 1800an di Philiphina yang digunakan sebagai

tanaman hias, spesies yang ditemukan adalah Medinilla magnificient (Mariana et

al., 2012). Medinilla speciosa Blume merupakan tanaman khas dari Desa Colo

Kecamatan Dawe Kabupaten Kudus Jawa Tengah yang tumbuh liar di lereng

gunung atau di hutan-hutan dan kadang dibudidayakan sebagai tanaman hias

(Wibowo et al., 2012). Daun dan buah Medinilla speciosa Blume digunakan

secara tradisional bagi masyarakat sebagai obat diare, sariawan, antiradang, dan

antibakteri, khususnya daun M. speciosa yang digunakan sebagai obat diare

(Anonim, 2014).

Berdasarkan penelitian sebelumnya, ekstrak metanol, etil asetat dan n-

heksan buah Medinilla speciosa Blume memiliki aktivitas antibakteri pada

konsentrasi 200 mg/mL, 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL, dan 12,5 mg/mL

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Pada konsentrasi

200 mg/mL, 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL, dan 12,5 mg/mL ekstrak etil

asetat mempunyai aktivitas antibakteri lebih besar daripada ekstrak metanol dan

ekstrak n-heksan dengan diameter hambat 17,67 mm; 16,3 mm; 15,67 mm; 14,67

mm; 13,33 mm terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan 12,33 mm; 11,33

mm; 10,67 mm; 9 mm; 8 mm terhadap bakteri Escherichia coli (Niswah, 2014).

Senyawa metabolit sekunder seperti glikosida, saponin, tanin, flavonoid,

terpenoid, dan alkaloid telah dilaporkan mempunyai aktivitas antibakteri (Okeke

et al., 2001 dan Rahman et al., 2010 dalam Niswah, 2014).

Sejauh ini, belum ditemukan adanya penelitian mengenai aktivitas

antibakteri yang terdapat dalam kapang endofit tumbuhan Medinilla speciosa

Blume. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah melakukan isolasi, seleksi,

dan uji aktivitas antibakteri dari kapang endofit daun parijoto (Medinilla speciosa

Blume) terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan

Shigella dysenteriae.

4


1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang diatas, maka dapat dibuat rumusan masalah

sebagai berikut :

1. Apakah pada daun parijoto (Medinilla speciosa Blume) dapat ditemukan

kapang endofit?

2. Apakah kapang endofit dari daun parijoto (Medinilla speciosa Blume)

memiliki aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae?

I.3 Hipotesis

Kapang endofit yang diisolasi dari daun parijoto (Medinilla speciosa

Blume) mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus

subtilis, Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae.

1.4 Tujuan Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah diatas, tujuan penelitian ini adalah sebagai

berikut :

1. Untuk melakukan isolasi kapang endofit pada daun parijoto (Medinilla

speciosa Blume).

2. Untuk melakukan seleksi kapang endofit pada daun parijoto (Medinilla

speciosa Blume).

3. Untuk mengetahui aktivitas kapang endofit dari daun parijoto sebagai

senyawa antibakteri terhadap Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis,

Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae.

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Memberikan informasi tentang keberadaan kapang endofit yang diisolasi dari

daun parijoto (Medinilla speciosa Blume).

2. Menambah pengetahuan peneliti di bidang mikrobiologi, khususnya tentang

kapang endofit yang mempunyai potensi sebagai penghasil senyawa

antibakteri yang dimanfaatkan untuk mendapatkan sumber obat baru


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Medinilla speciosa Blume

2.1.1 Taksonomi

Klasifikasi tanaman Medinilla speciosa Blume adalah sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Ordo : Myrtales

Famili : Melastomataceae

Genus : Medinilla

Spesies : Medinilla speciosa Blume

(GBIF, 2013)

2.1.2 Morfologi

Parijoto merupakan tanaman perdu dengan tinggi 1-2 m; batang bulat,

kulit dengan lapisan gabus jika tua, bergerigi kasar, putih kecoklatan; daun

tunggal, bersilang berhadapan, tangkai pendek, bulat, lunak, warna ungu

kemerahan, helaian daun bentuk lonjong, pangkal dan ujung runcing, tepi rata,

panjang 10-20 cm, lebar 4-15 cm, pertulangan melengkung, permukaan atas licin,

berwarna hijau, permukaan bawah kasar, warna hijau kelabu; bunga majemuk, di

ketiak daun, sempurna, berkelamin ganda, kelopak 5 helai, ujung runcing, pangkal

berlekat, panjang 3-8 mm, warna ungu tua, benang sari 2 kali lipat jumlah

mahkota, kepala sari berupa kuncup membengkok, warna merah keunguan, kepala

putik duduk di atas bakal buah, kepala putik bulat, ungu, mahkota lepas, 5 helai,

bentuk kuku, panjang 5-8 mm, warna merah muda; buah bulat, bagian ujung

berbenjol bekas pelekatan kelopak, diameter 5-8 mm, warna merah keunguan; biji

bulat, jumlah banyak, kecil, putih; akar serabut, putih kotor (Anonim, 2014).

6


Gambar 2.1 Tumbuhan Parijoto / Medinilla speciosa Blume

[Sumber : Koleksi Niswah, 2014]

2.1.3 Tempat Tumbuh

Merupakan tumbuhan liar di lereng-lereng gunung atau di hutan-hutan dan

kadang dibudidayakan sebagai tanaman hias. Tumbuh baik pada tanah yang

berhumus tinggi dan lembab, pada ketinggian 800 m sampai 2.300 m di atas

permukaan laut. Berbunga pada bulan November-Januari dan waktu panen tepat

bulan Maret-Mei (Anonim, 2014).

2.1.4 Kandungan Kimia

Daun dan buah parijoto mengandung saponin dan kardenolin, di samping

itu buahnya mengandung flavonid dan daunnya mengandung tanin (Anonim,

2014). Selain itu, buah parijoto juga mengandung terpenoid dan glikosida

(Niswah, 2014 dan Mukkaromah, 2015).

2.1.5 Khasiat

Secara tradisional parijoto digunakan sebagai obat sariawan, diare,

antiradang dan antibakteri, khususnya daun parijoto yang digunakan sebagai obat

diare (Anonim, 2014). Parijoto dipercaya oleh masyarakat di daerah Gunung

Merapi dapat meningkatkan kesuburan janin dan kesehatan ibu hamil (Anggana,

2011).

7


2.2 Mikroba Endofit

2.2.1 Definisi

Endofit berasal dari bahasa Yunani, “endo” berarti di dalam dan “fit”

(phyte) berarti tumbuhan (Agusta, 2009). Mikroba endofit adalah mikroba yang

hidup di dalam jaringan tanaman pada periode tertentu dan mampu hidup dengan

membentuk koloni dalam jaringan tanaman tanpa membahayakan inangnya.

Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikroba endofit yang

mampu menghasilkan senyawa biologi atau senyawa metabolit sekunder yang

diduga sebagai akibat koevolusi atau transfer genetik (genetic recombination) dari

tanaman inangnya ke dalam mikroba endofit (Tan RX et al., 2001 dalam Radji,

2005). Endofit mampu hidup pada variasi suhu yang luas, dengan suhu optimum

pada suhu 20°C sampai 26°C (Labeda, 1990).

Mikroba endofit terdiri atas bakteri, kapang, dan aktinomicetes, namun

yang paling banyak ditemukan adalah golongan kapang dan aktinomicetes.

Mikroba endofit mendapat perhatian besar karena dapat menghasilkan senyawa

bioaktif yang dapat berpotensi sebagai antibiotik disebabkan karena aktivitasnya

yang besar dalam membunuh beberapa mikroba patogen. Disamping itu, mikroba

endofit juga mampu menghasilkan senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai

antikanker, antimalaria, anti HIV, antioksidan, dan sebagainya (Prihatiningtias,

2006).

Mikroba endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas

yang lebih besar dibandingkan dengan aktivitas tumbuhan inangnya. Dilihat dari

segi efisiensi, hal ini menguntungkan, karena siklus hidup mikroba endofit lebih

singkat dibandingkan siklus hidup tumbuhan inangnya, sehingga dapat

menghemat waktu yang dibutuhkan untuk mendapatkan senyawa tersebut. Jumlah

senyawa yang diproduksi dapat dibuat dengan skala besar dengan menggunakan

proses fermentasi. Disamping itu, keuntungan lain yang diperoleh, yaitu menjaga

kelestarian tumbuhan obat, terutama yang termasuk jenis tumbuhan langka, agar

tidak dieksploitasi secara terus menerus yang mengakibatkan kepunahan

(Prihatiningtias, 2006).

8


2.2.2 Isolasi Kapang Endofit

Prosedur untuk mengisolasi kapang endofit pada umumnya relatif mudah.

Salah satu hal yang penting dalam mengisolasi kapang endofit adalah

mempertahankan kesegaran sampel. Bila sampel disimpan dalam waktu yang

cukup lama, akan terjadi kematian jaringan. Meskipun demikian, masih

memungkinkan untuk mengisolasi sejumlah kapang endofit dari jaringan yang

telah layu setelah penyimpanan beku (Freezing) dalam waktu lebih dari satu tahun

(Wahyudi, 1997).

Isolasi dimulai dengan melakukan sterilisasi permukaan. Pada umumnya,

untuk sterilisasi permukaan organ tumbuhan dengan cara merendamnya dalam

alkohol (70%-95%). Akan tetapi, kemampuan alkohol untuk mensterilkan

permukaan organ tumbuhan tersebut mempunyai spektrum yang sempit atau

sangat terbatas sehingga perlu dikombinasi dengan bahan kimia lainnya, dan

biasanya sering dikombinasikan dengan 5,3% larutan Natrium Hipoklorit

(NaOCl). Di samping itu, bahan kimia yang bersifat sebagai oksidan, seperti H2O2

(3%) dan KMnO4 (2%) juga dapat dipakai untuk mensterilkan permukaan organ

tumbuhan (Zang et al., 2006). Etanol merupakan derivat alkohol yang efektif dan

dapat diandalkan untuk sterilisasi dan disinfeksi. Natrium Hipoklorit adalah klorin

yang paling banyak dipakai untuk disinfeksi dan menghilangkan bau, karena

bersifat relatif tidak membahayakan bagi jaringan manusia, mudah ditangani,

tidak berwarna dan tidak mewarnai, meskipun dapat memudarkan warna (Block

SS, 1977 dan Chatim et al., 1993).

Sterilisasi dilakukan dengan cara mencuci tanaman yang masih segar

dengan air mengalir selama 10 menit. Setiap sampel dipotong menjadi potongan-

potongan kecil berukuran 1 cm, selanjutnya disterilisasi dengan cara

merendamkan ke dalam etanol dan NaOCl dan terakhir dibilas kembali dengan

etanol selama setengah menit (Wahyudi, 1997).

Proses isolasi selanjutnya dilakukan dengan metode tanam langsung yaitu

setelah perendaman berakhir pada etanol selama setengah menit, potongan sampel

dibiarkan kering di udara dalam Laminar Air Flow dan diletakkan di atas kertas

tisu steril. Potongan-potongan kecil tersebut kemudian diletakkan di atas media

seperti Corn Meal Malt Agar (CMMA) dan Nutrient Agar (NA) dengan posisi

9


permukaan belahan menempel pada agar medium. Tiap cawan petri bersisi 4

potongan (1, 2, 3 dan 4) (Wahyudi, 1997).

Pemilihan medium tumbuh pada tahap pertama isolasi mungkin juga akan

sangat berpengaruh terhadap jumlah dan jenis kapang endofit yang akan terisolasi.

Sebagai contoh, pada proses isolasi kapang endofit dari tanaman teh yang

menggunakan medium Corn Meal Malt Agar (CMMA) dengan antibiotik

kloramfenikol telah dilaporkan hanya 6 jenis kapang endofit yang berhasil

diperoleh (Agusta et al., 2006). Namun, pada proses isolasi kapang endofit dari

tanaman teh dengan menggunakan medium dari agar tanpa penambahan antibiotik

memberikan dua jenis kapang yang sama sekali berbeda dengan yang diperoleh

dari proses isolasi dengan medium CMMA dan antibiotik. Pada medium agar,

khamir memperlihatkan pertumbuhan yang lambat sehingga dapat digunakan

untuk purifikasi isolat kapang filamen yang tercampur dengan khamir (Agusta et

al., 2006).

Pembiakan isolat mikroba endofit membutuhkan waktu yang bervariasi.

Isolasi kapang endofit membutuhkan waktu yang relatif lama kurang lebih 5

sampai 21 hari diinkubasi pada suhu ruang (27-29°C). Waktu inkubasi yang

cukup lama ini disebabkan bahwa kebanyakan kapang endofit mempunyai sifat

sebagai mikroorganisme lambat tumbuh (Wahyudi, 1997).

Zhang et al., (2006) merekomendasikan bahwa kapang endofit akan mulai

tumbuh pada minggu kedua setelah inkubasi dan kapang yang tumbuh sebelum

waktu tersebut kemungkinan besar adalah kontaminan. Namun, perlu diingat

bahwa medium yang digunakan selama proses isolasi adalah medium yang kaya

akan nutrisi sehingga sangat mungkin untuk mempercepat pertumbuhan kapang

endofit. Pada medium yang kaya akan nutrisi seperti CMMA dan PDA, pada hari

ketiga atau keempat sudah terlihat adanya kapang endofit yang tumbuh.

Sementara pada medium yang relatif miskin nutrien, seperti medium agar,

membutuhkan waktu 1 sampai 2 minggu untuk pemunculan koloni kapang. Untuk

itu, cara yang paling rasional untuk mengidentifikasi kontaminan adalah dengan

melakukan isolasi kapang endofit berulang kali (paling tidak 3 kali) (Agusta et al.,

2006).

10


2.2.3 Fermentasi Mikroba Endofit

Fermentasi adalah proses yang memanfaatkan kemampuan mikroba untuk

menghasilkan metabolit primer dan metabolit sekunder dalam suatu lingkungan

yang dikendalikan. Pengendalian dilakukan dengan pengaturan kondisi medium,

komposisi medium, suplai O2 dan agitasi. Pada fermentasi terjadi perubahan

struktur kimia dan bahan-bahan organik dengan memanfaatkan agen-agen

biologis terutama enzim sebagai bioakatalis. Produk fermentasi dapat digolongkan

menjadi 4 jenis yaitu : produk biomassa, produk enzim, produk metabolit, dan

produk transformasi (Judoamidjojo et al., 1990).

Dalam bioproses, fermentasi memegang peranan penting karena

merupakan proses utama bagi produksi senyawa-senyawa berbasis biologi.

Senyawa yang dihasilkan merupakan hasil metabolit dari mikroba seperti

antibiotik, asam-asam organik, aldehid, dan alkohol. Medium yang digunakan

dalam fermentasi harus memenuhi syarat seperti: mengandung nutrisi yang

dibutuhkan bagi pertumbuhan sel mikroba, mengandung nutrisi yang dapat

digunakan sebagai sumber energi bagi mikroba, tidak mengandung zat yang dapat

membahayakan pertumbuhan sel, dan tidak terdapat kontaminan yang dapat

meningkatkan persaingan dalam penggunaan substrat (Judoamidjojo et al., 1990).

2.2.4 Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, diperoleh beberapa kapang

endofit yang menghasilkan antimikroba. Fisher (1989) menyatakan bahwa lebih

dari 30% kapang endofit yang berhasil diisolasi memiliki aktivitas terhadap

bakteri dan fungi patogen.

Banyak kelompok kapang endofit yang mampu memproduksi senyawa

antibiotik yang aktif melawan bakteri maupun fungi patogen terhadap manusia,

hewan dan tumbuhan, terutama dari genus Coniothrium dan Microsphaeropsis

(Petrini, 1992). Penelitian Dreyfuss et al., (1986) dalam Widyati Prihatiningtias

(2006), menunjukkan aktivitas yang tinggi dari penisilin N, sporiofungin A, B

serta C yang dihasilkan oleh isolat-isolat endofit Pleurophomopsis sp. dan

Cryptosporiopsis sp. yang diisolasi dari tumbuhan Cardamin heptaphylla. Kapang

endofit yang diisolasi dari tanaman obat sambung nyawa (Gynura procumbens)

11


dapat menghambat pertumbuhan Candida albicans dan Bacillus subtilis

(Simartama et al., 2007).

Cryptocandin adalah senyawa kapang yang dihasilkan oleh mikroba

endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari tanaman obat

Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang patogen terhadap

manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton sp. Pestalotiopsis micrispora

merupakan mikroba endofit yang paling sering ditemukan di tanaman hutan

lindung di seluruh dunia. Endofit ini menghasilkan metabolit sekunder ambuic

acid yang berkhasiat sebagai antifungi (Li, JY et al., 2001 dalam Radji, 2005).

Phomopsichalasin merupakan metabolit yang diisolasi dari mikroba endofit

Phomopsis sp., berkhasiat sebagai antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella

enterica, Staphylococcus aureus, dan juga dapat menghambat pertumbuhan fungi

Candida tropicalis (Horn WS et al., 1995 dalam Radji, 2005).

2.3 Antimikroba

2.3.1 Definisi

Antimikroba merupakan obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba

yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba

penyebab infeksi pada manusia harus memiliki toksisitas selektif setinggi

mungkin. Artinya, obat tersebut haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba,

tetapi relatif tidak toksik untuk hospes (Setiabudy, 2007).

Antibiotik adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba, terutama fungi,

yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Banyak antibiotik

dewasa ini dibuat secara semisintetik atau sintetik penuh. Namun, antimikroba

sintetik yang tidak diturunkan dari produk mikroba (misalnya sulfonamid dan

kuinolon) juga sering digolongkan sebagai antibotik (Setiabudy, 2007).

2.3.2. Antibakteri

Antibakteri adalah zat aktif yang memiliki efek menghambat atau

mematikan bakteri, sedangkan toksisitasnya relatif lebih kecil pada manusia.

12


Berdasarkan sifat toksisitas selektifnya, antibakteri terbagi menjadi

(Ganiswarna et al., 1995) :

a. Bakteriostatik : yaitu zat yang hanya menghambat pertumbuhan bakteri.

b. Bakterisidal : yaitu zat yang dapat membunuh bakteri.

Berdasarkan spektrumnya, antibakteri terbagi menjadi (Ganiswarna et al.,

1995) :

a. Spektrum luas : zat yang aktif terhadap bakteri Gram negatif dan Gram

positif. Contohnya adalah tetrasiklin dan kloramfenikol.

b. Spektrum sempit : zat yang aktif terhadap Gram negatif atau Gram positif

saja. Contonya adalah penisilin yang aktif terhadap bakteri Gram positif.

Kadar minimal yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba

atau membunuhnya, masing-masing dikenal dengan kadar hambat minimal

(KHM) dan kadar bunuh minimal (KBM). Antimikroba tertentu aktivitasnya

dapat meningkat dari bakteriostatik menjadi bakterisidal bila kadar

antimikrobanya ditingkatkan melebihi KHM (Setiabudy, 2007).

Berdasarkan mekanisme kerjanya, antibakteri dibagi dalam lima kelompok

(Setiabudy, 2007), yaitu :

1. Antibakteri yang menggangu metabolisme sel bakteri

Bakteri membutuhkan asam folat untuk kelangsungan hidupnya.

Bakteri mensintesis sendiri asam folat dari asam amino benzoat (PABA)

untuk kebutuhan hidupnya. Apabila antibakteri menang bersaing dengan

PABA, maka terbentuk analog asam folat yang nonfungsional. Akibatnya

kehidupan bakteri akan terganggu. Antibiotik yang termasuk dalam kelompok

ini adalah sulfonamid, trimetropin, asam p-aminosalisilat (PAS) dan sulfon.

2. Antibakteri yang menghambat sintesis dinding sel bakteri

Antibakteri menghambat reaksi dalam proses pembentukan dinding sel.

Hal ini disebabkan karena tekanan osmotik dalam sel bakteri lebih tinggi

daripada di luar sel, maka kerusakan dinding sel bakteri akan menyebabkan

terjadinya lisis yang merupakan dasar efek bakterisidal pada bakteri yang

peka. Antibiotik yang termasuk dalam kelompok ini adalah penisilin,

sefalosporin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin.

13


3. Antibakteri yang mengganggu keutuhan membran sel bakteri

Antibakteri dapat merusak membran sel setelah bereaksi dengan fosfat

pada fosfolipid membran sel mikroba. Antibakteri yang mengubah tegangan

permukaan, dapat merusak permeabilitas selektif dari membran sel bakteri.

Kerusakan membran sel menyebabkan keluarnya berbagai komponen penting

dari dalam sel bakteri, yaitu protein, asam nukleat, nukleotida, dan lain-lain.

Antibiotik yang termasuk dalam kelompok ini adalah polimiksin, golongan

polien, serta berbagai antimikroba kemoteurapetik.

4. Antibakteri yang menghambat sintesis protein sel bakteri

Untuk kehidupannya, sel bakteri perlu mensintesis berbagai protein.

Sintesis protein bakteri berlangsung di ribosom, dengan bantuan mRNA dan

tRNA. Pada bakteri, ribosom terdiri dari 2 subunit berdasarkan konstanta

sedimentasi dinyatakan sebagai ribosom 30S dan 50S. Untuk berfungsi pada

sintesis protein, kedua komponen ini akan bersatu pada pangkal rantai mRNA

menjadi ribosom 70S. Antibiotik yang termasuk dalam golongan ini adalah

aminoglikosida, makrolida, linkomisin, tetrasiklin dan kloramfenikol.

Penghambatan sintesis terjadi dengan berbagai cara, diantaranya :

a. Antibakteri berikatan dengan komponen ribosom 30S dan menyebabkan

kode pada mRNA salah dibaca oleh tRNA pada waktu sintesis protein.

Akibatnya akan terbentuk protein yang abnormal.

b. Antibakteri berikatan dengan ribosom 50S dan menghambat translokasi

kompleks tRNA-peptida dari lokasi asam amino ke lokasi peptida.

Akibatnya, rantai polipeptida tidak dapat diperpanjang karena lokasi asam

amino tidak dapat menerima kompleks tRNA-asam amino yang baru.

c. Antibakteri berikatan dengan ribosom 30S dan menghalangi masuknya

kompleks tRNA-asam amino pada lokasi asam amino.

d. Antibakteri berikatan dengan ribosom 50S dan menghambat pengikatan

asam amino baru pada rantai polipeptida oleh enzim peptidil transferase.

5. Antibakteri yang menghambat sintesis asam nukleat sel bakteri

Antibakteri berikatan dengan enzim polimerasi-RNA sehingga

menghambat sintesis RNA dan DNA. Selain itu, antibakteri juga

menghambat enzim DNA girase pada bakteri yang fungsinya menata

14


kromosom yang sangat panjang menjadi bentuk spiral hingga bisa muat

dalam sel bakteri yang kecil. Antibiotik yang termasuk dalam kelompok ini

adalah rifampisin dan golongan kuinolon.

2.4 Uji Aktivitas Antimikroba

Metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi aktivitas antimikroba

dalam produk alam terbagi menjadi dua kelompok, yaitu metode difusi dan dilusi.

Metode difusi dikenal dengan teknik kualitatif karena metode ini hanya

memberikan informasi mengenai ada atau tidaknya aktivitas antimikroba dalam

suatu sampel uji. Sedangkan metode dilusi merupakan teknik kuantitatif yang

dapat digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Mininum (KHM) dan

Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) (Vanden & Vlientink, 1991 dalam Valgas

et al., 2007).

2.4.1 Metode Difusi

Pada metode ini, zat antimikroba yang akan ditentukan aktivitasnya

berdifusi pada lempeng agar yang telah diinokulasi mikroba uji. Dasar

pengamatannya adalah dengan melihat ada atau tidaknya zona hambat

pertumbuhan mikroba (Lorian, 1980). Metode difusi dibagi menjadi tiga

kelompok, yaitu :

a. Metode disc diffusion (tes Kirby & Bauer)/Metode cakram

Pada metode ini, kertas filter cakram (dengan diameter ± 6 mm), berisi

senyawa uji yang ditempatkan pada permukaan yang sebelumnya telah

diinokulasi dengan mikroba uji. Kemudian, diinkubasi pada suhu kamar (27-

29°C) selama 1 sampai 2 minggu untuk fungi dan pada suhu 37°C selama 18-

24 jam untuk bakteri. Agen antimikroba akan berdifusi ke dalam agar dan

menghambat pertumbuhan mikroba uji. Kemudian ada atau tidaknya zona

hambat dapat diamati di sekeliling cakram (Lorian, 1980).

Pembacaan hasil percobaan didasarkan atas besarnya zona hambat yang

terbentuk dan dinyatakan dalam tiga kategori (Lorian, 1980) :

1. Zona hambat total : bila zona hambat yang terbentuk disekitar cakram

terlihat jernih.

15


2. Zona hambat parsial : bila di dalam zona hambat yang terbentuk masih

terlihat adanya pertumbuhan beberapa koloni baru.

3. Zona hambat nol : bila tidak ada zona hambat yang terbentuk di sekitar

cakram.

Kriteria kekuatan daya hambat adalah sebagai berikut (Davis dan Stout,

1971) :

1. Sangat kuat (zona hambat > 20 mm)

2. Kuat (zona hambat 10-20 mm)

3. Sedang (zona hambat 5-10 mm)

4. Lemah (zona hambat < 5 mm)

b. Ditch-plate technique/Metode parit

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan

pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri

pada bagian tengah secara membujur. Mikroba uji (maksimum 6 macam)

digoreskan ke arah parit yang berisi agen antimikroba (Pratiwi, 2008). Lalu,

diinkubasi pada suhu kamar (27-29°C) selama 1 sampai 2 minggu untuk

fungi dan pada suhu 37°C selama 18-24 jam untuk bakteri. Kemudian,

diamati ada atau tidaknya zona hambat terhadap pertumbuhan mikroba uji

disekeliling parit (Lorian, 1980).

c. Cup-plate technique/Metode lubang atau cawan

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat lubang

pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme. Pada lubang

tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji (Pratiwi, 2008). Lalu,

diinkubasi pada suhu kamar (27-29°C) selama 1 sampai 2 minggu untuk

fungi dan pada suhu 37°C selama 18-24 jam untuk bakteri. Kemudian,

diamati ada atau tidaknya zona hambat terhadap pertumbuhan mikroba uji

disekeliling lubang (Lorian, 1980).

2.4.2 Metode Dilusi

Pada metode ini zat antimikroba yang akan diuji dicampur dengan media

yang kemudian diinokulasi dengan mikroba. Dasar pengamatannya adalah dengan

melihat tumbuh atau tidaknya mikroba di dalam media. Aktivitas zat antimikroba

16


ditentukan sebagai konsentrasi hambat minimal (KHM) dan konsentrasi bunuh

minimal (KBM) (Lorian, 1980).

Metode ini dilakukan dengan beberapa cara :

a. Metode dilusi cair

Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen

antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji.

Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa

adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang

ditetapkan sebagai KHM selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa

penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba dan diinkubasi selama

18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah diinkubasi ditetapkan

sebagai KBM (Pratiwi, 2008)

b. Metode dilusi padat

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan

media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen

antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji

(Pratiwi, 2008).

2.5 Kapang

Kapang adalah organisme kemoheterotrof yang memerlukan senyawa

organik untuk nutrisinya (sumber karbon dan energi). Bila sumber nutrisi tersebut

diperoleh dari bahan organik mati, maka kapang tersebut bersifat saprofit. Kapang

saprofit mendekomposisi sisa-sisa tumbuhan dan hewan yang kompleks dan

menguraikannya menjadi zat yang lebih sederhana. Dalam hal ini, kapang bersifat

menguntungkan sebagai elemen daur ulang yang vital (Pratiwi, 2008).

Beberapa kapang juga bersifat menguntungkan karena merupakan bahan

makanan, misalnya cendawan (mushroom), dan beberapa kapang dapat

bersimbiosis dengan akar tanaman tertentu yang membantu penyerapan air dan

mineral tanah oleh akar. Simbiosis ini dikenal dengan nama mikoriza. Beberapa

kapang dapat bersifat parasit dengan memperoleh senyawa organik dari

mikroorganisme hidup. Dalam hal ini, kapang bersifat merugikan karena

menimbulkan penyakit pada manusia, hewan, maupun tanaman (Pratiwi, 2008).

17


2.5.1 Identifikasi Kapang Endofit

Identifikasi kapang dilakukan dengan mengamati beberapa karakter

morfologi baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis. Pengamatan

makroskopis meliputi warna dan permukaan koloni (granular, seperti tepung

menggunung, licin), tekstur, zonasi, daerah tumbuh, garis-garis radial dan

konsentris, warna balik koloni (reverse color) dan tetes eksudat (Ilyas, 2007).

Pengamatan secara mikroskopis meliputi sekat hifa (bersekat atau tidak

bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak bercabang), warna hifa (hialin,

transparan, atau gelap), ada tidaknya konidia dan bentuk konidia (bulat, lonjong,

berantai atau tidak beraturan) (Ariyono, 2014).

2.6 Bakteri Gram Positif dan Negatif

Bakteri merupakan sel prokariotik yang khas, uniseluler (sel tunggal) dan

tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Sel-

selnya secara khas, berbentuk bola seperti batang atau spiral. Bakteri mempunyai

diameter sekitar 0,5-1,0 µm dan panjangnya 1,5 sampai 2,5 µm. Reproduksi

terutama dengan pembelahan biner sederhana, yaitu proses aseksual. Beberapa

bakteri dapat tumbuh pada suhu 0°C, ada juga yang tumbuh dengan baik pada

sumber air panas yang suhunya 90°C atau lebih. Kebanyakan bakteri tumbuh pada

berbagai suhu di antara kedua suhu esktrim ini (Pelczar et al., 2008).

Berdasarkan komposisi dinding selnya, bakteri dibagi menjadi dua

golongan, yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram

negatif mengandung lipid, lemak atau susbtansi seperti lemak dalam persentase

lebih tinggi daripada yang dikandung bakteri Gram positif. Dinding sel bakteri

Gram negatif juga lebih tipis daripada sel bakteri Gram positif (Pelczar et al.,

2008).

18


Tabel 2.1 Ciri bakteri Gram positif dan Gram negatif (Pelczar et al., 2008)

Ciri Perbedaan Relatif

Gram positif Gram negatif

Struktur dinding sel Tebal (15-80 mm),

berlapis tunggal

Tipis (10-15 mm),

berlapis tiga (multi)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah

(1-4%). Peptidoglikan

ada sebagai lapisan

tunggak, komponen

utama merupakan lebih

dari 50% berat kering

pada beberapa sel bakteri.

Terdapat asam teikoat

Kandungan lipid tinggi

(11-22%). Peptidoglikan

ada didalam lapisan kaku

sebelah dalam;

jumlahnya sedikit,

merupakan sekitar 10%

berat kering. Tidak

terdapat asam teikoat

Kerentanan terhadap

penisilin

Lebih rentan Kurang rentan

Persyaratan nutrisi Relatif rumit pada banyak

spesies

Relatif sederhana

Resistensi terhadap

gangguan fisik

Lebih resisten Kurang resisten

2.7 Bakteri Uji

Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan

Bacillus subtilis ATCC 6633 yang merupakan bakteri Gram positif dan

Escherichia coli ATCC 8739 dan Shigella dysenteriae ATCC 13313 yang

merupakan bakteri Gram negatif.

a. Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif dengan klasifikasi

sebagai berikut (Depkes RI, 1989 dan Syahrurahman et al., 1992) :

Kingdom : Prokaryota

Divisi : Bacteria

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

19


Famili : Micrococaceae

Genus : Staphylococcus

Spesies : Staphylococcus aureus

Morfologi bakteri ini selnya berbentuk bulat (kokus) dengan diameter

antara 0,8-1,0 µm tunggal atau bepasangan, tidak bergerak dan tidak berspora.

Suhu pertumbuhan optimumnya adalah 35°C dengan pH optimum 7,4.

Pertumbuhan terbaik pada suasana aerob fakultatif. Bakteri ini sering ditemukan

di tanah, air tawar, dan selaput lendir pada binatang berdarah panas termasuk

manusia (Sleigh et al., 1994 dan Gibson JM, 1996).

Beberapa Staphylococcus tergolong flora normal pada kulit dan selaput

lendir manusia. Staphylococcus aureus dapat ditemukan pada kulit, saluran

pencernaan, udara, makanan, air, dan pakaian yang terkontaminasi. Bakteri ini

mudah tumbuh pada kulit yang mengalami peradangan, kulit yang mengalami

luka yang mengarah pada infeksi kulit dan proses-proses bernanah lainnya. Pada

saluran pernafasan dapat menyebabkan infeksi intra abdomen yang dapat timbul

karena komplikasi pasca bedah. Selain itu, Staphylococcus aureus dapat

menyebabkan infeksi traktus urinarius dan infeksi traktus genetali pada wanita

(Salle, 1961).

b. Bacillus subtilis

Bacillus subtilis adalah bakteri aerobik Gram positif berbentuk batang dan

memproduksi endospora dengan klasifikasi sebagai berikut (Singelton et al.,

1981) :


Divisi : Bacteria

Kelas : Shizomycetes


Familia : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis

Bakteri ini merupakan spesies basili yang dapat bergerak, menghasilkan

enzim katalase, koloni pada media agar (setelah 24 jam pada 37°C) berbentuk

20


lingkaran tidak rata, kekuningan, tidak mengkilap, berdiameter sampai 5 mm.

Bakteri ini dapat tumbuh pada agar darah membentuk zona hemolisis. Dapat juga

tumbuh pada larutan kaldu dan media lain. Bakteri ini tidak membuat toksin

apapun namun kadang dapat membuat hemolisis yang dapat larut. Bakteri ini

bersifat patogen, menyebabkan infeksi pada telur dan dapat mencemari botol

transfusi darah sehingga melisiskan sel darah (Singelton et al., 1981).

c. Escherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri Gram negatif dengan klasifikasi sebagai

berikut (Singelton et al., 1981) :


Divisi : Bacteria



Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli biasanya tumbuh berpasang-pasangan atau menyendiri.

Mikroba ini kebanyakan dapat bergerak dan kadang membentuk rantai-rantai

koloni. Koloni pada nutrisi agar (setelah 24 jam pada temperatur 37°C) biasanya

berbentuk bulat, berdiameter 2 sampai 3 mm, berwarna keputihan dengan

permukaan mengkilat. Koloni Escherichia coli terlihat seperti tepung ketika diuji

dengan sengkelit/loop. Kebanyakan Escherichia coli dapat memfermentasi

laktosa, mannitol, dan karbohidrat lain (Singelton et al., 1981).

Spesies ini adalah satu-satunya anggota genus Escherichia. Escherichia

coli terdapat pada saluran pencernaan manusia dan binatang, dapat pula

ditemukan di sungai, danau, tanah dan tempat lain yang telah terkontaminasi

feses. Escherichia coli dapat memproduksi endotoksin sehingga dapat

menyebabkan penyakit saluran urin, gangguan pencernaan seperti diare,

pneumonia, dan meningitis. Namun sebagai bagian dari flora normal saluran

penceranaan, Escherichia coli berperan penting untuk pencernaan makanan

21


dengan memproduksi vitamin K dan materi-materi yang tidak tercernakan di usus

besar (Singelton et al., 1981 dan Anonim, 2014).

Escherichia coli adalah bakteri yang banyak ditemukan di dalam usus

besar manusia sebagai flora normal. Sifatnya unik karena dapat menyebabkan

infeksi primer pada usus misalnya diare pada anak dan travelers diarrhea, serta

memiliki kemampuan menimbulkan infeksi pada jaringan tubuh yang lain di luar

usus (Gibson JM, 1996). Tempat yang paling sering terkena infeksi Escherichia

coli adalah saluran kemih, saluran empedu, dan tempat-tempat lain di rongga

perut (Jawetz et al., 2011). Bakteri ini juga menghasilkan enterotoksin penyebab

diare. Escherichia coli memproduksi enterotoksin yang tahan panas dan dapat

menyebabkan diare yang ringan, sedangkan enterotoksin yang tidak tahan panas

dapat menyebabkan sekresi air dan klorida ke dalam lumen usus dan menghambat

reabsorbsi natrium (Volk dan Wheeler, 1990).

d. Shigella dysenteriae

Shigella dysenteriae adalah bakteri Gram negatif dengan klasifikasi

sebagai berikut (Singelton et al., 1981) :


Divisi : Bacteria



Familia : Enterobacteriaceae

Genus : Shigella

Spesies : Shigella dysenteriae

Shigella dysenteriae merupakan bakteri berbentuk batang pendek, tumbuh

baik pada suasana aerob dan fakultatif anaerob, tidak dapat bergerak, tidak

berkapsul, tidak berflagel, tidak membentuk spora, dan bersifat patogen pada

pencernaan. Koloni bakteri berbentuk bulat, transparan dengan pinggir utuh, dan

mencapai diameter kira-kira 2 mm dalam media agar 24 jam (Jawetz et al., 2011).

Infeksi Shigella disebut dengan Shigellosis yang merupakan salah satu dari

gangguan yang ditandai dengan peradangan usus, terutama kolon dan disertai

dengan nyeri perut, dan buang air besar yang sering mengandung darah dan

22


lendir. Shigella dapat mengeluarkan lipopolisakarida yang bersifat toksik.

Enterotoksin yang dihasilkan bersifat termolabil dan menyebabkan penggumpalan

cairan di ileum. Enterotoksin bertanggung jawab atas terjadinya watery diarrhea

pada tahap dini dan timbul gejala klasik disentri basiler setelah bakteri

meninggalkan usus halus dan masuk ke usus besar. Shigella dysenteriae juga

memproduksi eksotoksin tidak tahan panas yang mempengaruhi saluran

pencernaan dan susunan saraf pusat. Pada manusia, eksotoksin juga dapat

menghambat absorpsi gula dan asam amino pada usus kecil (Jawetz et al., 2011).

2.8 Fase Pertumbuhan Mikroorganisme

Ada empat macam fase pertumbuhan mikroorganisme, yaitu fase lag, fase

log (fase eksponensial), fase stasioner, dan fase kematian. Fase lag, merupakan

fase adaptasi, yaitu fase penyesuaian mikroorganisme pada suatu lingkungan baru.

Ciri fase lag adalah tidak adanya peningkatan jumlah sel, yang ada hanyalah

peningkatan ukuran sel. Lama fase lag tergantung pada kondisi dan jumlah awal

mikroorganisme dan media pertumbuhan. Bila sel-sel mikroorganisme diambil

dari kultur yang sama sekali berlainan, maka yang sering terjadi adalah

mikroorganisme tersebut tidak mampu tumbuh dalam kultur (Pratiwi, 2008).

Fase log (fase eksponensial), merupakan fase dimana mikroorganisme

tumbuh dan membelah pada kecepatan maksimum, tergantung pada genetika

mikroorganisme, sifat media, dan kondisi pertumbuhan. Sel baru terbentuk

dengan laju konstan dan massa yang bertambah secara eksponensial. Hal yang

dapat menghambat laju pertumbuhan adalah bila satu atau lebih nutrisi dalam

kultur habis, sehingga hasil metabolisme yang bersifat racun akan tertimbun dan

menghambat pertumbuhan. Untuk organisme aerob, nutrisi yang membatasi

pertumbuhan biasanya adalah oksigen. Bila konsentrasi sel mikroorganisme

melebihi 1 x 107/mL, maka laju pertumbuhan akan berkurang, kecuali bila

oksigen dimasukkan secara paksa ke dalam kultur dengan cara pengadukan atau

penggojlokan (shaking). Bila konsentrasi sel mencapai 4-5 x 109/mL, laju

penyebaran oksigen tidak dapat memenuhi kebutuhan meskipun dalam kultur

tersebut diberikan udara yang cukup dan pertumbuhan akan diperlambat secara

progresif (Pratiwi, 2008).

23


Pada fase stasioner, pertumbuhan mikroorganisme berhenti dan terjadi

keseimbangan antara jumlah sel yang membelah dengan jumlah sel yang mati.

Pada fase ini terjadi akumulasi produk buangan yang toksik. Pada sebagian besar

kasus, pergantian sel terjadi dalam fase stasioner ini. Terdapat kehilangan sel yang

lambat karena kematian diimbangi oleh pembentukan sel-sel baru melalui

pertumbuhan dan pembelahan dengan nutrisi yang dilepaskan oleh sel-sel yang

mati karena mengalami lisis. Pada fase kematian, jumlah sel yang mati meningkat.

Faktor penyebabnya adalah ketidaktersediaan nutrisi dan akumulasi produk

buangan yang toksik (Pratiwi, 2008).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia

serta Laboratorium Mikrobiologi Pusat Lembaga Terpadu (PLT), Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta sejak bulan Januari hingga bulan Mei

2015.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri

(Normax), tabung reaksi (Pyrex), cover glass (Assistent), kaca objek (Sail Brand),

pipet tetes, pipet volumetrik, kaca arloji, labu erlenmeyer (Duran Schott), gelas

ukur (Ex 20°C MC YZ), gelas beker (Duran Schott), batang L, Laminar Air Flow

(LAF) (Minihelix II), spektrofotometer uv-vis, inkubator (France Etuves),

autoclave, oven (Memmert), shaker, timbangan analitik (Ogawa Seiki),

centrifuge, vortex, mikroskop cahaya (Olympus), hot plate, water bath, magnetic

stirrer, jarum ose, spatula, mikropipet dan tip (Mettler Toledo), tube, jangka

sorong, pinset, bunsen, gunting steril, kertas saring steril, kapas, kassa, indikator

pH, dan paper disc 6 mm dan 5,5 mm.

3.2.2 Bahan

3.2.2.1 Tanaman

Daun dari tanaman Parijoto (Medinilla speciosa Blume) diperoleh dari

Gunung Muria Desa Colo Kecamatan Dawe Kabupaten Kudus, Jawa tengah

diambil pada hari Senin, 12 Januari 2015. Bagian dari tanaman Parijoto diambil

bagian daunnya yang berwarna hijau muda, hijau tua, dan hijau kekuningan.

3.2.2.2 Bahan untuk Sterilisasi Permukaan

Air bersih yang mengalir, etanol 70%, natrium hipoklorit (NaOCl) 5,25%,

dan aquades steril.

25


3.2.2.3 Media Pertumbuhan Mikroba

Potato Dextrose Agar (Merck), Potato Dextrose Broth (Merck); Yeast

Extract (Merck); kalsium karbonat (CaCO3); Nutrient Agar (Merck); Nutrient

Broth (Merck); Mueller Hinton Agar (Merck).

3.2.2.4 Bakteri Uji

Bakteri uji diperoleh dari Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran,

Universitas Indonesia dan DIPA Pharmalab Intersains.

Bakteri : Gram positif : a. Staphylococcus aureus ATCC 6538

b. Bacillus subtilis ATCC 6633

Gram negatif : a. Escherichia coli ATCC 8739

b. Shigella dysenteriae ATCC 13313

3.2.2.5 Bahan Karakterisasi Kapang Endofit

Aquades steril.

3.2.2.6 Bahan Skrining Kapang Endofit dan Uji Antibakteri

NaCl 0,9%, cork borer, blank disc (cakram steril), cakram kloramfenikol,

dan aquades steril.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroba

a. Pembuatan Media PDA

Media PDA digunakan untuk isolasi dan pemurnian kapang endofit.

Ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram dan ditambahkan aquades sampai 1

liter. Media tersebut dipanaskan sampai mendidih di atas hot plate dan diaduk

dengan magnetic stirrer hingga homogen. Dilakukan sterilisasi dengan

autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C. Media dituang ke dalam cawan

petri masing-masing 10 mL, biarkan media memadat di dalam Laminar Air

Flow (Ramadhan, 2011) .

26


b. Pembuatan Media PDA Miring

Media PDA miring digunakan untuk pemurnian kapang endofit.

Ditimbang Potato Dextrose Agar 39 gram dan ditambahkan aquades sampai 1

liter. Media tersebut dipanaskan sampai mendidih di atas hot plate dan diaduk

dengan magnetic stirrer hingga homogen. Media dimasukkan ke dalam tabung

masing-masing 5 mL. Dilakukan sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit

pada suhu 121°C. Tabung diletakkan dalam posisi miring ± 45°, biarkan media

memadat di dalam Laminar Air Flow (Rustanti, 2007).

c. Pembuatan Media PDY Broth

Media PDY digunakan untuk fermentasi kapang endofit. Ditimbang Potato

Dextrose Broth 24 gram; Yeast Extract 2 gram; kalsium karbonat (CaCO3) 5

gram; dan ditambahkan aquades sampai 1 liter. Semua bahan kecuali kalsium

karbonat dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahkan aquades

hingga 1 liter, dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot plate.

Kalsium karbonat dimasukkan sedikit demi sedikit ke larutan media tersebut

hingga mencapai pH 6. Dilakukan sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit

pada suhu 121°C (Ramadhan, 2011).

d. Pembuatan Media NA

Media NA digunakan untuk seleksi kapang endofit yang berpotensi

sebagai antibakteri. Ditimbang Nutrient Agar sebanyak 20 gram dan

ditambahkan aquades sampai 1 liter. Media tersebut dipanaskan sampai

mendidih di atas hot plate dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer.

Dilakukan sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C.

Media dituang ke dalam cawan petri masing-masing 10 mL, biarkan memadat

di dalam Laminar Air Flow (Rustanti, 2007).

e. Pembuatan Media NA Miring

Media NA miring digunakan untuk peremajaan bakteri uji. Ditimbang

Nutrient Agar sebanyak 20 gram dan ditambahkan aquades sampai 1 liter.

Media tersebut dipanaskan sampai mendidih di atas hot plate dan

27


dihomogenkan dengan magnetic stirrer. Media dimasukkan ke dalam tabung

masing-masing 5 mL. Dilakukan sterilisasi dengan autoclave selama 15 menit

pada suhu 121°C. Letakkan tabung dalam posisi miring ± 45°, biarkan media

memadat di dalam Laminar Air Flow (Rustanti, 2007).

f. Pembuatan Media NB

Media NB digunakan untuk pembuatan kurva pertumbuhan bakteri uji.

Ditimbang Nutrient Broth sebanyak 8 gram dan ditambahkan aquades sampai 1

liter dalam labu Erlenmeyer. Media tersebut dipanaskan sampai mendidih di

atas hot plate dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer. Dilakukan sterilisasi

dengan autoclave selama 15 menit pada suhu 121°C di dalam Laminar Air

Flow (Himedia Laboratories, 2011).

g. Pembuatan Media MHA

Media MHA digunakan untuk uji aktivitas antibakteri. Ditimbang Mueller

Hinton Agar sebanyak 38 gram dan ditambahkan aquades sampai 1 liter. Media

tersebut dipanaskan sampai mendidih di atas hot plate dan dihomogenkan

dengan magnetic stirrer. Dilakukan sterilisasi dengan autoclave selama 15

menit pada suhu 121°C. Media dituang ke dalam cawan petri masing-masing

10 mL, biarkan memadat di dalam Laminar Air Flow (Laboratories Conda,

2014).

3.3.2 Isolasi Kapang Endofit Endofit

Isolasi kapang endofit dilakukan dengan teknik tanam langsung (direct

seed planting) potongan daun tanaman Parijoto yang sebelumnya dilakukan

proses sterilisasi permukaan daun terlebih dahulu (Ramadhan, 2011). Daun yang

masih segar dicuci dibawah air mengalir selama 10 menit. Daun tersebut

direndam ke dalam etanol 70% selama 1 menit kemudian langsung direndam

dalam NaOCl 5,25% selama 5 menit, lalu direndam kembali dengan etanol 70%

selama 30 detik. Lalu dibilas dengan air destilasi steril selama 3-5 detik (Radji et

al., 2011). Daun tersebut dikeringkan di atas kertas saring steril, biarkan kering di

udara (Rustanti, 2007). Daun dipotong menjadi bagian kecil dengan ukuran 1 x 1

28


cm2 (dikalibrasi dengan menggunakan penggaris) pada daun yang berwarna hijau

muda, hijau tua, dan hijau kekuningan dengan gunting yang telah disterilkan

(Ramadhan, 2011).

Potongan sampel ditempatkan pada cawan petri yang berisi media PDA.

Bagian daun tersebut harus menempel pada permukaan media. 2 cawan petri

masing-masing berisi 2 bagian potongan daun. Lalu media yang telah diinokulasi

dengan potongan daun diinkubasi pada suhu ruang selama 14 hari (Rustanti,

2007). Aquades bilasan terakhir diambil 1 mL dan diisolasi ke PDA lainnya,

perlakuan ini berfungsi sebagai kontrol sterilisasi permukaan daun (Ariyono et al.,

2014). Semua proses sterilisasi hingga proses isolasi dilakukan secara aseptis di

dalam Laminar Air Flow.

3.3.3 Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang tumbuh pada media isolasi PDA selanjutnya

dimurnikan ke dalam media PDA dengan cara menginokulasi sedikit hifa dengan

ose steril dari setiap koloni endofit yang berbeda. Lalu diinkubasi selama 5 hari

pada suhu ruang. Tiap koloni kapang dipindahkan ke dalam masing-masing satu

cawan PDA, dikerjakan secara duplo untuk working culture dan stock culture.

Tiap koloni kapang yang tumbuh pada media PDA dipindahkan ke agar miring

PDA dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 hari. Tiap isolat kapang dibuat

duplo pada agar miring, masing-masing sebagai working culture dan stock culture

(Rustanti, 2007).

3.3.4 Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Skrining kapang endofit yang berpotensi sebagai antibakteri dilakukan

dengan metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method). Bakteri uji yang

digunakan yaitu Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC

6633, Escherichia coli ATCC 8739, dan Shigella dysenteriae ATCC 13313.

Biakan bakteri uji dalam NB (biakan bakteri dibuat menggunakan kurva

pertumbuhan) dipipet 0,1 mL dimasukkan secara aseptis ke dalam media agar NA

yang telah memadat dan disebarkan secara merata dengan menggunakan batang L.

Isolat kapang endofit yang telah dimurnikan ke dalam medium PDA diambil

29


dengan sedotan steril atau cork borer dan dipindahkan ke media NA yang berisi

bakteri uji. Media diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Aktivitas antibakteri

kapang endofit dilihat dari zona hambat yang terbentuk (Elfina et al., 2014).

3.3.5 Karakterisasi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Karakterisasi kapang endofit dilakukan baik secara makroskopis maupun

mikroskopis. Pengamatan makroskopis dilakukan dengan mengamati bentuk dan

pertumbuhan koloni meliputi warna dan permukaan koloni (granular, seperti

tepung, menggunung, licin), tekstur, lingkaran-lingkaran konsentris (konsentris

atau tidak konsentris), warna balik koloni (reverse color), tetes eksudat, dan

diameter pertumbuhan koloni kapang (cm/hari) (Ilyas, 2007 dan Ariyono et al.,

2014).

Karakterisasi mikroskopik dilakukan dengan cara : bagian hifa kapang

dipindahkan ke bagian pinggir agar PDA ukuran 1 x 1 cm2 yang diletakkan pada

kaca objek dan ditutup dengan cover glass. Preparat tersebut ditempatkan pada

petri steril berisi sedikit aquades steril. Inkubasi selama 5 hari pada suhu ruang.

Setelah masa inkubasi selesai, diamati secara mikroskopik dengan mikroskop

cahaya perbesaran 400 kali (Yulia, 2005). Pengamatan mikroskopik meliputi

sekat hifa (bersekat atau tidak bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak

bercabang), bentuk dan ornamentasi spora (Ilyas, 2007 dan Ariyono et al., 2014).

3.3.6 Fermentasi Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Hasil metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit dapat

diperoleh melalui suatu proses fermentasi. Koloni kapang endofit yang telah

murni dan berpotensi sebagai antibakteri diambil menggunakan cork borer

sebanyak 3 potongan isolat kapang endofit dan diinokulasi ke dalam 200 mL

media PDY (Sinaga, 2009). Kemudian kultur tersebut diinkubasi secara kultur

diam (statis) pada suhu ruang selama 14 hari (Sugijanto et al., 2014). Suspensi

koloni kapang endofit yang diperoleh dari proses fermentasi disentrifugasi 3000

rpm selama 15 menit, pisahkan supernatan dari biomassa. Supernatan diambil

untuk digunakan sebagai larutan uji (Atika, 2007).

30


3.3.7 Cek kemurnian Bakteri Uji

Pengamatan bakteri uji dilakukan baik secara makroskopik dan

mikroskopik. Pengamatan makroskopik bakteri uji dilakukan dengan mengamati

morfologi dan pertumbuhan koloni, meliputi bentuk, warna, dan bagian tepi

koloni (Handayani, 2007).

Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan metode pewarnaan Gram.

Langkah metode pewarnaan Gram adalah sebagai berikut : preparat uji dioleskan

bakteri setipis mungkin, kemudian difiksasi dengan cara dilewatkan di atas nyala

api sebentar untuk melekatkan bakteri. Preparat tersebut diwarnai dengan larutan

kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir selama 5

detik. Kemudian diteteskan larutan lugol diatas preparat biarkan selama 1 menit,

dicuci kembali dengan air mengalir. Preparat kemudian diteteskan dengan etanol

96% selama 30 detik sampai tidak ada lagi zat warna lugol, lalu dicuci kembali

dengan air mengalir. Preparat diteteskan larutan safranin selama 10-30 detik,

kemudian dicuci kembali dengan air mengalir, dikeringkan dengan cara

diletakkan di atas kertas saring. Preparat diamati dengan mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali (Handayani, 2007). Pengamatan mikroskopis meliputi

bentuk dan warna bakteri. Jika sel berwarna ungu berarti bakteri uji termasuk

bakteri Gram positif. Tetapi jika sel berwarna merah berarti bakteri uji termasuk

bakteri Gram negatif.

3.3.8 Uji Aktivitas Antibakteri

3.3.8.1 Peremajaan Bakteri Uji

Bakteri uji, yaitu Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis

ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 8739, dan Shigella dysenteriae ATCC

13313 diremajakan pada medium NA miring. Bakteri uji diinokulasi sebanyak

satu ose ke dalam medium NA miring dan diinkubasi pada suhu 35°C selama 24

jam. Pengerjaan dilakukan dalam kondisi steril di dalam Laminar Air Flow (Radji,

2006).

31


3.3.8.2 Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Kurva pertumbuhan dibuat pada masing-masing bakteri uji untuk

menentukan fase log dari bakteri yang akan diuji, yaitu pada saat tercapainya

kecepatan pertumbuhan tertinggi. Biakan bakteri uji yang tumbuh pada agar

miring NA ditambahkan dengan 5 mL NaCl 0.9% steril. Sebanyak 0,1% (v/v)

suspensi bakteri dimasukkan ke dalam 100 mL medium NB kemudian dilakukan

perhitungan absorbansi pada panjang gelombang 600 nm. Kuvet dibersihkan

kemudian diukur absorban awal NB steril sebagai kontrol dan NB yang

mengandung bakteri pada menit ke-0 (t0). Setelah absorban awal ditentukan,

media NB diinkubasi pada pengocokan 120 rpm pada suhu 37°C. Setiap interval

30 menit dilakukan pengukuran absorban untuk mendapatkan kurva pertumbuhan

(Khotimah, 2010).

3.3.8.3 Uji Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi agar

dengan cakram atau dikenal sebagai metode Kirby-Baurer (Sinaga et al., 2009).

Biakan bakteri dalam NB dipipet 1 mL dimasukkan secara aseptis dalam cawan

petri steril kemudian ditambahkan media MHA sejumlah ± 10 mL. Suspensi

bakteri yang telah diberi agar dalam cawan petri digoyangkan perlahan (10 kali ke

kanan dan 10 kali ke kiri) untuk memperoleh suspensi bakteri yang tersebar

merata pada media agar (Rachmayani, 2008).

Larutan uji kapang endofit diambil sebanyak 20 µL dan larutan uji

diserapkan pada kertas cakram steril. Cakram dibiarkan kering, kemudian

diletakkan secara aseptis pada permukaan media yang telah berisi bakteri uji

(Atika, 2007).

Kontrol positif yang digunakan yaitu cakram antibiotik kloramfenikol.

Cakram antibiotik kloramfenikol diletakkan secara aseptis pada permukaan media

uji. Kontrol negatif yang digunakan yaitu aquades steril. Sebanyak 20 µL larutan

kontrol negatif diserapkan ke cakram steril. Cakram yang sudah diresapi larutan

kontrol negatif diletakkan secara aseptis pada permukaan media uji (Atika, 2007).

Media diinkubasi pada suhu 35°C selama 24 jam. Isolat kapang yang

memiliki aktivitas antibakteri akan menunjukkan zona hambat pada sekeliling

32


cakram. Zona hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong (Rachmayani,

2008).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil dan Pembahasan

4.1.1 Isolasi Kapang Endofit

Penelitian mikrobiologi yang bertema seleksi kapang endofit penghasil

senyawa antibakteri dilakukan untuk mengetahui aktivitas isolat kapang endofit

yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap beberapa bakteri patogen. Secara

garis besar ada 6 tahap dalam penelitian ini, yaitu isolasi kapang endofit,

pemurnian isolat kapang endofit, seleksi isolat kapang endofit yang berpotensi

sebagai antibakteri, karakterisasi, fermentasi, dan uji aktivitas antibakteri terhadap

beberapa bakteri patogen.

Kapang endofit diisolasi dari tanaman genus Medinilla speciosa Blume.

Tanaman ini diperoleh dari Gunung Muria, Desa Colo Kecamatan Dawe

Kabupaten Kudus, Jawa Tengah pada tanggal 12 Januari 2015. Pada penelitian

sebelumnya, ekstrak etil asetat buah Medinilla specciosa Blume pada konsentrasi

200 mg/mL, 100 mg/mL, 50 mg/mL, 25 mg/mL, dan 12,5 mempunyai aktivitas

dengan diameter hambat 17,67 mm; 16,3 mm; 15,67 mm; 14,67 mm; 13,33 mm

terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan 12,33 mm; 11,33 mm; 10,67 mm; 9

mm; 8 mm terhadap bakteri Escherichia coli (Niswah, 2014).

Medinilla speciosa Blume merupakan genus tanaman yang tumbuh pada

lingkungan yang khas serta memiliki sejarah etnobotani yang banyak digunakan

sebagai obat tradisional. Hal ini disebabkan Parijoto mengandung flavonoid,

tanin, saponin, kardenolid, terpenoid, dan glikosida dimana senyawa-senyawa

tersebut diketahui sebagai senyawa yang mempunyai aktivitas farmakologi

sebagai antibakteri. Secara empiris tanaman Parijoto digunakan sebagai obat

penyakit diare, sariawan, antiradang, dan antibakteri (Anonim, 2014).

Beberapa tumbuhan dapat mentransfer senyawa bioaktif yang dikandung

kepada mikroba endofit yang tumbuh dalam jaringan tanaman, sehingga mikroba

endofit tersebut mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang karakternya mirip

atau sama dengan inangnya. Hal ini disebabkan karena adanya koevolusi atau

34


transfer genetik dari tanaman inang ke dalam mikroba endofit (Tan & Zou, 2001

dalam Prihatiningtias, 2005).

Isolasi kapang endofit diawali dengan proses sterilisasi permukaan daun.

Sterilisasi permukaan daun bertujuan untuk mencegah kontaminasi endofit oleh

epifit, yaitu mikroorganisme yang hidup di permukaan daun. Teknik isolasi

diawali dengan menseleksi dan membersihkan daun uji yang digunakan. Sampel

daun tanaman Parijoto yang dipilih harus dalam kondisi sehat yang ditandai

dengan warna daun yang masih segar, sebab tanaman yang tidak sehat umumnya

dalam jaringannya telah terinfeksi dan didominasi oleh mikroba patogen dari luar

tanaman. Daun yang berwarna hijau muda, hijau tua, dan hijau kekuningan

kemudian dibersihkan dengan cara dicuci dengan air mengalir selama 10 menit.

Tujuan dicuci dengan air mengalir adalah untuk membersihkan daun dari kotoran

dan tanah yang menempel pada permukaan daun. Selanjutnya, daun disterilisasi

dengan etanol 70% selama 1 menit, NaOCl 5,25% selama 5 menit, etanol 70%

selama 30 detik dan terakhir dibilas dengan aquades steril selama 2-3 detik. Pada

penelitian ini menggunakan etanol 70% dan NaOCl 5,25% sebagai desinfektan

pada proses sterilisasi permukaan daun. Mekanisme kerja dari etanol 70% adalah

mendenaturasi protein dan melarutkan lemak pada membran protein mikroba

sehingga dapat merusak sel mikroba. Proses tersebut memerlukan air sehingga

etanol 70% menunjukkan aktivitas antimikroba yang lebih baik dibandingkan

etanol absolut (Siswandono, 1995 dalam Ramadhan, 2011). NaOCl merupakan zat

kimia yang termasuk ke dalam golongan halogen yang akan melepaskan radikal

klor yang mampu merusak membran dan protein mikroba (Pratiwi, 2008).

Pembilasan dengan aquades steril berfungsi sebagai kontrol sterilisasi permukaan

daun. Perlakuan kontrol sterilisasi permukaan daun ini berfungsi untuk

mengetahui dan menentukan apakah kapang yang tumbuh merupakan kapang

endofit atau bukan. Apabila pada media PDA kontrol sterilisasi permukaan daun

tumbuh mikroba yang morfologinya berbeda dengan isolat kapang endofit, maka

kapang yang tumbuh dari hasil isolasi merupakan kapang endofit yang berasal

dari tanaman.

Setelah sterilisasi permukaan daun, dilakukan isolasi kapang endofit dengan

metode direct plant (tanam langsung). Pada metode ini, bagian dalam dan

35


permukaan daun ditempelkan di atas media. 2 cawan petri masing-masing berisi 2

potongan daun yang diletakkan secara bersebrangan. Kemudian, potongan daun

yang telah diinokulasi pada media PDA diinkubasi selama 14 hari pada suhu

ruang. PDA merupakan media umum yang digunakan untuk menumbuhkan

kapang endofit sebagai media isolasi, dan media pemurnian kapang endofit yang

telah berhasil diisolasi. PDA merupakan media kaya akan nutrisi yang mudah

dicerna sehingga memudahkan untuk pertumbuhan kapang endofit (Ariyono et

al., 2014).

Koloni kapang endofit yang tumbuh adalah kapang endofit yang memiliki

ciri : waktu tumbuh lebih dari 5 hari, tumbuh disekitar sampel daun yang ditanam,

dan memiliki morfologi yang berbeda dengan mikroba yang tumbuh pada cawan

kontrol sterilisasi permukaan daun. Kontrol sterilisasi permukaan daun

menunjukkan bahwa sterilisasi permukaan daun yang dilakukan mampu

menghambat pertumbuhan mikroba patogen pada permukaan daun sehinggga

isolat yang diperoleh diyakini adalah kapang endofit.

Kapang endofit yang diisolasi tumbuh setelah 14 hari. Hal ini disebabkan

oleh kapang endofit yang bersifat lambat tumbuh (slow grower). Hanya kapang

endofit yang tumbuh di atas 5 hari yang diikutkan pada proses selanjutnya.

Kapang yang tumbuh dibawah 5 hari dikhawatirkan bukanlah endofit melainkan

kontaminan. Kapang endofit yang berhasil diisolasi lebih banyak dari daun yang

berwarna hijau kekuningan. Hal ini dikarenakan mikroba endofit tumbuh di

jaringan vaskular. Pada daun yang berwarna hijau kekuningan, jaringan vaskular

yang terbentuk sudah sempurna sehingga kemungkinan munculnya kapang

endofit lebih besar karena nutrien yang diperlukan untuk tumbuhnya kapang

endofit sudah cukup (Priharta, 2008).

Interaksi mikroba endofit dan tanaman merupakan suatu bentuk simbiosis.

Simbiosis antara tanaman dan mikroba endofit bersifat netral dan mutualisme

(Bacon dan Hinton, 2006 dalam Purwanto et al., 2014). Simbiosis mutualisme

antara mikroba endofit dengan tanaman, dalam hal ini mikroba endofit

mendapatkan nutrisi dari hasil metabolisme tanaman dan melindungi tanaman

dalam melawan serangan patogen, sedangkan tanaman mendapatkan derivat

36


nutrisi dan senyawa aktif yang diperlukan selama hidupnya (Simartama et al.,

2007 dalam Purwanto et al., 2014).

Berdasarkan hasil isolasi, didapatkan 20 isolat kapang endofit pada media

PDA yang terdiri dari 6 isolat dari daun berwarna hijau muda, 5 isolat dari daun

berwarna hijau tua, dan 9 isolat dari daun berwarna hijau kekuningan. Dari 20

isolat kapang endofit yang diperoleh dilakukan skrining terhadap antibakteri

untuk menseleksi isolat kapang yang berpotensi sebagai antibakteri.

Cawan 1

Cawan 2

Gambar 4.1 Hasil Isolasi Kapang Endofit Daun Medinilla speciosa Blume

pada Daun Berwarna Hijau Muda

Gambar 4.2 Kontrol Sterilisasi Permukaan Daun Kapang Endofit Medinilla

speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau Muda

37


Cawan 1

Cawan 2


pada Daun Berwarna Hijau Tua


speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau Tua


pada Daun Berwarna Hijau Kekuningan

38



speciosa Blume pada Daun Berwarna Hijau Kekuningan

4.1.2 Pemurnian Kapang Endofit

Pemurnian kultur kapang endofit bertujuan untuk mendapatkan kultur

kapang endofit yang murni. Pemurnian kapang endofit dilakukan pada media

PDA. Pemurnian ini dapat dilakukan secara terus menerus sampai didapatkan

koloni kapang endofit yang murni. Selanjutnya, koloni kapang endofit dimurnikan

kembali pada media PDA miring untuk mempersempit luas daerah pertumbuhan.

Pengamatan koloni kapang dilakukan dengan menggunakan kriteria bahwa

bentuk koloni kapang yang sama dianggap sebagai isolat yang sama dan

sebaliknya bentuk koloni kapang yang berbeda dipisahkan menjadi isolat yang

berbeda, sampai diperoleh isolat kapang murni yaitu isolat kapang yang hanya

mengandung satu bentuk morfologi koloni kapang yang sama.

4.1.3 Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai Antibakteri

Skrining isolat kapang endofit dilakukan secara kualitatif dengan

menggunakan mikroorganisme uniseluler yaitu bakteri (Abubakar, 2011). Bakteri

uji yang digunakan bersifat patogen yang terdiri dari Staphylococcus aureus dan

Bacillus subtilis yang merupakan bakteri Gram positif, serta Escherichia coli dan

Shigella dysenteriae yang merupakan bakteri Gram negatif. Skrining kapang

endofit bertujuan untuk menseleksi kapang endofit yang mempunyai aktivitas

antibakteri dengan cara mengamati ada tidaknya zona bening yang terbentuk.

39


Berikut adalah hasil skrining kapang endofit yang berpotensi sebagai

antibakteri :

Tabel 4.1 Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Bakteri Uji

No. Isolat Diameter zona hambat (mm)

S.aureus B.subtilis E.coli S.dysenteriae

1 DPU 1 9,71 - - -

2 DPU 2 - - - -

3 DPU 3 12,4 7 - -

4 DPU 4 - 8,7 20,13 -

5 DPU 5 - - - -

6 DPU 6 - - - -

7 DTE 1 9,65 - 10,66 -

8 DTE 2 - - - -

9 DTE 3 11,67 - 11,06 -

10 DTE 4 - - - -

11 DTE 5 - - - -

12 DTU 1 9,1 - 16,32 -

13 DTU 2 - - - -

14 DTU 3 - - - -

15 DTU 4 - 7,22 10, 55 6,9

16 DTU 5 - - - -

17 DTU 6 - 6,42 - 7,05

18 DTU 7 - 6,75 12,35 6,92

19 DTU 8 - - - -

20 DTU 9 - 6,72 mm 9,75 mm -

Keterangan :

DPU 1 : Isolat kapang endofit dari daun berwarna hijau muda (1)




40




DTE 1 : Isolat kapang endofit dari daun berwarna hijau tua (1)





DTU 1 : Isolat kapang endofit dari daun berwarna hijau kekuningan (1)









Dari proses seleksi diperoleh 10 isolat kapang endofit yang berpotensi

sebagai antibakteri yang ditandai dengan terbentuknya zona bening. Isolat DPU 1,

DPU 3, DTE 1, DTE 3 dan DTU 1 menunjukan zona bening terhadap

Staphylococcus aureus. Isolat DPU 3, DPU 4, DTU 4, DTU 6, DTU 7 dan DTU 9

menunjukkan zona bening terhadap Bacillus subtilis. Isolat DPU 4, DTE 1, DTE

3, DTU 1, DTU 4, DTU 7, dan DTU 9 menunjukkan zona bening terhadap

Escherichia coli. Isolat DTU 4, DTU 6, dan DTU 7 menunjukkan zona bening

terhadap Shigella dysenteriae.

41


Staphylococcus aureus Bacillus subtilis

Gambar 4.7 Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Staphylococcus aureus dan

Bacillus subtilis

DPU 1

DPU 3 DPU 4

DPU 2

DTU 9

DTE 1

DTU 6

DTU 7 DPU

5

DTU 7

DPU

6

DTU 7

DTU 8

DTE 2

42


Gambar 4.7 Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Staphylococcus aureus dan

Bacillus subtilis

DTU 1

DTU 4

DTE 3 DTE 4

DTE

5

DTE 3

DTU

3

DTE 3

DTU 2

DTU 5

43


Escherichia coli Shigella dysenteriae

Gambar 4.8 Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Escherichia coli dan

Shigella dysenteriae

DPU 1 DPU 3

DPU 4 DTE 1 DPU 1

DPU 3 DPU 4

DPU 2

DTU 7 DTU 6

DPU 5 DPU 6

DTE 1 DTU 9

DTU 8 DTE 2

44


Gambar 4.8 Hasil Skrining Kapang Endofit terhadap Escherichia coli dan

Shigella dysenteriae

4.1.4 Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi kapang endofit yang memiliki aktivitas antibakteri dilakukan

secara makroskopik dan mikroksopik terhadap 10 isolat yang diperoleh.

Karakterisasi makroskopik dilakukan dengan mengamati, bentuk dan

pertumbuhan koloni meliputi warna dan permukaan koloni (granular, seperti

tepung, menggunung, licin), tekstur, lingkaran-lingkaran konsentris (konsentris

atau tidak konsentris), warna balik koloni (reverse color), tetes eksudat, dan

diameter pertumbuhan koloni kapang (cm/hari) (Ilyas, 2007 dan Ariyono et al.,

2014). Sedangkan karakterisasi secara mikroskopik dilakukan dengan mengamati

sekat hifa (bersekat atau tidak bersekat), pertumbuhan hifa (bercabang atau tidak

bercabang), bentuk dan ornamentasi spora (Ilyas, 2007 dan Ariyono et al., 2014).

DTE 3 DTE 4

DTU 3 DTE 5

DTU 1

DTU 4

DTU 2

DTU 5

45


Berikut adalah hasil karakterisasi isolat-isolat kapang yang aktif sebagai

antibakteri :

a) Isolat DPU 1

Karakterisasi makroskopis meliputi, permukaan koloni berwarna putih

kehijauan tua, warna sebalik putih kehijauan tua, tekstur hifa seperti bulu dan

bagian tepi hifa tipis, memiliki spora berwarna hijau tua dan terdapat bintik

putih, dan diameter pertumbuhan koloni fungi 4,8 cm pada hari ke-5.

Karakterisasi mikroskopis meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan

koloni memiliki spora dengan bentuk bulat lonjong yang menempel pada hifa

koloni.

Makroskopik Mikroskopik

Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x

Gambar 4.9 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DPU 1

46


b) Isolat DPU 3


oranye, warna sebalik putih oranye, tekstur hifa tipis, memiliki spora berwarna

oranye, dan diameter pertumbuhan koloni fungi 2 cm pada hari ke-5.


koloni memiliki spora dengan bentuk lonjong seperti batang.


Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


c) Isolat DPU 4


kehijauan tua, warna sebalik kuning kehijauan, tekstur hifa tebal, memiliki

spora berwarna hijau tua yang menyebar pada media. Karakterisasi

mikroskopis meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan koloni memiliki

spora dengan bentuk bulat berantai yang menempel pada hifa koloni.

47



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


d) Isolat DTE 1


kecoklatan, warna sebalik putih hijau kecoklatan, tekstur hifa tebal berserabut,

memiliki spora cokat kehijauan, dan diameter pertumbuhan koloni fungi 6,9

cm pada hari ke-5. Karakterisasi mikroskopis meliputi, hifa koloni bersekat dan

bercabang, dan koloni memiliki spora berbentuk bulat bergerombol berwarna

hitam yang menempel pada hifa koloni.

48



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x

Gambar 4.12 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTE 1

e) Isolat DTE 3


kuning kecoklatan, warna sebalik kuning kecoklatan, membentuk lingkaran

konsentris, dan diameter pertumbuhan koloni fungi 8,1 cm pada hari ke-5.


koloni tidak memiliki spora.

49



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x

Gambar 4.13 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTE 3

f) Isolat DTU 1


kecoklatan, warna sebalik putih kuning kecoklatan, tekstur hifa tipis

berserabut, dan diameter pertumbuhan koloni fungi 2,5 cm pada hari ke-5.


koloni tidak memiliki spora.

50



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x

Gambar 4.14 Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik Isolat DTU 1

g) Isolat DTU 4

Karakterisasi makroskopis meliputi, permukaan koloni berwarna putih,

warna sebalik putih kekuningan, tekstur hifa tebal seperti kapas, memiliki

spora berwarna oranye dengan bagian tengah membentuk lingkaran hijau, dan

diameter pertumbuhan koloni fungi 7,4 cm pada hari ke-5. Karakterisasi

mikroskopis meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan koloni memiliki

spora dengan bentuk lonjong seperti batang.

51



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


h) Isolat DTU 6

Karakterisasi makroskopis meliputi, permukaan koloni berwarna putih,

warna sebalik putih kekuningan dengan bintik hitam pada bagian tengah,

tekstur hifa tebal seperti kapas, memiliki spora berwarna oranye, dan diameter

pertumbuhan koloni fungi 7,1 cm pada hari ke-5. Karakterisasi mikroskopis

meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan koloni memiliki spora

berbentuk lonjong seperti batang.

52



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


i) Isolat DTU 7

Karakterisasi makroskopik meliputi, permukaan koloni berwarna putih,

warna sebalik putih kekuningan dengan bagian tengah berwarna hijau tua,

tekstur hifa tebal seperti kapas, memiliki spora berwarna hitam, dan diameter

pertumbuhan koloni 6,9 cm pada hari ke-5. Karakterisasi mikroskopik

meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan koloni memiliki spora

berbentuk lonjong seperti batang.

53



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


j) Isolat DTU 9

Karakterisasi makroskopik meliputi, permukaan koloni berwarna putih

kehijauan, warna sebalik putih kekuningan dengan bagian tengah berwarna

hijau tua, tekstur hifa seperti kelopak bunga dan bergelombang, dan diameter

pertumbuhan koloni fungi 6,8 cm pada hari ke-5. Karakterisasi mikroskopik

meliputi, hifa koloni bersekat dan bercabang, dan koloni tidak memiliki spora.

54



Tampak Depan

Tampak Sebalik

Perbesaran 400 x


Dari 10 isolat kapang endofit yang telah diseleksi secara makroskopis,

sebagian besar berwarna putih dan hijau, tekstur berserabut dan seperti kapas,

memiliki spora berwarna hijau tua dan oranye. Sedangkan, dari 10 isolat kapang

endofit yang telah diseleksi secara mikroskopik, sebagian besar memiliki hifa

bersekat dan bercabang, dan spora berbentuk lonjong seperti batang.

4.1.5 Fermentasi Kapang Endofit

Fermentasi kapang endofit menggunakan medium PDY sebanyak 200 mL

terhadap 10 isolat kapang yang aktif sebagai antibakteri. Fermentasi kapang

endofit dilakukan secara statis (diam) pada suhu ruang selama 14 hari. Alasan

pemilihan waktu fermentasi disebabkan oleh produksi metabolit sekunder tejadi

secara optimum selama 14 hari untuk menghasilkan isolat yang mempunyai

aktivitas antibakteri (Mabrouk et al., 2008). Selama 14 hari, 10 isolat kapang

endofit yang di fermentasi diamati ada tidaknya kontaminan. Jika terdapat

55


kontaminan maka isolat kapang tersebut tidak dilakukan dalam uji aktivitas

antibakteri. Hasil fermentasi kapang endofit disentrifugasi dengan kecepatan 3000

rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan dipisahkan dari biomassa dan

digunakan sebagai larutan uji.

Fermentasi bertujuan untuk mensekresi senyawa metabolit sekunder yang

terkandung dalam koloni kapang endofit. Proses fermentasi mikroba endofit

digunakan media cair karena fermentasi dengan media cair lebih efektif untuk

memproduksi biomassa dan senyawa bioaktif dibandingkan fermentasi dalam

media padat (Nurhidayah et al., 2014). Fermentasi kapang endofit menggunakan

media PDY, karena dalam media ini mengandung sumber karbon yang berasal

dari kentang dan dextrose, serta ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen. Media

fermentasi harus mengandung nutrien untuk pertumbuhan, sumber energi,

penyusun substansi sel, dan biosintesis produk fermentasi. Komponen media yang

paling penting yaitu sumber karbon dan nitrogen, karena sel-sel mikroba dan

produk fermentasi sebagian besar terdiri dari unsur karbon dan nitrogen, selain itu

juga mengandung garam-garam organik serta beberapa vitamin dan mineral

(Kusumaningtyas et al., 2010).

4.1.6 Cek kemurnian Bakteri Uji

Pengamatan bakteri uji bertujuan untuk mengetahui bahwa bakteri uji yang

digunakan benar-benar murni dan tidak terkontaminasi, maka dilakukan

pengamatan secara makroskopik dan mikroskopik. Berikut adalah hasil

pengamatan bakteri uji :

a) Staphylococcus aureus

Pengamatan makroskopik meliputi, koloni bakteri berbentuk bulat

dengan bagian pinggir rata dan berwarna kuning mengkilat dengan diameter

sampai 1,3 mm. Pengamatan mikroskopis meliputi, sel bakteri berbentuk bulat

bergerombol seperti anggur, berwarna ungu dengan pewarnaan Gram dan

merupakan bakteri Gram positif.

56


Makroskopis Mikroskopis

Perbesaran 1000 x

Gambar 4.19 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Staphylococcus

aureus

b) Bacillus subtilis

Pengamatan makroskopis meliputi, koloni bakteri berbentuk bulat

dengan bagian pinggir rata dan berwarna putih dengan diameter sampai 1,5

mm. Pengamatan mikroskopis meliputi, sel bakteri berbentuk batang

berkelompok atau tunggal, berwarna ungu dengan pewarnaan Gram dan

merupakan bakteri Gram positif.


Perbesaran 1000 x

Gambar 4.20 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Bacillus subtilis

c) Escherichia coli

Pengamatan makroskopik meliputi, koloni bakteri berbentuk bulat

dengan bagian pinggir rata dan berwarna putih kekuningan dengan diameter

sampai 2,5 mm. Pengamatan mikroskopis meliputi, sel bakteri berbentuk

57


batang pendek berkelompok atau tunggal, berwarna merah dengan pewarnaan

Gram dan merupakan bakteri Gram negatif.


Perbesaran 1000 x

Gambar 4.21 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Escherichia coli

d) Shigella dysenteriae

Pengamatan makroskopis meliputi, koloni bakteri berbentuk bulat

dengan bagian pinggir rata dan berwarna putih dengan diameter sampai 1,4

mm. Pengamatan mikroskopis meliputi, sel bakteri berbentuk batang

berkelompok atau tunggal, berwarna merah dengan pewarnaan Gram dan

merupakan bakteri Gram negatif.


Perbesaran 1000 x

Gambar 4.22 Hasil Pengamatan Makroskopis dan Mikroskopis Shigella

dysenteriae

58


Pengamatan mikroskopik bakteri uji dilakukan dengan menggunakan

metode pewarnaan Gram untuk membedakan bakteri Gram positif dan Gram

negatif. Pada perwarnaan Gram ini, bakteri yang telah difiksasi dengan panas

sehingga membentuk noda pada kaca objek yang diwarnai dengan pewarna basa

yaitu crystal violet. Karena warna ungu mewarnai seluruh sel, maka pewarna ini

disebut pewarna primer (primary stain). Selanjutnya pewarna dicuci dan pada

noda spesimen ditetesi iodin atau lugol yang merupakan mordant (penajam).

Setelah iodin atau lugol dicuci, baik bakteri Gram positif maupun Gram negatif

tampak berwarna ungu. Selanjutnya, noda spesimen dicuci dengan alkohol yang

merupakan decolorizing agent (senyawa peluntur warna) yang pada spesies

bakteri tertentu dapat menghilangkan warna ungu dari sel. Setelah alkohol dicuci,

noda spesimen diwarnai kembali dengan safranin yang merupakan pewarna basa

berwarna merah. Bakteri yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram

positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam bakteri

Gram negatif (Pratiwi, 2008).

Perbedaan warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif

disebabkan oleh adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri

Gram positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan bakteri Gram negatif

banyak mengandung lipopolisakarida. Kompleks crystal violet-iodin yang masuk

ke dalam sel bakteri Gram positif tidak dapat dicuci oleh alkohol karena adanya

lapisan peptidoglikan yang kokoh pada dinding sel, sedangkan pada bakteri Gram

negatif, alkohol akan merusak lapisan polisakarida. Kompleks crystal violet-iodin

pada bakteri Gram negatif dapat dicuci dan menyebabkan sel bakteri tampak

transparan, yang akan berwarna merah setelah diberi safranin (Pratiwi, 2008).

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis dapat mempertahankan warna ungu

sehingga merupakan bakteri Gram positif, sedangkan Escherichia coli dan

Shigella dysenteriae kehilangan warna ungu dan berwarna merah setelah

diteteskan safranin sehingga merupakan bakteri Gram negatif.

59


4.1.7 Data Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Bakteri uji yang telah murni diinokulasi ke dalam media NB untuk

mendapatkan kurva pertumbuhan bakteri. Kurva pertumbuhan akan

menggambarkan pola pertumbuhan bakteri yang terbagi menjadi empat fase, yaitu

adaptasi, log, stasioner, dan kematian (Cooper, 1991 dalam Sholikah dan Nengha,

2014). Keempat fase pertumbuhan bakteri dapat diketahui dari pengukuran

turbiditas populasi bakteri pada kultur cair dengan menggunakan spektrofotometer

UV pada panjang gelombang 600 nm dengan melihat nilai absorbansi yang

dihasilkan (Harley dan Prescott, 2002 dalam Sholikah dan Nengha, 2014). Tujuan

pembuatan kurva pertumbuhan bakteri adalah untuk menentukan fase

eksponensial (log), dimana pada fase ini bakteri tumbuh dan membelah pada

kecepatan maksimum (Pratiwi, 2008). Kriteria nilai absorbansi yang dihasilkan

berada pada rentang 0,08-0,1 yang setara dengan 107

CFU/mL dimana bakteri uji

bersifat patogen (Halim et al., 2014).

Bakteri Staphylococcus aureus mengalami 2 fase, yaitu fase adaptasi dan

fase log. Fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 sampai jam ke-2. Fase log mulai

terjadi pada jam ke-3 sampai jam ke-9, dimana pada fase ini bakteri uji dapat

digunakan untuk uji aktivitas antibakteri. Bakteri Bacillus subtilis mengalami 3

fase, yaitu fase adaptasi, fase log dan fase stasioner. Fase adaptasi terjadi pada jam

ke-0 sampai jam ke-12. Fase log mulai terjadi pada jam ke-13 sampai jam ke-16,

60


dimana pada fase ini bakteri uji dapat digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.

Fase stasioner mulai terjadi pada jam ke-18 sampai jam ke-23.

Bakteri Escherichia coli mengalami 3 fase, yaitu fase adaptasi, fase log, dan

fase stasioner. Fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 sampai jam ke-2. Fase log

mulai terjadi pada jam ke-4 sampai jam ke-15, dimana pada fase ini bakteri uji

dapat digunakan untuk uji aktivitas antibakteri. Fase stasioner mulai terjadi pada

jam ke-17 sampai jam ke-22. Bakteri Shigella dysenteriae mengalami 2 fase, yaitu

fase adaptasi dan fase log. Fase adaptasi terjadi pada jam ke-0 sampai jam ke-4.

Fase log mulai terjadi pada jam ke-5 sampai jam ke-10, dimana pada fase ini

bakteri uji dapat digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.

4.1.8 Data Uji Aktivitas Antibakteri

Sebanyak 10 supernatan isolat kapang endofit dari hasil fermentasi

dilakukan uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi cakram atau Kirby-

Baurer. Pada penelitian ini menggunakan cakram dengan diameter 6 mm dan

cakram dengan diameter 5,5 mm. Sebanyak 20 µl larutan uji dari kapang endofit

diserapkan ke cakram hingga cakram mengering pada cawan petri steril.

Pengeringan cakram bertujuan agar senyawa metabolit sekunder terserap secara

merata pada cakram dan pelarut yang digunakan menguap. Apabila cakram

kurang kering pada saat ditempelkan ke media yang berisi bakteri uji, maka zona

bening yang dihasilkan tidak valid karena dikhawatirkan bakteri uji terhambat

oleh pelarut yang bersifat toksik dan bukan karena metabolit sekunder yang

dihasilkan kapang endofit. Cakram yang telah kering diletakkan secara aseptis ke

dalam media yang telah berisi bakteri uji dan diinkubasi pada suhu 35°C selama

24 jam. Aktivitas antibakteri dilihat dari terbentuknya zona bening disekitar

cakram. Zona bening merupakan indikasi terhambat atau tidaknya pertumbuhan

bakteri patogen akibat sekresi senyawa antibakteri oleh mikroba lain yang bersifat

antagonis (Elfina et al., 2014).

61


Berikut adalah hasil pengukuran zona hambat isolat kapang endofit yang

berpotensi sebagai antibakteri :

Tabel 4.2 Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Isolat Kapang Endofit

No. Isolat Diameter zona hambat (mm)

S.aureus B.subtilis E.coli S.dysenteriae

1 DPU 1 7,85 mm - 6,42 mm 6,68 mm

2 DPU 3 7,53 mm 6,2 mm 6,38 mm 6,46 mm

3 DPU 4 7,78 mm 6,11 mm 6,26 mm 6,68 mm

4 DTE 1 6,96 mm 7,05 mm 6,9 mm 7,3 mm

5 DTE 3 - - 7,03 mm 6,1 mm

6 DTU 1 6,95 mm 7,2 mm 7,28 mm 6,7 mm

7 DTU 4 - 5,76 mm 6,86 mm 6,1 mm

8 DTU 6 - 7,03 mm 6,35 mm 7,68 mm

9 DTU 7 6,55 mm - 6,91 mm -

10 DTU 9 6,61 mm - 6,9 mm 5,92 mm

Kontrol

Kloramfenikol (+)

Kontrol (-)

19,46 mm 14,52 mm 10,94 mm 16,91 mm

- - - -

Keterangan :











62


Berdasarkan hasil uji aktivitas antibakteri terhadap kapang endofit diperoleh

10 isolat kapang endofit yang menghasilkan zona hambat bening pada bakteri uji

tertentu. Supernatan isolat DPU 1 menghambat pertumbuhan Staphylococcus

aureus dengan diameter zona hambat 7,85 mm, menghambat pertumbuhan

Escherichia coli dengan diameter zona hambat 6,42 mm, menghambat

pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter zona hambat 6,68 mm, dan

tidak menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis.

Supernatan dari isolat DPU 3 menghambat pertumbuhan Staphylococcus


Bacillus subtilis dengan diameter zona hambat 6,2 mm, menghambat

pertumbuhan Escherichia coli dengan diameter zona hambat 6,38 mm, dan

menghambat pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter zona hambat

6,46 mm.

Supernatan dari isolat DPU 4 menghambat pertumbuhan Staphylococcus




menghambat pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter 6,68 mm.

Supernatan dari isolat DTE 1 menghambat pertumbuhan Staphylococcus




menghambat pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter zona hambat 7,3

mm.

Supernatan dari isolat DTE 3 menghambat pertumbuhan Escherichia coli

dengan diameter zona hambat 7,03 mm, menghambat pertumbuhan Shigella

dysenteriae dengan diameter 6,1 mm, dan tidak menghambat pertumbuhan

Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis.

Supernatan dari isolat DTU 1 menghambat pertumbuhan Staphylococcus




63


menghambat pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter zona hambat 6,7

mm.

Supernatan dari isolat DTU 4 menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis

dengan diameter zona hambat 5,76 mm, menghambat pertumbuhan Escherichia

coli dengan diameter zona hambat 6,86 mm, menghambat pertumbuhan Shigella

dysenteriae dengan diameter 6,1 mm, dan tidak menghambat pertumbuhan

Staphylococcus aureus.

Supernatan dari isolat DTU 6 menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis

dengan diameter 7,03 mm, menghambat pertumbuhan Escherichia coli dengan

diameter zona hambat 6,35 mm, menghambat pertumbuhan Shigella dysenteriae

dengan diameter zona hambat 7,68 mm, dan tidak menghambat pertumbuhan

Staphylococcus aureus.



Escherichia coli dengan diameter zona hambat 6,91 mm, dan tidak menghambat

pertumbuhan Bacillus subtilis dan Shigella dysenteriae.



Escherichia coli dengan diameter zona hambat 6,9 mm, menghambat

pertumbuhan Shigella dysenteriae dengan diameter zona hambat 5,92 mm, tidak

menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis.

Berdasarkan hasil skrining dan uji aktivitas antibakteri terdapat 3 isolat

kapang endofit, yaitu isolat DPU 4, DTU 7, dan DTU 9 yang menunjukkan

adanya zona hambat pada uji aktivitas antibakteri sementara pada pengamatan

hasil skrining tidak menunjukkan zona hambat terhadap Staphylococcus aureus.

Isolat DTE 1 dan DTU 1 menunjukkan zona hambat pada uji aktivitas antibakteri

sementara hasil skrining tidak menunjukkan zona hambat terhadap Bacillus

subtilis. Isolat DPU 1, DPU 3, dan DTU 6 menunjukkan zona hambat pada uji

aktivitas antibakteri sementara hasil skrining tidak menunjukkan zona hambat

terhadap Escherichia coli. Isolat DPU 1, DPU 3, DPU 4, DTE 1, DTE 3, DTU 1,

dan DTU 9 menunjukkan zona hambat pada uji aktivitas antibakteri sementara

hasil skrining tidak menunjukkan zona hambat terhadap Shigella dysenteriae.

64


Namun sebaliknya, isolat DTE 3 tidak menunjukkan adanya zona hambat pada uji

aktivitas antibakteri sementara hasil skrining menghasilkan zona hambat terhadap

Staphylococcus aureus. Isolat DTU 7 dan DTU 9 tidak menunjukkan adanya zona

hambat pada uji aktivitas antibakteri sementara hasil skrining menghasilkan zona

hambat terhadap Bacillus subtilis. Isolat DTU 7 tidak menunjukkan adanya zona

hambat pada uji aktivitas antibakteri sementara hasil skrining menghasilkan zona

hambat terhadap Shigella dysenteriae.

Adanya perbedaan hasil dimana isolat menghasilkan zona hambat pada uji

aktivitas antibakteri sementara tidak menghasilkan zona hambat pada skrining

dapat disebabkan oleh metabolit sekunder yang terkandung dalam isolat kapang

endofit dihasilkan lebih banyak pada proses fermentasi. Pada proses fermentasi

media cair kontak antara kapang endofit dengan nutrien membuat seluruh bagian

dari kapang endofit berada dalam media tersebut. Penyerapan nutrien yang lebih

banyak akan membuat kapang endofit lebih banyak menghasilkan metabolit

sekunder dibandingkan dengan mikroba endofit yang tidak melalui proses

fermentasi (Elfina et al., 2014). Namun sebaliknya, perbedaan hasil dimana isolat

tidak menghasilkan zona hambat pada uji aktivitas antibakteri sementara

menghasilkan zona hambat pada skrining dapat disebabkan oleh senyawa

metabolit sekunder yang terkandung dalam isolat kapang endofit tidak tersari

dalam pelarut air sehingga tidak mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji.

Oleh karena itu, perlu dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik

dengan tingkat kepolaran tertentu.

Diameter rata-rata zona hambat yang dihasilkan oleh kapang endofit yaitu

5-10 mm yang termasuk ke dalam kategori sedang dalam menghambat

pertumbuhan bakteri. Tingginya aktivitas antibakteri dari suatu senyawa

antimikroba dalam membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri patogen

dengan metode difusi dipengaruhi oleh kemampuan difusi senyawa antimikroba

dari cakram ke media yang berisi bakteri patogen (Elfina et al., 2014). Selain itu,

besar kecilnya zona daya hambat mikroba endofit terhadap bakteri patogen diduga

disebabkan oleh metabolit yang dihasilkan oleh isolat. Semakin tinggi konsentrasi

antibakteri yang dihasilkan maka semakin tinggi pula daya hambatnya yang

ditunjukkan oleh kecilnya pertumbuhan koloni bakteri patogen (Sunariasih et al.,

65


2014). Senyawa fitokimia yang diduga mempunyai aktivitas antibakteri adalah

komponen yang terdapat dalam supernatan (filtrat ekstraseluler) seperti flavonoid,

terpenoid, alkaloid, tanin, saponin, dan glikosida (Govindappa et al., 2011,

Dhankar et al., 2012, dan Bahgat et al., 2014).

Isolat kapang endofit yang diperoleh dari Medinilla speciosa Blume

memiliki potensi sebagai antibakteri yang ditandai dengan terbentuknya diameter

zona hambat, namun terdapat larutan uji dari isolat kapang endofit yang tidak

mampu menghambat bakteri uji tertentu.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian ini dapat dibuat kesimpulan sebagai berikut :

1. Isolasi kapang endofit dari daun Medinilla speciosa Blume diperoleh 20

isolat fungi endofit yang diperoleh dari daun berwarna hijau muda, hijau

tua, dan hijau kekuningan.

2. Uji aktivitas antibakteri dari kapang endofit diperoleh 10 isolat kapang

endofit yang aktif terhadap bakteri uji tertentu, yaitu Staphylococcus

aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae.

- Isolat DPU 1 aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus,



Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Shigella dysenteriae.



- Isolat DTE 1 aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus,


- Isolat DTE 3 aktif sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli dan

Shigella dysenteriae.

- Isolat DTU 1 aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus,


- Isolat DTU 4 aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis,


- Isolat DTU 6 aktif sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis,


- Isolat DTU 7 aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus

dan Escherichia coli.

- Isolat DTU 9 aktif sebagai antibakteri terhadap Staphylococcus aureus,



5.2 Saran

Berdasarkan hasil penelitian dapat dikemukakan saran sebagai berikut :

1. Identifikasi lebih lanjut terhadap kapang endofit terutama yang berpotensi

menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antibakteri.

2. Ekstraksi terhadap isolat kapang endofit yang berpotensi sebagai

antibakteri dengan pelarut organik tertentu untuk menarik senyawa

antibakteri yang terkandung didalamnya.

3. Uji aktivitas antibakteri terhadap bakteri patogen lainnya selain dari

bakteri patogen yang telah diujikan.


DAFTAR PUSTAKA

Abubakar H, Aris TW, Munti Y. 2011. Skrining Bakteri yang Berasosiasi dengan

Spons Jaspis sp. sebagai Penghasil Senyawa Antimikroba. Ilmu Kelautan

Vol. 16 (1). Bogor : Departemen Biologi FMIPIA IPB.

Agusta, Andria. 2006. Biotransformation of Catechins and Bioreproduction of

Bisanthraquinones by The Endophytic Fungus Diaporthe Sp. Isolated From

A Tea Plant. PhD Thesis. Japan : Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical

Science, Fakuyuma University.

Agusta, Andria. 2009. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Bandung : ITB, p. 3-5.

Anggana A.F. 2011. Kajian Etnobotani Masyarakat di Sekitar Taman Nasional

Gunung Merapi (Studi Kasus di Desa Umbulharjo, Sidorejo, Wonodoyo dan

Ngablak). Skripsi Sarjana Kehutanan Fakultas Kehutanan IPB. Bogor :

Institur Pertanian Bogor.

Anonim. 2014. Escherichia coli. http://www.emedicine.com. Diakses pada

tanggal 2 Desember 2014 pukul 08.00 WIB

Anonim.2014.http://www.warintek.ristek.go.id/pangan_kesehatan/tanaman_obat/

depkes/5-062.pdf diakses pada tanggal 4 November 2014.

Ariyono, Redha Q, Syamsuddin D, Lilik S. 2014. Keanekaragaman Jamur

Endofit Daun Kangkung Darat (Ipomoea reptans Poir) pada Lahan

Pertanian Organik dan Konvensional. Jurnal HPT Vol. 2 (1). Malang :

Program Studi Agroekoteknologi, Universitas Brawijaya, p. 22.

Atika, Dian. 2007. Uji Aktivitas Antimikroba Hasil Fermentasi Kapang Endofit

yang Diisolasi dari Akar, Batang, Daun Tanaman Garcinia fruticosa

Lauterb dan Garcinia lateriflora Blume Serta Akar dan Daun Tanaman

Garcinia cowa Roxb. Skripsi Sarjana Farmasi. Depok : FMIPA Universitas

Indonesia.

Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial Endophytes : The Endophytic Niche, Its

Occupants, And Its Utility. Plant-Associated Bacteria. Netherland :

Springer.

Bahgat, Mohsen M, Mona MEB, Salwa AK, Nesma AME. 2014. Characterization

Endophytic Bacteria Isolated from The Medical Plant CapparissinaicaVeill.

http://www.emedicine.com/

http://www.warintek.ristek.go.id/pangan_kesehatan/tanaman_obat/depkes/5-062.pdf

http://www.warintek.ristek.go.id/pangan_kesehatan/tanaman_obat/depkes/5-062.pdf


And Analyze Its Bioactive Flavonoid Vol. 4 (11). Indian Journal Applied

Research. Egypt : Phytochemistry and Plant Systematics Departement,

National Research Centre, dan Port-Said University.

Block SS. 1977. Disinfection, Sterilization, and Presevation. Phildalphia : Lea &

Febiger.

Chatim C, Suharto. 1993. Sterilisasi dan Disinfeksi Dalam : Mikrobiologi

Kedokteran. Jakarta : Binarupa Aksara, p. 39-51.

Conca Lab. 2014. Mueller Hinton Agar. New York : Pronadisa.

Cooper, S. 1991. Bacterial Growth and Division : Biochemistry and Regulation

of Prokaryotic and Eukaryotiv Division Cycles. San Diego : Academic

Press.

Davis dan Stout. 1971. Disc Plate Method of Microbiological Antibiotic Essay.

Journal of Microbiology Vol. 22, No. 4.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1989. Bakteriologi Klinik. Jakarta :

Pusat Pendidikan Tenaga Kesehatan RI, p. 11-45, 49-50, 56.

Dhankhar S, Sandeep K, Sandeep D, Jaya PY. 2012. Antioxidant Activity of

Fungal Endophytes Isolated from Salvadora Oleoides Decne. International

Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science Vol. 4 (2). Haryana :

Departement of Genetics Maharshi Dayanand University.

Dreyfuss ME, H.H. Hoffman, H. Kobel, W. Pache, and H. Tsecherter. 1986.

Cyclosporin A and C : New Metabolites from Trichoderma polysporum

(Link Expers) Rifai. Appl. Environ. Microbiologi, p. 125-133.

Elfina D, Atria M, Rodensia, MR. 2014. Isolasi dan Karakterisasi Fungi Endofit

dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Sebagai Antimikroba

Terhadap Candida albicans, Staphylococcus aureus, dan Escherichia coli.

Pekanbaru : Jurusan Biologi FMIPA-UR, p. 1-4.

Fisher PJ, Anson dan Petrini. 1989. Antibiotic Activity of Some Endophytic Fungi

from Ericaceous Plant. Bot. Helv. 40 (94), p. 249-253,

Ganiswarna SG, Rianto S, Frans DS, dan Purwantyastuti. 1995. Farmakologi dan

Terapi Edisi IV. Jakarta : Bagian Farmakologi Kedokteran Universitas

Indonesia, p. 560-583.


Gibson, JM. 1996. Mikrobiologi dan Patologi Modern untuk Perawat. Jakarta :

EGC, p. 6, 11-15.

Govindappa M, Channabasava R, Sowmya DV, Meenakshi J, Shreevidya MR,

Lavanya A, Gustavo S, dan Sadananda TS. 2011. Phytochemical Screening,

Antimicrobial And In Vitro Anti-Inflammatory Activity of Endophytic

Extracts from Loranthus sp. Pharmacognosy Journal Vol. 3 (25). Karnataka

: Departemen of Biotechnology, Shridevi Insitute of Engineering &

Technology.

Halim, Jasril, Saryono. 2014. Optimalisasi Produksi Senyawa Metabolit Sekunder

dari Pseudomonas sp. Endofit Tanaman Dahlia (Dahlia variabilis). Ind.

Che. Acta Vol. 5 (1). Pekanbaru : Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Universitas Riau.

Handayani. 2007. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dari Ranting

Tanaman Garcinia Tetrandra Pierre terhadap Escherichia coli,

Staphylococcus aures, Salmonella typhosa, Bacillus subtilis, Pseudomonas

aeroginosa, Candida albicans, dan Aspergillus niger. Skripsi Sarjana

Ekstensi Farmasi. Depok : FMIPA Universitas Indonesia, p. 27-29, 46.

Harley JP, dan L.M. Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology 5th

Edition. New York : The Mc Graw Hill Companies.

Himeda Laboratories. 2011. Nutrient Broth. Mumbai : Technical Data.

Horn WS, M.S.J. Simmonds, R.E. Schwartz, and W.M. Blaney. 1995.

Phomopsichalasin, A Novel Antimicrobial Agent from An Endophytic

Phomopsis Sp. Tetrahedron 14, p. hal 3969-3978.

Ilyas, M. 2007. Isolasi dan Identifikasi Mikroflora Kapang pada Sampel Serasah

Daun Tumbuhan di Kawasan Gunung Lawu, Surakarta, Jawa Tengah.

Jurnal Biodiversitas Vol. 8 (2), p.105-110.

Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s. 2011. Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta :

Salemba Medika.

Judoamidjojo M, Darwis AA, dan Sa’id EG. 1990. Teknologi Fermentasi. Bogor :

PAU-Bioteknologi IPB, p. 50-52.


Khotimah, Fiqi Khusnul. 2010. Isolasi Senyawa Aktif Antibakteri Minyak Atisiri

Bunga Cengkeh (Syzygium aromaticum). Skrispsi. Jakarta : Program Studi

Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Jakarta.

Kusumangingtyas E, M. Natasia, dan Darmono. 2010. Potensi Metabolit Kapang

Endofit Rimpang Lengkuas Merah dalam Menghambat Pertumbuhan

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus dengan Media Fermentasi

Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY). Seminar

Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Jakarta : Fakultas Farmasi

Universitas Pancasila.

Labeda, DP. 1990. Isolation Biotechnologic Organism from Nature. New York :

McGraw-Hill Publishing Company.

Lorian, V. 1980. Antibiotics in Laboratory Medicine 2th

Edition. London :

Wiliams and Wilkins, p. 510-515.

Mariana C, Buta E, Hort D. 2012. Medinilla : An Exotic and Attractive Indoor

Plant With Great Value. Journal of Horticulture, Forestry and

Biotechnology Vol.16 (2), p. 9-12.

Niswah, Lukluwatun. 2014. Uji Aktivitas Antibakteri Dari Ekstrak Buah Parijoto

(Medinilla speciosa Blume) Menggunakan Metode Difusi Cakram. Skrispsi

Sarjana Farmasi. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Nurhidayah, Uswatun H, dan Idramsa. 2014. Pengaruh Ekstrak Metabolit

Sekunder Jamur Endofit Tumbuhan Cotylelobium melanoxylon dalam

Menghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen. Medan : Jurusan Biologi

Fakultas MIPA Universitas Negeri Medan.

Nurul, Mukaromah. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri Beberapa Fraksi dari Ekstrak

Buah Parijoto (Medinilla speciosa Blume) dengan Metode Bioautografi.

Skripsi Sarjana Farmasi. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Okeke MI, Iroegbu CU, Eze EN, Okali AS, Esimone CO. 2001. Evaluation of

Extracts of The Root of Landolphia owerrience for Antibacterial Activity.

Journal Ethnopharmacol Vol. 78 : 119-127.

Pelczar, Michael J dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid I.

Jakarta : UI Press, p. 489-493.


Petrini O, T.N. Sieber, L. Toti dan O. Viret. 1992. Ecology Metabolite Production

and Substrate Utilization in Endophytic Fungi. Natural Toxins 1, p. 185-

196.

Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta : EGC, p.22-32, 38-43,

188-192.

Priharta, Antonius Alfian Yuan Dias. 2008. Isolasi dan Identifikasi Bakteri

Endofit dalam Batang Tanaman Artemisia annua L. yang Diuji Potensi

Antibakterinya Terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.

Skripsi Sarjana Farmasi. Yogyakarta : Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma, p. 31, 33.

Prihatiningtias, W. 2005. Senyawa Bioaktif Fungi Endofit Akar kuning

(Fibraurea chloroleuca Miers) Sebagai Senyawa Antimikroba. Universitas

Gadjah Mada : Yogyakarta.

Prihatiningtias, W. 2006. Mikroba Endofit Sumber Penghasil Antibiotik Yang

Potensial. Yogyakarta : Fakultas Farmasi UGM.

Prihatiningtias W, Mae SHW. 2005. Prospek Mikroba Endofit Sebagai Penghasil

Senyawa Bioaktif. Yogyakarta : Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Purwanto. 2014. Isolasi Bakteri Endofit dari Tanaman Sirih Hijau (Piper bettle L.)

dan Potensinya sebagai Penghasil Senyawa Antibakteri. Bogor : Fakultas

Kedokteran Hewan IPB, p. 54.

Rachmayani, Renita. 2008. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dan

Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia Mangostana. Skripsi

Sarjana Farmasi. Depok : FMIPA Universitas Indonesia, p. 31-34.

Radji, Maksum, Atiek S, Renita R, dan Berna E. 2011. Isolation of Fungal

Endophytes from Garcinia Mangostana and Their Antibacterial Activity.

African Journal of Biotechnology Vol. 10 (1). Depok : Laboratory of

Microbiology and Biotechnology, Departement of Pharmacy, Faculty of

Mathematics and Sciences, p. 104.

Radji, Maksum. 2005. Peranan Bioteknologi dan Mikroba Endofit dalam

Pengembangan Obat Herbal. Majalah Ilmu Kefarmasian Vol. 2 (3), p. 113-

126. Depok : Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Departemen

Farmasi FMIPA-UI.


Rahman MA, Ahsan T, Islam S. 2010. Antibacterial and Antifungal Properties of

Methanol Extract from The Stem of Argyreia argentea. Bang. Journal

Pharmacol Vol. 5 : 41-44.

Ramadhan, M. Gama. 2011. Skrining dan Uji Aktivitas Penghambatan α-

Glukosidase dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia siamea Lamk). Skripsi

Sarjana Farmasi. Depok : FMIPA Universitas Indonesia, p. 17-18,

Rante H, Burhanuddin T, Soendaria I. 2013. Isolasi Fungi Endofit Penghasil

Senyawa Antimikroba dari Daun Cabai Katokkon (Capsicum annumm L

var. chinensis) dan Profil KLT Bioautografi. Majalah Farmasi dan

Farmakologi Vol. 17 (2). Makassar : Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin, p. 39-41.

Rustanti, Mirna. 2007. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil Antimikroba

pada Akar Tanaman Sesoot (Garcinia picrorrhiza Miq.). Skripsi Sarjana

Farmasi. Depok : FMIPA Universitas Indonesia, p. 23-27, 28.

Salle AJ, 1961, Fundamental Principle of Bacteriologi 5th Edition. New York :

MC Graw Hill Book Company Inc.

Setiabudy, R. 2007. Farmakologi dan Terapi Edisi 5. Departemen Farmakologi

dan Terapeutik FKUI. Jakarta : Balai Penerbit FKUI, p. 571.

Sholikah, Umi dan Nengha DK. 2014. Uji Potensi Genera Bacillus sebagai

Bioakumulator Merkuri. Surabaya : Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember (ITS).

Simarmata R, S. Lekatompessy S, dan H. Sukiman. 2007. Isolasi Mikroba

Endofitik dari Tanaman Obat Sambung Nyawa (Gynura procumbens) dan

Analisis Potensinya Sebagai Antimikroba. Berkas Penelitian Hayati. Bogor

: Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan, LIPI, p. 85-90.

Sinaga E, Noverita, Dinah F. 2009. Daya Antibakteri Jamur Endofit yang

Diisolasi dari Daun dan Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga Sw.). Jurnal

Farmasi Indonesia Vol. 4 (4). Pasar minggu : Fakultas Biologi Universitas

Nasional, p. 161-164.

Singelton P, dan Diana S. 1981. Introduction to Bacteria : For Student In the

Biological Science. New York, p. 140-159.

Siswandono, S.B. 1995. Kimia Medisinal. Surabaya : Airlangga University Press.


Sjahrurachman A, W. Kumala dan T. Nurjadi. 1999. Kepekaan Kuman Terhadap

Antibiotika Golongan Kuinolon dan Sefalosporin. CDK 124, p. 17-20.

Sleigh JD, Timbury MC. 1994. Notes on Medical Bacteriology. Tokyo : Chruchill

Livingstone, p. 42-44, 59-65, 76-83.

Strobel GA. 2002. Microbial Gifts from Rain Forests. Can. J. Plant Panthol, p. 24.

Strobel GA, Miller RV, Condron MM, Teplow DB, Hess WM. 1999.

Cryptocandin, A Potent Antimycotic from Endophytic Fungus

Cryptosporiopsis Quercina. Mikrobiologi. 145, p. 1919-1926.

Strobel G, Daisy B. 2003. Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their

Natural Product. Microbiology and Molecular Biology Review : 67(4), p.

491-502.

Sugijanto, Noor EN, Beatrice Y, Made NK, Noor CZ. 2014. Aktivitas

Antimikroba dan Analisis KLT-Densitometri Metabolit Fraksi-Fraksi

Esktrak Endofit dari Aglaia odorata. Berkala Ilmiah Farmasi, Vol. 3 (1).

Surabaya : Fakultas Farmasi Universitas Airlangga.

Sumampouw M, Robert B, Henoch A, Jimmy P. 2010. Uji Antibakteri Jamur

Endofit Akar Bakau Rhizospora stylosa Terhadap Bakteri Staphylococcus

aureus dan Escherichia coli. Sam ratulangi : Bagian Farmakologi dan

Terapi Fakultas Kedokteran, p. 2-3.

Sunariasih, Ni Putu Linda., I Ketut Suada, Ni Wayan Suniti. 2014. Identifikasi

Jamur Endofit dari Biji Padi dan Uji Daya Hambatnya terhadap Pyricularia

oryzae Cav. E-Jurnal Agroteknologi Tropika Vol.3 (2). Denpasar : Program

Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian Universitas Udayana.

Syahrurahman A, et al. 1992. Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta :

Binarupa Aksara, p. 1-5, 37-38, 50-52, 79-105, 272-282.

Tan, RX and WX Zou. 2001. Endophytes : A Rich Source of Functional

Metabolites. Nat Prod. Rep. 18, p. 448-459.

Valgas C, de Souza SM, Smania EF, Smania A. 2001. Screening Method to

Determine Antibacterial Activity of Natural Prodcut. Brazilian Journal of

Microbiology. Vol. 34, p. 369-380.

Volk and Wheeler. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid 2 Edisi kelima. Jakarta :

Erlangga.


Wahyudi, P. 1997. Isolasi Mikroorganisme Endofitik Tanaman Tropis Indonesia.

Jakarta : Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, p. 1-3.

Wibowo HA, Wasino & Dewi LS. 2012. Kearifan Lokal dalam Menjaga

Lingkungan Hidup (Studi Kasus Masyarakat di Desa Colo Kecamatan Dawe

Kabupaten Kudus). Journal of Edocational Social Studies Vol.1 (1), p. 25-

30.

Yulia, Prima Roza. 2005. Isolasi dan Seleksi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba pada Beberapa Tanaman Obat Tradisional Indonesia. Skripsi

Sarjana Ekstensi Farmasi. Depok : FMIPA Universitas Indonesia, p. 15-17,

35.

Zang HW, Song YC, dan Tan RX. 2006. Nat. Prod. Rep, p. 23, 7

76

LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Penelitian

Sampling Tanaman

Daun Parijoto (Medinilla speciosa

Blume)

Sterilisasi Permukaan

Isolasi Kapang Endofit

Pemurnian Kapang Endofit

Identifikasi Bakteri Uji

Peremajaan

Bakteri Uji

Pembuatan Kurva

Pertumbuhan Bakteri Uji

Uji Aktivitas Antibakteri

Uji

Antibakteri

Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi

sebagai Antibakteri

Karakterisasi Kapang Endofit yang

Berpotensi sebagai Antibakteri

Fermentasi Kapang Endofit yang

Berpotensi sebagai Antibakteri

Lampiran 2. Determinasi Tumbuhan Parijoto (Medinilla speciosa Blume)

Lampiran 3. Bagan Kerja Isolasi Kapang Endofit

Dicuci dibawah

air mengalir

selama 10 menit

Kertas saring

Dipotong 1x1 cm2 dengan gunting

steril (dilakukan kalibrasi dengan

menggunakan pemggaris)

Keringkan di atas

kertas saring steril

Etanol 70% 1

menit Daun Parijoto (berwarna hijau

muda, hijau tua, dan hijau

kekuningan)

NaOCl

5 menit

Etanol 70%

0,5 menit

Aquades steril

3-5 detik

Media PDA diinkubasi 14 hari

pada suhu ruang

Aquades bilasan terakhir 1 mL

diisolasi ke PDA sebagai

kontrol pada cawan yang

berbeda

Lampiran 4. Bagan Kerja Pemurnian Kapang Endofit

;

Inokulasi sedikit

hifa dg ose steril

dari setiap koloni

yang berbeda

Pindahkan ke dalam

media PDA (dikerjakan

duplo : working culture

dan stock culture)

Inkubasi 5 hari

pada suhu ruang

Tiap koloni yang tumbuh

dipindahkan ke PDA miring

(dikerjakan duplo : working

culture dan stock culture)

Inkubasi 5 hari

pada suhu

ruang

Lampiran 5. Bagan Kerja Skrining Kapang Endofit yang Berpotensi sebagai

Antibakteri

Biakan bakteri uji

Staphylococcus aureus,

Bacillus subtilis,

Escherichia coli, Shigella

dysenteriae dalam NB

dipipet 0,1 mL ke dalam

media NA (biakan bakteri

dibuat menggunakan kurva

pertumbuhan)

Media NA yang berisi

bakteri uji disebar secara

merata dengan

menggunakan batang L

Isolat kapang endofit dalam

media PDA diambil dengan

cork borer

Isolat kapang endofit

dipindahkan ke dalam media

NA yang berisi bakteri uji.

Diinkubasi pada suhu ruang

selama 3 hari

Amati zona hambat yang

terbentuk

Lampiran 6. Bagan Kerja Karakterisasi Kapang Endofit yang Berpotensi

sebagai Antibakteri

Karakterisasi Kapang Endofit

Karakterisasi Makroskopik

warna dan permukaan

koloni

tekstur

lingkaran-lingkaran

konsentris

warna balik koloni

(reverse color)

tetes eksudat

diameter

pertumbuhan koloni

kapang (cm/hari)

Karakterisasi Mikroskopik

Bagian hifa kapang ukuran 1 x 1 cm2

dipindahkan ke bagian pinggir pada PDA,

diletakkan pada kaca objek dan ditutup

dengan cover glass

Preparat ditempatkan pada petri steril berisi

sedikit air. Diinkubasi selama 5 hari pada

suhu ruang

Pengamatan dilakukan dengan mikroskop

perbesaran cahaya 400 kali (meliputi sekat

hifa, pertumbuhan hifa, warna hifa, bentuk

dan ornamentasi spora)

Lampiran 7. Bagan Kerja Fermentasi Kapang Endofit

Koloni kapang yang

murni dan berpotensi

sebagai antibakteri

diambil dengan cork

borer sebanyak 3

potongan isolat

Inokulasi ke

dalam 200 mL

PDY

Inkubasi secara kultur

diam suhu ruang selama

14 hari

Sentrifugasi 3000 rpm

selama 15 menit

Supernatan diambil

Supernatan

Biomassa

Larutan uji

Lampiran 8. Bagan Kerja Identifikasi Bakteri Uji

Identifikasi Makroskopik : mengamati morfologi dan pertumbuhan koloni

meliputi : bentuk, warna, dan bagian tepi koloni

Identifikasi Mikrokskopik

Bakteri

uji

Teteskan kristal

violet biarkan

selama 1 menit

Cuci dengan air

mengalir selama 5

detik

Preparat

dioleskan

bakteri setipis

mungkin dan

difiksasi di atas

api

Teteskan lugol

biarkan selama 1

menit

Cuci dengan air

mengalir selama 5

detik

Teteskan dengan

etanol 96% selama

30 detik, lalu dicuci

dengan air mengalir

Teteskan

safranin 10-30

detik

Cuci dengan air

mengalir dan

keringkan diatas

kertas saring

Amati dengan

mikroskop cahaya

perbesaran 1000 kali

(pengamatan : bentuk

dan warna sel)

Lampiran 9. Bagan Kerja Peremajaan Bakteri Uji

Lampiran 10. Bagan Kerja Pembuatan Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Staphylococcus

aureus ATCC

6538, Bacillus

subtilis ATCC

6633, Escherichia

coli ATCC 25922,

dan Shigella

dysenteriae ATCC

13313

Satu ose bakteri

uji diinokulasi

ke dalam NA

miring

Inkubasi suhu

35°C selama 24

jam

Lampiran 11. Bagan Kerja Uji Aktivitas Antibakteri

Biakan bakteri

uji pada NA

miring

ditambahkan 5

mL NaCl

Sebanyak 0,1%

(v/v) suspensi

bakteri dimasukkan

ke dalam 100 mL

NB

Absorbansi bakteri

pada menit ke-0 (t0)

diukur pada panjang

gelombang 600 mm

Media NB

diinkubasi pada

pengocokan 120

rpm pada suhu 37°C

Setiap interval 30

menit dilakukan

pengukuran absorban.

Lampiran 12. Hasil Fermentasi Kapang Endofit

Biakan bakteri

uji dalam NB

dipipet

sebanyak 1 mL

Biakan bakteri uji

dimasukkan ke

dalam cawan petri

steril dan

ditambahkan MHA

± 10 mL

Suspensi bakteri

digoyangkan

perlahan (10 kali ke

kanan dan 10 kali

ke kiri) agar

suspensi tersebar

merata pada media

Larutan uji kapang

endofit dan kontrol

negatif (aquades

steril) dipipet

sebanyak 20 µL

dan diserap pada

cakram steril

Cakram dibiarkan

kering di udara

Cakram dan kontrol

positif

(kloramfenikol)

diletakkan secara

aseptis ke dalam

MHA yang berisi

bakteri uji

Media diinkubasi

24 jam pada suhu

35°C

Amati zona hambat

yang terbentuk dan

diukur dengan jangka

sorong

Fermentasi Kapang Endofit (hari ke-14) Hasil Sentrifugasi

DPU 1

DPU 3

DPU 4

DTE 1

DTE 3

DTU 1

DTU 4

DTU 6

DTU 7

DTU 9

Lampiran 13. Absorbansi Kurva Pertumbuhan Bakteri Uji

Jam S. aureus B.subtilis E.coli S. dysenteriae

0 0,001 0,002 0,007 0,003

1 0,005 0,002 0,012 0,007

2 0,014 0,006 0,055 0,017

3 0,066 0,009 0,203 0,037

4 0,198 0,021 0,402 0,088

5 0,404 0,065 0,542 0,226

6 0,821 0,163 0,624 0,402

7 1,022 0,294 0,689 0,579

8 1,142 0,434 0,806 0,757

9 1,191 0,633 0,884 0,891

10 1,485 0,474 1,056 0,892

11 1,479 0,621 1,160 0,976

12 1,769 0,830 1,470 0,956

13 2,122 0,855 1,647 0,990

14 1,946 1,132 1,895 1,229

15 2,083 0,156 1,973 1,581

16 1,839 1,776 2,053 1,631

17 1,911 1,893 2,086 1,692

18 1,956 2,072 1,744

19 1,978 2,058 1,731

20 1,946 2,057 1,786

21 1,981 2,033 1,780

22 1,958 2,033 1,797

23 1,944

Lampiran 14. Uji Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit

a. Isolat DPU 1, DPU 3, dan DPU 4

Staphylococcus aureus

+

-

DPU 4 DPU 3

DPU 1

Bacillus subtilis


+

- DPU 1

DPU 3 DPU 4

4

+ DPU 1

DPU 3

DPU 4

-

+ DPU 4

-

DPU

1

DPU 4

DPU 3

b. Isolat DTE 1, DTU 1, dan DTU 6

c. Isolat DTE 3,

DTU 4, DTU 7, dan DTU 9




+

- DTE 1

1

DTU 6

161

DTU 1

61161

+ DTE 1

1

DTU 1

61161

-

DTU 6

161

-

+ DTU 1

61161

DTU 6

161

DTE 1

1 + DTE 1

1

DTU 1

61161

-

DTU 6

161

DTU 7

DTU 9

97161

DTE 3

97161 DTU 4

+

-

DTU 4

DTE 3

97161

+ DTU 9

97161

DTU 7

-

DTU 4

DTE 3

97161


DTU 7

DTU 9

97161

DTE 3

97161

DTU 4

+

-

DTU 7

DTU 9

97161

DTE 3

97161

DTU 4

-

+

uin syarif hidayatullah jakartarepository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... · rachma...

Documents