uin syarif hidayatullah jakarta uji aktivitas...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI

EKSTRAK ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT DARI

AKAR TANAMAN KAYU JAWA (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr. )

SKRIPSI

Ahmad Hasyim Abbas

1113102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGRI (UIN) SYARIF

HIDAYATULLAH JAKARTA

AGUSTUS 2017

ii

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI

EKSTRAK ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT DARI

AKAR TANAMAN KAYU JAWA (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr. )

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

Ahmad Hasyim Abbas

1113102000010

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGRI (UIN) SYARIF

HIDAYATULLAH JAKARTA

AGUSTUS 2017

vi

ABSTRAK

Nama : Ahmad Hasyim Abbas

Program Study : Farmasi

Judul Skripsi : Uji Aktivitas Antioksidan dan Antibakteri Ekstrak Etil

Asetat Kapang Endofit dari Akar Tanaman Kayu Jawa

(Lannea Coromandelica (Houtt.) Merr.)

Kayu jawa atau dalam masyarakat Bugis dikenal dengan sebutan aju jawa

dipercaya ampuh dalam mengobati luka dalam dan luar. Selain itu, kulit batang

kayu jawa juga memiliki aktivitas trombolitik, antidiare dan antioksidan. Ekstrak

etanol dari akar kayu jawa mengandung alkaloid, karbohidrat, flavonoid,

triterpenoid, steroid, tanin, glikosida, saponin, dan protein. Tanaman yang banyak

mengandung senyawa fenolik seperti flavonoid dan tanin, senyawa nitrogen

seperti alkaloid dan terpenoid memiliki potensi sebagai antioksidan dan senyawa

alkaloid, fenol, steroid, tanin, flavonoid, dan saponin diketahui memiliki potensi

sebagai antimikroba. Oleh karena itu untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan

antibakteri pada isolat AP12A kapang endofit dari akar kayu jawa, dilakukan uji

aktivitas antibakteri dengan metode mikrodilusi menggunakan sterilized 96 round

bottom microwell plate dan uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH

(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) terhadap ekstrak etil asetat. Uji kuantitatif

antioksidan terhadap fraksi etil asetat menunjukkan nilai AAI 0,3 dan IC50

308,4326 ppm yang menunjukkan aktivitas antioksidan lemah. Uji aktivitas

antibakteri kuantitatif menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat memiliki nilai KHM

dan KBM terbesar terhadap bakteri Salmonella typhi ATCC 14028 dengan nilai

KHM 250 μg/mL dan KBM 500 μg/mL sedangkan KHM terhadap bakteri

Bacillus subtilis ATCC 6633 dan Staphylococus aureus ATCC 25923 sebesar

500 μg/mL, dan KBM sebesar 1000 dan >1000 μg/mL.

Kata Kunci : AAI, Antibakteri, Antioksidan, Kayu jawa, Lannea Coromandelica

(Houtt.) Merr, DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), Endofit, IC50, KBM

(konsentrasi bunuh minumum), KHM (konsentrasi hambat minimum), mikrodilusi

vii

ABSTRACT

Name : Ahmad Hasyim Abbas

Study Program : Pharmacy

Thesis Title : Antioxidant and Antibacterial Test Against Extract of

Ethyl Acetate Endophytic Fungi from The Roots of Kayu

Jawa (Lannea Coromandelica (Houtt.) Merr.).

Kayu Jawa or in the Bugis community known as Java aju believed effective in

treating wounds. The bark of Kayu Jawa has thrombolytic activity, antidiarrheal

and antioxidants. Ethanol extract from Kayu Jawa contains alkaloids,

carbohydrates, flavonoids, triterpenoids, steroids, tannins, glycosides, saponins,

and proteins. Plants contain phenolic compounds such as flavonoids and tannins,

nitrogen compounds such as alkaloids and terpenoids have potential antioxidants

activity and alkaloid compounds, phenols, steroids, tannins, flavonoids, and

saponins are known to have potential antimicrobials activity. Therefore,

antibacterial test was performed with microdilution methode using sterilized 96

round bottom microwell plate and antioxidant test was performed with DPPH

(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) methode against ethyl acetate extract to

determine the antioxidant and antibacterial activity in isolates AP12A of

endophytic fungi from the roots of Kayu Jawa. Antioxidant quantitative test,

showed that ethyl acetate extract have AAI 0.3 and IC 50 308.4326 ppm which

indicates a weak antioxidant activity. Antibacterial quantitative test showed that

the ethyl acetate extract have MIC and MBC biggest against Salmonella

typhi ATCC 14028 with a MIC of 250 µg/mL and MBC of 500 µg/ml while the

MIC against Bacillus subtilis ATCC 6633 and Staphylococus aureus ATCC

25923 500 µg/mL, and MBC 1000 and >1000 μg/mL

Keywords : AAI, Antibacterial, Antioxidant, Kayu jawa, Lannea Coromandelica

(Houtt.) Merr, DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl), Endophytic, IC50, MBC

(minimum Bactericidal concentration), MIC (minimum inhibition concentration)

viii

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil aalamiin, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat

Allah subhanahu wa ta’ala yang telah memberikan rahmat dan karunia kepada

penulis sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN DAN EKSTRAK ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT

DARI AKAR TANAMAN KAYU JAWA (Lannea Coromandelica (Houtt.)

Merr.).”Sholawat serta salam tak lupa tercurahkan kepada Rasulullah Nabi

Muhammad SAW beserta keluarga, sahabat dan para pengikutnya hingga akhir

zaman.

Penulis memohon maaf atas segala kekurangan dalam skripsi ini yang jauh

dari sempurna, tetapi harapan penulis semoga tulisan ini dapat bermanfaat kepada

banyak pihak serta menambah wawasan bagi pembacanya. Penulis juga

menyadari bahwa proses penyelesaian skripsi ini tidak terlepas dari bimbingan,

dukungan, dan do’a yang diberikan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan

segala kerendahan hati penulis menyampaikan penghargaan dan terimakasih yang

sebesar-besarnya kepada :

1. Kedua orang tua tercinta, Bapak tercinta Moh Mahfudz, Ibunda Siti

Nurjannah,S.Pdi yang senantiasa mencurahkan cinta, kasih sayang, do’a,

nasihat, serta dukungan baik moral maupun materil yang tak mampu

terbalaskan oleh apapun.

2. Adik tersayang Izatunnisa’ yang selalu menghiburku serta telah

memberikan doa dan dukungan baik moral maupun materil.

3. Nenek dan Kakek kami Hj Siti Fatimah dan H Nur Bahaauddin,Alm yang

selalu mendo’akan serta mendukung dengan kasih dan sayangnya.

4. Pakpoh Drs H Muh Badrudin M.pd Sekeluarga, Pakpoh Drs Sirojuddin

Sekeluarga, Om Hilaluddin S,Ag Sekeluarga, Om Diyauddin Sekeluarga,

Om Zakiuddin,S.Pd Alfauri Sekeluarga, Om Jaliluddin,S.Pd Bulek Siti

Komariah,S.Pdi Sekeluarga, Bulek Nur Laila,S.Pdi Sekeluarga yang selalu

ix

memberikan do’a, dukungan moral maupun materil.

5. Mbok Hj Ummi Badriyah dan Mbah Kung Abdurrohman, Paklek

Mahmud, Bulek Kip, serta saudara-saudaraku Mas Thofa sekeluarga, Mas

Ibtidaulhuda, Alm, Mas Fuad, Mbak Muhim, Mbak Uswatun, Mbak

Kholik yang selalu memberikan nasehat, motivasi serta serta do’a untuk

saya.

6. Puteri Amelia., M.Si, Apt, dan Narti Fitria, M.Si, selaku pembimbing yang

dengan sabar memberikan bimbingan, ilmu, masukan, dukungan, dan

semangat kepada penulis.

7. Dr. Arif Sumantri, M.KM selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

8. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

9. Nelly Suryani, Ph.D. Apt, selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

telah membimbing dan menerima keluh kesah selama perkuliahan.

10. Bapak dan Ibu Dosen Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan yang telah bersedia memberikan ilmunya kepada penulis

selama masa perkuliahan.

11. Team Endofit Ghifaril Azis, Fairuza Ajeng, Putri Agni Kreativita Ivada

yang telah berjuang Bersama dalam penelitian ini dan memberikan

motivasi dan bantuan selama penelitian

12. Teman-teman seperjuangan laboratorium Aulia Wardahani, Anggi, Asyraq

Fahruzzaman, Muhammad Faisal, Fandi Akhmad, Aisyah, Badriatun

Ni’mah, Fitrahtunnisa, Lisa Fizilalin, Nuril, Puspa Novadianti, Rizal,

Triwahyuni, Zakiyatul Munawaroh yang telah memberikan motivasi dan

bantuan selama penelitian.

13. Departemen Keislaman Dema FKIK periode 2016/2017 Auliani, Ramaza,

Jumia dan Azizah yang selalu mendukung penulis dalam penyelasaian

skripsi ini.

14. Kabinet FKIK Aksi Nyata periode 2016/2017 yang selalu mendukung

penulis dalam penyelasaian skripsi ini.

x

15. Teman terdekat Muhimmatunnisa, Hasan Asyari Khatib dan Aftah Naufal

yang selalu mendukung dan membantu dalam penyelesaian skripsi ini.

16. Teman-teman sejawat program studi Farmasi UIN Jakarta angkatan 2013

atas persaudaraan dan kebersamaan yang telah terjalin dan memotivasi

penulis baik selama pengerjaan skripsi ini maupun selama di bangku

perkuliahan.

17. Seluruh laboran Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Jakarta atas kerjasamanya selama melakukan penelitian di

laboratorium.

18. Semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penyelesaian

naskah skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang namanya

tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

Semoga Allah SWT memberikan balasan yang berlipat ganda atas semua

bantuan dan dukungan yang diberikan. Penulis menyadari bahwa penyusunan

skripsi ini masih belum sempurna dan banyak kekurangan. Oleh karena itu, saran

serta kritik yang membangun sangat diharapkan. Semoga skripsi ini bermanfaat

bagi penulis dan pembaca. Aamiin Ya Rabbal’alamiin.

Ciputat 2017

Ahmad Hasyim Abbas

xi

1 HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Ahmad Hasyim Abbas

NIM : 1113102000010

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi karya ilmiah

saya dengan judul:

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK

ETIL ASETAT KAPANG ENDOFIT DARI AKAR TANAMAN KAYU

JAWA (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu

Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademis sebatas sesuai dengan

Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat

dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada Tangggal : Agustus 2017

Yang Menyatakan

Ahmad Hasyim Abbas

xii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................ Error! Bookmark not defined.

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ... Error! Bookmark not defined.

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .... Error! Bookmark not defined.

LEMBAR PENGESAHAN ..................................... Error! Bookmark not defined.

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ..................................................... xi

DAFTAR ISI ........................................................................................................ xii

DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvii

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ............................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ....................................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................................... 4

1.4 Manfaat Penelitian ....................................................................................... 4

Manfaat Teoritis ........................................................................................ 4

Manfaat Aplikatif ...................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kayu Jawa (Lannea coromandelica) ........................................................... 5

Taksonomi................................................................................................. 5

Deskripsi Tanaman ................................................................................... 5

2.2 Ektraksi ........................................................................................................ 6

2.3 Pelarut .......................................................................................................... 6

2.4 Kapang Endofit ........................................................................................... 8

Deskripsi ................................................................................................... 8

Mekanisme Kerja Kapang Endofit............................................................ 9

Metabolit Sekunder dan Manfaat Kapang Endofit ................................... 9

2.5 Fermentasi ................................................................................................. 10

2.6 Media Fermentasi ...................................................................................... 11

2.7 Bakteri Uji ................................................................................................. 12

Staphylococcus aureus ............................................................................ 12

Escherichia coli ...................................................................................... 13

xiii

Salmonella typhi...................................................................................... 13

Bacillus Subtilis ...................................................................................... 14

Pseudomonas aeruginosa ....................................................................... 14

2.8 Antibiotik .................................................................................................. 15

Kloramfenikol ......................................................................................... 16

2.9 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................... 16

Metode Difusi ......................................................................................... 16

Metode Dilusi.......................................................................................... 17

Metode Bioautografi ............................................................................... 17

2.10 Antioksidan ............................................................................................... 19

2.11 Uji Antioksidan ......................................................................................... 19

Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)...................................... 19

Mekanisme Kerja 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ..................... 20

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................... 22

3.2 Alat dan Bahan .......................................................................................... 22

Alat. ......................................................................................................... 22

Bahan ...................................................................................................... 22

3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................... 23

Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme.................................. 23

Pemurnian Kapang Endofit ..................................................................... 24

Karakterisasi Kapang Endofit ................................................................. 24

Peremajaan Bakteri Uji ........................................................................... 25

Uji Kemurnian Bakteri Uji...................................................................... 25

Pembuatan Suspensi Bakteri Uji ............................................................. 26

Uji Pendahuluan Kapang Endofit Penghasil Antibakteri........................ 26

Fermentasi Kapang Endofit .................................................................... 27

Ekstraksi .................................................................................................. 27

Analisis KLT dan Sekrining Fitokimia ................................................... 27

Uji Aktivitas Antioksidan ....................................................................... 28

Uji Aktivitas Antibakteri Metode Mikrodilusi ....................................... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pemurnian Kapang Endofit ....................................................................... 33

4.2 Karakterisasi Kapang Endofit ................................................................... 33

4.3 Uji Kemurnian Bakteri Uji ........................................................................ 35

xiv

4.4 Uji Pendahuluan Kapang Endofit Penghasil Antibbakteri ........................ 36

4.5 Fermentasi ................................................................................................. 38

4.6 Ekstraksi .................................................................................................... 39

4.7 Analisis KLT Dan Skrining Fitokimia ...................................................... 40

4.8 Uji Aktifitas Antioksidan .......................................................................... 41

Uji Aktivitas Antioksidan Kualitatif ....................................................... 41

Uji Antioksidan Kuantitatif..................................................................... 42

4.9 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................... 46

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 51

5.2 Saran .......................................................................................................... 51

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 52

LAMPIRAN ......................................................................................................... 60

xv

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Penampak Isolat AP12A Secara Makroskopik dan Mikroskopik .........34

Tabel 4.2. Hasil karakteriasi mikroskopik mikroorganisme uji .............................35

Tabel 4.3. Hasil Zona Hambat Kapang Endofit Terhadap Bakteri Uji ..................37

Tabel 4.4. Karakteristik Dan Bobot Ekstrak Hasil Fermentasi Isolat AP12A .......39

Tabel 4.5. Hasil Analisis KLT dan eluen yang digunakan ....................................40

Tabel 4.6. Hasil skrining fitokimia ekstrak fraksi etil asetat dan n-heksana .........41

Tabel 4.7. Hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif.....................................42

Tabel 4.8. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Ekstrak Etil Asetat. .........44

Tabel 4.9. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Vitamin C ........................44

Tabel 4.10. Hasil Nilai KHM dan KBM Ekstrak Etil Asetat .................................48

xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan ........................21

Gambar 4.1. Kurva Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi Ekstrak Etil Asetat....45

Gambar 4.2. Kurva Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi Vitamin C .................46

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian ........................................................................60

Lampiran 2. Sertifikat Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 ...................61

Lampiran 3. Sertifikat Bakteri Salmonella typhi ATCC 14028 .............................62

Lampiran 4. Sertifikat Bakteri Bacillus subtilis ATCC 6633 ................................63

Lampiran 5. Sertifikat Ciprofloksasin ....................................................................64

Lampiran 6. Sertifikat Kloramfenikol ....................................................................65

Lampiran 7. Skema Pemurnian Kapang Endofit....................................................66

Lampiran 8. Skema Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik .......................67

Lampiran 9. Hasil Uji Pendahuluan Isolat (AP12A) .............................................68

Lampiran 10. Skema Metode Fermentasi dan Hasil Fermentasi ...........................76

Lampiran 11. Skema Ekstraksi ..............................................................................77

Lampiran 12. Hasil Skrining Fitokimia .................................................................78

Lampiran 13. Skema Uji Aktivitas Antioksidan ....................................................81

Lampiran 14. Perhitungan dalam Uji Antioksidan ................................................83

Lampiran 15. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Basillus subtilis. ...............85

Lampiran 16. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Stapillococcus aureus. .....86

Lampiran 17. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Salmonella typhi. ..............87

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang memiliki kekayaan alam yang melimpah

dan memiliki area hutan hujan tropis yang luas. Hutan hujan tropis merupakan

sumber tumbuh-tumbuhan yang mengandung senyawa bioaktif yang potensial

(Strobel, 2003). Kekayaan alam Indonesia salah satunya ialah tanaman kayu jawa

(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) yang tumbuh di Sulawesi Selatan.

Kayu jawa digunakan sebagai obat tradisional oleh masyarakat Bugis di

Sulawesi Selatan. Kayu jawa atau dalam masyarakat Bugis dikenal dengan

sebutan aju jawa dipercaya ampuh dalam mengobati luka dalam dan luar (Amin

dan Yuliana, 2010). Selain itu, kulit batang kayu jawa juga memiliki aktivitas

trombolitik (Wahid, 2009), antidiare (Majumder, et al., 2013), antioksidan

(Wahid, 2009 ; Prawirodihirjo, 2014), dan antiinflamasi (Saputra, 2015). Arun

Joshi dan Nikita Naik (2014) menyatakan bahwa ekstrak etanol dari akar kayu

jawa mengandung alkaloid, karbohidrat, flavonoid, triterpenoid, steroid, tanin,

glikosida, saponin, dan protein.

Berdasarkan studi fitokimia, kulit batang tanaman kayu jawa telah

dilaporkan mengandung senyawa golongan karbohidrat, steroid, alkaloid,

terpenoid, tanin, dan flavonoid (Manik, et al., 2013). Menurut Ivanišová, et al.,

(2013) Tanaman yang banyak mengandung senyawa fenolik seperti flavonoid

dan tanin, senyawa nitrogen seperti alkaloid dan terpenoid memiliki potensi

sebagai antioksidan.

Wahid (2009) telah melaporkan ekstrak metanol daun dan batang kayu jawa

yang dipartisi dengan n-heksana, diklorometan : etil asetat, dan air pada pengujian

antioksidan dengan metode DPPH, didapatkan IC50 ketiga fraksi tersebut berturut-

turut 3,8 µg/ml, 8 µg/ml, dan 6 µg/ml, dengan kontrol pembanding Vitamin C

dengan IC50 24 µg/ml. Selain itu Manik et al. (2013) dalam penelitiannya

menyatakan bahwa fraksi n-heksana, diklorometana, dan etil asetat kulit batang

dan daun tumbuhan kayu jawa memiliki aktivitas antioksidan, antimikroba, dan

2


trombolitik. Fraksi etil asetat menunjukkan aktivitas antioksidan paling besar

dengan IC50 sebesar 3,8±0,14 μg/ml

Senyawa alkaloid, fenol, steroid, tanin, flavonoid, dan saponin diketahui

menjadi senyawa yang berpotensi sebagai antimikroba (Brian dan Christian,

1996). Gauniyal dan Teotia (2015) melaporkan bahwa ekstrak etanol ranting

Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. memberikan zona hambat terhadap

pertumbuhan mikroorganisme Streptococcus mutans, Lactobacillus acidophilus,

Enterococcus faecalis, dan Candida albicans. Aktivitas antimikroba dihasilkan

pula dari ekstrak kulit batang kayu jawa terhadap bakteri Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa (Rahmadani,

2015), Aspergillus niger, dan Trichophyton rubrum (Mozer, 2015).

Potensi tumbuhan obat berhubungan dengan mikroorganisme yang hidup di

jaringan tumbuhan. Mikroorganisme tersebut dikenal sebagai mikroba endofit,

yaitu mikroba yang hidup dalam periode tertentu dan membentuk koloni di dalam

jaringan tumbuhan tanpa merugikan inangnya (Dompeipen dan Simanjuntak,

2015). Beberapa mikroba endofit dapat menghasilkan senyawa-senyawa bioaktif

sebagai senyawa metabolit sekunder yang memiliki daya antimikroba,

antimalaria, antikanker dan sebagainya. Mikroba endofit selain memiliki peranan

penting dalam dunia pengobatan, juga memiliki peranan penting dalam dunia

industri dan pertanian (Strobel dan Daisy, 2003).

Penelitian terhadap bagian akar tanaman kayu jawa masih belum banyak

dilakukan. Hal ini dikarenakan adanya kendala dalam pengambilan bagian akar

karena memerlukan satu pohon untuk mendapatkannya. Untuk mengatasi kendala

tersebut, peneliti menggunakan metode endofit karena tidak membutuhkan banyak

sampel.

Endofit menjadi terobosan baru dalam meminimalisir pemakaian bahan

baku tanaman. Selain itu, jamur yang merupakan salah satu jenis endofit juga

menjadi bagian organisme eukariot yang banyak diekplorasi untuk kepentingan

medis, jika dibandingkan dengan sesamanya dalam hal untuk mendapatkan

senyawa bioaktif, jamur endofit lebih unggul daripada jamur yang berasal dari

tanah atau jamur yang berkolaborasi dengan algae (Suryanarayanan, et al., 2009).

3


Di dalam penelitian Zulfa (2016), terdapat isolat (AP12A) kapang endofit

yang diperoleh dari akar kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr) yang

mempunyai daya hambat terhadap Escherichia coli, Helicobacter pylori,

Salmonella typhi, dan Staphylococcus aureus. Potensi adanya senyawa di

dalamnya juga terlihat dari hasil KLT (Kromatografi Lapis Tipis) ekstrak kapang

yang menunjukkan adanya spot yang aktif pada fraksi etil asetat dan n-heksana.

Kandungan senyawa isolat kapang endofit dari akar kayu jawa berpotensi sebagai

antibakteri dan antioksidan, sehingga dapat dijadikan sebagai usaha untuk

mengeksplorasi kekayaan alam Indonesia tanpa mengeksploitasi keanekaragaman

hayati.

Berdasarkan uraian di atas peneliti ingin melanjutkan dan

mengembangkan penelitian yang telah dilakukan oleh Zulfa (2016) yang telah

menguji aktivitas antibakteri secara kualitatif dengan metode difusi isolat

(AP12A) kapang endofit dari akar tanaman kayu jawa (Lannea coromandelica

(Houtt.) Merr.). Peneliti ingin memfokuskan pengamatan pada isolat yang

memiliki aktivitas antibakteri secara kuantitatif dengan metode mikrodilusi yaitu

isolat (AP12A) dan menguji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dari

isolat tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan masalah sebagai

berikut:

a. Belum diketahui adanya senyawa yang memiliki ativitas antioksidan dari

ekstrak isolat (AP12A) kapang endofit dari akar tanaman kayu jawa

(Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.)

b. Belum diketahui adanya aktivitas antibakteri dari ekstrak etil asetat, isolat

(AP12A) kapang endofit dari akar tanaman kayu jawa (Lannea

coromandelica (Houtt.) Merr.) terhadap bakteri Escherichia coli,

Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa dan

Bacillus subtilis secara kuantitatif dengan metode mikrodilusi.

4


1.3 Tujuan Penelitian

a. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan ekstrak isolat (AP12A) kapang

endofit dari akar tanaman kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.)

Merr.) pada fraksi n-heksana dan etil asetat.

b. Untuk memperoleh ekstrak isolat (AP12A) kapang endofit dari akar

tanaman kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) yang

mempunyai aktivitas antibakteri serta untuk mengetahui Konsentrasi

Hambat Minimum (KHM) dan Konsentasi Bunuh Minimum (KBM)

ekstrak etil asetat terhadap bakteri Escherichia coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat Teoritis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah

mengenai kapang endofit dari akar kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.)

Merr.) dan aktivitasnya sebagai antibakteri terhadap Escherichia coli, Salmonella

typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, serta

adanya aktivitas Antioksidan pada isolat kapang (AP12A) dari akar tanaman kayu

jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr. ).

Manfaat Aplikatif

Hasil yang diperoleh diharapkan dapat dijadikan sebagai sebagai acuan

dalam pengembangan antibiotik dan antioksidan yang bersumber dari ekstrak

kapang endofit akar kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.).

5


2 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kayu Jawa (Lannea coromandelica)

Taksonomi

Klasifikasi tanaman kayu jawa Lannea coromandelica adalah sebagai

berikut :

Kingdom : Plantae

Phylum : Tracheophyta

Divisi : Magnoliopsida

Ordo : Sapindales

Famili : Anacardiaceae

Genus : Lannea

Spesies : Lannea coromandelica

(GBIF, 2017)

Deskripsi Tanaman

Kayu jawa merupakan deciduous tree atau pohon gugur yang dapat

tumbuh hingga mencapai 25 m (umumnya 10-15 m). Permukaan batang berwarna

abu-abu sampai coklat tua, kasar, ada pengelupasan serpihan kecil yang tidak

teratur, batang dalam berserat berwarna merah atau merah muda gelap dan

memiliki eksudat yang bergetah. Daun meruncing, dan berjumlah 7-11. Bunga

berkelamin tunggal berwarna hijau kekuningan. Buah berbiji, panjang 12 mm,

bulat telur, kemerahan, dan agak keras. Tanaman ini berbunga dan berbuah dari

bulan Januari hingga Mei. Lannea coromandelica memiliki sinonim Odina wodier

yang tersebar di Himalaya (Swat-Bhutan), Assam, Burma, Indo-China, Ceylon,

Pulau Andaman, China, dan Malaysia (Kumar, et al., 2011)

Tanaman kayu jawa merupakan tanaman pekarangan yang dapat

dimanfaatkan daun dan kulit batangnya dengan cara ditumbuk ataupun direbus

untuk mengobati luka luar, luka dalam, dan perawatan paska persalinan (Rahayu,

et al., 2006). Kulit batang dapat digunakan sebagai astringen, mengobati sakit

perut, lepra, tukak lambung, penyakit jantung, disentri, dan sariawan. Kulit batang

digunakan bersama dengan kulit batang Aegle mermelos, Artocarpus


heterophyllus dan Sygygium cumini berguna dalam penyembuhan impotensi.

Perebusan daun juga dianjurkan untuk mengobati pembengkakan dan nyeri lokal

(Wahid, 2009).

2.2 Ektraksi

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (DepKes RI, 2000). Ekstraksi adalah penarikan kandungan kimia yang

dapat larut sehinggga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut

cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan

senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein dan lain-lain.

Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan kedalam

golongan minyak atsiri, alkaloid, flavonoid dan lain-lain. Dengan diketahuinya

senyawa aktif yang terkandung dalam simplisia akan mempermudah pemilihan

pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (DepKes RI, 2000).

Ekstraksi adalah pemisahan bagian aktif sebagai obat dari jaringan

tumbuhan ataupun hewan menggunakan pelarut yang sesuai melalui prosedur

yang telah ditetapkan. Selama proses ekstraksi, pelarut akan berdifusi sampai ke

material padat dari tumbuhan dan akan melarutkan senyawa dengan polaritas yang

sesuai dengan pelarutnya (Tiwari, et al., 2011).

2.3 Pelarut

Pelarut adalah zat yang digunakan sebagai media untuk melarutkan zat lain.

Kesuksesan penentuan senyawa biologis aktif dari bahan tumbuhan sangat

tergantung pada jenis pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi. Sifat

pelarut yang baik untuk ekstraksi yaitu toksisitas dari pelarut yang rendah, mudah

menguap pada suhu yang rendah, dapat mengekstraksi komponen senyawa

dengan cepat, dapat mengawetkan dan tidak menyebabkan ekstrak terdisosiasi

(Tiwari, et al., 2011).

Pemilihan pelarut tergantung pada senyawa yang ditargetkan. Faktor- faktor

yang mempengaruhi pemilihan pelarut adalah jumlah senyawa yang akan

diekstraksi, laju ekstraksi, keragaman senyawa yang akan diekstraksi, kemudahan


dalam penanganan ekstrak untuk perlakuan berikutnya, toksisitas pelarut dalam

proses bioassay, potensial bahaya kesehatan dari pelarut (Tiwari, et al., 2011).

Berbagai pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi antara lain :

1) Air

Air adalah pelarut yang universal, biasanya digunakan untuk mengekstraksi

produk tumbuhan yang mempunyai aktivitas antimikroba. Meskipun

pengobatan secara tradisional menggunakan air sebagai pelarut, tetapi

ekstrak tumbuhan dari pelarut organik telah ditemukan untuk memberikan

aktivitas antimikroba lebih konsisten dibandingkan dengan ekstrak air. Air

juga melarutkan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas penting sebagai

antioksidan (Tiwari, et al., 2011).

2) Aseton

Aseton dapat melarutkan beberapa komponen senyawa hidrofilik dan

lipofilik dari tumbuhan. keuntungan pelarut aseton yaitu dapat bercampur

dengan air, mudah menguap dan memiliki toksisitas rendah. Aseton

digunakan terutama untuk studi antimikroba dimana banyak senyawa

fenolik yang terekstraksi dengan aseton (Tiwari, et al., 2011).

3) Alkohol

Aktivitas antibakteri yang lebih tinggi dari ekstrak etanol dibandingkan

dengan ekstrak air dapat dikaitkan dengan adanya jumlah polifenol yang

lebih tinggi pada ekstrak etanol dibandingkan dengan ekstrak air.

Konsentrasi yang lebih tinggi dari senyawa flavonoid terdeteksi dengan

etanol 70% karena polaritas yang lebih tinggi daripada etanol murni. Etanol

lebih mudah untuk menembus membran sel untuk mengekstrak bahan

intraseluler dari bahan tumbuhan. Metanol lebih polar dibanding etanol

namun karena sifat yang toksik, sehingga tidak cocok digunakan untuk

ekstraksi (Tiwari, et al., 2011).

4) Kloroform

Terpenoid lakton telah diperoleh dengan ekstraksi berturut-turut

menggunakan heksana, kloroform dan metanol dengan konsentrasi aktivitas

tertinggi terdapat dalam fraksi kloroform. Kadang-kadang tanin dan


terpenoid ditemukan dalam fase air, tetapi lebih sering diperoleh dengan

pelarut semipolar (Tiwari, et al., 2011).

5) Eter

Eter umumnya digunakan secara selektif untuk ekstraksi kumarin dan asam

lemak (Tiwari, et al., 2011).

6) N-Heksana

N-Heksana mempunyai karakteristik sangat tidak polar, volatil, mempunyai

bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. Berat molekul heksana adalah

86,2 gram/mol dengan titik leleh -94,3 sampai -95,3°C. Titik didih heksana

pada tekanan 760 mmHg adalah 66 sampai 71° C (Dainitith, 1994). N-

Heksana biasanya digunakan sebagai pelarut untuk ekstraksi minyak nabati.

7) Etil asetat

Etil asetat merupakan pelarut dengan karakateristik semipolar. Etil asetat

secara selektif akan menarik senyawa yang bersifat semipolar seperti fenol

dan terpenoid (Tiwari, et al., 2011).

2.4 Kapang Endofit

Deskripsi

Kapang endofit adalah kapang yang hidup di dalam jaringan tanaman pada

periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Tanaman yang

mengandung endofit sering tumbuh lebih cepat dari tanaman yang tidak terinfeksi.

Selain itu juga endofit dapat membantu inang dalam mengambil nutrisi seperti

nitrogen dan fosfor (Purwanto, 2011).

Kapang adalah organisme yang paling sering diisolasi sebagai endofit

(Strobel dan Daisy, 2003). Kapang endofit dapat diisolasi dari hampir semua

jaringan tanaman, namun memerlukan seleksi dan skrining yang ketat untuk dapat

mengidentifikasi kapang endofit yang menghasilkan metabolit sekunder yang

memiliki aktivitas biologi. Bagian organ atau jaringan tanaman tertentu dapat

mengandung kapang endofit tertentu pula yang berbeda satu dengan yang lainnya,

hal ini merupakan mekanisme adaptasi dari endofit terhadap mikroekologi dan

kondisi fisiologis yang spesifik dari masing-masing tanaman inang (Wahyudi,

2001). Kapang yang masih dalam bentuk spora baik dalam daun, akar dan batang


tidak dapat diamati tanpa ditumbuhkan dalam medium pertumbuhan. Populasi

kapang endofit yang terdapat pada batang dan daun lebih banyak dibandingkan

pada akar (Purwanto, 2011).

Mekanisme Kerja Kapang Endofit

Endofit dapat berperan sebagai perangsang pertumbuhan tanaman dan

meningkatkan hasil melalui produksi fitohormon dan penyedia hara, sebagai

penetral kontaminan tanah sehingga meningkatkan fitoremidiasi, dan agen

pengendali hayati. Endofit juga dapat berperan dalam mengurangi infeksi

nematoda, meningkatkan ketahanan tanaman, memproduksi metabolit sekunder

seperti alkaloid, steroid dan lain-lain (Yulianti, 2012).

Interaksi endofit yang terjadi dengan tanaman inangnya adalah umumnya

simbiosis mutualisme. Mikotoksin yang dihasilkan kapang endofit seperti alkaloid

pada tanaman rumput-rumputan mampu melindugi inang dari serangan

invertebrata herbivor, nematoda dan patogen. Endofit juga mampu menghasilkan

senyawa metabolit yang berperan melindungi inang tanaman dari kondisi

lingkungan ekstrim. Endofit yang berada dalam jaringan daun dan ranting

tanaman juga berperan dalam peningkatan ketahanan dari tanaman (Ariyono, et

al., 2014).

Metabolit Sekunder dan Manfaat Kapang Endofit

Kapang endofit memiliki prospek yang baik dalam penemuan sumber-

sumber senyawa bioaktif yang dalam perkembangan lebih lanjut dapat dijadikan

sebagai sumber penemuan obat untuk berbagai penyakit. Beberapa metabolit

sekunder yang diproduksi oleh endofit yang telah berhasil diisolasi dan

dimurnikan diantaranya adalah sebagai penghasil antibiotik, antivirus, antikanker,

antimalaria, dan antioksidan (Radji, 2005).

Berbagai jenis endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman inangnya, dan

telah berhasil ditumbuhkan dalam medium yang sesuai. Metabolit sekunder yang

diproduksi oleh kapang endofit tersebut telah berhasil diisolasi dan dimurnikan

serta telah dielusidasi struktur molekulnya (Strobel dan Daisy, 2003). Beberapa

metabolit sekunder dan endofit yang berhasil diisolasi dari beberapa tanaman

diantaranya yaitu :

1) Mikroba endofit yang menghasilkan antibiotik (Strobel dan Daisy, 2003).


a. Muscodor albus merupakan fungi endofit yang dihasilkan dari

Cinnamomum zeylanicum, yaitu fungi yang tidak berspora yang efektif

mencegah pertumbuhan fungi dan bakteri lain dengan menghasilkan

senyawa volatil.

b. Cryptosporiopsis quercina, yaitu fungi yang diisolasi dari tanaman

Tripterigeum wilfordii yang menghasilkan criptocandin, mempunyai

aktivitas sebagai antifungi terhadap fungi patogen pada manusia yaitu

Candida albicans dan Trichopyton sp. Cryptosporiopsis quercina juga

menghasilkan cryptocin, yaitu tetramic acid, yang mempunyai aktivitas

terhadap Pyricularia oryzae serta sejumlah jamur yang patogen terhadap

tanaman.

c. Pseudomonas viridiflava, yaitu fungi endofit yang menghasilkan ecomycin

aktif terhadap fungi patogen terhadap manusia yaitu Cryptococcus

neoformans dan Candida albicans. Ecomycin merupakan lipopeptida dan

memiliki berat molekul 1,153 dan 1,181.

d. Phomopsis sp. menghasilkan phomopsichalasi yang mempunyai aktivitas

sebagai antibakteri terhadap Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,

Salmonella enterica sv Gallinarum, dan juga dapat menghambat

pertumbuhan jamur Candida tropicalis.

2) Endofit yang menghasilkan antioksidan

Endofit Pestalotiopsis microspora menghasilkan senyawa pestacin dan

isopestacin yang berhasil diisolasi dari tanaman Terminalia morobensis, yaitu

tumbuhan yang hidup di Papua New Guinea. Baik pestacin ataupun

isopestacin berhasiat sebagai antioksidan. Isopestacin diduga mempunyai

aktivitas antioksidan berdasarkan struktur molekulnya yang mirip dengan

flavonoid (Strobel dan Daisy, 2003).

2.5 Fermentasi

Fermentasi dalam mikrobiologi industri digambarkan sebagai proses untuk

mengubah bahan dasar menjadi produk yang dikehendaki dalam kultur mikroba

tertentu. Pengambilan hasil fermentasi, terdapat sejumlah tahapan yang tergantung

bahan awal, konsentrasi awal, kestabilan produk, dan tingkat kemurnian produk

akhir yang diinginkan (Purwanto, 2011).


Fermentasi dapat menghasilkan : a) Biomassa (sel-sel mikroba), misalnya

protein sel tunggal; b) Enzim, misalnya amylase dan protease; c) Metabolit

mikroba, yaitu metabolit primer misalnya polisakarida, protein, asam nukleat, dan

metabolit sekunder misalnya antibiotika; d) Produk rekombinan, misalnya insulin

dan interferon; dan e) Biokonversi, misalnya konversi asam asetat dari etanol,

aseton dari propanol, sorbitol serta produk steroid, antibiotika dan prostaglandin

(Purwanto, 2011).

2.6 Media Fermentasi

Media yang digunakan dalam fermentasi dapat berupa media cair dikenal

dengan ‘submerged’, dalam permukaan air atau media padat disebut ‘surface’ di

atas permukaan (Okafor, 2007). Fermentasi media padat umumnya digunakan

untuk produksi enzim dan asam organik yang menggunakan kapang (Radji, et al.,

2011). Akan tetapi media yang sering digunakan berupa media cair, sebab area

media cair cukup aman dan mudah dikontrol. Sementara volume media

disesuaikan dengan tujuan fermentasi. Nutrisi yang diberikan dalam media

fermentasi terdiri dari beragam seperti, umumnya selalu terdapat karbohidrat

kompleks (Okafor, 2007). Nutrisi tersebut harus memenuhi kebutuhan

mikroorganisme terhadap air, energi, sumber karbon, nitrogen, dan mineral

(Radji, et al., 2011).

Sebelum fermentasi, kemurnian dari inokulum harus dipastikan,

sebagaimana sterilitas dalam pengerjaan (Okafor, 2007). Selama masa fermentasi,

tidak boleh ditambahkan zat apapun ke dalam fermentor, kecuali oksigen (untuk

mikroorganisme aerob), agen antibusa, atau pengontrol pH (Brian dan Christian,

1996). Kandungan media kultur, konsentrasi biomassa dan metabolit akan

berubah secara konstan sebanding dengan metabolisme sel selama fermentasi

(Brian dan Christian, 1996).

Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kocok menggunakan alat

pengocok atau metode diam dengan menginkubasi mikroorganisme tanpa

goncangan (Kumala, 2014). Metabolit yang dihasilkan berupa metabolit sekunder

ekstraseluler yang terdapat pada supernatan atau filtrat dan metabolit sekunder

intraseluler yang terkandung dalam biomassa kapang (Gandjar dan Sjamsuridzal

2006). Ekstraksi bahan yang dihasilkan dari proses fermentasi tergantung produk


akhir yang diharapkan apakah mikroorganisme itu sendiri atau metabolit yang

dihasilkan mikroorganisme tersebut (Okafor, 2007).

2.7 Bakteri Uji

Staphylococcus aureus

Kingdom : Monera

Divisi : Protophyta

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Famili : Micrococcaceae

Spesies : Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus merupakan bakteri kokus Gram positif,

berdiameter 1 μm (Pratiwi, 2008). Kokusnya tersusun tidak teratur. Bentuk seperti

anggur yang tidak teratur ini tampak bila bakteri ditumbuhkan pada medium

padat, tetapi biasanya terlihat seperti rantai pendek bila ditumbuhkan pada

medium cair. Apusan yang diambil dari nanah menunjukan keberadaan yang

tunggal atau berpasangan, tandanan, atau rantai pendek yang terdiri dari tiga atau

empat sel (Parija, 2009).

Bakteri Staphylococcus aureus mengeluarkan toksin pada makanan

berprotein tinggi (daging, telur, susu, ikan). Toksin yang dikeluarkan oleh bakteri

ini relatif tahan panas dan tidak mudah dimusnahkan dengan pemanasan normal

pada prosedur pemasakan makanan. Bakteri Staphylococcus aureus merupakan

salah satu bakteri yang cukup kebal di antara mikroorganisme lainnya, dan tahan

pemanasan 60°C selama 30 menit. bakteri ini memproduksi enterotoksin yang

bersifat stabil terhadap pemanasan dan tahan terhadap aktivitas pemecahan oleh

enzim-enzim pencernaan. Selain enterotoksin, bakteri ini juga memproduksi

hemolisin, yaitu toksin yang dapat merusak dan memecah sel-sel darah merah.

Makanan yang mengandung enterotoksin, yang masuk ke dalam saluran

pencernaan akan mencapai usus halus, selanjutnya dengan cepat akan merusak

dinding usus halus dan menimbulkan sekresi jaringan usus (Pratiwi, 2008).


Escherichia coli

Kingdom : Procaryotae

Divisi : Gracilicutes

Kelas : Scotobacteria


Famili : Enterobacteriaceae

Genus : Escherichia

Spesies : Escherichia coli

Escherichia coli merupakan Gram negatif berukuran basil yang berukuran

sekitar 1-3 x 0,4-0,7 μm. Basil tersusun secara tunggal ataupun berpasangan.

Escherichia coli merupakan bakteri aerob dan anaerob fakultatif. Tumbuh pada

rentan suhu 10-41°C (suhu optimum 37°C) dan pH 7,2. Bakteri tumbuh pada

berbagai medium Mueller-Hinton Agar, Nutrient Agar, Blood Agar. dan

MacConkey Agar. Isolasi utama dapat ditemukan dari Nutrient Agar dan Blood

Agar (Parija, 2009).

Escherichia coli merupakan bakteri utama pada flora normal usus. Bakteri

ini dikenal sebagai bakteri yang sedikit membahayakan dan juga patogen.

Escherichia coli menyebabkan penyakit dengan spektrum luas pada manusia.

Merupakan penyebab penting enterik, infeksi saluran urin, neonatal sepsis dan

neonatal meningitis. Hemolytic Uremic Syndrome merupakan komplikasi serius

terhadap infeksi enterik dengan rantai spesifik Escherichia coli (Parija, 2009).

Salmonella typhi

Kingdom : Bakteria

Phylum : Proteobakteria

Classis : Gamma proteobakteria

Ordo : Enterobakteriales

Familia : Enterobakteriakceae

Genus : Salmonella

Species : Salmonella thyposa

Salmonella typhi berbentuk batang peritrichous dengan ukuran 2-4 µm,

Gram negatif, tidak berspora, bergerak dengan flagel peritrik, dan motil (Bauman,


Robert W, 2012). Bakteri yang masuk dalam famili Enterobacteriaceae ini hidup

pada kondisi anaerob fakultatif (Zhang, et al., 2008).

Salmonella typhi bukan merupakan flora normal manusia (Bauman, Robert

W, 2012). Salmonella thypi merupakan bakteri patogen terhadap manusia yang

bertanggung jawab terhadap terjadinya infeksi pada sistemik dan demam tifus.

Bakteri ini tersebar luas di Afrika, Asia, dan Amerika Selatan. Bakteri Salmonella

typhi telah resisten terhadap sejumlah antibiotik seperti ampisilin, kloramfenikol,

dan trimetoprim-sulfametoksazol di wilayah Asia Selatan (Zhang, et al., 2008).

Bacillus Subtilis

Kingdom : Prokaryota

Divisi : Bacteria

Kelas : Schizomyces


Famili : Bacillaceae

Genus : Bacillus

Spesies : Bacillus subtilis

Bacillus subtilis merupakan bakteri Gram positif, kemoorganotrof yang

memiliki bentuk basil atau batang atau silinder tunggal dengan panjang 0,3–2,2

µm × 1,27–7,0 µm. Sebagian besar bergerak dengan flagellum khas lateral dan

membenuk endospora tidak lebih dari satu dalam satu sel sporangium. Bacillus

subtilis termasuk aerobik sejati atau anaerobik fakultatif dan umum dijumpai

dalam tanah (Adji, et al., 2007 ; Pratiwi, 2008)

Suhu optimum pertumbuhan Bacillus subtilis yaitu antara 25-37°C. Bacillus

subtilis merupakan bakteri patogen yang dapat menyebabkan penyakit pada

manusia dengan sistem imun terganggu, misalnya diare dan meningitis. Bakteri

ini juga dikenal sebagai penyebab keasaman pada makanan kaleng karena

fermentasi gula yang dikandung bahan pangan tersebut (Kumala dan Pratiwi,

2014).

Pseudomonas aeruginosa

Kingdom : Bacteria

Phylum : Proteobacteria

Kelas : Gamma proteobacteria


Ordo : Pseudomonadales

Famili : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Spesies : Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa merupakan bakeri patogen Gram negatif

berbentuk tangkai berukuran 0,6-2 μm. Pseudomonas aeruginosa hanya sedikit

ditemukan pada flora saluran pencernaan dan pada kulit manusia (Rachmayani,

2008).

Pseudomonas aeruginosa merupakan patogen oportunistik yaitu

memanfaatkan kerusakan pada mekanisme pertahanan inang untuk memulai suatu

infeksi. Sehingga infeksi lebih sering terjadi pada seseorang yang mengalami

gangguan sistem pertahanan tubuh. Kelainan klinis yang ditimbulkan oleh

Pseudomonas aeruginosa antara lain: infeksi pada luka bakar, infeksi saluran

kemih, endokarditis, gastroenteritis, pneumonia dan lain-lain (Jauhari, 2010).

2.8 Antibiotik

Antimikroorganisme atau antibiotik merupakan senyawa atau substansi

kimia yang berasal dari mikroorganisme dan digunakan untuk mengendalikan

pertumbuhan mikroorganisme lain yang bersifat merugikan baik melalui

penghambatan pertumbuhan bakteri (bakteriostatik) maupun dengan membunuh

bakteri (bakterisida). Pengendalian pertumbuhan mikroorganisme bertujuan untuk

mencegah penyebaran penyakit dan infeksi, membasmi mikroorganisme pada

inang yang terinfeksi, dan mencegah pembusukan serta perusakan bahan oleh

mikroorganisme. Antimikroorganisme meliputi golongan antibakeri, antifungi,

dan antiviral (Sulistyo, 1971).

Pencarian antibiotik dimulai pada akhir tahun 1800-an ketika teori tentang

asal-usul penyakit yang menyebutkan bahwa bakteri dan mikroorganisme lain

sebagai penyebab penyakit diterima oleh masyarakat luas. Kemudian penemuan

sumber-sumber antibiotik baru di alam terus dilakukan dengan cara penapisan

atau skrining untuk menemukan mikroorganisme penghasil antibiotik. Strain

mikrorganisme yang berguna untuk menghasilkan antibiotik harus mampu

menghasilkan metabolit yang dapat menghambat pertumbuhan atau reproduksi

mikroorganisme patogen (Pratiwi, 2008).


Antibiotik dapat diklasifikasikan berdasarkan spektrum atau kisaran kerja,

mekanisme kerja, strain penghasil, cara biosintesis, maupun berdasarkan struktur

biokimianya. Berdasarkan spektrum atau kisaran kerjanya, antibiotik dibedakan

menjadi antibiotik dengan spektrum sempit dan luas. Antibiotik dengan spektrum

sempit hanya mampu menghambat segolongan jenis bakteri saja, misalnya hanya

bakteri Gram negatif saja atau Gram positif saja, sedangkan antibiotik dengan

spektrum luas dapat menghambat atau membunuh bakteri dari golongan Gram

negatif maupun Gram positif (Pratiwi, 2008).

Kloramfenikol

Kloramfenikol memiliki rumus kimia C11H12Cl2N2O5 dengan bobot

molekul 323,1. Kloramfenikol awalnya diproduksi oleh Streptomyces venezuelae,

namun saat ini dapat diperoleh dengan cara sintesis (Pharmaceutical Press, 2009).

Kloramfenikol merupakan antibiotik spektrum luas yang bersifat

bakteriostatik. Kloramfenikol menjadi obat dalam pengobatan demam tifoid akut

akibat Salmonella sp. dan infeksi berat akibat bakteri Gram positif maupun

negatif, namun kloramfenikol tidak dianjurkan untuk pengobatan pada infeksi

saluran kencing, sebab hanya 5-10% bentuk tidak terkonjugasinya diekskresikan

melalui urin (Siswandono dan Soekardjo, 2008).

2.9 Uji Aktivitas Antibakteri

Metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi aktivitas antibakteri dalam

bahan alam terbagi tiga kelompok, yaitu metode bioautografi, difusi dan dilusi.

Metode bioautografi dan difusi dikenal sebagai teknik kualitatif, karena metode

ini hanya memberikan informasi mengenai ada atau tidaknya aktivitas nya dalam

suatu sampel uji. Metode dilusi merupakan teknik kuantitatif yang dapat

digunakan untuk mengukur Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) (Valgas, et al.,

2007).

Metode Difusi

Metode difusi sering digunakan untuk uji yang rentan terhadap senyawa

murni, senyawa polar ataupun nonpolar. Pada prosedur ini, kertas filter cakram

(kira-kira berdiameter 6 mm), berisi senyawa uji yang ditempatkan pada

permukaan yang sebelumnya telah diinokulasi dengan bakteri uji. Agen

antibakteri akan berdifusi ke dalam agar dan menghambat pertumbuhan dari


bakteri uji. Cawan petri diinkubasi dan zona inhibisi diukur. Pada metode silinder,

silinder dari stainless steel atau porcelin dengan ukuran yang seragam (biasanya 8

mm x 6 mm x 10 mm) ditempatkan di atas agar terinokulasi di dalam cawan petri,

dan diisi dengan sampel dan standar. Setelah diinkubasi, silinder dipindahkan dan

zona inhibisi yang terbentuk diukur. Pada uji menggunakan hole-plate, dibuat

beberapa milimeter lubang pada permukaan agar yang diinokulasi dan kemudian

diisi sampel. Larutan uji akan berdifusi ke dalam medium agar dan menghambat

pertumbuhan organisme. Cawan petri dibiarkan pada suhu ruangan untuk proses

inkubasi, kemudian zona hambat yang terbentuk diukur (Choma dan Grzelak,

2011).

Metode Dilusi

Metode ini memiliki kemampuan untuk mengukur Konsentrasi Hambat

Minimum (KHM) dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) (Pratiwi, 2008). Dua

jenis metode dilusi adalah dilusi adalah agar dan pengenceran tabung (Choma dan

Grzelak, 2011). Metode dilusi menurut Pratiwi 2008 dibedakan menjadi dilusi cair

(serial dilution) dan dilusi padat. Pada dilusi cair, dibuat seri pengenceran agen

antibakteri pada medium cair yang ditambahkan dengan metode uji. Larutan uji

agen antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya

pertumbuhan bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan

sebagai KHM dikultur ulang tanpa penambahan bakteri uji ataupun agen

antibakteri, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Medium cair yang terlihat tetap

jernih setelah diinkubasi ditetapkan sebagai Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)

(Pratiwi, 2008).

Metode dilusi padat serupa dengan metode dilusi cair tapi menggunakan

medium padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen

antibakteri yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa bakteri uji

(Pratiwi, 2008).

Metode Bioautografi

Bioautografi merupakan uji yang tepat dan sederhana dalam menguji efek

ekstrak tanaman dan senyawa fitokimia terhadap mikroba penyebab penyakit pada

manusia maupun tumbuhan (Hostettmann, 1999). Metode ini menggabungkan

penggunaan teknik kromatografi lapis tipis dengan respon dari mikroorganisme


uji berdasarkan aktivitas biologi dari suatu analit yang berupa antibakteri,

antikapang dan antiprotozoa (Choma dan Grzelak, 2011).

Bioautografi merupakan metode skrining mikrobiologi yang umum

digunakan untuk mendeteksi adanya aktivitas antimikroba. Skrining merupakan

prosedur pertama, yang dilakukan pada sampel yang akan dianalisis, untuk

mengetahui ada atau tidaknya analit yang didapat. Metode skrining ini

memberikan sensitivitas yang lebih tinggi daripada metode lainnya. Metode ini

juga memiliki kelebihan yaitu, sederhana, murah, hemat waktu dan tidak

memerlukan peralatan yang canggih (Choma dan Grzelak, 2011).

Metode bioautografi dibedakan menjadi tiga yaitu, bioautografl kontak,

bioautografi imersi atau bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung.

Prinsip bioautografi kontak, plat kromatogram diletakkan pada permukaan agar

yang telah diinokulasi mikroba uji selama beberapa menit atau jam sehingga

proses difusi dapat terjadi. Plat kromatogram diambil dan media agar diinkubasi.

Daerah hambatan ditunjukkan dengan adanya spot antimikroba yang menempel

pada permukaan media agar. Pada bioautografi imersi, plat kromatogram

dicelupkan pada medium agar, setelah agar memadat ditambahkan

mikroorganisme uji lalu diinkubasi. Metode ini merupakan kombinasi dari

bioautografi kontak dan langsung, karena senyawa antimikroba ditransfer dari

kromatogram ke media agar, seperti dalam metode kontak, tetapi lapisan agar

tetap pada permukaan kromatogram selama inkubasi dan visualisasi, seperti pada

bioautografi langsung (Choma dan Grzelak, 2011).

Bioautografi langsung merupakan metode bioautografi yang paling banyak

digunakan dari semua metode bioautografi. Prinsip dari metode ini adalah plat

KLT dicelupkan pada suspensi mikroorganisme kemudian diinkubasi. Visualisasi

dari zona ini biasanya dilakukan dengan menggunakan reagen dehidrogenase

untuk deteksi aktivitas, yang paling umum adalah garam tétrazolium.

Dehydrogenase. Mikroorganisme mengkonversi garam tétrazolium menjadi

berwarna sehingga, terlihat spot krem-putih dengan latar belakang ungu pada

permukaan plat KLT menunjukkan keberadaan agen antibakteri (Choma dan

Grzelak, 2011). Keuntungan dari metode bioautografi adalah sifatnya yang efisien

untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba, karena letak bercak dapat


ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga

memungkinkan untuk mengisolasi senyawa aktif tersebut (Pratiwi 2008).

2.10 Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau

reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi,

dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga dapat didefinisikan

sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat

yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau menghambat oksidasi senyawa

tersebut. (Kuncahyo dan Sunardi 2007).

Fungsi utama antioksidan digunakan untuk memperkecil terjadinya proses

oksidasi lemak dan minyak, memperkecil terjadinya proses kerusakan dalam

makanan, memperpanjang masa pemakaian dalam industri makanan,

meningkatkan stabilitas lemak yang terkandung dalam makanan. Antioksidan

tidak hanya digunakan dalam industri farmasi, tetapi juga digunakan secara luas

dalam industri makanan, industri petroleum, industri karet dan sebagainya (Tahir,

et al., 2003).

Antioksidan dapat bersumber dari zat-zat sintesis atau zat-zat alami hasil

isolasi. Adanya antioksidan alami maupun sintesis dapat menghambat oksidasi

lipid, mencegah kerusakan, perubahan degradasi komponen organik dalam bahan

makanan. Beberapa senyawa antioksidan sintetis yang umum digunakan adalah

butylated hydroxytoluen (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA),

tertbutylhydroxyquinone (TBHQ), asam galat dan propil galat. Antioksidan alami

dapat diperoleh dari makanan sehari-hari seperti sayuran, buah-buahan,

kacangkacangan dan tanaman lainnya yang mengandung antioksidan bervitamin

(seperti vitamin A, C, dan E), asam-asam fenolat (seperti asam ferulat, asam

klorogerat, asam elagat, dan asam kafeat) dan senyawa flavonoid seperti

kuersetin, mirisetin, apigenin, luteolin, dan kaemferol (Pokorny, et al., 2001 ;

Rohdiana, 2001).

2.11 Uji Antioksidan

Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak

membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan


menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Metode ini

sering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free radical

scavengers atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidannya, serta

mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal-antioksidan yang terbentuk. Metode

DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun cairan

(Prakash, et al., 2011).

Mekanisme Kerja 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) merupakan radikal bebas yang stabil

pada suhu kamar, berbentuk kristal berwarna ungu dan sering digunakan untuk

mengevaluasi aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau ekstrak bahan alam

(Prakash, et al., 2011). Radikal bebas DPPH akan ditangkap oleh senyawa

antioksidan melalui reaksi penangkapan atom hidrogen dari senyawa antioksidan

oleh radikal bebas untuk mendapatkan pasangan elektron dan mengubahnya

menjadi difenil pikril hidrazin (DPPH-H). Radikal ini mempunyai kereaktifan

rendah, sehingga dapat mengurangi radikal bebas yang bersifat toksik (Antolovich

et al., 2001). DPPH menerima elektron atau radikal hidrogen akan membentuk

molekul diamagnetik yang stabil. Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara

transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH, akan menetralkan karakter

radikal bebas dari DPPH (Kedare dan Singh, 2011). Aktivitas antioksidan dapat

dinyatakan dengan satuan persen inhibisi. Nilai ini diperoleh dengan rumus

sebagai berikut (Molyneux, 2004).

%𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 =𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥100%

Absorbansi kontrol yang digunakan dalam prosedur DPPH ini adalah

absorbansi DPPH, sedangkan blanko yang digunakan adalah etanol 95%.

Berdasarkan rumus tersebut, semakin tinggi tingkat diskolorisasi (absorbansi

semakin kecil) maka semakin tinggi nilai aktivitas penangkapan radikal bebas

(Molyneux, 2004).

Aktivitas antioksidan pada metode DPPH dinyatakan dengan IC50

(Inhibition Concentration). IC50 adalah bilangan yang menunjukkan konsentrasi

ekstrak yang mampu menghambat aktivitas DPPH sebesar 50%. Semakin kecil

nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas antioksidan. Secara spesifik, suatu


senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 0,05

mg/mL, aktivitas kuat untuk IC50 antara 0,05-0,1 mg/mL, aktivitas sedang jika

IC50 bernilai 0.101-0.150 mg/mL dan aktivitas lemah jika IC50 bernilai 0,151 -

0,200 mg/mL (Blois, 1958). Kekuatan antioksidan juga dapat ditentukan dengan

mengukur nilai AAI (Antioxidant Activity Index). Konsentrasi DPPH yang

digunakan dalam uji (ppm) dibagi dengan nilai IC50 yang diperoleh (ppm). Nilai

AAI < 0.5 adalah antioksidan lemah, AAI > 0,5- 1 adalah antioksidan sedang,

AAI >1-2 adalah antioksidan kuat, dan AAI > 2 adalah antioksidan sangat kuat

(Vasi, et al., 2012).

Gugus kromofor dan auksokrom pada radikal bebas DPPH memberikan

absorbansi maksimm pada panjang gelombang 517 nm sehingga

menimbulkanwarna unguu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning

seiring penambahan antioksidan. Hasil dekolorasi oleh antioksidan serta dengan

jumlah electron yang tertangkap. Mekanisme penangkapan radikal bebas

ditunjukan pada reaksi di bawah ini.

Gambar 2.1 Reaksi penangkapan radikal DPPH oleh antioksidan

(AH = Antioksidan, ox = Oksidasi, red = reduksi) (dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel,

dan Mohammad, 2009)

22


3 BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada tanggal bulan Novembe 2016 sampai

dengan Mei 2017 di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

Alat

Cawan petri, laminar air flow (Minihelic), autoklaf (ALP Ogawa Seiki),

inkubator (France Etuves), refrigerator, vortex (Vortex MIXER VM-300),

mikroskop cahaya (Shimadzu), timbangan analitik (AND GH-202), hot plate

stirrer (VELP Scientifica), jarum ose, batang L, pinset, mikropipet

(Thermoscientific) dan tip, botol kaca, bunsen dan pemantik api, jangka sorong,

cover glass, kaca objek, kertas cakram 6 mm, pH indikator, spatula, batang

pengaduk, kaca arloji, gelas beaker (Schott Duran), Erlenmeyer (Schott Duran),

gelas ukur (Pyrex), labu ukur (Schott Duran), tabung reaksi (Pyrex), corong pisah,

pipet tetes, pisau, tisu, kapas, kasa, tali, karet gelang, alumunium foil, plastic

wrap, plastik tahan panas dan kertas saring, gunting, sedotan, spektrofotometer

UV Vis.

Bahan

3.2.2.1 Bahan Isolat (AP12A)

Isolat kapang endofit (AP12A) diperoleh dari tanaman sampel berupa

akar kayu jawa (Lannea coromandelica (Houtt.) Merr.) yang diperoleh dari

Watampone, Bone, Sulawesi Selatan pada bulan September dan Oktober 2015.

Bagian yang diambil adalah pangkal tengah akar.

3.2.2.2 Bahan Pengujian

Alkohol 70%, NaCl 5,25%, akuades steril, methylene blue, NaCl 0,9%,

larutan kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin, cakram kloramfenikol 30 μg,

potato dextrose agar (PDA) (Merck), nutrient agar (NA) (Merck), kentang,

dextrose (Merck), yeast extract (Merck), mueller–hinton agar (MHA) (Merck),

etil asetat, n-heksana, DMSO (Dimethyl Sulfoxide), DPPH (2,2-difenil-l-pikril

hidrazil).


3.2.2.3 Mikroorganisme Uji

Mikroorganisme uji yang digunakan adalah bakteri Escherichia coli

ATCC 25923, Salmonella typhi ATCC 14028, Bacillus subtilis ATCC 6633,

Pseudomonas Airoginosa ATCC 27853 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923.

yang didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi Farmasi FMIPA UI.

3.3 Prosedur Penelitian

Pembuatan Media Pertumbuhan Mikroorganisme

3.3.1.1 Pembuatan Media PDA

Media potato dextrose agar (PDA) digunakan untuk isolasi dan pemurnian

kapang endofit akar kayu jawa. PDA ditimbang sebanyak 39 gram dan dilarutkan

dalam 1 L akuades. Suspensi PDA dipanaskan di atas heating magnetic stirrer

hingga mendidih dan larutan tampak bening. Suspensi PDA kemudian disterilkan

dengan autoklaf bertekanan 1 atm selama 15 menit dengan suhu 121°C. Media

PDA dituang dalam cawan petri steril sekitar 10 mL dan dibiarkan menjadi padat

dalam laminar air flow (LAF) (Maryanti, 2015).

3.3.1.2 Pembuatan Media PDY

Media PDY dibuat dengan cara potato dextrose ditimbang sebanyak 24

gram; yeast extract 2 gram; dan kalsium karbonat (CaCO3) 5 gram. Semua bahan

kecuali kalsium karbonat dimasukkan ke dalam labu bulat dan ditambahkan

akuades hingga 1 liter, dan dihomogenkan dengan magnetic stirrer di atas hot

plate. Kalsium karbonat ditambahkan sedikit demi sedikit ke larutan media

tersebut hingga dicapai pH 6-7. Selanjutnya 500 mL larutan media dituang ke labu

erlenmeyer 1000 mL dan disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu

121°C (Ramadhan, 2013).

3.3.1.3 Pembuatan Media NA

Media NA digunakan untuk seleksi kapang endofit yang memiliki potensi

sebagai anti bakteri. Sebanyak 20 g nutrient agar dimasukan kedalam labu yang

sudah berisi 1 liter aquades. kemudian dipanaskan diatas hot plate hingga

mendidih sambil dihomogenkan menggunakan magnetic stirrer. Lalu dilakukan

sterilisasi menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121C . sebanyak 15

ml media dituang kedalam cawan petri steril di laminar air flow dan dibiarkan

sampai memadat (Maryanti, 2015).


3.3.1.4 Pembuatan Media NA Miring

Pembuatan media NA untuk peremajaan bakteri uji. Sebanyak 10 gram

NA dilarutkan dengan akuades 500 ml dalam erlenmeyer dan dipanaskan di atas

heating magnetic stirrer hingga homogen dan mendidih. NA disterilkan dengan

autoklaf bertekanan 1 atm dan suhu 121°C selama 15 menit. Media dituang dalam

tabung reaksi yang sebelumnya sudah di sterilisasi, kemudian dimiringkan dengan

kemiringan 45°, dan media dibiarkan memadat dalam laminar air flow (LAF)

(Maryanti, 2015).

3.3.1.5 Pembuatan Media MHA

Media mueller hinton agar (MHA) digunakan pada saat uji aktivitas

antibakteri. Ditimbang MHA sebanyak 34 gram dan ditambahkan akuades hingga

1 liter. Media dipanaskan di atas heating magnetic stirrer hingga homogen dan

mendidih. MHA disterilkan dengan autoklaf suhu 121°C selama 15 menit dan

tekanan 1 atm. MHA dituang dalam cawan petri steril sebanyak 15 mL dan

dibiarkan memadat dalam LAF (Maryanti, 2015).

3.3.1.6 Pembuatan Media NB

Sebanyak 8 gram serbuk nutrient broth (NB) ditambahkan dengan 1 liter

aquades dipanaskan hingga larut diatas hot plate dan menggunakan magnetik

stirer sampai bening. Media disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121ᵒC selama

15 menit (Alexander, 2004).

Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang tumbuh pada medium PDA kemudian dimurnikan ke

dalam medium PDA baru dengan cara hifa kapang diinokulasikan dengan

menggunakan ose dari medium isolasi PDA kemudian diletakkan pada medium

PDA baru kemudian diinkubasi selama 7-14 hari pada suhu ruang. Setiap koloni

kapang endofit yang berbeda dipindahkan ke dalam 1 cawan petri berisi medium

PDA baru hingga diperoleh isolat murni (Rachmayani, 2008). Setiap isolat kapang

endofit dibuat duplo pada agar miring, masing-masing sebagai stock culture dan

working culture (Handayani, 2015).

Karakterisasi Kapang Endofit

Kapang dikarakterisasi secara makroskopik dan mikroskopik untuk

menentukan identitas (genus) kapang (Pawthong, et al., 2012), namun


karakterisasi pada penelitian ini hanya untuk membedakan kapang. Pada

karakterisasi makroskopik diperhatikan pertumbuhan dan organoleptis kapang.

Karakteristik makroskopik yang diamati pada kapang berupa warna dan

permukaan koloni (granular, seperti tepung; menggunung; licin; ada atau tidaknya

tetesan eksudat), garis-garis radial dari pusat ke arah tepi koloni, lingkaran-

lingkaran konsentris, dan pertumbuhan koloni per hari (Ariyono, et al., 2014)

Karakteristik mikroskopik dilakukan dengan pemeriksaan preparat kapang

melalui mikroskop menggunakan metode slide culture. Metode slide culture

dilakukan dengan cara tisu diletakkan pada dasar cawan petri, kemudian di

atasnya diletakkan kaca objek dan kaca penutup (cover glass), lalu cawan petri

ditutup. Cawan petri disterilkan di autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit

(Radji, et al., 2011).

Setelah sterilisasi, kaca objek diteteskan medium PDA steril dan

didiamkan hingga memadat, kemudian diletakkan sedikit miselium kapang di atas

PDA yang telah memadat dan ditutup secara hati-hati dengan kaca penutup. Tisu

ditetesi akuades steril agar suasana dalam cawan petri menjadi lembap. Dilakukan

inkubasi selama 7 hari pada suhu 29°C (Radji, et al., 2011).

Setelah masa inkubasi selesai, cover glass dilepaskan, lalu kapang ditetesi

1 tetes alkohol 70% dan 1 tetes methylene blue, kemudian ditutup dengan cover

glass dan diamati dengan mikroskop cahaya dari perbesaran terkecil hingga

terbesar. Pengamatan yang dilakukan meliputi ada atau tidaknya sekat pada hifa,

pertumbuhan hifa, bentuk dan warna konidia (Radji, et al., 2011).

Peremajaan Bakteri Uji

Mikroorganisme uji yang digunakan, Escherichia coli, Salmonella typhi,

Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis,

diremajakan pada media NA miring. Mikroorganisme diambil 1 ose lalu dioleskan

pada permukaan media dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 24

jam. Pengerjaan peremajaan kultur ini dilakukan dengan kondisi aseptis di dalam

laminar air flow (LAF).

Uji Kemurnian Bakteri Uji

Bakteri yang akan digunakan untuk pengujian, dicek kemurniannya

dengan pengamatan secara makroskopis maupun mikroskopik. Pengamatan


makroskopis bakteri meliputi pengamatan pertumbuhan dan morfologi bakteri

berupa bentuk, warna, dan bagian tepi koloni. Sementara itu, pengamatan

mikroskopik dilakukan dengan teknik pewarnaan Gram.

Koloni bakteri yang telah dianggap murni, diambil sedikit menggunakan

jarum ose dan dioleskan pada kaca objek. Preparat difiksasi dengan melewatkan

kaca objek di nyala api. Preparat ditetesi pewarna kristal violet selama 1 menit

lalu preparat dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian ditetesi iodin selama

1 menit. Preparat dicuci kembali dengan air mengalir, lalu preparat ditetesi

alkohol 96% selama 15-30 detik dan dicuci kembali. Terakhir, preparat ditetesi

safranin selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir. Preparat dikeringkan

dengan tisu tanpa mengenai bagian bakteri dan diamati menggunakan mikroskop

dengan perbesaran 1000 kali (Alexander, et al., 2004).

Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Pembuatan inokulum atau suspensi mikroorganisme uji dilakukan dengan

cara biakan mikroorganisme uji diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam tabung

reaksi yang telah diisi dengan 3 mL larutan NaCl 0,9%, kemudian dihomogenkan

dengan vortex. Kekeruhan suspensi mikroorganisme dibandingkan dengan

kekeruhan standar McFarland 3 (109 CFU/mL). Apabila kekeruhan belum sama,

mikroorganisme diinokulasikan lagi ke dalam suspensi hingga diperoleh

kekeruhan yang sama dengan standar Mc Farland 3. Suspensi mikroorganisme 109

kemudian diencerkan sehingga diperoleh suspensi 106. Pengenceran dilakukan

dengan cara 1 mL suspensi mikroorganisme uji 109 dipipet ke dalam tabung reaksi

berisi 9 mL NaCl 0,9%, sehingga diperoleh suspensi mikroorganisme uji 108.

Demikian seterusnya hingga didapatkan suspensi mikroorganisme uji 106

(Andidha, 2015 ; Kumalasari dan Sulisyani, 2011)

Uji Pendahuluan Kapang Endofit Penghasil Antibakteri

Skrining isolat kapang endofit penghasil antibakteri dilakukan dengan

menginokulasikan 1 potongan agar dengan sedotan berukuran 6 mm isolat kapang

endofit umur 14 hari ke medium NA yang mengandung suspensi bakteri uji.

Kultur diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam. Aktivitas antibakteri kapang

endofit dilihat dari zona hambat yang terbentuk (Elfina, et al., 2013).


Fermentasi Kapang Endofit

3.3.8.1 Fermentasi Statis

Fermentasi kapang endofit dilakukan dengan fermentasi cair menggunakan

media potato dextrose yeast (PDY). Koloni murni isolat kapang endofit yang

berusia 7 hari diambil sebanyak 3 potongan menggunakan sedotan steril lalu

diinokulasikan ke dalam media fermentasi cair PDY yang telah steril. Media PDY

yang digunakan sebanyak 20% dari volume botol, selanjutnya media diinkubasi

secara statis pada suhu kamar (27 – 29°C) selama 21 hari (Kumala, 2014 ; Radji,

et al., 2011)

Ekstraksi

Supernatan hasil fermentasi diekstraksi menggunakan pelarut n-heksana

dan etil asetat. secara bertingkat, hasil ekstraksi dipekatkan sampai diperoleh

ekstrak kering pekat (Kumala dan Pratiwi, 2014). Partisi cair dengan kedua

pelarut ini, diuapkan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak

kental atau kering.

Analisis KLT dan Sekrining Fitokimia

Setiap ekstrak dari fraksi n-heksana dan etil asetat dilihat keberadaan

senyawa yang terkandung menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Eluen

yang digunakan adalah pelarut asetat dan n-heksana untuk ekstrak fraksi etil asetat

dan n-heksana. Perbandingan pelarut disesuaikan dengan hasil spot senyawa.

Ekstrak ditotolkan pada plat KLT dan dielusi dalam wadah yang telah

dijenuhkan dengan eluen (Sherma dan Fried, 2003). Hasil elusi diamati

menggunakan sinar ultraviolet pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.

Skrining fitokimia dilakukan dengan berbagai pereaksi semprot untuk

mengidentifikasi kandungan kimia yang terdapat pada ekstrak. Pereaksi semprot

yang digunakan FeCl3 yang digunakan untuk mengidentifikasi polifenol, bercak

akan berwarna abu-abu pada plat KLT jika positif mengandung polifenol

(Wagner,1984). Senyawa flavonoid dideteksi dengan sitorbat, jika bercak yang

dihasilkan bewarna kuning kehijauan maka positif mengandung senyawa

flavonoid (Markham, 1982). Pereaksi dragendorf untuk mendeteksi senyawa

alkaloid, akan menimbulkan bercak berwarna coklat (Wagner,1984). Pereaksi

vanilin untuk mendeteksi minyak atsiri, bercak berwarna biru sampai ungu dan


lieberman burchard untuk mendeteksi saponin, bercak yang ditimbulkan berwarna

hijau gelap (Kumar, et al., 2007).

Uji Aktivitas Antioksidan

3.3.11.1 Uji Aktivitas Antioksidan Kualitatif

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode

peredaman radikal bebas dengan menggunakan pereaksi DPPH (Dompeipen dan

Simanjuntak, 2015) dan dibandingkan dengan Vitamin C sebagai kontrol positif.

Ekstrak uji dilarutkan dengan pelarut yang digunakan pada ekstraksi sebelumnnya

(larutan uji), lalu ditotolkan pada plat KLT. Setelah kering dilakukan elusi pada

eluen yang telah dijenuhkan. setelah eluen mencapai garis atas lempeng

dikeluarkan dan dikeringkan. Setelah kering Kromatogram disemprot dengan

larutan 0,2% DPPH dalam metanol pro analisa,.kromatogram diperiksa 30 menit

setelah penyemprotan. Senyawa aktif penangkap radikal bebas akan menunjukkan

bercak berwarna putih kekuningan dengan latar belakang ungu (Wahdaningsih, et

al., 2013).

3.3.11.2 Uji Aktivitas Antioksidan Kuantitatif

1) Pembuatan Larutan DPPH 0,25 mM

Serbuk DPPH ditimbang 0,0049 gram dilarutkan dengan metanol p.a

kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, volumenya dicukupkan

dengan metanol p.a sampai tanda batas (Chyau et al , 2002 dalam Komala et

al., 2015).

2) Penentuan Panjang Gelombang Maksimum DPPH

Larutan DPPH 0,25 mM sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam

tabung reaksi lalu ditambahkan metanol p.a sebanyak 4 mL, dikocok

menggunakan vortex hingga homogen lalu dituang ke dalam kuvet dan

diukur pada panjang gelombang 400-800 nm dengan menggunakan

spektrofotometer UV-Vis (Chyau et al., 2002 dalam Komala et al., 2015).

3) Pembuatan Larutan Blanko

Larutan DPPH 0,25 mM sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam

tabung reaksi dan ditambahkan metanol p.a sebanyak 4 mL, kemudian

dikocok dengan vortex hingga homogen, selanjutnya diinkubasi dalam


ruangan gelap selama 30 menit (Chyau et al., 2002 dalam komala et al.,

2015). Selanjutnya, serapan diukur dengan spektrometer UV-Vis.

4) Pembuatan Larutan Pembanding

a. Pembuatan larutan induk konsentrasi 1000 ppm

Vitamin C sebagai pembanding masing-masing ditimbang 50 mg.

dilarutkan dengan metanol p.a lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50

mL, volume dicukupkan dengan metanol p.a sampai tanda batas.

b. Pembuatan seri konsentrasi 1,2,3,4,5 ppm

Larutan induk vitamin C, masing-masing dipipet 5, 10, 15. 20, dan 25

(µL), dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL. volume dicukupkan

dengan metanol p.a sampai tanda batas.

c. Pengukuran serapan dengan spektrofotometer UV-Vis

Larutan uji pembanding sebanyak 4 mL dimasukkan ke dalam tabung

reaksi dan ditambahkan larutan DPPH 0.25 mM sebanyak 1 mL,

kemudian dikocok menggunakan vortex hingga homogen, diinkubasi

dalam ruang gelap selama 30 menit (Chyau, et al., 2002 dalam

komala, et al., 2015). Selanjutnya, serapan diukur dengan

spektrometer.

5) Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Isolat (AP12A)

a. Pembuatan larutan induk konsentrasi 1000 ppm

Ekstrak Isolat (AP12A) etil asetat (EA) ditimbang 25 mg, dilarutkan

dengan metanol p.a lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 25 mL,

kemudian volume dicukupkan dengan metanol p.a sampai tanda batas.

b. Pembuatan larutan uji seri konsentrasi 200,100,50,25,12.5, 6.25 ppm

Larutan induk ekstrak masing-masing dipipet 1000, 500. 250. 125,

62.5, dan 31,25 (µL) menggunakan mikropipet, kemudian

dimasukkan ke dalam labu ukur 5 mL, volume dicukupkan dengan

metanol p.a sampai tanda batas.

c. Pengukuran serapan menggunakan spektrofotometer UV-Vis

Larutan uji ekstrak dengan berbagai konsentrasi yang telah dibuat

sebanyak 4 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan

larutan DPPH 0,25 mM sebanyak 1 mL, kemudian dikocok


menggunakan vortex hingga homogen, diinkubasi dalam ruang gelap

selama 30 menit (Chyau,, et al., 2002 dalam komala,, et al., 2015).

Selanjutnya, serapan diukur dengan spektrometer UV-Vis.

6) Penentuan Persen Inhibisi

Aktivitas penangkal radikal diekspresikan sebagai persen inhibisi

yang dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

% inhibisi = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥100%

(Ghosal, et al., 2012).

7) Penentuan Nilai Inhibition Concentration (IC50)

Konsentrasi sampel dan persen inhibisinya diplot masing-masing

pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan tersebut

digunakan untuk menentukan nilai IC50 dari masing-masing sampel

dinyatakan dengan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh

sebagai IC50 (Molyneux, 2004). Secara spesifik senyawa dikatakan sebagai

antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang dari 0,05 mg/mL, aktivitas

kuat untuk IC50 antara 0,05-0,1 mg/mL, aktivitas sedang jika IC50 bernilai

0.101-0.150 mg/mL dan aktivitas lemah jika IC50 bernilai 0,151 - 0,200

mg/mL (Blois, 1958).

8) Penentuan Nilai Antioxidant Activity Index (AAI)

Konsentrasi DPPH yang digunakan dalam uji (ppm) dibagi dengan

nilai IC50 yang diperoleh (ppm). Nilai AAI < 0.5 adalah antioksidan

lemah, AAI > 0,5-1 adalah antioksidan sedang, AAI >1-2 adalah

antioksidan kuat, dan AAI > 2 adalah antioksidan sangat kuat (Vasi, et al.,

2012).

Uji Aktivitas Antibakteri Metode Mikrodilusi

3.3.12.1 Pembuatan Inokulum Bakteri

Pembuatan inokulum bakteri uji dilakukan dengan cara biakan bakteri uji

diinokulasikan sebanyak 1 ose ke dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 9

mL larutan NaCl 0,85%, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex.

Kekeruhan suspensi bakteri dibandingkan dengan kekeruhan standar McFarland

0,5 (1-2)x108 CFU/mL). Apabila kekeruhan belum sama, bakteri diinokulasikan

lagi ke dalam suspensi hingga diperoleh kekeruhan yang sama dengan standar


McFarland 0,5. Suspensi bakteri kemudian diencerkan dalam media MHB

sehingga mendapatkan tingkat kekeruhan 106 CFU/mL. (Novitri, 2016 dengan

modifikasi).

3.3.12.2 Pengujian Aktivitas Antibakteri

1) Penyiapan Larutan Induk Uji Ekstrak Etil Asetat

Larutan uji dibuat dengan melarutkan ekstrak dengan pelarut

DMSO 10% dengan cara ditimbang 16 mg ekstrak dilarutkan dalam 4 mL

DMSO 10% (Larutan induk) 4000 ppm.

2) Pembuatan Larutan Kontrol Media

Sebanyak 200 µL media MHB ditambahkan pada microwell plate

3) Pembuatan Larutan Kontrol Positif Pertumbuhan Bakteri

Sebanyak 100 µL MHB dan 100 µL suspensi bakteri uji

ditambahkan dalam microwell plate.

4) Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minumim (KHM) Metode

Mikrodilusi Cair

Pengujian metode mikrodilusi cair dilakukan dengan menggunakan

microwell plate yang terdiri dari 8 baris dan 12 kolom sehingga terdapat

96 sumur pelat mikro. Pada setiap pengujian disertakan kontrol media

(KM) pada sumur kolom pertama, kontrol negatif (K-) pada kolom kedua

dan kontrol positif (K+) pertumbuhan bakteri pada kolom ketiga. KM

berisi media MHB saja, sedangkan K- berisi media MHB dan ekkstrak

atau kontrol antibiotik dengan konsentrasi yang sama dengan sumur ke-12.

Langkah pertama yaitu mengisi semua sumur dengan media MHB

sebanyak 100 µL, kecuali K+ diisi dengan media MHB sebanyak 200 µL.

Setelah itu larutan induk uji 4000 ppm sebanyak 100 µL dimasukan ke

dalam sumur ke-12. Sebanyak 100 µL campuran dari sumur ke-12 di

pindahkan ke sumur 11 lalu di campur sampai homogen. Pengenceran

dilakukan sampai sumur ke-5 yang memiliki konsentrasi ekstrak terkecil.

Setelah itu, dimasukkan suspensi bakteri ke semua sumur kecuali sumur

KM pada sumur pertama. Microwell plate selanjutnya di inkubasi pada

suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan KHM secara visual dilakukan

dengan penambahan pewarna INT (p-iodonitrotetrazolium) kedalam setiap


sumur, dan diinkubasi 37oC selama 30 menit. Pengujian ini dilakukan

secara triplo (Novitri, 2016 ; Wafa, 2011 dengan modifikasi).

5) Penentuan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM)

Nilai KBM ditentukan dengan melakukan penggoresan dari hasil

mikrodilusi yang menunjukkan KHM dan pada konsentrasi dibawah KHM

pada media MHA padat. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37oC selama

24 jam. KBM ditentukan apabila tidak ada pertumbuhan pada permukaan

media (Novitri, 2016).

33


4 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Pemurnian Kapang Endofit

Pemurnian dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan koloni endofit

yang berbeda berdasarkan morfologinya. Dikhawatirkan isolat (AP12A) terjadi

kontaminasi karena lamanya dalam penyimpanan. Pengamatan morfologi juga

dilakukan pada masa inkubasi, jika ditemukan pertumbuhan koloni yang berbeda

secara makroskopik, maka dilakukan pemurnian ulang sampai diperoleh isolat

murni, yaitu isolat dengan morfologi koloni yang sama karena berasal dari

pembelahan 1 sel (Kumala, 2014; Noverita, et al., 2009; Handayani, 2015).

Isolat (AP12A) selanjutnya diremajakan dan dibuat stock culture pada

media PDA. Peremajaan merupakan tahap penting untuk tetap menjaga kapang

agar tidak berada pada fase kematian akibat banyaknya sel yang tumbuh dan

terjadi kompetisi nutrisi. Stock culture dibuat pada media PDA miring dan

diinkubasi pada suhu ruang selama 7 hari, kemudian disimpan dalam refrigerator

dengan suhu 4°C sebagai kultur cadangan yang dapat diremajakan kembali dan

digunakan jika working culture terkontaminasi (Gandjar, et al., 2006; Kumala,

2014).

4.2 Karakterisasi Kapang Endofit

Isolat kapang endofit selanjutnya dikarakterisasi secara makroskopik dan

mikroskopik. Karakteristik makroskopik dilakukan dengan pengamatan morfologi

koloni meliputi bentuk koloni, warna koloni, warna sebalik koloni (reverse color),

tekstur, zonasi, tetes eksudat, garis-garis radial dari pusat koloni ke arah tepi

koloni dan lingkaran-lingkaran konsentris (Gandjar, 2000).

Karakterisasi bertujuan untuk membedakan dan memisahkan antar kapang

endofit. Pengamatan mikroskopik kapang dilakukan setelah kapang tumbuh

selama 5-7 hari menggunakan bantuan mikroskop (Ariyono, et al., 2014).

Karakterisasi ini juga berguna untuk mereduksi jumlah isolat kapang endofit yang

memiliki karakter yang sama.

Miselium isolat AP12A seperti kapas berwarna putih hingga abu-abu

kehitaman memenuhi cawan dengan pusat hitam. Warna sebalik krem dengan


pusat hitam. Kapang akan berwarna hitam setelah menua. Hifa bersekat,

bercabang, berwarna biru cerah hingga gelap setelah diberi pewarna biru metil.

Hal ini membuktikan bahwa tidak ada perbedaan antara isolat AP12A yang telah

didapatkan oleh peneliti sebelumnya Zulfa (2016) dengan peneliti sekarang.

Tabel 4.1. Penampak Isolat AP12A Secara Makroskopik dan Mikroskopik

AP12A Zulfa (2016) AP12A Abbas (2017)

Tampak Depan Tampak Depan

Tampak Belakang Tampak Belakang

Penampak Mikroskopik Perbesaran 400

kali

Penampak Mikroskopik Perbesaran 400

kali


4.3 Uji Kemurnian Bakteri Uji

Mikroorganisme uji yang digunakan pada penelitian ini yaitu, gram negatif

Escherichia coli ATCC 25923, Salmonella typhi ATCC 14028, gram positif

Bacillus subtilis ATCC 6633, gram negatif Pseudomonas airoginosa ATCC

27853 dan gram positif Staphylococcus aureus ATCC 25923. Identifikasi

kemurnian mikroorganisme uji dilakukan dengan karakterisasi mikroskopik, yang

bertujuan untuk melihat bahwa mikroorganisme yang digunakan adalah murni dan

tidak terdapat kontaminasi. Hasil karakteriasi mikroskopik mikroorganisme uji

adalah sebagai berikut :

Tabel 4.2. Hasil karakteriasi mikroskopik mikroorganisme uji

Bacillus subtilis

Bakteri gram positif, berwarna ungu

pada pewarnaan gram, berbentuk

basil (batang). [sumber: koleksi

pribadi] pada perbesaran 1000 kali

Pseudomonas Airoginosa

Bakteri gram negatif, berwarna

merah pada pewarnaan gram,

berbentuk basil (batang). [sumber:

koleksi pribadi] pada perbesaran 1000

kali

Staphylococcus aureus

Bakteri gram positif, berwarna ungu

pada pewarnaan gram, berbentuk

kokus (bulat) tunggal atau

bergerombol. [sumber: koleksi



Salmonella typhi

Bakteri gram negatif, berbentuk

batang merah [sumber: koleksi


Escherichia coli

Bakteri gram negatif yang ditandai

dengan warna merah, berbentuk

batang tunggal [sumber: koleksi


Identifikasi kemurnian bakteri uji dilakukan dengan metode pewarnaan

gram. Metode ini merupakan salah satu metode pewarnaan diferensial yang

digunakan untuk membedakan dua kelompok besar bakteri, yaitu gram positif

dan gram negatif. Pada pewarnaan gram, bakteri gram positif berwarna ungu dan

gram negatif berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan

struktur pada dinding sel kedua jenis bakteri gram tersebut. Dinding bakteri gram

positif banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri gram

negatif banyak mengandung lipopolisakarida. Pada gram positif, kompleks kristal

violet dan iodin tidak dapat tercuci oleh alkohol karena lapisan peptidoglikan yang

kokoh, sedangkan pada gram negatif alkohol dapat merusak lapisan

lipopolisakarida sehingga sel bakteri tampak transparan dan menjadi berwarna

merah setelah diberikan safranin (Pratiwi, 2008).

4.4 Uji Pendahuluan Kapang Endofit Penghasil Antibbakteri

Uji pendahuluan kapang endofit penghasil antibakteri bertujuan untuk

melihat aktifitas kapang endofit pada bakteri uji, dan selanjutnya akan dijadikan

sebagai acuan untuk uji secara kuantitatif. Uji pendahuluan kapang endofit

dilakukan dengan metode difusi agar padat. Metode difusi agar didasarkan pada

kemampuan senyawa antimikroba pada isolat kapang endofit yang diuji untuk


menghasilkan zona penghambatan disekeliling potongan agar yang ditumbuhi

oleh isolat AP12A kapang endofit dari tanaman kayu jawa terhadap bakteri

(Nurainy et al, 2008). Bakteri yang diujikan adalah Escherichia coli, Salmonella

typhi, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, dan Bacillus subtilis.

Aktivitas antibakteri dari kapang endofit dapat dilihat dari zona hambat

yang terbentuk. Data hasil pengukuran zona hambat kapang endofit terhadap

bakteri uji dapat dilihat pada tabel 4.3.

Tabel 4.3. Hasil Zona Hambat Kapang Endofit Terhadap Bakteri Uji

No.

Isolat

Escherichia coli Staphylococcus aureus

Inkubator Ruang Inkubator Ruang

S P P S P P

1. K (+) 3,005 2,54 2,42 2,52 2,255 3,11

2,77 2,55 2,5 2,65 2,255 2,85

2. AP12A - - - - 1,0(p) -

- - - - - -

No.

Isolat Salmonella typhi Bacillus subtilis

Inkubator Ruang Inkubator Ruang

S P P S P P

1 K (+) 3,755 3,1 3,26 2,71 2,5 2,31

3,755 3,5 3,75 2,71 2,345 2,31

2 AP12A 1,385 1,0

Kapang

tumbuh - -

Kapang

tumbuh

1,19 1,24

Kapang

tumbuh - -

Kapang

tumbuh

No

Isolat

Pseudomonas aeruginosa

Inkubator Ruang

S P P

1 K (+) 1,16 0,95 1,1

0,93 0,95 (p) 1,1

2

AP12A - - -

- - -

Merujuk pada hasil dari uji pendahuluan, isolat AP12A kapang endofit dari

akar tanaman kayu jawa memiliki aktifitas atau zona hambat pada bakteri

Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus. Pada bakteri Bacillus subtilis

potongan isolat AP12A kapang endofit tidak terbentuk zona hambat tetapi kapang

tumbuh pada inkubasi suhu ruang. Berdasarkan hasil uji pendahuluan, dipilih tiga

bakteri yang akan dilanjutkan untuk uji aktivitas antibakteri secara kuantitatif,


yaitu Salmonella typhi, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis, karena isolat

AP12A kapang endofit dari akar kayu jawa menunjukkan aktivitas antibakteri

secara kualitatif terhadap tiga bakteri tersebut.

4.5 Fermentasi

Fermentasi isolat kapang endofit dilakukan menggunakan media cair

potato dextrose yeast (PDY) dengan metode statis selama 21 hari. Proses ini

bertujuan untuk mendapatkan metabolit sekunder dari kapang endofit (Stanbury,

et al., 2003). Proses fermentasi berlangsung selama 21 hari yang dinilai bahwa

kapang telah melewati masa stasioner yang menjadi fase penghasil metabolit

sekunder (Stanbury, et al., 2003). Lamanya masa fermentasi ini diketahui dari

pengamatan kapang saat peremajaan. Ciri fase stasioner adalah pertumbuhan

kapang tetap, karena terjadi kematian sel yang dimbangi dengan pembentukan sel

baru (Pratiwi, 2008). Penggunaan media fermentasi cair memiliki beberapa

keuntungan dibandingkan dengan media fermentasi padat, yaitu komposisi dan

konsentrasi medium dapat diatur dengan mudah sehingga dapat memberikan

kondisi yang optimum bagi pertumbuhan (Okafor, 2007).

Media PDY yang digunakan terbuat dari kentang, dextrosa dan ekstrak

yeast yang baik dan cocok untuk fermentasi kapang endofit karena didalamnya

terdapat kandungan senyawa karbon serta nitrogen (Kumala dan Pratiwi, 2014).

Senyawa tersebut merupakan komponen terpenting dalam proses fermentasi

kapang endofit, karena sel-sel mikroorganisme dan berbagai produk fermentasi

sebagian besar terdiri dari unsur-unsur karbon dan nitrogen (Kusumaningtyas, et

al., 2010).

Metode fermentasi statis dipilih karena pada metode fermentasi statis

menghasilkan miselium dan produk yang lebih banyak dibandingkan dengan

metode fermentasi shaker (Azhari, 2014). Hal ini juga berhubungan dengan

lamanya waktu fermentasi, dimana dengan bertambahnya waktu fermentasi maka

akan semakin meningkatkan penurunan bahan organik yang dibutuhkan oleh

kapang untuk pertumbuhan miselium (Sangadji, et al., 2008), sehingga kapang

dapat mencapai fase stasionernya.

Kapang tumbuh di permukaan media fermentasi cair dan pada isolat

terdapat hifa yang tumbuh ke dalam medium. Media fermentasi berubah seiring


dengan pertumbuhan kapang. Media berwarna keruh kuning pekat. Hal ini terjadi

karena adanya proses metabolisme kapang yang menyebabkan perubahan substrat

dalam media (Gandjar dan Sjamsuridzal, 2006).

4.6 Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan metode partisi untuk filtrat. Ekstraksi

dilakukan untuk memisahkan senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan dari

fermentasi berdasarkan kepolarannya (Kumala, 2014). Biomassa dari hasil

fermentasi tidak dilakukan maserasi, karena pada penelitian sebelumnya, Zulfa,

(2016) menunjukkan ekstrak metanol dari hasil maserasi biomassa tidak

menunjukkan aktivitas pada bakteri uji.

Supernatan yang telah dipisahkan dari biomassa kemudian dipartisi

dengan metode partisi cair-cair menggunakan corong pisah dengan perbandingan

supernatan dan pelarut 1:1. Pelarut yang digunakan adalah n-heksana dan etil

asetat. Kedua fraksi, yaitu n-heksana dan etil asetat selanjutnya dipekatkan

menggunakan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kental n-heksana dan

etil asetat. Karakteristik dan bobot ekstrak hasil fermentasi isolat kapang endofit

yang didapatkan dapat dilihat pada tabel 4.4.

Tabel 4.4. Karakteristik Dan Bobot Ekstrak Hasil Fermentasi Isolat AP12A

Fraksi Bobot (mg) Ekstrak

Gambar Organoleptis

Etil asetat 77,8 mg

Kuning

kecoklatan,

kering semi

kental

N-heksana 17,6 mg Hijau muda,

kering


Hasil yang didapatkan untuk ekstrak etil asetat adalah 77,8 mg, dan untuk

ekstrak n-heksana 17,6 mg. Ekstrak n-heksana yang didapatkan sangat sedikit dan

tidak cukup untuk diujikan pada uji aktivitas antioksidan dan antibakteri secara

kuantitatif.

4.7 Analisis KLT Dan Skrining Fitokimia

Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT) bertujuan untuk mengetahui spot

senyawa pada ekstrak dan mencari eluen yang paling bagus untuk ekstrak. Hasil

KLT ekstrak sebagaimana tabel 4.5. Hasil KLT tersebut merupakan uji

pendahuluan untuk menguji skrining fitokimia dan uji aktivitas antioksidan

kualitatif. Tabel 4.5 memperlihatkan perbedaan spot serta eluen yang digunakan.

Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam tiap ekstrak tidak

sama persis.

Tabel 4.5. Hasil Analisis KLT dan eluen yang digunakan

Skrining fitokimia dilakukan untuk mengidentifikasi kandungan metabolit

sekunder yang tersari di dalam ekstrak etil asetat dan n-heksana isolat (AP12A)

kapang endofit dari akar kayu jawa, sehingga dapat diketahui metabolit sekunder

yang berpotensi memiliki aktivitas antioksidan ataupun antibakteri. Metode yang

digunakan untuk melakukan skrining fitokimia harus memenuhi beberapa

persyaratan antara lain, sederhana, cepat, dirancang untung peralatan minimal dan

bersifat selektif untuk golongan senyawa yang dipelajari (Fransworth, 1966).

Pada penelitian ini skrining fitokimia dilakukan dengan menggunakan plat

KLT serta pengamatan dibawah sinar UV pada panjang gelombang 254 dan 366

nm, dengan pereaksi semprot yang digunakan untuk penampak bercak yaitu

vanilin asamsulfat, FeCL3, liberman bourchard, dragendorf dan sitroborat.

Isolat Etil Asetat (EA) N-Heksana (NH)

KLT Eluen KLT Eluen

AP12A

Etil Asetat

: N-

Heksana

= 4:1

N-Heksana :

Etil Asetat

= 4:1


Pengamatan dibawah sinar UV 366 nm bertujuan untuk menampakkan noda yang

berfluoresensi. Pada sinar 366 nm, senyawa yang mengadsorpsi sinar UV noda

pada plat silikia gel akan berfluoresensi yaitu memancarkan cahaya tampak saat

dikenai sinar UV sedangkan silika gel yang tidak berfluoresensi pada sinar UV

366 nm akan berwarna gelap (Marliana, 2005). Hasil dari skrining fitokimia dapat

dilihat pada tabel 4.6 berikut :

Tabel 4.6. Hasil skrining fitokimia ekstrak fraksi etil asetat dan n-heksana

Pengujian Hasil

Senyawa Ekstrak Etil Asetat Ekstrak N-Heksana

Alkaloid _ +

Flavonoid + +

Saponin + +

Terpenoid + +

Fenol _ _

Arun Joshi dan Nikita Naik (2014) menyebutkan bahwa ekstrak etanol dari

akar kayu jawa mengandung alkaloid, karbohidrat, flavonoid, triterpenoid, steroid,

tanin, glikosida, saponin, dan protein. Hal ini berhubungan dengan hasil yang

telah didapakan dari uji skrining fitokimia ekstrak fraksi etil asetat dan n-heksana

isolat AP12A kapang endoit dari akar tanaman kayu jawa, yaitu diketahui

mengandung alkaloid, flavonoid, saponin dan terpenoid.

4.8 Uji Aktifitas Antioksidan

Uji Aktivitas Antioksidan Kualitatif

Uji aktivitas antioksidan ekstrak etil asetat dan n-heksana isolat AP12A

kapang endofit akar tanaman kayu jawa dilakukan dengan menggunakan metode

penangkapan radikal bebas DPPH (2,2-difenil-l-pikrilhidrazil). Metode DPPH

dipilih karena memerlukan sedikit sampel, sederhana, mudah, cepat, dan peka

untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari senyawa bahan alam. Pada metode

ini, DPPH bertindak sebagai model radikal bebas yang akan berikatan dengan

senyawa antioksidan (Wahdaningsih, et al., 2013).

Pengujian kualitatif antioksidan terlebih dahulu dilakukan elusi dengan

beberapa kombinasi eluen. Kombinasi eluen yang cukup baik untuk mengelusi


ekstrak etil asetat yaitu dengan pelarut etil asetat dan n-heksana dengan

perbandingan 4:1, dan untuk ekstrak n-heksana dengan perbandingan 1:4. Adanya

perubahan warna DPPH yang disemprotkan pada bercak plat KLT dari ungu

menjadi putih kekuningan menandakan bahwa ekstrak etil asetat dan n-heksana

isolat (AP12A) kapang endofit akar kayu jawa memiliki aktivitas antioksidan

(Wahdaningsih, et al., 2013).

Tabel 4.7. Hasil uji aktivitas antioksidan secara kualitatif

Fraksi Ekstrak

& Eluen Yang

Digunakan

Hasil Uji Kualitatif Antioksidan

UV 254 UV 366 Semprot DPPH Keterangan

Etil Asetat

Etil Asetat :

N-Heksana = 4:1

Terjadi bercak

putih

kekuningan

pada Rf-1: 0,9

dan Rf-: 0,45

N-Heksana

N-Heksana :

Etil Asetat

= 4:1

Terjadi bercak

putih

kekuningan

pada Rf-1: 0,3

Pada penelitian ini, uji kualitatif antioksidan pada ekstrak etil asetat

digunakan eluen n-heksana:etil asetat (4:1) dan ekstrak n-heksan menggunakan

eluen n-heksana:etil asetat (1:4). Setelah dielusi dan disemprot DPPH 0,2% dan

didiamkan selama 30 menit, pola bercak dari bahan uji berubah menjadi warna

putih kekuningan dengan latar belakang ungu yang menandakan bahwa kedua

ekstrak memiliki aktivitas antioksidan.

Uji Antioksidan Kuantitatif

Pengujian aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakukan dengan

menggunakan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Metode DPPH ini

dipilih karena merupakan metode yang sederhana, mudah, cepat dan peka serta


hanya memerlukan sedikit sampel untuk evaluasi aktivitas antioksidan dari

senyawa bahan alam (Molyneux, 2004).

Prinsip pengukuran aktivitas antioksidan secara kuantitatif menggunakan

metode DPPH ini adalah adanya perubahan intensitas warna ungu DPPH yang

sebanding dengan konsentrasi larutan DPPH tersebut. Radikal bebas DPPH yang

memiliki elektron tidak berpasangan akan memberikan warna ungu. Warna akan

berubah menjadi kuning saat elektronnya berpasangan. Perubahan intensitas

warna ungu ini terjadi karena adanya peredaman radikal bebas yang dihasilkan

oleh bereaksinya molekul DPPH dengan atom hidrogen yang dilepaskan oleh

molekul senyawa sampel sehingga terbentuk senyawa difenil pikril hidrazin dan

menyebabkan terjadinya peluruhan warna DPPH dari ungu ke kuning.

Perubahanwarna ini akan memberikan perubahan absorbansi pada panjang

gelombang maksimum DPPH menggunakan spektrofotometer UV-Vis sehingga

akan diketahui nilai aktivitas peredaman radikal bebas yang dinyatakan dengan

nilai inhibitory concentration (IC50) (Molyneux, 2004).

Nilai IC50 didefinisikan sebagai besarnya konsentrasi senyawa uji yang

dapat meredam radikal bebas sebanyak 50%. Semakin kecil nilai IC50 maka

aktivitas peredaman radikal bebas semakin tinggi (Molyneux, 2004). Secara

spesifik senyawa dikatakan sebagai antioksidan sangat kuat jika nilai IC50 kurang

dari 0,05 mg/mL, aktivitas kuat untuk IC50 antara 0,05-0,1 mg/mL, aktivitas

sedang jika IC50 bernilai 0.101-0.150 mg/mL dan aktivitas lemah jika IC50 bernilai

0,151 - 0,200 mg/mL (Blois, 1958).

Kekuatan antioksidan juga dapat ditentukan dengan mengukur nilai

antioxidant activity index (AAI) . Konsentrasi DPPH yang digunakan dalam uji

(ppm) dibagi dengan nilai IC50 yang diperoleh (ppm). Nilai AAI < 0.5 adalah

antioksidan lemah, AAI > 0,5-1 adalah antioksidan sedang, AAI >1-2 adalah

antioksidan kuat, dan AAI > 2 adalah antioksidan sangat kuat (Vasi, et al., 2012).

Pengukuran absorbansi ekstrak dengan DPPH menggunakan

spektrofotometer UV-Vis, sebelumnya dilakukan penentuan panjang gelombang

maksimum DPPH. Hasil gelombang maksimum larutan DPPH adalah 515,5 nm.

Penetapan panjang gelombang maksimal bertujuan untuk mengetahui besarnya

panjang gelombang yang dibutuhkan larutan DPPH untuk mencapai serapan


maksimum (Prastiwati, et al., 2010). Aktivitas antioksidan dari ekstrak dan

kontrol positif yang digunakan diukur pada panjang gelombang maksimum. Hasil

uji aktivitas antioksidan yang diperoleh dapat dilihat pada tabel berikut :

Tabel 4.8. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Ekstrak Etil Asetat.

Tabel 4.9. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Kuantitatif Vitamin C

Uji antioksidan secara kuantitatif terhadap ekstrak etil asetat isolat AP12A

kapang endofit akar kayu jawa diperoleh IC50 308,4326 ppm dengan nilai AAI

0,3. Untuk ekstrak n-heksana tidak diujikan dikarenakan ekstrak yang didapatkan

tidak mencukupi untuk pengujian secara kuantitatif. Vitamin C sebagai kontrol

positif memiliki nilai IC50 2,7339 ppm dengan nilai AAI 35,8461. Nilai AAI

menggambarkan sifat dari aktivitas antioksidan, apakah tergolong memiliki

aktivitas sangat kuat, kuat, sedang atau lemah. Nilai AAI yang kurang dari 0,5

menandakan antioksidan lemah, nilai AAI diantara 0,5 sampai 1 menandakan

antioksidan sedang, nilai AAI diantara 1 sampai 2 menandakan antioksidan kuat,

dan nilai AAI lebih dari 2 menandakan antioksidan yang sangat kuat (Vasi, et al.,

2012).

Berdasarkan penggolongan tersebut, ekstrak etil asetat isolat AP12A

kapang endofit akar kayu jawa memiliki aktivitas antioksidan yang lemah. Hal ini

berhubungan dengan hasil skrining fitokimia, yaitu tidak ada senyawa fenol pada

ekstrak etil asetat. Sahidi (1997) mengatakan bahwa komponen fenol dari tanaman

Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi

Rata-rata

% Inhibisi

(%)

Persamaan

Linear

IC50 AAI

200 0,313 33,96624 y = 0,1477x +

4,4445

R² = 0,9987

308,4326 0,3

100 0,384 18,98734

50 0,4165 12,1308

25 0,433 8,649789

12,5 0,444 6,329114

6,25 0,4515 4,746835

Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi

Rata-rata

% Inhibisi

(%)

Persamaan

Linear

IC50 AAI

5 0,9237 92,3700 y = 19,257x -

2,6469

R² = 0,9918

2,7339 35,8461

4 0,7799 77,9878

3 0,5145 51,4517

2 0,3747 37,4747

1 0,1634 16,3403


merupakan konstituen yang berperan aktif sebagai antioksidan. Antioksidan

senyawa fenolik dapat menghentikan atau menghambat tahapan inisiasi dengan

cara bereaksi dengan radikal asam lemak atau menghambat propagasi dengan cara

bereaksi dengan radikal peroksi atau radikal alkoksi. Oleh karena itu, semakin

tinggi kandungan senyawa fenolik dalam ekstrak seperti tanin, antosianin, dan

asam-asam fenolat akan memberikan efek penghambatan peroksida lebih besar.

Selain itu flavonoid juga berperan sebagai antioksidan dengan cara bertindak

sebagai scavenger/penangkal radikal bebas secara langsung (Arora, et al.,1998 ).

Ekstrak etil asetat juga mengandung flavonoid, tetapi dimungkinkan karena kadar

dari flavonoid yang sedikit mengakibatkan aktivitas antioksidan bersifat lemah.

Pada vitamin C sebagai kontrol positif memiliki aktivitas antioksidan yang sangat

kuat.

Vitamin C merupakan antikosidan yang bekerja sebagai oxygen

scavengers, yaitu mengikat oksigen sehingga tidak mendukung reaksi oksidasi.

Dalam hal ini, vitamin C akan mengadakan reaksi dengan oksigen yang berada

dalam sistem sehingga jumlah oksigen akan berkurang. Selain vitamin C, senyawa

yang bekerja sebagai oxygen scavengers diantaranya asam eritorbat dan sulfit

(Gordon, 1990).

Terdapat hubungan yang erat antara konsentrasi dengan % daya

antioksidan (% inhibisi) hal ini dibuktikan dengan kurva pada ekstrak etil asetat

dan vitamin C pada kurva gambar berikut :

Gambar 4.1. Kurva Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi Ekstrak Etil Asetat

y = 0,1477x + 4,4445R² = 0,9987

05

10152025303540

0 100 200 300

% i

nh

ibis

i

Konsentrasi (%)

Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi

Ekstrak etil asetat isolat AP12A kapang endofit akar

kayu jawa

Series1

Linear (Series1)


Gambar 4.2. Kurva Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi Vitamin C

Dari data kurva regresi menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang erat

antara konsentrasi dengan % daya antioksidan (% inhibisi). Hal ini diperlihatkan

dengan nilai R² (koefisien korelasi) di atas 0,9. Nilai R² menyatakan bahwa

terdapat korelasi antara konsentrasi sampel dengan % inhibisi yang diamati

dengan derajat keeratan untuk isolat etil asetat sebesar 0,9987. Ini menunjukan

bahwa lebih dari 99% derajat penghambatan dipengaruhi oleh konsentrasi bahan,

sedangkan kurang dari 1% dipengaruhi oleh faktor lain (Wahdaningsih, et al.,

2013).

Kurva di atas diperoleh dengan menggunakan regresi linier pada aplikasi

pengolah data microsoft excel 2010. Koefisien y pada persamaan linier bernilai 50

merupakan koefisien IC50, sedangkan koefisien x pada persamaan linier ini

merupakan konsentrasi ekstrak yang akan dicari nilainya, dimana x yang

diperoleh merupakan besarnya konsentrasi yang diperlukan untuk dapat meredam

50% aktivitas radikal DPPH.

4.9 Uji Aktivitas Antibakteri

Pengujian aktivitas antibakteri pada penelitian ini dilakukan dengan

penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) dengan metode mikrodilusi dan

penentuan konsentrasi bunuh minimum (KBM). Mikroorganisme uji yang

digunakan adalah Salmonella typhi ATCC 14028, Bacillus subtilis ATCC 6633,

dan Staphylococcus aureus ATCC 25923.

y = 19,257x - 2,6469R² = 0,9918

0,0000

10,0000

20,0000

30,0000

40,0000

50,0000

60,0000

70,0000

80,0000

90,0000

100,0000

0 1 2 3 4 5 6

% I

nh

ibis

i

Konsentrasi (ppm)

Hubungan Konsentrasi dan % Inhibisi Vitamin C


Pemilihan bakteri tersebut berdasarkan hasil uji pendahulua kapang

endofit sebelumnya, yaitu dihasilkan isolat AP12A menunjukkan aktivitas pada

tiga bakteri yaitu Salmonella typhi, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis.

Ekstrak yang digunakan adalah etil asetat, karena hasil ekstrak n-heksana yang

didapatkan tidak mencukupi untuk uji dengan metode mikrodilusi. Penentuan

KHM secara in vitro dengan metode broth microdilution (pengenceran agar)

dipilih karena metode pengujian ini lebih sederhana, sampel yang dibutuhkan

lebih sedikit, sensitivitasnya lebih tinggi dan hasilnya kuantitatif. Pengujian KHM

dilakukan triplo untuk ekstrak uji dan triplo untuk kontrol kloramfenikol dan

ciprofloksasin dengan prinsip pengujian yaitu pengenceran berganda bahan uji

pada media cair MHB yang dilakukan pada sterilized 96 round bottom microwell

plate. Dimana konsentrasi paling tinggi ada pada sumur kolom kedua belas.

Kemudian konsentrasi sumur kolom kesebelas merupakan setengah dari

konsentrasi akhir sumur kolom kedua belas. Prinsip ini berlaku sama hingga

kolom kelima. Kolom keempat dikosongkan untuk mempermudah dalam

penandaan atau sebagai pembatas untuk kontrol. Kolom ketiga sebagai kontrol

positif yang berisi media MHB dan bakteri uji saja tanpa adanya ekstrak tanaman

uji, kolom kedua di gunakan sebagai kontrol positif yang berisi media MHB dan

ekstrak uji dengan konsentrasi ekstrak paling besar, sedangkan kolom pertama

digunakan sebagai kontrol media yang berisi media MHB saja. Konsentrasi

ekstrak uji yang digunakan dalam pengujian mikrodilusi ini berada pada rentang

1000 μg/mL hingga 7,8 μg/mL. Sedangkan untuk kloramfenikol dan

ciprofloksasin masing masing berada pada rentang 16 μg/mL hingga 0,125 μg/mL

dan 8 μg/mL hingga 0.0625 μg/mL.

Pada saat melarutkan ekstrak tanaman uji dan antibiotik digunakan

dimetilsufoksida (DMSO) yang memiliki sifat sebagai pelarut universal, yaitu

dapat melarutkan sebagian besar senyawa polar, sebagian kecil senyawa

semipolar dan sebagian kecil senyawa non polar. DMSO mempunyai aktivitas

antibakteri pada konsentrasi >10%, sehingga pada penggunaannya sebagai

pelarut, konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 2,5%. Pada

konsentrasi tersebut DMSO tidak memberikan aktivitas antibakteri.


Tahap akhir dari metode mikrodilusi ini adalah penambahan p-

iodotetrazolium (INT), yang digunakan untuk indikator pertumbuhan bakteri, lalu

diinkubasi selama 30 menit. INT digunakan karena selain dari hasilnya yang baik

dan kontras karena memberikan warna ungu juga penyiapannya yang mudah yaitu

dilarutkan dalam aquadest (Valgas et al, 2007). Garam tetrazolium akan diubah

oleh mikroba melalui enzim dehidrogenase menjadi pewarna formazan dan akan

terlihat berwarna ungu jika ada pertumbuhan pada bakteri (Choma, 2010). Hal ini

memudahkan untuk penentuan nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) secara

visual.

Nilai KHM adalah nilai konsentrasi terkecil dimana tidak ada

pertumbuhan bakteri secara visual ditandai dengan larutan yang bening dan tidak

ada endapan serta tidak berwarna ungu karena penambahan INT pada sumur yang

digunakan, sedangkan nilai KBM merupakan konsentrasi terkecil yang tidak

menunjukkan yang bertujuan untuk adanya pertumbuhan bakteri pada media agar

setelah diinkubasikan. Penentuan nilai KBM dilakukan dengan cara

menggoreskan larutan uji pada konsentrasi larutan bening hasil pengujian KHM

menuju media muller hilton agar (MHA) steril yang telah memadat dalam cawan

petri. Konsentrasi agar yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri

dinyatakan sebagai KBM. Hasil KHM dan KBM esktrak tanaman uji dan

antibiotik terhadap bakteri selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 4.10

Tabel 4.10. Hasil Nilai KHM dan KBM Ekstrak Etil Asetat

Bakteri KHM

dan

KBM

Nilai KHM dan KBM (μg/mL)

Fraksi Etil

asetat AP12A

Kloramfenikol Ciprofloksasin

Bacillus subtilis

ATCC 6633

KHM

KBM

500ppm

>1000ppm

8ppm

16ppm

-

Staphylococus

aureus ATCC

25923

KHM

KBM

500ppm

1000ppm

- 2ppm

8ppm

Salmonella typhi

ATCC 14028

KHM

KBM

250ppm

500ppm

- 4ppm

8ppm

Hasil uji dengan metode mikrodilusi menunjukkan ekstrak etil asetat isolat

AP12A akar tanaman kayu jawa mempunyai Konsentrasi Hambat Minimum

(KHM) terbesar pada bakteri Salmonella typhi yaitu 250 µg/mL dengan nilai


konsentrasi bunuh minimum (KBM) 500 µg/mL, sedangkan untuk kontrol

antibiotik mempunyai nilai KHM terbesar 2 µg/mL dengan nilai KBM 8 µg/mL,

yaitu antibiotik ciprofloksasin pada bakteri Salmonella typhi. Ekstrak etil asetat

pada bakteri Bacillus subtilis dan Staphylococus aureus menunjukkan nilai KHM

yang sama yaitu 500 µg/mL. Hal ini menunjukkan ekstrak etil asetat lebih reaktif

menghambat bakteri Salmonella typhi dibandingkan dengan bakteri bakteri

Bacillus subtilis dan Staphylococus aureus, tapi masih jauh dengan nilai KHM

kontrol antibiotik yang digunakan.

Pada uji KHM dilakukan beberapa kontrol, yaitu kontrol media dan

kontrol positif. Kontrol media yang berisi media MHB saja, yang bertujuan untuk

menunjukkan bahwa media yang digunakan steril tanpa ada kontamiasi dari

bakteri, dan untuk kontrol positif yaitu berisi media MHB dan bakteri unutuk

menunjukkan bahwa bakteri dapat tumbuh pada media MHB.

Berdasarkan beberapa literature, berbagai metabolit sekunder yang

terdapat pada tanaman memiliki aktivitas antibakteri diantaranya, flavonoid,

terpenoid, saponin, tanin dan alkaloid. Hal tersebut berhubungan dengan hasil

skrining fitokimia pada ekstrak etil asetat yang positif mengandung senyawa

terpenoid, flavonoid dan saponin.

Metabolit sekunder yang terdapat pada tanaman memiliki aktivitas

antibakteri dengan berbagai makanisme kerja. Umumnya senyawa flavonoid dapat

menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Mekanisme

kerja flavonoid sebagai antibakteri dapat dibagi menjadi tiga yaitu: (1)

menghambat sintesis asam nukleat, (2) menghambat fungsi membran sel, dan (3)

menghambat metabolisme energi (Cowan, 1999).

Mekanisme antibakteri flavonoid menghambat sintesis asam nukleat

terletak pada cincin B yang berperan penting dalam proses interkalasi atau ikatan

hidrogen dengan menumpuk basa asam nukleat yang menghambat pembentukan

DNA dan RNA (Cushnie, 2005). Mekanisme kerja flavonoid menghambat fungsi

membran sel adalah dengan membentuk ikatan komplek dengan dinding sel dan

merusak membran (Pepeljnjak et al, 2005). Senyawa ini merupakan antimikroba

karena kemampuannya membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler terlarut

serta dinding sel mikroba. Flavonoid yang bersifat lipofilik akan merusak


membran mikroba (Rahman, 2008). Flavonoid dapat menghambat metabolisme

energi dengan cara menghambat sistem respirasi, karena dibutuhkan energi yang

cukup untuk penyerapan aktif berbagai metabolit dan untuk biosintesis

makromolekul (Cushnie, 2005).

Senyawa terpenoid juga diketahui aktif melawan bakteri, tetapi mekanisme

antibakterial terpenoid masih belum benar-benar diketahui. Aktivitas antibakteri

terpenoid diduga melibatkan pemecahan membran oleh komponen-komponen

lipofilik (Cowan, 1999; Bobbarala, 2012).

Senyawa saponin juga dapat memberikan aktivitas antibakteri. Mekanisme

kerja saponin sebagai antibakteri adalah menurunkan tegangan permukaan

sehingga mengakibatkan naiknya permeabilitas atau kebocoran sel dan

mengakibatkan senyawa intraseluler akan keluar yang mengakibatkan kematian

sel (Nuria, et al., 2009).

Berdasarkan penelitian ini, maka dapat diketahui bahwa ekstrak etil asetat

isolat AP12A dari akar tanaman kayu jawa menunjukkan adanya aktivitas

antibakteri dan didukung dengan hasil skrining fitokimia yang menunjukkan

bahwa ekstrak mempunyai senyawa flavonoid, saponin dan terpenoid yang

berpotensi sebagai antibakteri. Isolat AP12A juga menunjukkan adanya senyawa

antioksidan yang lemah dengan metode DPPH yang mempunyai IC50 308,4326

ppm dengan nilai AAI 0,3.

51


5 BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Ekstrak etil asetat dan n-heksana isolat AP12A dari akar tanaman kayu

jawa memiliki aktivitas antioksidan, hal ini dibuktikan dengan hasil uji

antioksidan kualitatif menggunakan DPPH 0.2%.

2. Uji aktivitas antioksidan kuantitatif menunjukkan bahwa ekstrak etil

asetat memiliki aktivitas antioksidan lemah dengan nilai AAI 0,3 dan IC50

308,4326 ppm.

3. Uji aktivitas antibakteri kuantitatif menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat

isolat AP12A dari akar tanaman kayu jawa memiliki akttivitas antibakteri

tergolong tidak aktif (KHM > 250) terhadap bakteri Bacillus subtilis

ATCC 6633 nilai KHM sebesar 500 μg/mL dan KBM sebesar > 1000

μg/mL, nilai KHM dan KBM untuk bakteri Staphylococus aureus ATCC

25923 adalah 500 μg/mL dan 1000 μg/mL dan nilai KHM sebesar 250

μg/mL dan KBM sebesar 500 μg/mL terhadap bakteri Salmonella typhi

ATCC 14028.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui senyawa aktif yang

berperan sebagai antioksidan dan antibakteri.

2. Perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan secara kuantitatif dan

pengujian antibakteri secara kuantitatif untuk mengetahui Konsentrasi

Hambat Minimum dan Konsentrasi Bunuh Minumum terhadap ekstrak n-

heksana.

3. Perlu memperbanyak volume media fermentasi agar didapatkan ekstrak

yang lebih banyak lagi.

52


DAFTAR PUSTAKA

Adji., Zuliyanti, & Henry Larasanti. 2007. Perbandingan Efektivitas Serilisasi

Alkohol 70%, Inframerah, Autoklaf dan Ozon Terhadap Pertumbuhan

Bakteri Bacillus subtilis. Yogyakarta : Sain Vet, 27 NO.1, pp.17–24.

Alexander, K. S., Strte, D, & Niles, J.M. 2004. Laboratory Excercises in

Organismal and Molecular Microbiology, New York: McGraw-Hill.

Amin, A., & Yuliana, D. 2010. Etnofarmakologi Tumbuhan Obat Pada Etnis

Bugis Untuk Pengobatan Gangguan Saluran Cerna Dan Identifikasi

Farmakognostiknya. Yogyakarta : Prosiding Seminar Nasional “Eight Star

Performance Pharmacist”.

Andidha, Karimah Yulianti. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Daun

Garcinia bentami Pierre Terhadap Beberapa Bakteri Patogen Dengan

Metode Bioautografi. Skripsi. Jakarta: Program Studi Farmasi, Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah.

Antolovich, M., Prenzler, P.D., Patsalides, E., McDonald, M & Kevin Robards.

2001. Analist Methods for Testing Antioxidant Activity. Australia : School of

Science and Technology, Charles Sturt University, DOI : 10.1039/b009171

Ariyono, R.Q., Djauhari, S. & Sulistyowati, L. 2014. Keanekaragaman Jamur

Endofit Akar Kangkung Darat ( Ipomoea Reptans Poir.) Pada Lahan

Pertanian Organik Dan Konvensional. Jurnal Hama dan Penyakit Tanaman,

2(1), pp.1–10.

Arora, A., M.G. Nair, and G.M. Strasburg. 1998. Structure – activity relationships

for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system.

Free Radic. Biol.& Med. 24(9): 1355-1363.

Bauman, Robert W. 2012. Microbiology with Disease by Body System Third

Edition. Pearson.

Blois, M.S. 1958. Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free

Radical. California : Stanford University, doi:10.1038/1811199a0

Bobbarala, Varaprasad. 2012. Antimicrobial Agents. Janeza Tridine 9,51000

rijeka, Crotia.

Brian, P. & Christian, J., 1996. An Introduction to Fermentation: Fermentation

Basic. Diakses dari www.wakenbtech.co.jp pada 18 April 2017 pukul 16.22

WIB

Choma, I.M. & Grzelak, E.M., 2011. Bioautography Detection in Thin-Layer

Chromatography. Polandia : Journal of Chromatography A, ISSN 00219673

, pp.2684–2691.


Cowan, .M.M. 199. Plan Product as Antimicrobial Agents. J. Microbiology

Reviews 12(4):564-582.

Cushnie, T.P., Lamb, Andrew J. 2005. Revew Antimicroba Activity of Flavonoids.

Schol of Pharmacy, The Robert Gordon University, Schoolhill, Aberdeen

AB10 1FR, UK

Dainitith, J., 1994. A Concise Dictionary of Chemistry. Inggris : Oxford

University Press.

Desale, M.G. & Bodhankar, M.G., 2013. Antimicrobial Activity of Endophytic

Fungi Isolated From Vitex negundo Linn. India : Int. J. Curr. Microbiol.

App. Sci, 2(12), ISSN: 2319-7706 pp.389–395.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 2000. Parameter Standar

Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Departemen Kesehatan Republik

Indonesia. Jakarta.

Dompeipen, E. J & Simanjuntak, P., 2015. Aktivitas Antidiabetes dan Antioksidan

Kapang Endofit dari Tanaman Mahoni (Swietenia macrophylla King).

Indonesia : Biopropal Industri (Kemenperin), 6(1), pp.7–17.

Elfina, D., Martina, A. & Roza, R.M., 2013. Isolasi dan Karakterisasi Fungi

Endofit dari Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Sebagai

Antimikroba Terhadap Candida albicans, Staphylococcus aureus, dan

Escherichia coli. Riau. Diakses dari id.portalgaruda.org pada 18 April 2017

pukul 17 : 27 , pp.1–10.

Gandjar,I., Samson,R.,A dan Karin Van Den. 1999. Pengenalan Kapang Tropik

Umum, Jakarta: Yayasan Obor Indonesia.

Gandjar, I. 2000. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta: Yayasan Obor

Indonesia. Hlm. 2-7.

Gandjar, Indrawati; Sjamsuridzal, Wellyzar, Ed. 2006. Mikologi: Dasar dan

Terapan. Jakarta: Yayasan Obor Indonesia.

Gauniyal, P. & Teotia, U.S., 2015. Antimicrobial Activity of Sixteen Medicinal

Plants against Oral Flora and its Efficacy Comparison with 2 %

Chlorhexidine. India : International Journal of Multidisciplinary and

Scientific Emerging Research, ISSN 2349 – 6037. 4(2), p.12.

Ghosal, M. & Mandal, P., 2012. Phytochemical Screening And Antioxidant

Activities Of Two Selected “Bihi” Fruits Used As Vegetables In Darjeeling

Himalaya. University of North Bengal, Siliguri : ISSN- 0975-1491 , 4(2).

Gordon, MH. 1990. The Mechanism of Antioxidants Action in Vitro. Dalam B.J.F.

Hudson, editor. Food Antioxidants. Elsevier Applied Science, London.


Handayani, P.N., 2015. Isolasi, Seleksi, dan Uji Aktivitas Antimikroba Kapang

Endofit dari Daun Tanaman Jamblang (Syzygium cumini L.) terhadap E.

coli, P. aeruginosa, B. subtillis, S. aureus, C. albicans, dan Aspergilus

niger. Skripsi. Jakarta: Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah.

Ivanišová, E., Tokar, K., Mocjo, K., Bajnanska, T., Marecek, J., & Mendelevo, A.

2013. Antioxidant Activity of Selected Plant Products. Slovakia : Journal of

Microbiology, Biotechnology, and Food Sciences.

Jauhari, L.T., 2010. Seleksi dan Identifikasi Kapang Endofit Penghasil

Antimikroba Penghambat Pertumbuhan Mikroba Patogen. Skripsi. Jakarta:

Program Studi Sarjana Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah.

Kedare, S.B. & Singh, R.P., 2011. Genesis and Development of DPPH Method of

Antioxidant Assay. India : Association of Food Scientists & Technologists,

DOI 10.1007/s13197-011-0251-1

Komala, I., Azrifitria., Yardi., Betha, O.S., Muliati, F., Ni’mah, M. 2015.

Antioxidant and Anti-Inflamatory of the Indonesian Ferns, Nephrolepis

falcata and Pyrrosia lanceolata. Ciputat, Indonesia: Internatoional Of

Pharmacy And Pharmaceutical Sciences.

Kumala, S, & Pratiwi,A. 2014. Efek Antimikroba dari Kapang Endofit Ranting

Tanaman Biduri.Jakarta : Jurnal Farmasi Indonesia, Fakultas Farmasi

Universitas Pancasila , 7(2), pp.111–120.

Kumala, S., 2014. Mikroba Endofit: Pemanfaatan Mikroba Endofit dalam Bidang

Farmasi. Jakarta: ISFI Penerbitan.

Kumar, G.S., Jayaveera, K. N., Kumar, C. K. A., Sanjay, U. P., Swamy, B. M. V.,

dan Kumar, D. V. K. 2007. Antimicrobial effects of Indian medicinal plants

against acne-inducing bacteria. Benin city, Nigeria : Tropical Journal of

Pharmaceutical Research.

Kumar, R.G.A., Joy,J.M. Rasheed, A., & Ashok Kumar, C.K. 2011.

Pharmacognostical and Phytochemical Study on the Leaves of Lannea

Coromandelica (Houtt.) Merr. India : International Journal of Pharmacy

Practice & Drug Research , 1(1), pp.14–20.

Kumalasari E., Sulstyani N. 2011. Aktivitas Antifungi Ekstrak Etanol Batang

Binahong (Anredera cordifolia (Tenore) Steen.) Terhadap Candida albicans

Serta Skrining Fitokimia. Jurnal Ilmiah Kefarmasian, Vol. 1, No. 2, Hal. 51-

62.

Kuncahyo, I. & Sunardi. 2007. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing

Wuluh (Averrhoa Bilimbi, L) Terhadap 1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl

(DPPH). Yogyakarta : Seminar Nasional Teknologi, 2007(November),

ISSN : 1978 – 9777 pp.1–9.


Kusumaningtyas E., Natasia M., Darmono. 2010. Potensi Metabolit Kapang

Endofit Rimpang Lengkuas Merah dalam Menghambat Pertumbuhan

Eschericia coli dan Staphylococcus aureus dengan Media Fermentasi

Potato Dextrose Broth (PDB) dan Potato Dextrose Yeast (PDY). Seminar

Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner.

Majumder, R., Jami,S.I., Efie Khairul Alam & Badrul Alam. 2013. Antidiarrheal

Activity of Lannea coromandelica Linn. Bark Extract. Banggladesh :

American-Eurasian Journal of Scientific Research, 8(3), pp.128–134, ISSN

1818-6785.

Manik, M.K., Wahid, M.A., Islam, S.M.A. Pal, A., & Ahmed, K.T. 2013. A

Comparative Study Of The Antioxidant, Antimicrobial And Thrombolytic

Activity Of The Bark And Leaves Of Lannea Coromandelica

(Anacardiaceae). Bangladesh : International Journal of Pharmaceutical

Sciences and Research, ISSN: 0975-8232.

Markham, K.R. 1982. Cara Mengidentifikasi Flavonoid.Bandung : diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB Bandung.

Maryanti, A., 2015. Isolasi dan Karakterisasi Kapang Endofit dari Ranting

Tanaman Parijoto (Mednilla spiciosa Reinw. Ex Blume) dan Uji

Aktivitasnya sebagai Antibakteri. Jakarta : Skripsi UIN Syarif Hidayatullah.

Molyneux, P., 2004. the Use of the Stable Free Radical Diphenylpicryl- Hydrazyl

( DPPH ) for Estimating Antioxidant Activity. , 50(June 2003).

Mozer, H., 2015. Uji Aktivitas Antifungi Ekstrak Etanol 96% Kulit Batang Kayu

Jawa (Lannea coromandelica) terhadap Aspergillus niger, Candida

albicans, dan Trichophyton rubrum. Jakarta : Skripsi UIN Syarif

Hidayatullah.

Noverita, Firia D., Sinaga E. 2009. Isolasi dan Uji Aktivitas Antibakteri Jamur

Endofit dari Daun dan Rimpang Zingiber ottensii Val. Jurnal Farmasi

Indonesia Vol. 4 No. 4: 171-176.

Novitri, S.A., 2016. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Kulit Buah Delima

(Punica Granatum L.) Dan Batang Sereh (Cymbopogon Citratus) serta

Kombinasinya Terhadap Klebsiella Pneumoniae, Escherichia Coli,

Staphylococcus Aureus dan Pseudomonas Aeruginosa. Bandung, Thesis,

Program Studi Magister Farmasi, Institut Teknologi Bandung.

Nurainy et al. 2008. Pengaruh Konsentrasi Kitosan terhadap Aktivitas Antibakteri

dengan Metode Difusi Agar (Sumur). Jurnal Teknologi Industri dan Hasil

Pertanian. Volume 13, No. 2.

Nurdin M., Supriyanti T., Zackiyah. 2010. Penantuan Pelarut Terbaik dalam

Mengekstraksi Senyawa Bioaktif dari Kulit Batang Artocarpus

heterophyllus. Jurnal Sains dan Teknologi Kimia. ISSN 2087-7412. Vol. 1,

No. 2. Hal 150-158.


Nuria, M.C et.,al. 2009. uji aktivitas antibakteri ekstrak etaol daun jarak pagar

(Jatropha Curcas L) Terhadap Bakteri Staphyloccocus Aureus ATCC

25923, Escherichia Coli ATCC 25922, dan Salmonella typhosa ATCC 1408.

Jurnal Ilmu-ilmu Pertanian.

Okafor, N., 2007. Modern Industrial Microbiology and Biotechnology. South

Carolina USA : Department of Biological Sciences Clemson University,

Clemson, Science Publisher.

Parija, S.C., 2009. Textbook of Microbilogy & Immunology. India : Elsevier,

Department of Microbiology, Jawaharlal Institute of Postgraduate Medical

Education and Research Puducherry, India.

Pawthong, P., Jantrapanukorn, B., Thongmee, A., dan Pattra Suntornthiticharoen.

2012. “Evaluation of Endophytic Fungi Extract for Their Antimicrobial

Activity from Sesbania grandifloria (L). Pers. International Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Research, 3(2): 132-136.

Pepeljinjak, S., Z. Koladera, & Zovko, M. 2005. Antimicrobial Activity of

Flafoniod from Pelargonium radula (cav) L'herit. Acta Pharm. 55:431-435.

Pokorny, J., Yanishlieva N., Gordon M. 2001. Antioxidant in Food, Practical

Applications. England: Woodhead Publishing Ltd and CRC Press LLC.

Prakash, A., Rigelhof, F. & MIller, E., 2011. Antioxidant Activity. European

Review for Medical and Pharmacological Sciences, 15(4), pp.376–378.

Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21621684.

Pratiwi, S.T., 2008. Mikrobiologi Farmasi, Jakarta: Erlangga.

Prastiwati, R., Wranti S.R., Dwi, H., 2010 : Perbandingan Daya Antioksidan

Ekstrak Metanol Daun Tembakau (Nicotiana Tabacum L) Dengan Rutin

Terhadap Radikal Bebas 1,1-Diphenil-2-Pikrilhidrazil (Dpph). Purwokerto :

Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto, ISSN 1693-

3591.

Prawirodihirjo, E., 2014. Uji Aktivitas Antioksidan dan Uji Toksisitas Ekstrak

Etanol 70% dan Ekstrak Air Kulit Batang Kayu Jawa (Lannea

coromandelica). Jakarta : Skripsi UIN Syarif Hidayatullah.

Purwanto. 2011. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Penghambat Polimerisasi Hem

dari Fungi Endofit Tanaman Artemisia annua L. Yogyakarta : Tesis.

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada.

Rachmayani, R. 2008. Skrining Kapang Endofit Penghasil Antimikroba dan

Antioksidan dari Ranting dan Daun Tanaman Garcinia mangostana.

Depok: Skripsi, Program Studi Farmasi. Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam. Universitas Indonesia.


Radji, M. 2005. Peranan Bioteknologi Dan Mikroba Endofit Dalam

Pengembangan Obat Herbal. Depok : Majalah Ilmu Kefarmasian,

Departemen Farmasi, FMIPA-UI, Kampus UI Depok ISSN : 1693-9883,

II(3), pp.113–126.

Radji, M., Sumiati, A., Rachmayani, R, & Elya, B. 2011. Isolation of fungal

endophytes from Garcinia mangostana and their antibacterial activity.

African Journal of Biotechnology, 10(1), ISSN 1684-5315, pp.103–107.

Rahayu., Sunarti , S., Diah, P. Suhardjono. 2006. Pemanfaatan Tumbuhan Obat

secara Tradisional oleh Masyarakat Lokal di Pulau Wawonii, Sulawesi

Tenggara. Jurnal Biodiversitas Vol. 7 (3).

Rahmadani, F. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri dari Ekstrak Etanol 96% Kulit

Batang Kayu Jawa (Lannea coromandelica) terhadap Bakteri

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori, dan

Pseudomonas aeruginosa. Jakarta : Skripsi UIN Syarif Hidayatullah.

Ramadhan, M.G. 2013. Skrining Dan Uji Aktivitas Penghambatan Α-Glukosidase

Dari Kapang Endofit Daun Johar (Cassia Siamea Lamk.).Sekripsi Depok :

Program Studi Sarjana Farmasi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Indonesia

Rohdiana, D., 2001. Aktivitas Pengangkapan Radikal Polifenol Dalam Daun Teh.

Bandung : Majalah Farmasi Indonesia, 1(1), pp.52–58.

Sahidi F., & P.K.J. Warnasundara. 1997. Phenolic antioxidant. Crit Rev J. Food

Sci. Nutrition.

Sangadji I., Parakkasi A., Wiryawan K.G., Haryanto B. 2008. Perubahan Nilai

Nutrisi Ampas Sagu selam pada Fase Pertumbuhan Jamur Tiram Putih

(Pleurotus ostreatus) yang Berbeda. Jurnal Ilmu Ternak, Vol. 8, No. 1, Hal.

31-34.

Saputra, A. 2015. Uji Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Etanol 96% Kulit Batang

Kayu Jawa (Lannea coromandelica) dengan Metode Stabilisasi Membran

Sel Darah Merah secara In Vitro. Jakarta : Skripsi UIN Syarif Hidayatullah.

Sherma, J & Fried, B., 2003. Handbook of Thin-Layer Chromatography Third

Edition. New York: Marcel Dekker.

Siswandono dan Bambang Soekardjo, E. D. 2008. Kimia Medisinal Edisi 2.

Surabaya: Airlangga University Press.

Strobel G, & Daisy, B. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their

natural product. Amerika : Microbiology and Molecular Biology Review,

DOI: 10.1128/MMBR.67.4.491–502.2003, 67(4), pp.491–402.

Stanbury, Peter F; Whitaker, Allan; Hall, Stephen J. 2003. Principles of

Fermentation Technology Second Edition. Burlington MA: Elsevier

Science.


Suryanarayanan, T.S., Thirunavukkarasu, N., Govindarajulu, M.B., Fasse, F.,

jansen, R., dan Murali, T. S., 2009. Fungal endophytes and bioprospecting.

Fungal Biology Reviews, ISSN 1749-4613, 23(1–2), pp.9–19.

Tahir,I.,Wijaya,K, & Widianingsih, D. 2003. Terapan Analisis Hansch untuk

Aktivitas Antioksidan Senyawa Turunan Flavon/Flavonol. Yogyakarta,

Seminar on Chemometrics, (January 2003).

Tiwari, P.,Kumar, B., Kaur, M., Kaur,G, & Kaur, H. 2011. Phytochemical

screening and extraction - A review. India : Internationale Pharmaceutica

Sciencia, 1(1), pp.98–106. Available at: http://www.ipharmsciencia.com.

Valgas, C., Souza, S. M. D., Smania, E. F. A., & Artur Smania Jr. 2007.

Screening Methods To Determine Antibacterial Activity of Natural

Products. Brasil : Brazilian Journal of Microbiology, ISSN 1517-8382, 38,

pp.369–380.

Vasi, M.V., Stefanović, O.D., Ličina, B.Z., Radojević, I.D., Čomić, L.R. 2012.

Biological Activities of Extracts from Cultivated Granadilla Passiflora

alata. Serbia : ISSN 1611-2156 , pp.208–218.

Wafa, N.I., 2011. Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi Air Daun Gambir (Uncaria

Gambir Roxb) Dengan Mikrodilusi dan Analisis Komponen Penyusunnya.

Bogor. Thesis. Institut Pertanian Bogor.

Wahdaningsih, S., Wahyuono, S., & Styowati, E.P., 2013 : Isolation And

Identification Of Antioxidant Compounds In Fern Stems (Alsophila Glauca

J.Sm) Using Dpph Method (2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl). Department Of

Biology, Faculty Of Pharmacy , Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,

Indonesia ; ISSN : 1410-5918.

Wahid, M.A., 2009. In vitro Phytochemical and biological Investigation of plant

Lannea coromandelica ( Family : Anacardiaceae ). Bangladesh : Thesis

East West University, ID: 2008-3-70-081.

Wahyudi, P., 2001. Mikroba endofitik : Simbion dalam Jaringan Tanaman. BPPT

: Lingkungan Manajemen Ilmiah.

Wagner, H., Bladt, S., and Zgainski, E. M., 1984, Plant Drug Analisys: A Thin

Layer Chromatography Atlas. Berlin : diterjemahkan oleh Th. A. Scott,

Springer- Verlag.

Yulianti, T., 2012. Menggali Potensi Endofit untuk Meningkatkan Kesehatan

Tanaman Tebu Mendukung Peningkatan Produksi Gula. Malang : Balai

Penelitian Tanaman Pemanis dan Serat, ISSN: 1412-8004, 11(2), pp.11–

112.


Zhang, X.-L., Jeza, V.T. & Pan, Q., 2008. Salmonella Typhi: from a Human

Pathogen to a Vaccine Vector” Cellular & Molecular Immunology. Cellular

& molecular immunology, ISSN : 1672-7681 5(2), pp.91–97.

Zulfa, I., 2016. Isolasi Dan Uji Aktivitas Antibakteri Kapang Endofit Akar

Tanaman Kayu Jawa (Lannea Coromandelica (Houtt.) Merr.). Jakarta :

Skripsi UIN Syarif Hidayatullah.

60


LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Alur Penelitian

Uji Aktivitas Antibakteri

Uji Aktivitas Antioksidan

Analisis KLT dan Sekrining Fitokimia

Ekstraksi

Fermentasi Kapang Endofit

Uji Pendahuluan Kapang Endofit Penghasil Antibakteri

Karakterisasi Kapang Endofit

Pemurnian Kapang Endofit


Lampiran 2. Sertifikat Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923


Lampiran 3. Sertifikat Bakteri Salmonella typhi ATCC 14028


Lampiran 4. Sertifikat Bakteri Bacillus subtilis ATCC 6633


Lampiran 5. Sertifikat Ciprofloksasin


Lampiran 6. Sertifikat Kloramfenikol

Lampiran 7. Skema Pemurnian Kapang Endofit


Lampiran 7. Skema Pemurnian Kapang Endofit

Kapang endofit yang

telah tumbuh pada

media PDA

Dimurnikan pada media PDA baru

Diinkubasi selama

7 hari pada suhu

kamar (27-29ºC)

Jika belum murni / terjadi

kontaminasi, inokulasi

kembali sampai didapatkan

isolat kapang yang diinginkan

Sehingga didapatka

kultur murni

Kemudian akan di

karakterisasi dan akan di

seleksi untuk mendapatkan

isolat kapang yang

mempunyai aktivitas bagus


Lampiran 8. Skema Karakterisasi Makroskopik dan Mikroskopik

1. Karakterisasi makroskopik

Dilakukan pengamatan morfologi koloni meliputi:

- Bentuk koloni (halus, kasar, licin, rata, menggunung),

- Warna koloni dan warna sebalik koloni (reverse color),

- Tekstur (granular, seperti tepung, seperti beludru, seperti kapas),

- Zonasi, dan tetes eksudat.

2. Karakterisasi mikroskopik

Diinkubasi selama 5

– 7 hari pada suhu

ruang (29°C)

Kaca objek dan kaca

penutup di atas tisu di

dalam cawan petri di

sterilisasi dengan

autoklaf 121ºC 15

menit

Kaca objek steril

diteteskan media

PDA

Diletakkan satu

sengkelit kapang di

atas media PDA yang

telah padat menit

Kaca objek ditutup

dengan kaca penutup

dan tisu ditetesi

aquades steril

Kaca penutup

dibuka, kapang

ditetesi alkohol 96%

dan methylene blue

Preparat diamati

dengan mikroskop

cahaya Tisu ditempelkan diatas

kapang untuk

menghilangkan

kelebiham methilene blue


Lampiran 9. Hasil Uji Pendahuluan Isolat (AP12A)

1. Eschericia coli Inkubator (37°C , 24 jam) SPREAD PLAT

Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Eschericia coli

dengan metode spread plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam

Inkubator (37°C , 24 jam) POUR PLAT


dengan metode pour plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam


Suhu Ruang (37°C , 24 jam) POUR PLAT


dengan metode pour plat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam

2. Stapillococcus aureus

Inkubator (37°C , 24 jam) SPREAD PLAT

Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Stapilococcus

aureus dengan metode spread plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam



Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Streptococcus

aureus dengan metode pour plat dan diinkubasi pada inkubator selama 24 jam

Suhu Ruang (37°C , 24 jam) POURPLAT

Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Streptococcus

aureus dengan metode pour plat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam


3. Salmonella thypi Inkubator (37°C , 24 jam) SPREAD PLAT

Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Salmonella

thypi dengan metode spread plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam



thypi dengan metode pour plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam




thypi dengan metode pour plat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam

4. Bacillus subtilis


Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Bacillus

subtilis dengan metode spread plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam




subtilis dengan metode pour plat dan diinkubasi pada inkubator selama 24 jam

Suhu Ruang (37°C , 24 jam) POURPLAT


subtilis dengan metode pour plat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam


5. Pseudomonas aeruginosa


Keterangan : Hasil uji pendahuluan isolat AP12A terhadap bakteri Pseudomonas

aeruginosa dengan metode spread plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24

jam



aeruginosa dengan metode pour plat dan diinkubasi pada ikubator selama 24 jam




aeruginosa dengan metode pour plat dan diinkubasi pada suhu ruang selama 24

jam


Lampiran 10. Skema Metode Fermentasi dan Hasil Fermentasi

a. Metode Fermentasi

b. Foto Hasil Fermentasi

500

ml

Dimasukkan ke

dalam media PDY

steril, volume PDY

20% dari Volume

botol Kultur murni kapang endofit

AP12A dipotong menggunakan

sedotan steril sebanyak 5 potongan

Diinkubasi secara statis pada

suhu ruang selama 21 hari


Lampiran 11. Skema Ekstraksi

Kultur Hasil Fermentasi

Disaring menggunakan Corong dan Kertas

Saring

Media di partisi menggunakan

pelarut n-heksana dan etil asetat

Fraksi n-heksana

Fraksi etil asetat

Di evaporasi

Ekstrak kental n-heksana

Ekstrak kental etil asetat


Lampiran 12. Hasil Skrining Fitokimia

No. Senyawa

Fitokimia

Etil Asetat N-Heksana

Pereaksi Hasil Keterangan Pereaksi Hasil keterangan

1. Alkaloid Dragendorf

(sinar tampak)

(-) Tidak

menampakkan

bercak

berwarna

coklat dg latar

belakang

kuning

Dragendorf

(sinar tampak)

(+) Bercak

berwarna coklat

dengan latar

belakang

kuning dengan

Rf -1 : 0,4

Rf-2 : 0,6

(wegner &

Harborel 1996)


2 Terpenoid Vanilin Asam

sulfat

(sinar tampak)

+ Bercak

berwarna

kuning

kecoklatan

pada Rf-1 :0,8

dan berwarna

ungu pada Rf-

2 : 0,75

(wegner, 1996)

Vanilin Asam

Sulfat

(sinar tampak)

+ Bercak

berwarna biru

pada Rf-1 : 0,8

dan berwarna

merah ungu

pada Rf- : 0,7

(wegner, 1996)

3 Flavonoid Sitroborat

(UV 366)

(+) Bercak

berwarna hijau

kekuningan

pada Rf-1 :

0,75 (Alam,

2012 ;

markham,

1982 dalam

rachma, 2012)

Sitroborat

(UV 366)

(+) Bercak

berwarna hijau

kekuningan

pada Rf-1 : 0,9

dan berwarna

merah pada Rf-

2 : 0,55 (Alam,

2012 ;

markham, 1982

dalam rachma,

2012)


4 Polifenol FeCl3

(sinar tampak)

(-) Tidak

menimbulkan

bercak yang

menunjukkan

ciri senyawa

polifenol

FeCl3

(sinartampak)

(-) Tidak

menimbulkan

bercak yang

menunjukkan

ciri senyawa

polifenol

5 Saponin

Steroid

Vanilin Asam

sulfat

(sinar tampak)

(+) Berwarna

ungu atau

violet pada Rf-

2 : 0,75

(Huseini,

2014)

Vanilin Asam

Sulfat

(sinartampak)

(+) Bercak

berwarna biru

pada Rf-1 : 0,8

(wegner, 1996)

dan berwarna

merah ungu

pada Rf- : 0,7

(Huseini, 2014)


Lampiran 13. Skema Uji Aktivitas Antioksidan

1. Uji Antioksidan Kualitatif

2. Uji Antioksidan Kuantitatif


Lampiran 14. Perhitungan dalam Uji Antioksidan

1. Pembuatan larutan DPPH (0,1 mM)

- Banyaknya DPPH yang ditimbang :

0,1 𝑚𝑀 =𝑚𝑔

𝑚𝑟𝑥

1000

𝑉

0,1 𝑚𝑀 =𝑥

394,32𝑥

1000

50 𝑚𝐿

X = 1,98 mg

- Jadi, ditimbang 1,98 mg DPPH dan dilarutkan dengan metanol p.a serta

dicukupkan volumenya hingga 50 mL

2. Pembuatan larutan induk ekstrak etil asetat isolat AP12A 1000 ppm

- Konsentrasi 1 ppm setara dengan 1 µg/mL, sehingga untuk membuat

konsentrasi 1000 ppm dapat dilakukan dengan menimbang 20 mg ekstrak

dan dicukupkan dengan metanol p.a hingga 20 mL.

20 𝑚𝑔

20 𝑚𝐿𝑥

5000 µ𝑔

50 𝑚𝐿= 1000 µ 𝑚𝐿⁄ = 1000 𝑝𝑝𝑚

3. Contoh perhitungan pembuatan larutan uji dan kontrol positif

- Pembuatan larutan uji ekstrak etil asetat isolat AP12A konsentrasi

20 ppm dari larutan induk 1000 ppm menggunakan labu ukur 10

mL.

N1 x V1 = N2 x V2

1000 ppm x V1 = 20 ppm x 10mL

V1= 0,2 mL atau 200 µL (jumlah yang dipipet dari

larutan induk), kemudian dicukupkan dengan metanol p.a hingga 10 mL

pada labu ukur.

4. Contoh perhitungan % inhibisi

- Contoh perhitungan % inhibisi pada absorbansi rata-rata konsentrasi

0,05% ekstrak etil asetat sebesar 0,2913 dengan absorbansi blangko

(DPPH) sebesar 0,523.

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 =𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜𝑥 100%

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 =0,523 − 0,2913

0,523𝑥 100%

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 = 44,3021%


5. Perhitungan IC50

- Contoh perhitungan IC50 pada ekstrak etil asetat

Sebelumnya, konsentrasi (x) dan % inhibisi (y) dari ekstrak etanol 70%

dibuat persamaan regresi linearnya menggunakan aplikasi pengolah data

microsoft excel 2010 hingga diperoleh persamaan y = 0,1477x + 4,4445.

Dari persamaan ini dihitunglah nilai IC50 nya.

y = 0,1477x + 4,4445

50 = 0,1477x + 4,4445

x = 308,4326 ppm

Jadi, nilai IC50 dari ekstrak etil asetat adalah 308,4326 ppm

6. Perhitungan AAI (Antioxidant Activity Index)

- Contoh perhitungan nilai AAI dari kontrol positif vitamin C

Konsentrasi DPPH yang digunakan adalah 1,98 mg/50 mL = 39,6 ppm

serta nilai IC50 vitamin C yang diperoleh sebesar :

𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝐴𝐴𝐼 =𝑘𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 𝐷𝑃𝑃𝐻 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

𝑛𝑖𝑙𝑎𝑖 𝐼𝐶50 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ

𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝐴𝐴𝐼 =98 𝑝𝑝𝑚

2,7339

𝑁𝑖𝑙𝑎𝑖 𝐴𝐴𝐼 = 35,8461

Jadi, nilai AAI dari vitamin C adalah 35,8461 dan tergolong sangat kuat


Lampiran 15. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Basillus subtilis.

KHM Ekstrak Etil Asetat.

KHM Kontrol Kloramfenikol.

KBM Ektrak Etil Asetat KBM Kontrol Kloramfenikol


Lampiran 16. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Stapillococcus aureus.

KHM Ekstrak Etil Asetat

KHM Kontrol Ciprofloksasin

KBM Ekstrak Etil Asetat KBM Kontrol Cyprofloksasin


Lampiran 17. Hasil (KHM) dan (KBM) Pada Bakteri Salmonella typhi.

KHM Ekstrak Etil Asetat.

KHM Kontrol Kloramfenikol.

KBM Ekstrak Etil Asetat KBM Kontrol Ciprofloksasin

uin syarif hidayatullah jakarta uji aktivitas...

Documents