uin syarif hidayatullah jakarta -...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS FRAKSI AKTIF EKSTRAK KULIT BATANG

Garcinia dioica Blume TERHADAP ENZIM Malate: Quinone

Oxidoreductase DARI Plasmodium falciparum (PfMQO)

SKRIPSI

MUZI LATUNIL ISMA

NIM : 1113102000047

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

DESEMBER / 2017

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS FRAKSI AKTIF EKSTRAK KULIT BATANG

Garcinia dioica Blume TERHADAP ENZIM Malate: Quinone

Oxidoreductase DARI Plasmodium falciparum (PfMQO)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Farmasi

MUZI LATUNIL ISMA

NIM : 1113102000047

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

DESEMBER / 2017

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

NAMA : Muzi Latunil Isma

NIM : 1113102000047

TANDA TANGAN :

TANGGAL : Desember 2017

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Muzi Latunil Isma

Program Studi : Farmasi

Judul : Uji Aktivitas Fraksi Aktif Ekstrak Kulit Batang Garcinia

dioica Blume Terhadap Enzim Malate: Quinone

Oxidoreductase dari Plasmodium Falciparum (PfMQO)

Malaria adalah penyakit yang disebabkan oleh infeksi protozoa yang disebut

dengan Plasmodium. Kasus malaria ini masih menjadi masalah global dan masih

menghadapi banyak tantangan. Penggunaan obat-obat malaria telah dilaporkan

banyak mengalami kegagalan terhadap protozoa plasmodium akibat resistensi.

Resistensi parasit terhadap obat malaria merupakan kasus malaria yang berujung

kematian dan perlu segera ditekan. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan

pemurnian fraksi aktif ekstrak kulit batang tanaman Garcinia dioica Blume yang

menghambat aktivitas enzim Plasmodium falciparum Malate Quinone

Oksidoreductase (PfMQO). Kulit batang asam kandis mengandung senyawa yang

mempunyai aktivitas antimalaria. Enzim L-Malat: Quinone Oksidoreductase

(MQO) adalah enzim fungsional yang bekerja dalam mengkatalisis konversi malat

menjadi oksaloasetat yang bekerja dalam rantai transport elektron mitokondria.

Uniknya MQO ini merupakan enzim spesifik yang hanya ada pada parasit

plasmodium yang akan dijadikan target obat. Dilakukan proses ekstraksi secara

maserasi bertingkat dengan pelarut n-heksan, etil asetat, dan 96% etanol. Hasil uji

aktivitas inhibisi ketiga esktrak, menghasilkan ekstrak etil asetat memiliki

aktivitas inhibisi tertinggi yaitu 95 % pada konsentrasi 20 µg/ml. Uji inhibisi

terhadap aktivitas enzim PfMQO menggunakan spetrofotometer (paradigm) dan

DCIP sebagai indikator pada panjang gelombang 600 nm (Ɛ600= 21 cm-1

.mM-1

).

Pemurnian dengan kolom kromatografi menghasilkan 8 fraksi dan preparatif

HPLC terhadap fraksi F1, F2, F3 berhasil memisahkan kandungan senyawa.

Analisis fraksi F2 dengan HPLC menghasilkan subfraksi aktif no.27 dan no.28

pada konsentrasi 12,5 ppm menunjukkan puncak yang tunggal pada retensi waktu

masing-masing ke 26,09 menit dengan nilai inhibisi 96,34 % dan ke 18,57 menit

94,05 %. Penelitian ini menyimpulkan bahwa purifikasi terhadap esktrak etil

asetat Kulit Batang Garcinia dioica Blume menghasilkan subfraksi aktif yang

berpotensi sebagai inhibitor enzim PfMQO.

Kata kunci : Garcinia dioica Blume, PfMQO, Malate, Oksaloasetat, DCIP,

Preparatif HPLC

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Muzi Latunil Isma

Program Study : Pharmacy

Title : Activity Test of Active Fraction Extract of Bark Leaf

Garcinia dioica Blume Against Malate Enzyme: Quinone

Oxidoreductase from Plasmodium Falciparum (PfMQO)

Malaria is a disease caused by a protozoal infection called Plasmodium. The case

of malaria is still a global problem and still faces many challenges. The use of

malaria medicines has been reported to be a lot of failure against protozoa

plasmodium due to resistance. Parasitic resistance to malaria drugs is a case of

malaria that leads to death and needs to be suppressed immediately. The aim of

this research is to purify the active fraction of Garcinia dioica Blume leaf extract

which inhibits the activity of Plasmodium falciparum Malate Quinone

Oxideductase (PfMQO) enzyme. The bark of kandis acid contains a compound

that has antimalarial activity. L-Malate Enzymes: Quinone Oxidoreductase

(MQO) is a functional enzyme that works in catalyzing the conversion of malate

into oxaloacetate acting in the mitochondrial electron transport chain. Uniquely

MQO is a specific enzyme that exists only in plasmodium parasite that will be

targeted drugs. Maceration extraction process with n-hexane solvent, ethyl

acetate, and 96% ethanol. Result of activity test of third inhibition of extract,

yielding ethyl acetate extract have highest inhibition activity that is 95% at

concentration 20 μg / ml. The inhibition test of PfMQO enzyme activity uses

spetrofotometer (paradigm) and DCIP as an indicator at 600 nm (Ɛ600= 21 cm-

1.mM

-1) wavelength. Purification by column chromatography yields 8 fraction

and preparative HPLC to fraction of F1, F2, F3 successfully separates the

compound content. The fractional analysis of fraction F2 with HPLC resulted in

the active subfraction no.27 and no.28 showing a single peak at retention time of

26.09 min with 96.34% inhibition value and 18.57 min 94.05% respectively. This

study concludes that purification the ethyl acetate extract of bark Garcinia dioica

Blume Leaf produces an active subfraction potentially as a PfMQO enzyme

inhibitor.

Keywords: Garcinia dioica Blume, PfMQO, Malate, Oksaloacetate, DCIP, HPLC

Preparative

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Bismillahirahmaanirrahiim

Segala puji kehadirat Allah SWT dengan segala nikmat dan hidayah yang

dilimpahkan kepada hamba-Nya dengan kekuatan dari-Nya hingga tugas akhir ini

dapat diselesaikan. Shalawat serta salam semoga tersampaikan kepada Nabi agung

Muhammad SAW, sahabat, keluarga dan pengikutnya yang senantiasa

bershalawat kepadanya.

Penulisan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Fraksi Aktif Ekstrak Kulit

Batang Garcinia dioica Blume Terhadap Enzim Malate: Quinone Oxidoreductase

dari Plasmodium Falciparum (PfMQO)” dilakukan dalam rangka memenuhi

salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada program studi

farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta. Kami sadar tanpa campur tangan, bantuan dan bimbingan

berbagai pihak sangatlah sulit bagi kami untuk menyelesaikan skripsi ini. Pada

kesempatan ini kami ucapkan terima kasih kepada :

1. Bapak Hendri Aldrat, PhD,. Apt. dan bapak Danang Waluyo, M.Eng.

selaku pembimbing skirpsi kami yang telah memberikan waktu, tenaga,

saran, dan pikiran kepada penulis mulai dari awal penelitian hingga

penyusunan skripsi.

2. Dr. Arief Sumantri, SKM, M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran

dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;

3. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi dan

ibu Nelly Suryani, Ph.D., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Farmasi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4. Bapak/ibu dosen serta segenap staf dan karyawan yang telah

memberikan ilmu pengetahuan dan bimbingan selama penulis

menempuh pendidikan farmasi.

5. Orang tua ibu ,ayah, ummi dan pakcik yang telah mendidik dan

membesarkan kami dengan penuh rasa kasih, senantiasa memberikan

dukungan lahir batin, dan selalu ada untuk penulis semoga, amalan dan

jerih payah keduanya diberikan balasan yang lebih baik di sisi-Nya.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Serta kakak, adik, sepupu tercinta yang selalu memberikan semangat

dalam proses penyusunan skripsi ini.

6. Sensei saya Daniel Ken Inaoka yang telah memberikan banyak ilmunya.

7. Masyarakat dan Pemerintah Provinsi Sumsel yang telah memberikan

kesempatan penulis untuk mengemban ilmu di FKIK UIN Jakarta.

8. Kakak-kakak laboran farmasi UIN dan segenap pihak BPPT Serpong

yang telah membantu dalam melakukan penelitian

9. Teman –teman Farmasi UIN 2013 yang selalu bersama kami hingga

akhir sarjana ini

10. Keluarga Besar HMI KOMFAKDIK dan LKMI HMI Cab. Ciputat yang

memberikan banyak pengalaman dan pembelajaran.

11. Orang-orang tersayang, tim soulmate yang mana tanpa kalian penelitian

ini sangat susah dijalani. Keluarga kedua kami “Bolangers” dan

“Kohatiers” dari kalian kami belajar perjuangan dan kesetiaan.

12. Seleuruh pihak yang tidak bisa kami sebutkan satu persatu yang telah

banyak membantu secara langsung maupun tidak langsung dalam proses

penelitian dan penyusunan skripsi ini.

Semoga Allah SWT membalas semua bantuan yang telah kalian berikan

kepada kami. Kami sadar penyusunan skripsi ini banyak sekali kekurangan oleh

karena itu, kami sangat mengharapkan adanya kritik dan saran yang membangun

dari semua pihak. Semoga banyak manfaatnya terutama bagi perkembangan ilmu

pengetahuan terutama farmasi.

Ciputat, Desember 2017

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama : Muzi Latunil Isma

NIM : 1113102000047

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi karya ilmiah

saya dengan judul:

UJI AKTIVITAS FRAKSI AKTIF EKSTRAK KULIT

BATANG Garcinia dioica Blume TERHADAP ENZIM

Malate: Quinone Oxidoreductase DARI Plasmodium

falciparum (PfMQO)

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu

Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademis sebatas sesuai dengan

Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat

dengan sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tangggal : Desember 2017

Yang Menyatakan

Muzi Latunil Isma

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................ v

ABSTRAK .......................................................................................................... vi

ABSTRACT ...................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ...................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH .................................... x

DAFTAR ISI ....................................................................................................... xi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xv

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 LATAR BELAKANG ................................................................................. 1

1.2 RUMUSAN MASALAH ............................................................................ 4

1.3 TUJUAN PENELITIAN ............................................................................. 4

1.4 HIPOTESIS ................................................................................................. 4

1.5 MANFAAT PENELITIAN ......................................................................... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 5

2.1 GENUS GARCINIA ................................................................................... 5

2.2 Garcinia dioica Blume ................................................................................ 5

2.3 KANDUNGAN KIMIA GENUS GARCINIA ........................................... 7

2.4 MALARIA ................................................................................................... 8

2.5 EKSTRAKSI DAN FRAKSINASI ........................................................... 18

2.6 METODA PEMISAHAN DAN PEMURNIAN ....................................... 21

BAB 3 METODE PENELITIAN ..................................................................... 29

3.1 LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN ................................................... 29

3.2 BAHAN ..................................................................................................... 29

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.3 PERALATAN............................................................................................ 29

3.4 CARA KERJA ........................................................................................... 30

3.4.1 Penyiapan Bahan .............................................................................. 30

3.4.2 Pembuatan Ekstrak ........................................................................... 30

3.4.3 Uji Inhibisi Ekstrak Garcinia Dioica Blume dalam Menghambat

Aktivitas Enzim PfMQO ........................................................................... 31

3.4.4 Fraksinasi Dengan Kromatografi Kolom ......................................... 33

3.4.5 Purifikasi ........................................................................................... 33

3.4.6 Uji Kemurnian Dengan HPLC Preparatif ......................................... 34

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 35

4.1 PENYIAPAN BAHAN ............................................................................. 35

4.2 EKSTRAKSI ............................................................................................. 35

4.3 UJI INHIBISI EKSTRAK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PFMQO 37

4.4 PENAPISAN FITOKIMIA ....................................................................... 39

4.5 PENGGUNAAN ASSAY MIX ................................................................. 40

4.6 FRAKSINASI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM ......................... 41

4.7 UJI INHIBISI FRAKSI ETIL ASETAT TERHADAP AKTIVITAS ENZIM

PFMQO ..................................................................................................... 42

4.8. ANALISIS DAN FRAKSINASI DENGAN HPLC PREPARATIF ......... 43

4.9 FRAKSINASI FRAKSI AKTIF DENGAN PREPARATIF HPLC .......... 45

4.10 PENGUJIAN INHIBISI SUBFRAKSI F2 HASIL PEMISAHAN

PREPARATIF HPLC ................................................................................ 46

4.11 ANALISIS SUBFRAKSI AKTIF DENGAN HPLC ................................ 48

BAB 5 KESIMPULAN ..................................................................................... 51

5.1 KESIMPULAN ......................................................................................... 51

5.2 SARAN ...................................................................................................... 51

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 52

LAMPIRAN ....................................................................................................... 57

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar

Gambar 2.1 Tanaman dan Kulit Batang G. dioica Blume .................................... 7

Gambar 2.2 Struktur Xanton ................................................................................. 7

Gambar 2.3 Siklus Hidup Plasmodium falciparum............................................. 13

Gambar 2.4 Oksidasi Malat menjadi OAA in TCA Cycle.................................. 15

Gambar 2.5 MQO dan MDH pada manusia ....................................................... 16

Gambar 2.6 MQO pada parasit Plasmodium ...................................................... 16

Gambar 2.7 MQO Targeting in mETC Parasite.................................................. 17

Gambar 2.8 Reaksi enzimatis MQO Plasmodium falciparum ............................ 18

Gambar 3.1 Peta plate pengujian inihibisi dalam menghambat aktivitas enzim

PfMQO ................................................................................................................ 31

Gambar 4.1 Hasil uji inhibisi ektrak G. dioica Blume terhadap aktivitas enzim

PfMQO .............................................................................................................. 38

Gambar 4.2 Hasil pemantauan KLT ................................................................... 42

Gambar 4.3 Hasil uji inhibisi fraksi terhadap aktivitas enzim PfMQO .............43

Gambar 4.4 Profil analisis HPLC fraksi aktif F2 ................................................ 45

Gambar 4.5 Profil analisis dengan preparatif HPLC fraksi aktif F2 ................... 46

Gambar 4.6 Hasil uji inhibisi subfraksi F2 terhadap aktivitas enzim PfMQO ... 47

Gambar 4.7 Hasil uji inhibisi subfraksi nomor 25, 26, 27, 28, dan 29 terhadap

aktivitas PfMQO ................................................................................................. 48

Gambar 4.8 Hasil kromatogram HPLC subfraksi nomor 27 pada panjang

gelombang 254 nm .............................................................................................. 49


gelombang 254 nm .............................................................................................. 49

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel

Tabel 4.1 Data rendemen ekstrak kulit batang Garcinia dioica Blume .............. 37

Tabel 4.2 Hasil uji penapisan fitokimia .............................................................. 39

Tabel 4.3 Profil analisis HPLC fraksi F1, F2, dan F3 ......................................... 44

Tabel 4.4 Hasil uji inhibisi subfraksi F2 terhadap aktivitas enzim PfMQO ....... 47

Tabel 4.5 Program waktu gradien eluen HPLC untuk subfraksi aktif ................ 49

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Hasil determinasi tumbuhan ............................................................ 58

Lampiran 2 Alur kerja penelitian ........................................................................ 59

Lampiran 3 Bagan alur ekstraksi dari kulit batang Garcinia dioica Blume ....... 60

Lampiran 4 Alur kerja uji aktivitas inhibisi ekstrak dan fraksi ........................... 61

Lampiran 5 Alur kerja fraksinasi kolom kromatografi ....................................... 62

Lampiran 6 Alur kerja pemurnian fraksi dengan HPLC analitis ........................ 63

Lampiran 7 Alur kerja pemurnian fraksi dengan HPLC preparatif .................... 64

Lampiran 8 Alur kerja uji aktivitas inhibisi fraksi terhadap enzim PfMQO....... 65

Lampiran 9 Perhitungan Rendemen Ekstrak....................................................... 66

Lampiran 10 Perhitungan pengenceran konsentrasi ekstrak dan fraksi pengujian

inhibisi aktivitas enzim PfMQO ......................................................................... 67

Lampiran 11 Perhitungan Penggunaan Assay Mix .............................................. 68

Lampiran 12 Perhitungan jumlah ekstrak dan fraksi pada pengujan inhibisi

aktivitas enzim PfMQO....................................................................................... 69

Lampiran 13 Pembuatan seri konsentrasi dari subfraksi aktif F2 pada pengujan

inhibisi aktivitas enzim PfMQO ......................................................................... 71

Lampiran 14 Penyiapan sampel uji HPLC .......................................................... 72

Lampiran 15 Profil HPLC Fraksi Aktif Etil Asetat Garcinia dioica Blume ...... 73

Lampiran 16 Hasil analisis HPLC subfraksi aktif............................................... 74

Lampiran 17 Hasil uji inhibisi ekstrak kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO ................................................................. 75

Lampiran 18 Hasil uji inhibisi fraksi kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO ................................................................. 76

Lampiran 19 Hasil uji inhibisi subfraksi kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO (Pengujian 1) .......................................... 77

Lampiran 20 Hasil uji inhibisi subfraksi aktif kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO (Pengujian 2)...........................................78

1


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit yang ditularkan oleh nyamuk sudah ada semenjak ribuan tahun

yang lalu. Sungguhpun demikian, peran nyamuk sebagai vektor penyakit baru

diketahui semenjak ditemukannya mikroskop. Kisah terdahulu juga menyebutkan

bahkan Raja Namrudz sendiri akhirnya tidak berdaya menghadapi seekor nyamuk

yang masuk ke telinganya dan menyebabkan raja tersebut meninggal dunia.

Selanjutnya pada abad ke 7, Alquran memberikan suatu perumpamaan dengan

seekor nyamuk pada QS Al Baqarah (2):26

ا بعوضة فما فوقها إ ن هللا ال يستحيي أن يضرب مثال م

Artinya :

“Sesungguhnya Allah tidaklah malu membuat perumpamaan apa saja; nyamuk

(betina) atau yang lebih kecil dari padanya”.

Sungguh menarik sekali bahwa Alquran menggunakan kata ba’udhatan

(nyamuk betina) sebagai sebuah perumpamaan. Peran nyamuk betina dalam

penyebaran penyakit tentu saja penting sekali. Nyamuk betina dari Anopheles sp.

bertanggung jawab dalam membawa parasit Plasmodium pada sistem darah

manusia (Finch et al, 2005). Meskipun penanganan terkait penyakit malaria terus

diupayakan, tapi sampai sekarang belum sepenuhnya berhasil. Ada beberapa

faktor yang menyebabkan penyakit malaria tidak bisa diberantas sepenuhnya,

yakni parasit tersebut menjadi resisten terhadap antimalaria yang beredar di

pasaran (Larry, 1996).

Malaria sampai sekarang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat di

lebih dari 90 negara, yang dihuni oleh 2,4 milyar penduduk atau 40% populasi

penduduk dunia. Saat sekarang di tingkat global kesakitan dan kematian akibat

malaria juga cenderung menurun pada periode 2005-2015. Meskipun demikian,

masih ada lebih kurang 3,2 milyar jiwa atau hampir separuh penduduk dunia yang

berisiko tertular penyakit malaria. Pada tahun 2015 WHO memperkirakan ada

sekitar 214 juta kasus baru malaria dengan kematian sekitar 438 ribu orang di

seluruh dunia dan sekitar sepertiga atau 306 ribu terjadi pada balita.

2


Plasmodium falciparum merupakan parasit yang paling mematikan dan

berdampak serius dibandingkan dengan Plasmodium lain seperti P. vivax, P.

malariae, dan P. ovale. Kurangnya vaksin yang efektif dan munculnya masalah

resistensi parasit terhadap obat mendorong peneliti untuk terus melakukan

pengembangan obat baru dengan mekanisme dan tindakan yang baru sehingga

dapat menggantikan obat antimalaria yang sudah tidak sensitif lagi dan dapat

menekan terjadinya efek samping yang tidak diinginkan (D.K. Inaoka, et al ;

2017)

Perkembangbiakan parasit Plasmodium falciparum ini dari segi biokimia

merupakan suatu proses yang menarik untuk dipelajari agar kita dapat

mengembangkan cara yang efektif untuk menaklukkan parasit tersebut. Untuk

tujuan ini, target obat yang ideal adalah penting untuk keberlangsungan hidup

parasit. Rantai electron transport chain (ETC) adalah salah satu sumber target

potensial karena enzim seperti L-malate: quinone oxidoreductase (PfMQO) hanya

terdapat di dalam mitokondria P. falciparum namun tidak terdapat bentuk

ortolognya pada manusia (H Ke et al, 2011). PfMQO bekerja dalam mengkatalisis

oksidasi L-malat menjadi oksaloasetat dan ubiquinon menjadi ubiquinol. Enzim

PfMQO ini merupakan protein membran yang terlibat dalam tiga jalur

pembentukan energi yaitu (ETC, siklus asam sitrat, dan siklus fumarat) dan sangat

penting untuk keberlangsungan hidup parasit pada tahap intra eritrositik aseksual.

Untuk tujuan ini, maka enzim PfMQO ini dijadikan target obat ideal untuk

kelangsungan hidup parasit tetapi tidak mengganggu host mamalia sehingga,

PfMQO ini dapat dijadikan target obat yang berharga untuk pengembangan

antimalaria dengan mekanisme kerja yang baru (D.K. Inaoka et al, 2017 ).

Tanaman Indonesia yang mempunyai potensi sebagai sumber senyawa

kimia bioaktif antimalaria adalah genus Garcinia. Masyarakat mengenalnya

sebagai tanaman keluarga manggis dan banyak dimanfaatkan sebagai obat

tradisional karena mengandung senyawa xanton mempunyai berbagai aktivitas

farmakologi seperti antikanker, antioksidan, antimikroba, antiparasit, dan juga

antimalaria (S. T. Syamsudin et al, 2007). Salah satu diantara spesies Garcinia

yang digunakan untuk obat antimalaria yaitu Garcinia dioica Blume yang

memiliki aktivitas antiplasmodium. Bagian kulit batang dari tanaman yang tidak

3


dilirik manfaatnya sama sekali ternyata mengandung senyawa yang memiliki

aktivitas biologis.

Laporan data sebelumnya oleh (S. T. Syamsudin et al, 2007)

mengungkapkan bahwa G. parfivolia Miq sinonim dengan G. dioica Blume yang

merupakan salah satu tanaman obat yang telah dilaporkan menunjukkan aktivitas

antiplasmodium (S. T. Syamsudin, 2007). Spesies garcinia yang lain yaitu G.

mangostana L juga memiliki aktivitas antiplasmodium baik secara in

vitro maupun in vivo pada mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei dan

daun G. atroviridis Griff T Anders yang diberikan secara oral pada mencit pada

dosis 360 mg/kg dapat menghambat pertumbuhan Plasmodium berghei sampai

79,95%.

Uji pendahuluan yang dilakukan terhadap ekstrak kulit batang G. dioica

Blume menghasilkan nilai inhibisi dalam menghambat aktivitas enzim PfMQO

sebesar 95% pada konsentrasi 20 µg/ml. Purifikasi untuk melakukan pemisahan

terhadap kandungan senyawa kimia utamanya dengan metode fraksinasi kolom

kromatografi dan preparatif HPLC menghasilkan subfraksi aktif yang kemudian

di analisis dengan HPLC dan di uji aktivitas inhibisinya terhadap enzim PfMQO.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan hasil penelusuran pustaka yang didapat, diketahui belum ada

penelitian uji aktivitas antimalaria dari ekstrak kulit batang G. dioica Blume yang

menghambat aktivitas enzim PfMQO. Penelitian terhadap tumbuhan ini

diharapkan memperoleh peluang besar untuk mendapatkan senyawa kimia

terhadap aktivitas antimalaria yang kemungkinan berbeda dari yang telah

didapatkan sebelumnya terutama.

1.3 Tujuan Penelitian

Dari latar belakang diatas maka tujuan dari penelitian ini adalah

melakukan pemurnian fraksi aktif dari ekstrak kulit batang tanaman G. dioica

Blume terhadap aktivitas enzim Plasmodium falciparum malate quinone

oxidoreductase (PfMQO)

4


1.4 Hipotesis

Ekstrak etil asetat kulit batang tanaman G. dioica Blume dapat

menghambat aktivitas enzim PfMQO

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian yang diharapkan adalah :

1. Memperoleh fraksi aktif dari ekstrak kulit batang tanaman asam kandis

yang menghambat aktivitas enzim PfMQO.

2. Dapat melengkapi data penelitian bahan alam terhadap aktivitas

antimalaria dapat melengkapi data obat-obat tradisional, dengan harapan

dapat mengurangi ketergantungan terhadap obat modern yang masih

menggunakan bahan baku impor.

5


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Genus Garcinia

Garcinia adalah salah satu genus dari keluarga Clusiaceae yang tersebar di

Asia, Afrika, Kaledonia Baru dan Polinesia (Merza et al., 2004). Berdasarkan

kajian literatur dan pengamatan spesimen herbarium, Indonesia memiliki 64

spesies Garcinia (Garcinia spp.) dan 25 spesies Garcinia ditemukan di Pulau

Kalimantan (Uji, 2007).

Famili Clusiaceae memiliki 40 genus dan lebih dari 1000 spesies yang

tersebar di daerah tropika dan sub tropika (Heyne, 1987). Famili Clusiaceae ini

terdiri dari dua genus utama yaitu Garcinia dan Calophyllum serta sub famili

Mesua dan Mammea. Kedua sub familia ini kaya dengan senyawa xanton,

kumarin, kalanon, flavonoida, biflavonoida, benzofenon dan poliisoprenilketon

(Linuma, 1996).

Tanaman garcinia ini dikenal sebagai tanaman keluarga manggis, banyak

dimanfaatkan sebagai bahan pangan dan obat tradisional. Salah satunya adalah

Garcinia mangostana merupakan spesies yang banyak terdapat di Asia Tenggara

yang dikenal dengan queen of fruit yang selain buahnya dapat dimakan, kulit ari

biji dari buah ini digunakan sebagai obat luka dan infeksi, penurun panas dan

mengurangi rasa sakit. Garcinia indica yang berasal dari India secara komersil

dikenal dengan “Kokam Butter” di dunia perindustrian digunakan sebagai bahan

dasar sabun dan lilin, sebagai preparat industri farmasi, minyak dari tanaman ini

juga dapat digunakan untuk obat urut dan urtikaria serta buahnya digunakan

sebagai obat cacing dan kardiotonik (Fumio, Y., 2000; Sari, R., 1999).

2.2 Garcinia dioica Blume

2.2.1 Taksonomi

TanamanG. dioica Blumesecara taksonomi mempunyai klasifikasi sebagai

berikut (Global Biodiversity Information Facility):

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Dicotyledoneae

6


Ordo : Guttiferales

Species : Garcinia dioica Blume

2.2.2 Deskripsi Garcinia dioica Blume

TanamanG. dioica Blume pertama kali dipublikasikan tahun 1823 yang

tercatat ditemukan di Pulau Jawa (Verh. Batav. Genootsch. Kunst. ix. 170 (1823).

G. dioica Blume atau yang dikenal oleh masyarakat awam sebagai asam kandis

atau asam gelugur atau ceuri atau siriang-riang merupakan tanaman yang tersebar

di Asia Tenggara dan memiliki banyak kegunaan. Masyarakat Sumatera Barat

menyebut tanaman ini dengan asam kandih, masyarakat Lampung menyebut

kunyi talerang, sedangkan di Kalimantan biasa disebut buran. Di Negara India

tempat tanaman ini berasal menyebutnya kokkam, dan di Malaysia disebut asam

kandis, serta di Thailand biasa disebut mada luang atau chakasa(Unknown,

Dipublikasikan pada 17 Maret 2009).

G. dioica Blume ini berupa pohon dengan ukuran yang kecil hingga

sedang, tinggi ada yang mencapai 33 m dan diameter 140 cm. Arah tumbuh

batang lurus (erectus), jenis batang berkayu (lignosus), warna batang coklat

kehijauan, bentuk lintang batang bulat (teres), batangnya mengeluarkan getah

berwarna kuning pekat (Ridley, 1922).Daun seperti kertas (papyraceus), tersusun

berseling-berhadapan (folia opposita), bentuk helaian daun memanjang

(oblongus), panjang daun 10,5 cm dan lebar 3,7 cm, ujung daun meruncing

(acuminatus) dengan sudut 500, pangkal daun runcing (acutus) dengan sudut

105⁰, pinggir daun rata (integer), permukaan atas daun licin (leavis) mengkilap

dan berwarna hijau tua, permukaan bawah daun licin mengkilap dan berwarna

hijau pupus, pertulangan daun menyirip (penninervis) tenggelam, tangkai daun

bulat (teres), permukaan tangkai licin, warna tangkai hijau muda, panjang tangkai

1,1 cm dan diameter 0,175 cm (Ridley, 1922).

7


Gambar 2.1. Tanaman dan Kulit Batang G. dioicaBlume

2.3 Kandungan Kimia Genus Garcinia

Genus Garcinia kaya kandungan senyawa xanton, benzofenon, golongan

flavonoid, triterpen dan asam organik.Kandungan bahan aktif dari senyawa ini di

antaranya dari golongan xanton yang menunjukkan aktivitas biologi termasuk

antimalaria (Merza et al, 2004). Penelitian oleh (Linuma et al, 1996) diperoleh

tiga xanton yang diisolasi dari kulit G. dioica Blume ini yaitu xanton yang paling

dikenal, 1, 3, 6-trihidroksi-8-geranyl-7-methoxyxanthone (rubraxanthone).

2.3.1 Senyawa Xanton

Senyawa xanton merupakan senyawa organik yang mempunyai struktur

molekul C13H8O2. Pada tahun 1939 xanton dikenal sebagai insektisida. Senyawa

ini banyak ditemui pada famili Bonnetiaceae dan Clusiaceae. Khasiat yang telah

dilaporkansebagai antioksidan, antiproliferatif, antiinflamasi dan antimikroba.

Saat ini sudah lebih dari 200 senyawa xanton yang sudah diisolasi dari tumbuhan

dan sebagian besar terdapat pada genus Garcinia (Iswari,K., Sudaryono, T., 2007).

[ Sumber : LookChem; Xanthone ]

Gambar 2.2 Struktur Xanton

8


Beberapa senyawa baru yang mempunyai aktivitas antiplasmodial telah

berhasil di isolasi dari tanaman obat yang secara tradisional digunakan oleh

masyarakat di berbagai negara untuk melawan infeksi P. falciparum. Hasil

penelitian mendapatkan bahwa pada kulit batang asam kandis terkandung

senyawa xanton, biflavonoid, benzofenon, triterpen, dan tannin. Senyawa xanton

yang terkandung dalam kulit batang asam kandis terdiri dari berbagai jenis santon,

dan saat ini telah berhasil diidentifikasi 9 jenis senyawa xanton dari golongan

parvixanton (Xu et al, 2001).

2.4 Malaria

2.4.1 Definisi Malaria

Malaria merupakan penyakit yang disebabkan karena parasit yang terdapat

di daerah tropis (Panggabean, 2010). Penyakit malaria disebabkan oleh parasit

Plasmodium yang ditularkan oleh nyamuk Anopheles sp. betina sebagai vektor

dari dalam salivanya sewaktu menggigit manusia. Plasmodium memasuk sel-sel

hepatosit, dan kemudian melalui sirkulasi darah akan memasuki sel-sel eritrosit.

Di dalam sel eritrosit Plasmodium selanjutnya bereplikasi. Replikasi ini

merangsang sitolisis sel eritrosit dan menyebabkan lepasnya hasil metabolisme

Plasmodium yang bersifat toksis ke sirkulasi darah. Hal ini mencetuskan sejumlah

gejala klinik yang ringan sampai berat yang dapat menyebabkan kematian

(Farmedia, 2005)

2.4.2 Sejarah Malaria dan Kondisi di Indonesia

Malaria adalah penyakit reemerging, yakni penyakit yang menular

kembali secara massal. Malaria juga adalah suatu penyakit yang ditularkan oleh

nyamuk (Mosquito Borne Diseases). Malaria diinfeksikan oleh parasit bersel satu

dari kelas Sporozoa, suku Haemosporida, keluarga Plasmodium (Arsin, 2012).

Malaria diduga berasal dari negara Afrika dan telah ikut berevolusi

bersama dengan inang dan vektornya (Carter, Mendis, Miller, Molineaux, & Saul,

2000). Pada abad ke-18, malaria (mal-aria = udara kotor) diberi nama atas dasar

kepercayaan Roman kuno bahwa penyakit ini ditransmisikan melalui asap

berbahaya dari daerah sekitar rawa yang mengelilingi Roma. Laporan pertama

mengenai penyakit ini di Indonesia (Hindia Belanda) adalah oleh tentara Belanda

9


yang menyebutkan adanya wabah di Cirebon pada tahun 1852-1854 (Arsin,

2012).

Penyebaran Plasmodium malaria berbeda menurut geografi dan iklim.

Plasmodium falciparum banyak ditemukan didaerah tropik beriklim panas dan

basah. Plasmodium vivax banyak ditemukan didaerah beriklim dingin, sub tropik

sampai daerah tropik, Plasmodium ovale lebih banyak ditemukan di Afrika yang

beriklim tropik dan pasifik barat.

2.4.3 Epidemiologi Malaria

Penyakit malaria merupakan isu kesehatan global dan endemik yang

melibatkan sekitar 105 negara yang setiap tahunnya dengan total 600 juta

penderita baru malaria di seluruh dunia (WHO, 2010). Penduduk yang berisiko

terkena malaria berjumlah sekitar 2,3 miliar atau 41% dari penduduk dunia

(Malaria & Organization, 2000). Prevalensi malaria di seluruh dunia berkisar

antara 300- 500 juta kasus dengan kematian antara 1 sampai 2 juta setiap tahun

dimana lebih dari 80% adalah anak-anak yang berusia kurang dari 5 tahun. Data

Badan Kesehatan Dunia memperkirakan insiden malaria di dunia mencapai 215

juta kasus dan diantara yang terinfeksi parasit Plasmodium sekitar 655 ribu.

Khususnya di Asia Tenggara negara yang termasuk wilayah endemis malaria

adalah : Bangladesh, Bhutan, India, Indonesia, Maldives, Myanmar, Nepal,

Srilanka, dan Thailand (Arsin, 2012).

2.4.4 Gejala Penyakit Malaria

Secara klinis, gejala dari penyakit malaria terdiri atas beberapa serangan

demam dengan interval tertentu yang diselingi oleh suatu periode dimana

penderita bebas sama sekali dari demam.

Gejala klinis malaria antara lain sebagai berikut (Kamus Kedokteran Webster’s

New World) :

a. Badan terasa lemas dan pucat karena kekurangan darah dan berkeringat.

b. Nafsu makan menurun.

c. Mual-mual kadang-kadang diikuti muntah.

d. Sakit kepala yang berat, terus menerus, khususnya pada infeksi dengan

Plasmodium Falciparum.

10


e. Dalam keadaan menahun (kronis) gejala diatas, disertai pembesaran

limpa.

f. Malaria berat, seperti gejala diatas disertai kejang-kejang dan

penurunan.

g. Pada anak, makin muda usia makin tidak jelas gejala klinisnya tetapi

yang menonjol adalah mencret (diare) dan pusat karena kekurangan darah

(anemia) serta adanya riwayat kunjungan ke atau berasal dari daerah

malaria.

Malaria menunjukkan gejala-gejala yang khas, yaitu:

a. Demam berulang yang terdiri dari tiga stadium: stadium kedinginan,

stadium panas, dan stadium berkeringat

b. Splenomegali (pembengkakan limpa)

c. Anemi yang disertai malaise

2.4.5 Penyebab Penyakit Malaria

Parasit malaria merupakan suatu protozoa darah yang termasuk dalam

Phylum Apicomplexa, kelas Protozoa, subkelas Coccidiida, ordo Eucudides, sub

ordo haemosporidiidae, famili plasmodiidae, genus Plasmodium dengan spesies

yang menginfeksi manusia adalah P.vivax, P. malariae, P. ovale. Subgenus

Lavarania dengan spesies yang menginfeksi malaria adalah P. Falcifarum, serta

subgenus Vinkeia yang tidak menginfeksi manusia (menginfeksi kelelawar,

binatang pengerat dan lain-lain) (Yawan, 2006).

Malaria disebabkan oleh protozoa dari genus Plasmodium, pada manusia

terdapat 4 spesies yaitu P. falciparum, P.vivax, P. malariae, P.ovale, P.

falciparum menyebabkan infeksi paling berat dan angka kematian tertinggi (D.

RI, 2009).

Data ini berbeda dengan data riskesdas 2010, yang mendapatkan 86,4%

penyebab malaria adalah Plasmodium falsifarum, dan Plasmodium vivax

sebanyak 6,9%. Laporan oleh Riskesdas 2013 menyebutkan angka kesakitan

malaria penduduk >1 tahun dengan pemeriksaan (Rapid Diagnostic Test) RDT

adalah 1,3 persen dengan infeksi P. falciparum yang dominan dibandingkan

spesies lainnya.

11


Saat ini di Indonesia terdapat 4 macam spesies parasit malaria :

a. P. falciparum penyebab malaria tropika yang sering menyebabkan malaria

yang berat/malaria otak dengan kematian.

b. P. vivax penyebab malaria tertiana

c. P. malariae penyebab malaria quartana

d. P. ovale jenis ini jarang sekali dijumpai, umumnya banyak di Afrika dan

Pasifik Barat (Arsin, 2012).

a. Plasmodium falciparum

Malaria Falciparum adalah jenis malaria paling berbahaya dan yang paling

mematikan manusia yang disebabkan oleh parasit Plasmodium falciparum.

Malaria falciparum berkaitan dengan kadar tinggi parasit dalam darah dan

mempunyai tingkat kematian dan komplikasi paling tinggi diantara semua jenis

malaria. Sel darah merah yang terinfeksi dengan parasit cenderung akan kotor dan

menyebabkan mikroinfarksi (daerah kecil jaringan mati karena kekurangan

oksigen) dalam kapiler otak, liver, kelenjar adrenal, sistem usus, ginjal, paru-paru

dan organ lainnya. Pasien sebaiknya dirawat di rumah sakit menggunakan

medikasi intravena (Kamus Kedokteran Webster’s New World, edisi ketiga, hal.

322).

Spesies yang banyak dijumpai di Indonesia adalah P. falciparum dan P.

vivax sedangkan P. ovale pernah ditemukan di Papua dan Nusa Tenggara Timur.

Plasmodium melengkapi siklus hidupnya dalam dua host: nyamuk dan manusia.

Penularan P. falciparum ke host manusia memerlukan vektor nyamuk dimana

replikasi seksual terjadi. P. falciparum bereplikasi sebagai parasit intraseluler

pada manusia dan sebagai parasit ekstraseluler di nyamuk, dan mengalami

beberapa perubahan perkembangan pada kedua host (Lang-Unnasch & Murphy,

1998).

b. Siklus Hidup Plasmodium

Plasmodium mempunyai siklus hidup yang lebih kompleks, karena selain

terjadi pergantian generasi seksual dan aseksual juga mengalami pergantian

hospes. Siklus hidup Plasmodium terdiri dari siklus seksual (sporogoni) yang

berlangsung pada nyamuk Anopheles betina, dan siklus aseksual yang

berlangsung pada manusia. Siklus hidup pada manusia terdiri dari fase exo-

12


erithrocytic di dalam parenkim sel hepar dan fase erithrocytic schizogoni

(Muti’ah, 2013). Ciri utama genus Plasmodium adalah adanya dua siklus hidup,

yaitu siklus hidup askesual dan siklus seksual (Prabowo, 2004).

1. Fase Aseksual

Siklus dimulai ketika anopheles betina menggigit manusia dan

memasukkan sporozoit yang terdapat pada air liurnya ke dalam aliran darah

manusia. Jasad yang langsing dan lincah ini dalam waktu 30 menit sampai satu

jam memasuki sel parenkim hati dan berkembang biak membentuk skizon hati

yang mengandung ribuan merozoit. Lama fase ini berbeda untuk tiap jenis

Plasmodium. Pada akhir fase, skizon hati pecah, merozoit kelur lalu masuk ke

dalam aliran darah (disebut sporulasi).

Pada P.vivax dan P.ovale sebagian sporozoit membentuk hipnozoit dalam

hati (atau sporozoit yang “tidur” selama periode tertentu) sehingga mengakibatkan

relaps jangka panjang, yaitu kembalinya penyakit setelah tampak mereda dan

rekurens. Fase eritrosit dimulai saat merozoit dalam darah menyerang sel darah

merah dan membentuk trofozoit. Proses berlanjut menjadi trofozoit-skizon-

merozoit. Setelah dua sampai tiga generasi, merozoit terbentuk, lalu sebagian

merozoit menjadi bentuk seksual.

2. Fase Seksual

Jika nyamuk anopheles betina menghisap darah manusia yang

mengandung parasit malaria, parasit bentuk seksual masuk kedalam perut

nyamuk. Bentuk ini mengalami pematangan menjadi mikrogametosit dan

makrogametosit dan terjadilah pembuahan yang disebut zigot (ookinet).

Selanjutnya, ookinet menembus dinding lambung nyamuk dan menjadi ookista.

Jika ookista pecah, ribuan sporozoit dilepaskan dan mencapai kelenjar liur

nyamuk dan siap ditularkan jika nyamuk menggigit manusia.

13


Gambar 2.3 Siklus Hidup Plasmodium

2.4.6 Target Pengobatan Malaria

Proses glikolisis, biosintesis nukleotida dan katabolisme heme merupakan

target untuk pengembangan obat anti malaria yang baru. Pertumbuhan parasit juga

terhambat akibat pemberian obat antitubulin. Proses polimerisasi haem baik yang

melibatkan enzim maupun yang tidak merupakan target pengobatan yang baik.

Desain molekul yang dapat menghalangi proses invasi, adhesi dan rosetting akan

dapat digunakan sebagai kemoterapi yang mampu menghambat terjadinya malaria

otak (Sundari, 2001).

Obat antimalaria dapat dikelompokkan menurut efek atau cara kerja obat

pada parasit stadium eritrositik. Beberapa mekanisme kerja dan target dari obat

malaria yang telah diteliti oleh para peneliti sebelumnya, antara lain:

a. Gangguan pencernaan hemoglobin dalam lisosom vakuola makanan (food

vacuola) parasit. Obat golongan 4-aminokuinolin sangat esensial dalam

mengganggu proses pencernaan hemoglobin oleh parasit dengan jalan

mengadakan interaksi dengan heme atau menghambat pembentukan hemozoin.

Target baru obat golongan ini adalah menghambat enzim plasmepsin dan enzim

falcipain yang berperan dalam pemecahan globin menjadi asam-asam amino.

Hemozoin dan asam asam amino diperlukan untuk pertumbuhan parasit, sehingga

jika pembentukan dihambat maka parasit akan mati.

14


b. Gangguan pada jalur folat dalam sitoplasma parasit. Obat antimalaria

sulfadoxine pyrimethamine (SP) dan kombinasi baru chlorproguanil-dapsone

merupakan inhibitor kompetitif yang berperan dalam jalur folat.

c. Pengantar proses alkilasi generasi obat dari artemisin menghasilkan

radikal bebas yang berfungsi untuk mengalkilasi membran parasit.

d. Mempengaruhi fungsi mitokondria karena mitokondria target obat baru

yangpotensial. Kerja atovaquone melalui penghambatan reduktase sitokrom c

menjadi dasar bersinergi dengan obat-obatan proguanil (Simamora & Loeki,

2007).

2.4.7 Enzim PfMQO Sebagai Target Pengobatan Antimalaria

a. Target penghambatan enzim PfMQO dalam sirkulasi darah pada

siklus hidup Plasmodium falciparum

Secara garis besar, cara kerja obat antimalaria dibagi atas dua kelompok

utama, yaitu pada siklus eksoeritrositer dan siklus eritrositer. Umumnya obat

antimalaria ditujukan pada pemusnahan parasit pada siklus eritrositer, kecuali

primakuin yang dapat juga bekerja pada siklus eksoeritrositer. Salah satu obat

malaria yang sudah beredar dalam bentuk obat yang memiliki mekanisme kerja

dalam menghambat enzim PfMQO pada jalur transport elektron adalah obat

Atovaquone.

Atovaquone mempunyai mekanisme kerja baru dan tidak mempunyai efek

cross resisten terhadap obat antimalaria lain. Atovaquone menghambat P.

falciparum melalui inhibisi transport elektron pada mitokondria dan

menggagalkan membran potensial mitokondria. Hambatan transport elektron

mitokondria ini pada level cytochrome bc1 complex. Pada malaria, biosintesia

pyrimidine dan transport elektron dirangkai melalui ubiquinone/ ubiquinol.

Enzim PfMQO merupakan target pengobatan untuk obat antimalaria yang

bekerja pada organel subselluler Plasmodium (Roshental,2003) dan target inhibisi

pada siklus eritrositer. Siklus eritrositer terjadi pada saat merozoit yang dilepaskan

dari sel hepar menginvasi eritrosit, berkembang menjadi ringform, kemudian

tropozoit akhirnya menjadi skizon. Eritrosit yang mengandung skizon mengalami

ruptur dan melepaskan merozoit yang siap menginvasi eritrosit yang lain.

Sebagian besar merozoit masuk kembali ke eritrosit dan sebagian kecil

15


membentuk gametosit jantan dan betina yang siap untuk dihisap nyamuk

Anopheles betina dan melanjutkan siklus hidupnya di tubuh nyamuk. Pada

pencegahan kausal , penghambatan enzim PfMQO ini bekrja pad skizon yang

baru memasuki hati. Dengan demikian tahap infeksi eritrosit dapat dicegah dan

transmisi lebih lanjut dihambat.

b. Target penting pada rantai transpor elektron (produksi ATP)

Siklus krebs merupakan serangkaian reaksi yang memindahkan elektron

dari produk glikolisis NADH, FADH2 kemudian membentuk ATP. Dalam reaksi

akhir siklus asam sitrat, terdapat pembentukan oksaloasetat dengan mengoksidasi

malat dengan molekul NAD untuk menghasilkan NADH. H+ adalah proton yang

hilang dari NADH , menjadi NAD. Dalam istilah sederhana rantai transpor

elektron“merenggut” H+ dari NADH. Apa yang tertinggal adalah NAD dan H

+

yang dipompa di matriks mitokondria bagian dalam ke ruang membran dalam.

NADH adalah molekul energi tinggi yang digunakan oleh sel untuk menghasilkan

ATP pada Transpor Elektron.

Gambar 2.4 Oksidasi malat menjadi oksaloasetat dalam siklus krebs

Siklus krebs adalah roda pusat metabolisme mitokondria, maka transpor

elektron dalam rantai membran adalah motor biokimia yang mendorong banyak

fungsi mitokondria dan seluler. Rantai transpor elektron Plasmodium telah secara

ekstensif dipelajari, dan merupakan target dari atovaquone sebagai obat

antimalaria (Fry, 1991;. Mi-Ichi et al, 2003; Krungkrai, 2004; Vaidya, 2004).

Rantai transport elektron terdiri dari empat kompleks dan dua senyawa

lainnya yaitu ubiquinon (CoQ) dan sitokrom c. NADH dan FADH2 memasuki

rantai untuk menyumbangkan elektron. Dapat dilihat bahwa ubiquinon dan

sitokrom c adalah pembawa elektron perantara antara kompleks. Ubiquinon

menerima elektron dari kompleks I dan II untuk dibawa ke kompleks III, dan

sitokrom c menerima dari III kemudian dibawa ke kompleks IV.

16


Enzim PfMQO dapat dijadikan target penting oleh molekul kecil sehingga

bisa divalidasi sebagai target obat untuk pengembangan antimalaria baru dan

menyiratkan bahwa Plasmodium MQO bisa menjadi sasaran perancangan obat

(Inaokaet al, 2016). Perbedaan yang mendasar lagi,enzim MQO tidak terdapat

pada mamalia namun hanyak ditemukan pada parasit Plasmodium dan beberapa

bakteri. Manusia memiliki enzim Malate Dehydrogenase (MDH) padacytoplasmic

dan mitokondria. Elektron acceptornya adalah NAD+, sedangkan pada parasit

Plasmodium memiliki enzim MDH cytoplasmic dan enzim MQO di mitokondria.

Elektron acceptornya ubiquinon (Inaokaet al, 2016).

Berikut perbedaan antara manusia dan parasit, dengan ada atau tidaknya MQO :

a. Manusia

b. Parasit Plasmodium falciparum

Gambar 2.5 Rantai transpor elektron pada manusia dan parasit Plasmodium

Penelitian oleh Daniel Ken Inaoka, 2016, dikembangkanlah sebuah

rekombinan PfMQO sebagai inhibitor poten terhadap aktivitas antimalaria yang

diidentifikasikan untuk pertama kalinya. Malate Quinone Oxidoreductase (MQO)

adalah enzim yang terikat dengan membran yang mengkatalisis oksidasi malat

menjadi oksaloasetat. Enzim MQO menjadi kunci pada siklus TCA yang

menghubungkan rantai respirasi dengan mentransfer elektron dari malat ke

ubiquinon untuk memproduksi oksaloasetat dan ubiquinol. Pada mitokondria

17


Plasmodium, MQO dapat mereduksi ubiquinon, yang kemudian dioksidasi ulang

oleh kompleks sitokrom c1 (kompleks III).

Gambar 2.6 Reaksi enzim MQO pada mitokondria parasit Plasmodium

Elektron oleh NADH dalam mitokondria, dihasilkan untuk memproduksi

ATP selama proses fosforilasi oksidatif. Elektron dibawa ke dalam mitokondria

dalam bentuk malat. Malat kemudian memasuki mitokondria dimana reaksi

sebaliknya dilakukan oleh MDH mitokondria. Dalam siklus rantai transpor

elektron pada Plasmodium, suksinat quinone reductase dioksidasi oleh enzim

SQR dan malat quinon oxidoreductase oleh enzim MQO, kemudian mentranspor

elektron ke dalam membran mitokondria.

c. Mekanisme reaksi enzimatis PfMQO (Daniel Ken, et al; 2017)

Aktivitas enzim PfMQO dapat diukur dalam fraksi membran

menggunakan spektrofotometri. Penggunaan spektrofotometri berguna untuk

mengukur senyawa intensitas serapan zat yang mengalami perubahan warna saat

reaksi berlangsung. Dichlorophenolindophenol (DCIP) adalah reagen yang umum

digunakan untuk mengukur zat pereduksi melalui pengujian spektrofotomerik.

DCIP berwarna biru dalam bentuk teroksidasi namun setelah reduksi, senyawa

tersebut menjadi tidak berwarna. DCIP adalah senyawa kimia yang digunakan

sebagai pewarna redoks. Bila dioksidasi DCIP berwarna biru dengan penyerapan

maksimal 600 nm; bila dikurangi DCIP tidak berwarna. Karena DCIP berkurang

menjadi tidak berwarna, peningkatan transmitansi cahaya dapat diukur dengan

spetrofotometer.

18


Gambar 2.7 Reaksi enzimatis PfMQO diukur menggunakan spektrofotometri

Oksidasi malat menjadi oksaloasetat diikuti dengan reduksi ubiquinon

menjadi ubiquinol. Pada reaksi tersebut terjadi proses pelepasan dan penerimaan

elektron. Elektron yang dilepas ditangkap oleh DCIP, sehingga terjadi reduksi

DCIP kembali dari yang berwarna biru menjadi tidak berwarna. DCIP yang tidak

berwarna mengindikasikan terjadinya aktivitas enzim yang dihambat oleh ekstrak,

menunjukkan bahwa, terjadi penghambatan pembentukan produk oksaloasetat.

2.5 Ekstraksi dan Fraksinasi

2.5.1 Metode Ekstraksi

Ekstraksi merupakan proses pemisahan kandungan senyawa kimia dari

jaringan tumbuhan maupun hewan dengan menggunakan penyari yang sesuai

(Depkes, 2000).

Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan

senyawa non polar dalam senyawa non polar. Metode ekstraksi dipilih

berdasarkan beberapa faktor seperti sifat dari bahan mentah obat, daya

penyesuaian dengan tiap macam metode esktraksi, dan kepentingan dalam

memperoleh ekstrak yang sempurna atau mendekati sempurna (Ansel,1989).

Berikut adalah beberapa cara ekstraksi dengan menggunakan pelarut:

2.5.1.1 Cara Dingin

a. Maserasi

Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan

beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (suhu

kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian

konsentrasi pada keseimbangan. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan

penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan

seterusnya.

19


b. Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai

sempurna (exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada suhu kamar.

Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap

perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak), terus menerus

sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan.

2.5.1.2 Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu

pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna.

b. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan

jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum

dilakukan pada temperatur 40°-50°C.

d. Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur (96°-

98°C) selama waktu tertentu (15-20 menit).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur sampai

titik didih air selama 30 menit.

2.5.2 Pemilihan Pelarut

Faktor utama untuk pertimbangan pada pemilihan pelarut adalah

selektivitas, kemudahan bekerja dan proses dengan cairan pelarut, ekonomis,

ramah lingkungan dan aman (Anonim, 2000) . Pelarut harus memenuhi syarat

kefarmasian atau dalam perdagangan dikenal dengan kelompok spesifikasi

20


“pharmaceutical grade”(Depkes, 2000). Sampai saat ini berlaku bahwa pelarut

yang diperbolehkan adalah air dan alkohol (etanol) serta campurannya. Jenis

pelarut seperti metanol dan lainnya (alkohol dan turunannya), heksana dan lainnya

(hidrokarbon alifatik), toluen dan lainnya (hidrokarbon aromatik), kloroform,

aseton, umumna digunakan sebagai pelarut untuk tahapan separasi dan tahapan

pemurnian (fraksinasi). Khusus metanol, dihindari penggunannya karena sifatnya

yang toksik akut dan kronik (Depkes, 2000). Tabel tingkat polaritas pelarut

sebagai berikut :

Pelarut Indeks Kepolaran

n-heksan 0,0

Diklorometana 3,1

n-Butanol 3,9

Iso propanol 3,9

n-propanol 4,0

Kloroform 4,1

Etil asetat 4,4

Aseton 5,1

Metanol 5,1

Etanol 5,2

Air 9,0 Sumber : Sarkey, Latif, dan Gray (2006)

a. Maserasi dengan pelarut Hexane

Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkana dengan rumus kimia

C6H14. Awalan heks- merujuk pada enam karbon atom yang terdapat pada heksana

dan akhiran –ana berasal dari alkana yang merujuk pada ikatan tunggal yang

menghubungkan atom-atom karbon tersebut. Dalam keadaan standar senyawa ini

merupakan cairan tak berwarna yang tidak larut dalam air.

b. Maserasi dengan pelarut Etil Asetat

Etil asetat merupakan senyawa aromatik yang bersifat semipolar dengan

rumus CH3CH2OC(O)CH3 sehingga dapat menarik analit-analit yang bersifat

polar dan nonpolar (Snyder, 1997). Indeks pelarut etil asetat adalah 4,4 . Hal ini

berarti pelarut etil asetat mampu menarik komponen senyawa kimiayang

terkandung di dalam ekstrak etil asetat. Eter pada umumnya digunakan secara

selektif untuk ekstraksi kumarin dan asam lemak (Tiwari, Kumar, Kaur, Kaur, &

Kaur, 2011).

21


c. Maserasi dengan pelarut Etanol

Etanol disebut juga etil alkohol yang di pasaran lebih dikenal sebagai

alkohol merupakan senyawa organik dengan rumus kimia C2H5OH. Memiliki

nilai indeks kepolaran 5,2. Dalam kondisi kamar, etanol berwujud cairan yang

mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna.

2.5.3 Pemekatan/penguapan (vaporasi dan evaporasi)(Depkes, 2000)

Pemekatan berarti peningkatan jumlah partial solute (senyawa terlarut)

secara penguapan pelarut tanpa sampai menjadi kondisi kering, ekstrak hanya

menjadi kental/pekat.

2.5.4 Rendemen(Depkes, 2000)

Rendemen adalah perbandingan antara berat ekstrak yang diperoleh

dengan berat simplisia awal.

2.5.5 Fraksinasi (Gritter et al., 1987)

Prinsip dari fraksinasi adalah proses penarikan senyawa pada suatu ekstrak

dengan menggunakan dua macam pelarut yang saling tidak bercampur. Pelarut

yang umum dipakai untuk fraksinasi adalah n-heksan, etil asetat dan metanol.

Untuk menarik lemak dan senyawa non polar digunakan n-heksan, etil asetat

untuk menarik senyawa semipolar sedangkan metanol untuk menarik senyawa-

senyawa polar. Dari proses fraksinasi ini dapat diduga sifat kepolaran dari

senyawa yang akan dipisahkan. Sebagaimana diketahui bahwa senyawa-senyawa

yang bersifat non polar akan larut dalam pelarut yang non polar sedangkan

senyawa-senyawa yang polar akan larut dalam pelarut yang bersifat polar juga.

Tiap-tiap fraksi diuapkan sampai kental dengan penguap putar pada suhu kurang

lebih 50˚C.

2.6 Metoda Pemisahan dan Pemurnian (Silverstein. et al., 1991)

Kromatografi merupakan metoda yang umum digunakan untuk

memisahkan komponen-komponen senyawa. Kromatografi akan memisahkan

campuran menjadi berbagai komponennya berdasarkan kesetimbangan heterogen

yang terjadi selama bergeraknya pelarut yang disebut fase gerak melewati fase

diam untuk memisahkan dua atau lebih komponen dari materi yang dibawa oleh

pelarut. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan sedangkan fase gerak dapat

berupa cairan atau gas (Touchstone,Dobbins, 1983).

22


Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu

kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi

gas, dan high performance liquid chromatography.

2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisika kimia dan

kromatografi cair paling sederhana yaitu dengan menggunakan plat-plat kaca atau

plat aluminium yang dilapisi silika gel dan menggunakan pelarut tertentu

(Harbone, 1987).

Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama,

dipakai sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, dan preparatif.

Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan

dipakai dalam kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi. Analisis

dari KLT dapat membantu menentukan pelarut terbaik apa yang akan dipakai dan

berapa perbandingan antar pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak pada

kromatografi kolom (Gritter, 1991).

Metode KLT dipilih karena memungkinkan variasi kombinasi fase gerak.

Polaritas senyawa menjadi dasar bagi pemilihan fase gerak yang sesuai untuk

pemisahan. Metode trial and error sering diterapkan untuk menentukan fase

gerak. Proses dilanjutkan dengan menjenuhkan bejana elusi. Proses penjenuhan

bejana dipercepat dengan meletakkan kertas saring sepanjang dinding atau

sebagian bejana dan fase gerak dimasukkan setelahnya. Bejana dijenuhkan dalam

posisi tertutup pada suhu ruang selama waktu tertentu (Handa dkk., 2008).

Prinsip KLT yaitu perpindahan analit pada fase diam karena pengaruh fase

gerak. Proses ini biasa disebut elusi. Semakin kecil ukuran rata-rata partikel fase

diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin baik kinerja

KLT dalam hal efisiensi dan resolusinya (Gritter, 1991). KLT mempunyai

beberapa keuntungan, diantaranya : waktu yang dibutuhkan tidak lama (2-5

menit) dan sampel yang dipakai hanya sedikit sekali (2-20 μg). Kerugiannya

dengan menggunakan KLT adalah tidak efektif untuk skala industri. Walaupun

lembaran KLT yang digunakan lebih lebar dan tebal, pemisahannya sering

dibatasi hanya sampai beberapa miligram sampel saja (Gritter, 1991).

23


a. Fase Diam

Silika gel paling banyak digunakan sebagai adsorben dan fase diam yang

dominan untuk KLT. Sebagian besar analisis KLT dilakukan dengan

menggunakan fase normal lapisan silika gel. Fase diam ini dapat digunakan

sebagai fase polar maupun nonpolar. Untuk fase polar, merupakan silika yang

dibebaskan dari air dan bersifat sedikit asam. Lapisan tipis yang biasa digunakan

adalah kaca dengan ukuran 20x20 cm, 10x20 cm, atau 5x10 cm. pendukung yang

lain berupa lembaran alumunium atau plastik seperti ukuran di atas yang

umumnya dibuat oleh pabrik (Sumarno, 2001).

b. Fase Gerak

Fase gerak adalah medium angkut, terdiri dari satu atau beberapa pelarut,

yang bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori karena adanya gaya

kapiler (Stahl, 1985). Pemilihan sistem pelarut yang dipakai didasarkan atas

prinsip like dissolves like, artinya untuk memisahkan sampel yang bersifat

nonpolar digunakan sistem pelarut yang bersifat nonpolar juga.

Campuran dilarutkan dan ditotolkan pada garis mulai berupa titik atau

pita. Penotolan berupa titik sebaiknya mempunyai diameter antara 2 mm dan

paling besar 5 mm (Stahl, 1969). Polaritas fase gerak perlu diperhatikan pada

analisa dengan KLT, sebaiknya digunakan campuran pelarut organik yang

mempunyai polaritas serendah mungkin. Campuran yang baik memberikan fase

gerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang. Secara umum dikatakan bahwa

fase diam yang polar akan mengikat senyawa polar dengan kuat sehingga bahan

yang kurang sifat kepolarannya akan bergerak lebih cepat dibandingkan bahan-

bahan polar (Gritter, et al., 1991).

Menurut (Gandjar,2007) nilai Rf sangat karakteristik untuk senyawa

tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi

adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih

besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal

tersebut dikarenakan fase diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan

tertahan kuat pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Nilai

Rf KLT yang bagus berkisar antara 0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus

dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen.

24


c. Metode Deteksi

Metode deteksi yang paling banyak dilakukan adalah metode kimia

destruktif (tidak memberikan perubahan permanen pada identitas kimia zat.

Contoh untuk metode kimia destruktif adalah pengarangan dengan asam sulfat,

sedangkan metode non-destruktif adalah dengan uap iodin. Contoh untuk metode

fisik adalah pengamatan di bawah sinar UV, banyak digunakan dan bersifat non-

destruktif terhadap sebagian besar zat, walaupun pada beberapa vitamin dan

steroid dapat bersifat destruktif (Touchstone & Dobbins, 1983).

Laju pergerakan fase gerak terhadap fase diam dihitung sebagai

Retardation farctor (Rf). Nilai Rf diperoleh dengan membandingkan jarak yang

ditempuh oleh zat terlarut dengan jarak yang ditempuh oleh fase gerak (Gandjar &

Rohman, 2007).

2.6.2 Kromatografi Kolom

Salah satu metode pemisahan senyawa dalam jumlah besar adalah

menggunakan kromatografi kolom. Pada kromatografi kolom fasa diam yang

digunakan dapat berupa silika gel, selulose atau poliamida. Sedangkan fasa

geraknya dapat dimulai dari pelarut non polar kemudian ditingkatkan

kepolarannya secara bertahap, baik dengan pelarut tungal ataupun kombinasi dua

pelarut yang berbeda kepolarannya dengan perbandingan tertentu sesuai tingkat

kepolaran yang dibutuhkan (Stahl, 1969).

Sistem eluen dalam kromatografi adalah isokratik dan gradien. Pelarut

isokratik berarti digunakan satu jenis pelarut selama proses elusi. Tipe isokratik

biasa digunakan untuk memisahkan senyawa yang tidak terlalu kompleks

campurannya dan umum digunakan sebagai pelarut pada KLT. Pada sistem

gradien, digunakan pelarut berbeda dan polaritasnya semakin meningkat selama

proses elusi. Peningkatan gradien pelarut bertujuan untuk mengelusi senyawa dari

non-polar bertahap sampai senyawa yang lebih polar (Handa dkk., 2008). Proses

elusi dengan sistem gradien cenderung lebih cepat dan umumnya diterapkan pada

HPLC.

Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung dan dimonitor

dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram

yang sama digabung kemudian pelarutnya diuapkan sehingga akan diperoleh

25


beberapa fraksi. Noda pada plat KLT dideteksi dengan lampu ultraviolet panjang

gelombang 254 nm dan 366 nm untuk senyawa-senyawa yang mempunyai gugus

kromofor, dengan penampak noda seperti larutan Iod, FeCl3 dan H2SO4 dalam

metanol 10% (Stahl, 1969).

Senyawa murni hasil isolasi sulit didapatkan karena terdiri dari banyak

senyawa gabungan. Senyawa yang berbentuk kristal pemurniannya dapat

dilakukan dengan rekristalisasi, yaitu berdasarkan perbedaan kelarutan antara zat

utama yang dimurnikan dengan senyawa minor dalam suatu pelarut tunggal atau

campuran pelarut yang cocok (Stahl, 1969).

2.6.3 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC merupakan salah satu teknik pemisahan campuran secara modern

(Hendayana, 2006). HPLC dapat digunakan untuk analisis kuantitatif maupun

kualitatif, dan paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa

tertentu, dan memurnikan senyawa dalam

suatu campuran (Gandjar dan Rohman, 2009).

Prinsip kerja HPLC yaitu dengan bantuan pompa fase gerak cair dialirkan

dengan cara penyuntikan. Pemisahan komponen -komponen campuran terjadi di

dalam kolom karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fase

diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fase diam akan keluar

dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fase

diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar

kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram

(Hendayana, 2006).

HPLC pada dasarnya terdiri dari beberapa komponen pokok, antara lain :

a. Fase gerak

Fase gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga dengan

eluen atau pelarut. Dalam HPLC fase gerak selain berfungsi sebagai pembawa

komponen-komponen campuran menuju detektor, fase gerak dapat berinteraksi

dengan solut-solut. Oleh karena itu, fase gerak merupakan salah satu faktor

penentu keberhasilan proses pemisahan (Hendayana, 2006).

Sebelum digunakan, fase gerak harus dihilangkan gasnya terlebih dahulu

(degassing) untuk menghindari berkumpulnya gas dengan komponen lain pada

26


pompa dan detektor. Fase gerak juga harus disaring untuk menghindari partikel-

partikel kecil yang dapat terkumpul dalam kolom atau tabung yang sempit

sehingga mengakibatkan kekosongan pada kolom atau tabung tersebut (Gandjar

dan Rohman, 2009).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Fase normal (fase diam lebih polar

dari pada fase gerak) kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas

pelarut. Sedangkan untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase

gerak) kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut

(Gandjar dan Rohman, 2009).

b. Pompa

Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :

menghasilkan tekanan sampai 600 psi, kecepatan alir berkisar antara 0,1-10

ml/menit, dan bahan tahan korosi (Hendayana, 2006). Jenis pompa yang

digunakan dalam HPLC antara lain pompa dengan tekanan konstan, dan pompa

dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan lebih umum digunakan dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan

konstan (Gandjar dan Rohman, 2009).

c. Penyuntikan sampel pada HPLC

Penyuntikan sampel ke dalam kolom terkadang merupakan suatu masalah

karena tekanan tinggi dari HPLC (Munson, 1991). Faktor ketidaktepatan

pengukuran HPLC dapat disebabkan pada keterulangan pemasukan sampel ke

dalam kolom. Pemasukan sampel yang banyak dapat menyebabkan band

broadening. Oleh karena itu, sampel yang dimasukkan harus sekecil mungkin, dan

diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan sampel ke dalam fase

gerak. Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLCantara lain

dengan injeksi syringe, injeksi stop-flow, dan kran cuplikan (Hendayana, 2006).

27


d. Kolom

Kolom HPLC biasanya terbuat dari stainless steel. Kolom utama berisi

fase diam, tempat terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-

komponennya (Hendayana, 2006).

e. Fase diam

Fase diam dalam HPLC berupa silika. Silika dapat dimodifikasi dengan

menggunakan reagen-reagen. Silika yang dimodifikasi mempunyai karakteristik

kromatografi dan selektifitas yan berbeda jika dibandingkan dengan silika yang

tidak dimodifikasi. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang

sering digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan

kepolaran yang rendah, sedang maupun tinggi (Gandjar dan Rohman, 2009).

f. Detektor

Detektor yang digunakan harus memenuhi beberapa syarat, yaitu: cukup

sensitif; stabilitas dan keterulangan tinggi; respon linier terhadap solut; waktu

respon pendek sehingga tidak bergantung pada kecepatan alir; reliabilitas tinggi

dan mudah digunakan; tidak merusak cuplikan (Hendayana, 2006); mempunyai

sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita; dan tidak

peka terhadap perubahan suhu (Gandjar dan Rohman, 2009).

2.6.4 HPLC Preparatif

Perbedaan antara kromatografi preparatif dan analitik biasanya

berdasarkan pada ukuran kolom, ukuran partikel, dan jumlah sampel yang

diinjeksikan. Sedangkan perbedaan antara cara kerjanya ditentukan berdasarkan

keberhasilan dari proses pemisahan. Jika informasinya berupa keberhasilan proses

pemisahan maka metodenya berupa kromatografi analitik dan jika tujuannya

untuk mengumpulkan produk maka pemisahannya merupakan metode preparatif.

Pada HPLC analitik sampel dapat diproses, dikendalikan dan dimodifikasi dengan

cara apa saja yang sesuai untuk memperoleh informasi yang diperlukan,

sedangkan dalam HPLC preparatif sampel dapat digunakan kembali sebelum

menjalani pemisahan berikutnya (Ditz, 2005).

HPLC preparatif digunakan untuk purifikasi atau isolasi senyawa murni

atau senyawa utama dari fraksi-fraksi sebelumnya yang diperoleh dari

kromatografi kolom lainnya. Dengan kromatografi preparatif diharapkan dapat

28


diisolasi sejumlah besar molekul organik yang diinginkan, dengan cara

memperbesar konsentrasi sampel, volume injeksi, atau kombinasi keduanya

(Piecha et al,2007).

29


BAB 3

METODE PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Bahan Alam Farmakognosi dan

Fitokimia, Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Kimia Obat Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah

Jakarta, dan Laboratorium Bioteknologi Serpong sejak bulan Januari hingga

Agustus 2017.

3.2 Bahan

3.2.1 Tanaman

Tanaman yang digunakan adalah G. dioica Blume yang diperoleh dari

Desa Siduampan Kecamatan Ranah Batahan Kabupaten Pasaman Barat, Sumatera

Barat dan dideterminasi di Pusat Penelitian Biologi – LIPI Cibinong, Bogor

(Lampiran 1). Adapun bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit

batang dari tanaman tersebut.

3.2.2 Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini adalah n-heksan, etil

asetat, etanol 96%, dan metanol teknis yang telah didestilasi; DMSO p.a (Merck);

silika gel 0.063-0.200 mm (E.Merck); asam sulfat (H2SO4) 10% sebagai

penampak noda pada KLT; aquades; asam klorida; asetat glasial p.a. (Merck);

asam sulfat (H2SO4) p.a (Merck); besi (III) klorida (FeCl3) (Merck); aluminium

klorida (AlCl3) (Merck); serbuk magnesium (Mg) (Merck); serbuk seng (Merck);

dragendorff LP; bouchardat LP; molisch LP; dimetil sulfoksida (DMSO)

(Sigma), enzim malate quinone oxidoreductase (MQO) (Wako), substrat malate

(Wako), 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) (Sigma),

2,6-Dichlorophenolindophenol (DCIP) (Sigma), dan kalium sianida (KCN)

(Sigma), Decyl-ubiquinone (D7911 Sigma).

3.3 Peralatan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah blender, rotary

evaporator (Buchi), timbangan analitik (mettlee toledo AB 204-s/FOC), labu

erlenmeyer, cawan penguap, kertas saring, alat gelas (tabung reaksi, pipet tetes,

gelas ukur, gelas kimia, corong, spatula dan batang pengaduk), oven, Thin Layer

30


Chromatography (TLC silica gel 60 F254) Merck , kolom kromatrografi (Pyrex),

kertas saring, botol timbang, krus silikat, lampu UV Hand Held, Spectramax

(Paradigm), chamber KLT, microtubes MCT-150-c 1,5 ml, pipet tips 10 µL, 200

µL Biologix, pipet tips 1-1000 µL Axygen, microwell plate 96 (269787) (NuncTm

), vial, micropipet multiple, dan micropipet single.

3.4 Cara Kerja

Pengujian aktivitas inhibisi dari ekstrak kulit batang Garcinia dioica

Blume dalam menghambat aktivitas enzim Malate: Quinone Oxidoreductase dari

Plasmodium falciparum (PfMQO) dilakukan melalui beberapa tahapan penelitian

meliputi ekstraksi dengan maserasi bertingkat, pemisahan senyawa dengan

kromatografi kolom, purifikasi dengan KLT analitis dan HPLC, serta uji aktivitas

inhibisi menggunakan 96 well plate, microplate reader 600 nm dengan mengikuti

metode dan optimasi yang telah divalidasi pada proyek penelitian bersama Tokyo

University, Universitas Airlangga Surabaya, dan Balai Bioteknologi Serpong.

3.4.1 Penyiapan Bahan

Kulit batang G. dioica Blume yang digunakan pada penelitian ini

dikumpulkan pada bulan Agustus 2016 dari Desa Siduampan Kecamatan Ranah

Batahan Kabupaten Pasaman Barat, Sumatera Barat sebanyak 2 kg berupa kulit

batang basah segar. Pengambilan sampel dilakukan pada sore hari dan dilakukan

sortasi untuk dipisahkan dari kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing sehingga

dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut kemudian diangin-anginkan hingga

kering. Simplisia yang telah disortasi dihaluskan dengan blender hingga didapat 1

kg serbuk simplisia kasar kemudian serbuk simplisia disimpan dalam wadah

bersih, kering dan terlindung dari cahaya.

3.4.2 Pembuatan Ekstrak

Sejumlah 1 kg serbuk kering kulit batang G. dioica Blume dimaserasi

dengan 2 L pelarut n-heksan, etil asetat, 96% etanol teknis yang telah didestilasi,

selama 3 hari. Maserasi dilakukan sebanyak 3 kali. Hasil maserasi disaring dan

filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu lebih

kurang 45⁰C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan. Hasil ampas n-heksan

kembali di maserasi berturut turut dengan pelarut etil asetat dan 96% etanol

kemudian pelarut diuapkan dengan vacum rotary evaporator hingga diperoleh

31


ekstrak kental n-heksan, etil asetat dan 96% etanol yang kemudian masing-masing

ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat simplisia awal. Ekstrak yang

telah kental disimpan di kulkas pada suhu 4ºC. Untuk menghitung rendemen

ekstrak digunakan persamaan berikut.

% Rendemen = ( )

( ) x 100 %

3.4.3 Uji Inhibisi Ekstrak G. dioica Blume Dalam Menghambat Aktivitas

Enzim PfMQO

a. Penyiapan Ekstrak Untuk Assay

Masing-masing ekstrak dari kulit batang G. dioica Blume (ekstrak n-

heksan, etil asetat dan 96% etanol) ditimbang seksama 2-8 mg dilarutkan larutan

DMSO 100% dalam tube eppendorf 1,5 mL, dibuat dalam konsentrasi 10 mg/mL

sebagai larutan induk. Ditransfer 100 µl ekstrak ke dalam “Bioassay plate”,

dengan 96 lubang, berdiameter 0,5 cm dan tinggi lubang 1 cm kemudian, untuk

uji dicuplik kembali 0,4 µl ekstrak konsetrasi menjadi (20 μg/mL) dan 2 µl

ekstrak (100 μg/mL) disiapkan dalam well pengujian. Pengujian terhadap uji

aktivitas inhibisi dilakukan duplo.

Keterangan/Note: (*) = Volume akhir sampel adalah 200 µl setiap sumuran

Gambar 3.1 Peta Plate Pengujian inhibisi dalam menghambat aktivitas enzim

PfMQO

32


b. Penyiapan Bahan Uji Hasil Fraksinasi Ekstrak Etil Asetat

Ditimbang seksama fraksi etil asetat 2-8 mg dilarutkan larutan DMSO

100% dalam tube eppendorf 1,5 mL, hingga konsentrasi akhir 10.000 μg/mL

sebagai larutan induk. Dicuplik 100 µl ekstrak dan disiapkan dalam “Bioassay

plate”. Untuk fraksinasi dibuat dalam bentuk pengenceran dengan cara dari 100

µl diambil 50 µl dan diencerkan 10 kalinya dengan ditambahkan DMSO 100%

hingga diperoleh konsentrasi akhir pengenceran (100; 10; 1; dan 0,1 μg/mL) dan

disiapakan didalam “Bioassay plate”.

Untuk pengujian terhadap enzim PfMQO, esktrak yang telah diencerkan

pada masing-masing konsentrasi di cuplik sebanyak 2 µl lalu ditambahkan assay

mix dan diuji dengan spektrofotometer.

c. Penyiapan Bahan Uji Hasil Pemurnian Fraksi Aktif

\ Hasil tampungan pemurnian fraksi aktif dengan HPLC preparatif dicuplik

100 µl dan 50 µl disiapkan dalam “Bioassay plate”. Kemudian dikeringkan dan

dilarutkan dengan 5 µl DMSO; 190 µl assay; 5 µl substrat . Mixing selama 20

menit 1300 rpm.

d. Pembuatan Larutan Uji Enzim (Assay)

Larutan untuk pengujian aktivitas terhadap enzim PfMQO mengandung

komponen 50 mM HEPES (NaOH pH 7.0); 1 mM KCN; 25 µM d-UQ; 120 µM

DCIP; 2,778 µg/ml enzim PfMQO membrane stock dan 400 mM substrat malate

(ditambahkan sebelum assay).

e. Pengujian Enzim PfMQO (D.K. Inaoka, et al ; 2017)

Tiap-tiap volume sumuran V-plate dicukupkan sampai 200 µl. Untuk

konsetrasi 100 ppm mengandung (2 µl ekstrak;193 µl assay; 5 µl substrat) dan

konsentrasi 20 ppm mengandung (0,4 µl ekstrak;194,6 µl assay; 5 µl substrat).

Selanjutnya, bahan preparasi assay berupa larutan 50 mM HEPES diambil

sebanyak 20 µl, di tambahkan KCN 1 M 20 µl, lalu di ambil UQ2 8,33 µl, 200 µl

DCIP dan terakhir di tambahkan enzim PfMQO membran stock sebanyak 3,1 µl.

Kemudian di mixing selama 15 sec (2x) dan diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 3

menit selanjutnya serapan diukur pada panjang gelombang 600 nm (Ɛ600= 21 cm-

1.mM

-1) dengan Spektrofotometer (Spectramax Paradigm) sebagai background.

33


Setelah 3 menit di tambahkan 5 µl dari 400 mM sodium malate lalu di ukurselama

10 menit.

f. Perhitungan Aktivitas Enzim

Persen inhibisi dari ekstrak kulit batang Garcinia dioica Blume terhadap

enzim PfMQO dapat di hitung dengan menggunakan rumus :

Sampel : Absorbansi sampel yang dibaca selama 10 menit

Kontrol positif : Rata-rata absorbansi pada kontrol positif

Kontrol negatif : Rata-rata absorbansi pada kontrol negatif

3.4.4 Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom

Fraksinasi dilakukan dengan menggunakan cairan elusi pada KLT yang

sesuai sebagai fase gerak dan silika gel 60 GF254sebagai fasa diam. Sebanyak 3 g

ekstrak etil asetat kulit batang G. dioica Blume dimasukkan ke dalam kolom kaca

yang telah berisi 25 g silika gel yang telah dilarutkan dengan pelarut n-heksan.

Ditambahkan cairan elusi dengan metode step ways menggunakan n-heksan : etil

asetat (10:1 – 1:1) dibiarkan mengalir melalui kolom dan ditampung dengan vial.

Fraksi yang mempunyai pola sama selanjutnya digabungkan menjadi satu

sehingga diperoleh fraksi yang mempunyai sifat hampir sama dan diuji kembali

aktivitasnya. Adanya senyawa dalam fraksi yang menghasilkan % inhibisi terbaik

dideteksi kembali dengan KLT dengan eluen yang sesuai, kemudian noda pada

plat KLT divisualisasi dengan lampu UV 254 nm. Fraksi-fraksi yang dihasilkan

ini kemudian dilakukan pemisahan dengan analisis HPLC/KCKT.

3.4.5 Purifikasi

3.4.5.1 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / HPLC

a. Penyiapan Alat Kromatografi

Masing-masing unit diatur, kolom yang digunakan Shimadzu ODS (C18),

detektor UV-VIS dan dideteksi pada panjang gelombang 254 nm. Setelah HPLC

dihidupkan maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30

menit dengan laju alir 1 ml/menit sampai diperoleh garis atas yang datar (sistem

telah stabil.

(

x 100%

34


b. Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan adalah 95 % MeOH : 5 % H20 dengan volume

1000 ml dan diudarakan selama 20 menit untuk menghilangkan gas yang

terperangkap

c. Penyiapan Sampel Uji

Ditimbang seksama sampel 10 mg/ml konsentrasi 10.000 ppm sebagai

larutan induk. Diencerkan, sehingga diperoleh konsetrasi 2000 ppm dengan

pelarut metanol pure HPLC dalam eppendorf. Kemudian dilakukan sentrifugasi

selama 10 menit 1300 rpm.

d. Uji Identifikasi Menggunakan HPLC

Sampel dengan konsentrasi 2000 ppm diinjeksikan sebanyak 20 µl,

dianalisis pada kondisi HPLC dengan fase gerak metanol : air (95:5) dengan laju

alir 1 ml/menit panjang gelombang 254 nm. Diamati peak yang muncul terhadap

waktu retensi.

3.4.6 Uji Kemurnian dengan HPLC Preparatif

Fraksi aktif dimurnikan kembali menggunakan HPLC preparatif. HPLC

preparatif dilakukan dengan menggunakan HPLC Shimadzu, dengan Photodiode

Detector Array (PDA), Waters Column Puresil 5m C18, volume injeksi 100

µl/injeksi dengan kecepatan aliran 1 ml/menit, dan tekanan kolom 1350 psi.

Konsetrasi sampel yang diinjeksikan adalah sebesar 5000 µg/ml. Semua fraksi

hasil pemurnian dengan HPLC preparatif dikumpulkan dan diuji (bioassay)

terhadap enzim PfMQO.

35


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan Bahan

Bagian tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit batang

Garcinia dioica Blume sebanyak 2 kg basah yang diperoleh dari Desa Siduampan

Kecamatan Ranah Batahan Kabupaten Pasaman Barat, Sumatera Barat

dandideterminasi oleh LIPI Cibinong (Lampiran 1). Setelah melalui proses

sortasi, pengeringan, penghalusan dan penyaringan, diperoleh 1 kg serbuk kering

kulit batang G. dioica Blume.

Sortasi dilakukan untuk memisahkan kotoran dan bahan asing dari bahan

simplisia sehingga dapat mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam

bahan uji. Proses pengeringan bahan simplisia dilakukan untuk mendapatkan

simplisia yang tidak mudah rusak bila disimpan dalam waktu yang lama.

Pengeringan bahan simplisia adalah proses pengurangan kandungan air dalam

tanaman, sehingga suhu dan waktu pengeringan perlu diperhatikan. Suhu

pengeringan yang baik adalah antara 30⁰C – 90⁰C. Untuk bahan simplisia yang

senyawa aktifnya tidak tahan panas sebaiknya dikeringkan pada suhu 30⁰C –

45⁰C atau dengan pengeringan vacum.

Simplisia yang telah kering di sortasi kembali dari kotoran-kotoran yang

tertinggal. Simplisia yang telah disortir, kemudian dihaluskan dengan blender

hingga menjadi serbuk kemudian diayak hingga didapatukuran serbuk yang

seragam. Untuk mencegah kerusakan atau mutu simplisia,serbuk simplisia

disimpan dalam wadah bersih, kering dan terlindung dari cahaya.

4.2 Ekstraksi

Sejumlah 1 kg serbuk kering kulit batang G. dioica Blume dimaserasi

dengan 4 L pelarut n-heksan selama 3 hari, maserasi dilakukan 3 kali. Proses

esktraksi dilakukan dengan cara dingin dengan tujuan untuk meminimalisir

terjadinya pemanasan yang dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada

senyawa yang tidak tahan panas. Keuntungan dari maserasi ini sendiri adalah

pengerjaan dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah sedangkan,

kerugiannya adalah pelarut yang digunakan banyak dan penyarian tidak

berlangsung maksimal.

36


Penggunaan ekstraksi bertingkat yang dilakukan bertujuan untuk

memaksimalkan proses ekstraksi dimana senyawa akan terekstraksi berdasarkan

sifat kepolarannya. Ekstraksi dilakukan pertama dengan menggunakan pelarut n-

heksan yang bersifat polar untuk mengekstraksi senyawa yang bersifat non polar

dan menghindari terbawanya asam lemak yang terkandung dalam senyawa,

selanjutnya dengan pelarut etil asetat yang bersifat semi polar dan terakhir dengan

menggunakan pelarut metanol yang bersifat polar untuk menarik senyawa yang

bersifat polar. Ekstraksi menggunakan pelarut dengan kepolaran yang tinggi

(etanol) terlebih dahulu harus dihindari karena akan terbawanya asam-asam lemak

dalam ekstrak non polar. Pemisahan dalam sistem normal diawali senyawa kurang

polar terelusi terlebih dulu diikuti dengan senyawa yang lebih polar (Handa dkk.,

2008).

Masing-masing tahap esktraksi dilakukan hingga pelarut yang digunakan

ekstraksi berwarna bening. Hasil dari maserasi kemudian disaring dan filtrat yang

diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator pada suhu lebih kurang

45⁰C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan.

Hasil dari ampas n-heksan dilakukan kembali maserasi berturut-turut

dengan pelarut etil asetat dan etanol 96% kemudian pelarut diuapkan dengan

vacum rotary evaporator kembali hingga diperoleh bobot ekstrak etil asetat dan

etanol berturut-turut adalah 5,7 g ekstrak n-heksan; 43,87 g ekstrak etil asetat dan

78,14 g ekstrak etanol (Tabel 4.1). Nilai rendemen masing ekstrak n-heksan

(0,50%) , etil asetat (4,38%) dan 96% etanol (7,81%).

Nilai rendemen yang dihasilkan dapat disebabkan oleh beberapa faktor,

yaitu metode ekstraksi yang digunakan, ukuran partikel sampel, kondisi dan

waktu penyimpanan, lama waktu ekstraksi, perbandingan jumlah sampel terhadap

jumlah pelarut yang digunakan dan jenis pelarut yang digunakan (Salamah, et al.,

2008). Ekstrak 96% etanol memiliki nilai rendemen paling tinggi, diikuti

rendemen ekstrak etil asetat dan ekstrak n-heksan. Tingginya rendemen ekstrak

etanol menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung dalam ekstrak G.dioica

Blume lebih banyak bersifat polar.

37


Tabel 4.1 Data rendemen ekstrak kulit batang G. dioica Blume

4.3 Uji Inhibisi Ekstrak Terhadap Aktivitas Enzim PfMQO

Uji inhibisi ekstrak terhadap enzim PfMQO dilakukan untuk mengetahui

adanya senyawa yang beraktifitas antimalaria dalam ekstrak kulit batang G. dioica

Blume dalam menghambat enzim Plasmodium falciparum Malate Quinone

Oxidoreductase (PfMQO). Dalam pengujian inhibisi ekstrak terhadap aktivitas

enzim PfMQO digunakan Spectrofotometer (Spectramax Multimode). Metode

Optimasi yang sudah divalidasi dengan suhu 37⁰C selama 10 menit dan serapan

maksimum terletak pada panjang gelombang 600 nm. Selanjutnya, untuk semua

pengukuran terhadap enzim PfMQO dilakukan pada panjang gelombang tersebut.

Hasil uji inhibisi masing-masing ekstrak menunjukkan bahwa ekstrak etil

asetat memiliki nilai inhibisi yang kuat dibanding ekstrak 96% etanol dan n-

heksan dalam menghambat aktivitas enzim PfMQO. Menurut literatur, senyawa

yang berperan sebagai antimalaria adalah senyawa golongan alkaloid dan

flavonoid. Sejalan dengan hasil penelitian di atas serta pengujian fitokimia dapat

diduga senyawa marker yang berperan sebagai antimalaria merupakan senyawa

dari golongan alkaloid dan flavonoid (xanthon) yang terkandung dalam ekstrak

etil asetat (semi polar).

Dilakukan pengukuran inhibisi dengan spetrofotometer pada seri

konsentrasi 100; 10; 1; dan 0,1 ppm secara duplo, menghasilkan nilai standar error

(error bars) yang semakin kecil sehingga perlakuan duplo menghasilkan nilai

yang lebih akurat. Hasil inhibisi ekstrak terhadap aktivitas enzim PfMQO

ditunjukkan oleh tabel 4.2.

No Ekstrak Bobot

ekstrak (g)

Rendemen

Ekstrak (%)

Warna Ekstrak

1 n-heksan 5,7 0,50 Coklat

2 etil asetat 43,87 4,38 Coklat kemerahan

3 96% etanol 78,14 7,81 Coklat kehitaman

38


Gambar 4.1 Hasil uji inhibisi ekstrak G. dioica Blume terhadap aktivitas enzim

PfMQO

Parameter yang digunakan untuk menunjukkan nilai inhibisi dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO ini adalah nilai persen inhibisi yang

merupakan persen hambat yang dapat menyebabkan 50% penghambatan terhadap

aktivitas enzim PfMQO atau yang memberikan persentase penghambatan 50%.

Mekanisme perubahan warna saat reaksi berlangsung diikuti oleh

pelepasan dan penerimaan elektron. Oksidasi malate menjadi oksaloasetat diikuti

dengan reduksi d-ubiquinon menjadi quinol. Elektron yang dilepas ditangkap oleh

Dichlorophenolindophenol (DCIP) menyebabkan terjadinya reduksi DCIP

kembali dari yang berwarna biru menjadi tidak berwarna. DCIP yang tidak

berwarna mengindikasikan terjadinya aktivitas enzim. Pengukuran aktivitas

inhibisi enzim pada sampel uji dihitung terhadap serapan kontrol yakni dengan

substrat malate (kontrol negatif) dan tanpa substrat malate (kontrol positif) (Ken

inaoka et al, 2016).

Malate Oksaloasetat

(Substrat) (Produk)

Berdasarkan hasil yang diperoleh, pengukuran nilai inhibisi ekstrak pada

seri konsetrasi 100; 10; 1; dan 0,1 ppm menunjukkan ekstrak etil asetat pada

konsentrasi 100 ppm memberikan nilai inhibisi tertinggi yaitu (97,95%)

dibanding ekstrak n-heksan (59,87%) dan etanol (87,01%). Secara spesifik suatu

senyawa dikatakan sangat kuat aktivitasnya jika nilai persen inhibisi lebih dari

50%. Sehingga berdasarkan hal tersebut ekstrak etanol, etil asetat, dan n-heksan

dari ekstrak kulit batang G. dioica Blume dapat dikatakan aktif sebagai

antimalaria dalam menghambat aktivitas PfMQO yang kuat karena memiliki

97,95 90,42

13,62

0

50

100

100 ppm 10 ppm 1 ppm 0,1 ppm

% In

hib

itio

n

n-heksan Etil asetat 96% etanol

Enzim MQO

39


nilai persen inhibisi lebih dari 50%. Ketiga ekstrak memberikan nilai persen

inhibisi lebih dari 50%, namun persen inhibisi tertinggi yaitu pada ekstrak etil

asetat (97,95%). Kemudian dilakukan pengenceran namun diperoleh data yang

kurang linier. Screening pada konsentrasi tinggi dan rendah diharapkan

memberikan nilai pengukuran yang linier agar nilai perbedaan pada masing-

masing konsentrasi didapatkan. Ekstrak etil asetat kemudian difraksinasi dengan

kromatografi kolom menggunakan fase gerak dengan gradient kepolaran yang

berbeda (n-heksan : etil asetat).

4.4 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia bertujuan untuk mendeteksi senyawa yang terkandung

dalam tanaman berdasarkan golongannya. Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak

etil asetat dari kulit batang G. dioica Blume dapat dilihat pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil uji penapisan fitokimia dari ekstrak kulit batang G. dioica Blume

Hasil penapisan fitokimia menunjukan bahwa ekstrak etil asetat G. dioica

Blume mengandung golongan senyawa alkaloid, flavonoid, tanil dan polifenol,

saponin dan triterpenoid.

No Golongan Kimia Pengamatan Sampel

Esktrak

etil asetat

Hasil

1 Alkaloid (+) Dengan pereaksi

Dragendroff terbentuk

endapan jingga

2 Flavonoid (+) Fluoresensi kuning

intensif

3 Steroid (-) Terbentuk cincin

kecoklatan

4 Tanin dan Polifenol (+) Hitam kehijauan

5 Glikosida (-) Coklat

6 Saponin (+) Terbentuk busa setinggi

1,3 cm selama 30 detik

7 Triterpenoid (+) Terbentuk cincin

kecoklatan

40


4.5 Optimalisasi Penggunaan Assay Mix pada pengujian PfMQO (D.K.

Inaoka, et al ; 2017

Assay mix yang digunakan dalam pengujian aktivitas PfMQO ini adalah

campuran pelarut HEPES, DCIP, KCN, enzim PfMQO , d-ubiquinol dan substrat

malate. Aktivitas enzim dibaca menggunakan spektrofotometer molecular

(paradigm) pada panjang gelombang 600 nm (Ɛ600= 21 cm-1

.mM-1

) selama 10

menit dengan suhu 37°C. Optimalisasi suhu untuk uji PfMQO dilakukan secara

spektrofotometri menggunakan UV760 (Jasco-Japan) yang dilengkapi dengan

circulator air mandi (Taitec) (D.K. Inaoka, et al ; 2017. Sebelum penambahan

substrat, assay mix dibaca menggunakan spektrofotometer selama 3 menit sebagai

background. Panjang gelombang 600 nm adalah panjang gelombang DCIP

dengan penyerapan maksimal, dalam bentuk teroksidasi DCIP berwarna biru, bila

direduksi DCIP menjadi tidak berwarna.

Penggunaan DCIP untuk mengevaluasi inhibisi sintesis dari enzim

PfMQO dengan prinsip uji kolorimetrik. Dalam proses reaksi, PfMQO

mengkatalisis oksidasi malate menjadi oksaloasetat secara bersamaan terjadi juga

reduksi dari ubiquinon menjadi ubiquinol sehingga terjadi reduksi DCIP,

menghasilkan perubahan warna (Wijaya et al.)

HEPES adalah buffer zwitterionic yang banyak digunakan di biokimia dan

biologi molekuler, kisaran pH dari HEPES adalah 6,8 - 8,2 bertujuan untuk

mempertahankan pH pada larutan assay mix. Derajat pH perlu diatur sedemikian

rupa agar aktivitas larutan enzim menjadi stabil. Sebagai akseptor elektron

digunakanlah decylubiquinon. Dalam proses reaksi enzim akan terjadi proses

reduksi dan oksidasi elektron dan decylubiquinon akan menerima elektron

tersebut. Elektron yang dihasilkan selama proses oksidasi akan digunakan untuk

melakukan reduksi merubah ubiquinon menjadi ubiquinol.

Selama proses preparasi dan pengujian, enzim PfMQO harus diperlakukan

khusus, yaitu enzim harus disimpan dalam suhu -30°C (Sigma,1996). Suhu

merupakan salah satu faktor penting yang harus diperhatikan pada proses

penyimpanan sampel yang akan dianalisis. Perubahan suhu dapat mempengaruhi

aktivitas enzim tersebut dan ini dapat mengakibatkan kesalahan dalam interpretasi

hasil pemeriksaan terhadap aktivitas enzim tersebut. Selama proses pengujian

41


enzim PfMQO disimpan di dalam ice box untu menjaga larutan enzim tetap

berada dalam suhu rendah.

Penambahan malate dalam campuran assay mix berfungsi sebagai substrat

dari enzim PfMQO. Jumlah substrat yang ditambahkan sebanyak 5 µl. Konsetrasi

substrat yang rendah menyebabkan kecepatan reaksi akan amat rendah dan

kecepetan reaksi akan meningkat seiring dengan konsentrasi substrat yang

meningkat akhirnya, tercapai titik batas aktivitas enzim. Jika titik batas atau

optimal ini terlampaui, kecepatan reaksi hanya akan bertambah sedemikian

kecilnya dengan bertambahnya konsentrasi substrat (Al.Lehninger; 2000).

4.6 Fraksinasi dengan kromatografi kolom

Dilakukan fraksinasi dengan metode kromatografi kolom terhadap ekstrak

kental etil asetat kulit batang Garcinia dioica Blume . Kromatografi kolom yang

digunakan memiliki ukuran tinggi 30 cm dan diameter 2 cm. Fase diam yang

digunakan adalah silika gel 60 GF 254 (ukuran partikel 0,063-0,2 mm). Sebelum

digunakan terlebih dahulu kolom dibersihkan dan pada bagian dasar diberikan

kapas. Selanjutnya kolom dialiri dengan pelarut n-heksan dan kapas ditekan-tekan

dengan batang pengaduk hingga tidak ada udara yang terjerap. Pembuatan bubur

silika dengan menimbang 250 gram serbuk silika gel lalu didespersikan dengan

pelarut n-heksan hingga menjadi suspensi silika. Ekstrak kental etil asetat

sebanyak 1 gram yang akan dipisahkan sebelumnya dicampur dengan silika gel

sebanyak 8 gram untuk preadsorbsi.

Sistem fase gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksan dan

etil asetat yang kepolarannya dinaikkan secara bertahap (step ways). Masing-

masing fase gerak digunakan sebanyak 300 ml dengan perbandingan n-heksan dan

etil asetat yang setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 10%. Pelarut yang

menetes ditampung dalam vial yang sebelumnya telah diberi nomor. Fraksinasi

dilakukan hingga fase gerak yang digunakan telah mencapai gradien akhir yaitu

100% etil asetat.

Dari hasil kromatografi kolom, diperoleh fraksi sebanyak 220 fraksi. Vial

hasil penampungan pelarut kemudian dikeringkan. Fraksi yang telah diperoleh

dilakukan kromatografi lapis tipis dan dilihat pola bercak yang dihasilkan

dibawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Fraksi yang

42


memiliki kemiripan Rf dan pola noda digabung sehingga menghasilkan 8 fraksi

yaitu fraksi F1 = 0,3961 g, , fraksi F2 = 0,2205 g. , fraksi F3 = 0,0152 g, fraksi F4

= 0,0471 g, fraksi F5 = 0,0111 g, fraksi F6 = 0,0191 g, fraksi F7 = 0,0213 g, dan

fraksi F8 = 0,0113 g.

Hasil pemantauan KLT diduga menghasilkan senyawa yang berbeda

karena menghasilkan nilai Rf yang berbeda. Spot fraksi F1 didapatkan nilai Rf

spot sebesar 0,857, fraksi F2 0,858, fraksi F3 0,771, fraksi F4 0,774, fraksi F5

0,780, fraksi F6 0,742, fraksi F7 0,751, dan fraksi F8 0,749 maka, fraksi F1

sampai dengan fraksi F8 dipilih untuk dilanjutkan uji inhibisi terhadap aktivitas

enzim PfMQO.

Ket 1 = Fraksi F1 2 = Fraksi F2

3 = Fraksi F3 4 = Fraksi F4

5 = Fraksi F5 6 = Fraksi F6

7 = Fraksi F 8 = Fraksi F8

Gambar 4.2 Hasil pemantauan KLT dengan fase diam silika gel GF 254 fase gerak

60 % n-heksan : 40% etil asetat dilihat pada lampu UV 254 nm

4.7 Uji Inhibisi Fraksi Etil Asetat Terhadap Aktivitas Enzim PfMQO

Fraksi ekstrak etil asetat yang telah di kromatografi kolom dan

digabungkan mengahasilkan 8 fraksi, yaitu fraksi F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, dan

fraksi F8 dilakukan pengujian inhibisinya dalam menghambat aktivitas enzim

PfMQO. Uji inhibisi menggunakan Spektrofotometer, optimasi dengan suhu 37⁰C

dan serapan maksimum terletak pada panjang gelombang 600 nm. Pengujian

fraksi etil asetat ini dilakukan pada seri konsentrasi 100; 10; 1, dan 0,1 ppm. Hasil

pengukuran inhibisi fraksi pada gambar 4.3.

1 2 3 4 5 6 7 8

43


Gambar 4.3 Hasil uji inhibisi fraksi terhadap aktivitas enzim PfMQO

Dari grafik diatas menunjukkan hasil uji inhibisi fraksi F1, F2 dan F3 pada

konsentrasi 10 ppm menghasilkan nilai inhibisi terhadap aktivitas enzim PfMQO

lebih dari 50%. Nilai inhibisi fraksi F1 (98,99%), fraksi F2 (98,48%), dan fraksi

F3 (97,95%). Aktivitas antimalaria dalam menghambat aktivitas enzim PfMQO

ini dapat dinyatakan dengan persentase penghambatan atau persentase inhibisi.

Pada tabel diatas dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi ekstrak yang

digunakan maka semakin besar aktivitas antioksidan yang diperoleh dan semakin

rendah konsentrasi ekstrak maka semakin kecil aktivitasnya. Dari data di atas nilai

persen inhibisi yang melebihi 50% terdapat pada fraksi F1, F2, dan F3. Fraksi F4,

F5, F6, F7 dan F8 menunjukkan nilai kurang dari 50% dan tidak aktif dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO selanjutnya dilakukan analisis dengan

HPLC analitis dan HPLC preparatif.

4.8 Analisis dan Fraksinasi dengan HPLC Preparatif

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan

kepolarannya. Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel

yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian

akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan

perbedaan afinitasnya (Clark J; 2007).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dilakukan dengan memperhatikan pola

dan puncak serapan spektrum dari sampel. Penelitian ini menggunakan panjang

gelombang 254 nm, karena panjang gelombang ini merupakan panjang

gelombang yang maksimum dan memberikan kondisi analisis yang baik (bebas

98,98 97,95 97,95

8,39 2,62

-1,51 -4,72 -1,7

-30

-10

10

30

50

70

90

110

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

% In

hib

itio

n

Fraksi etil asetat

100 ppm 10 ppm 1 ppm 0,1 ppm

44


dari gangguan pelarut) (Clark J; 2007). Fraksi aktif F1, F2, dan F3 dari ekstrak etil

asetat G. dioica Blume diidentifikasi menggunakan kromatografi cair kinerja

tinggi (HPLC) untuk dilihat profil senyawanya. Sampel disuntikan dengan

memakai suntikan mikrovolume injeksi 20 μl melalui septum elastomer.

Identifikasi dengan ini, memakai HPLC Shimadzu ODS (C18) 4,6 mml.D x 250

mm (No.1702072Y), dan detektor UV (254 nm).

Fase gerak yang digunakan adalah 95 % MeOH - 5 % H20 volume 1000

ml dan laju alir 1 ml/menit selama 30 menit. Panjang gelombang 254 digunakan

karena metanol dapat menyerap radiasi pada panjang gelombang 205 nm,

sedangkan air menyerap radiasi pada panjang gelombang 190 nm, sehingga

detektor UV yang digunakan harus memiliki panjang gelombang yang lebih tinggi

dari panjang gelombang metanol dan air untuk menghindari pembacaan yang

salah dari pelarut (Putra 2004). Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan

degassing (penghilangan gas).

Pada lampiran 3, tampak adanya beberapa puncak senyawa, ini

menandakan bahwa senyawa pada fraksi F1, F2, dan F3 belum murni dan masih

mengandung lebih dari dua senyawa kimia. Hasil spektra dari kromatografi HPLC

menunjukkan terdapat 1 peak tinggi dan 2 peak kecil pada F1, 1 peak tinggi dan 3

peak kecil pada F2, dan 1 peak tinggi dan 2 peak kecil pada F1 yang dapat

dipisahkan (Lampiran 2). Hasil puncak kromatografi HPLC ini, tidak semuanya

merupakan suatu senyawa yang dapat dipisahkan, karena dimungkinkan juga itu

hasil dari pengotor-pengotor yang dibawa oleh sampel. Dari ketiga profil fraksi

F1,F2, dan F3 hampir semuanya memiliki profil yang mirip. Menghasilkan

peak/puncak pada retensi waktu 20 – 29 menit.

Tabel 4.3 Profil analisis HPLC fraksi F1, F2, dan F3

Fraksi Aktif Bobot fraksi Peak/ Puncak Waktu Retensi

F1 0,01 g

1a

2a

3a

23,966

26,289

26,788

F2 0,22 g

1b

2b

3b

4b

23,883

24,527

26,306

26,741

F3 0,03 g

1c

2c

3c

24,407

26,332

26,516

45


Hasil tabel di atas menunjukkan retensi waktu yang sangat berdekatan dan

tidak menghasilkan pemisahan yang sempurna dan masih ada peak kecil yang

tidak terbaca. Setiap puncak grafik mempunyai waktu retensi yang berbeda,

berarti senyawa kimia yang terdapat pada puncak-puncak tersebut mempunyai

sifat yang berbeda satu sama lainnya dan dapat diisolasi guna mendapatkan

senyawa murni dengan menggunakan preparatif HPLC.

Fraksi F1, F2, dan F3 menunjukkan puncak pada menit ke 26. Puncak

pada menit ke 26 diperkirakan adalah senyawa target karena puncak yang

dihasilkan cukup besar, tetapi tidak menutup kemungkinan pada menit ke 23-24

juga merupakan senyawa target namun memiliki peak kecil.

Gambar 4.4 Profil analisis HPLC fraksi aktif F2

Pada gambar diatas menunjukkan puncak yg dominan pada waktu retensi

26,30 menit dengan skala intensitas yang besar. Dilanjutkan fraksi aktif F2 untuk

di fraksinasi dengan preparatif HPLC karena memiliki bobot yang yang lebih

besar dibanding fraksi F1 dan F3. Fraksi yang terkumpul kemudian diinjeksikan

ulang ke dalam sistem HPLC preparatif untuk mencapai kemurnian yang

diinginkan. Fraksinasi menggunakan HPLC peparatif diharapkan mampu

memisahkan semua senyawa yang akan ditampung setiap menitnya.

4.9 Fraksinasi Fraksi Aktif dengan HPLC Preparatif

Pemisahan dengan kinerja tinggi (HPLC Preparatif) memiliki kemampuan

pemisahan yang optimal dan cepat serta produktif dibanding KLT preparatif

konvensional. Menghasilkan kemurnian fraksi yang optimal dan pemisahan yang

sangat selektif pada kolom dengan efisiensi tinggi.

Waktu (min)

Inte

nsi

tas

46


Sampel disuntikan dengan memakai suntikan mikrovolume injeksi 100 μl

melalui septum elastomer. Identifikasi dengan ini, memakai HPLC Shimadzu

ODS (C18) 4,6 mml.D x 250 mm (No.1702072Y), dan detektor UV (254 nm).

Fase gerak yang digunakan adalah 95 % MeOH - 5 % H20 volume 1000 ml dan

laju alir 1 ml/menit selama 30 menit. Senyawa kimia yang terkandung dalam

fraksi F2 yang telah dilarutkan dengan metanol pada konsentrasi 20.000 ppm

kemudian diencerkan sampai 5000 ppm. Senyawa fraksi F2 dipisahkan tiap

menitnya, menghasilkan 30 subfraksi dan volume subfraksi masing-masing 10 ml.

Gambar 4.5 Profil analisis dengan preparatif HPLC fraksi aktif F2

Senyawa yang dibawa eluen akan terpisah setelah melewati kolom dan

terekam pada detektor berupa puncak-puncak grafik. Untuk mendapatkan

senyawa murni maka cairan yang menetes pada saat jarum mulai menggambar

suatu puncak hingga puncak itu berakhir dikumpulkan, kemudian dikeringkan.

Hasil pemisahan fraksi aktif F2 kemudian dilakukan pengujian inhibisinya

terhadap aktivitas enzim PfMQO.

4.10 Pengujian Inhibisi Subfraksi F2 Hasil Pemisahan Preparatif HPLC

Terhadap Aktivitas Enzim PfMQO

Fraksi aktif F2 yang telah dipisahkan menggunakan preparatif HPLC

kembali diuji inhibisnya terhadap aktivitas enzim PfMQO. Sebanyak 100 µl dan

50 µl hasil tampungan preparatif HPLC semuanya diuji didalam “Bioassay plate”

kemudian dikeringkan menggunakan alat konsentrator, dan diuji aktivitas

inhibisinya menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 600 nm selama 10

menit.

Waktu (min)

Inte

nsi

tas

47


Gambar 4.6 Hasil uji inhibisi subfraksi F2 terhadap aktivitas enzim PfMQO

Hasil uji aktivitas inhibisi PfMQO fraksi F2 pada pemisahan menit ke 25 sampai

29 menghasilkan nilai inhibisi lebih dari 50% yang menunjukkan aktif terhadap

PfMQO tabel 4.4.

Tabel 4.4 Hasil uji inhibisi subfraksi F2 terhadap aktivitas enzim PfMQO

Dari hasil isolasi dengan HPLC preparatif tersebut maka didapatkan lima

subfraksi aktif. Hal ini juga dibuktikan dengan hasil profiling HPLC analitik,

dimana pada retensi waktu ke 25 sampai 29 menghasilkan peak yang menumpuk

yang harus dipisahkan menggunakan preparatif HPLC dan kemudian diuji daya

hambatnya.

Hasil penampungan preparatif HPLC subfraksi nomor 25, 26, 27, 28, dan

29 sebanyak 10 ml dikeringkan dengan evaporator dan diperoleh bobot masing-

masing isolat. Bobot isolat fraksi yang diperoleh subfraksi nomor 25 (0,25 mg),

nomor 26 (0,34 mg), nomor 27 (3,98 mg), nomor 28 (1,45 mg), dan nomor 29

(0,89 mg) kemudian dilarutkan dalam 1 ml metanol. Dibuat seri konsentrasi 12,5;

2,5; 1,25; 0,625 ppm. Seri konsentrasi yang dibuat diperoleh dari membandingkan

bobot konsentrasi subfraksi yang terendah yaitu 0,25 mg dengan konsentrasi akhir

pengujian pada volume 10 µl, 2 µl, 1 µl, dan 0,5 µl .

0102030405060708090

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

% In

hib

itio

n

Nomor fraksi

100 ul 50 ul

Nomor fraksi % Inhibisi Terhadap Aktivitas PfMQO

100 µl 50 µl

25’ 87,07 41,73

26’ 57,51 19,89

27’ 106,6 101,1

28’ 104 101,3

29’ 70,61 27,75

48


Fungsi dibuatnya rentan konsentrasi adalah untuk mendapatkan

suatu persamaan regresi linier secara matematika yang nantinya digunakan

untuk menentukan kadar suatu sampel dengan memasukan nilai kedalam

persamaan tersebut. Subfraksi yang telah ditentukan tadi konsentrasinya

dilakukan pengujian inhibisinya terhadap aktivitas PfMQO.

Gambar 4.7 Hasil uji inhibisi subfraksi nomor 25, 26, 27, 28, dan 29 terhadap

aktivitas PfMQO

Hasil uji inhibisi subfraksi nomor 25, 26, 27, 28, dan 29 terhadap aktivitas

enzim PfMQO diatas menghasilkan nilai inhibisi subfraksi nomor 25 (58,83%),

nomor 26 (63,10%), nomor 27 (96%), nomor 28 (94,05%) dan nomor 29

(18,77%). Subfraksi nomor 25 sampai 28 pada konsentrasi 12,5 ppm

menghasilkan nilai inihibisi lebih dari 50% menunjukkan aktif dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO, sedangkan subfraksi nomor 29

menghasilkan nilai inhibisi kurang dari 50% yang menunjukkan tidak aktif dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO. Terhadap subfraksi nomor 25 sampai 28

dilakukan analisis HPLC untuk memantau sidik jari subfraksi apakah sudah

menghasilkan satu peak senyawa

4.11 Analisis Subfraksi Aktif dengan HPLC

Analisis kembali hasil subfraksi aktif dengan HPLC dilakukan untuk

meyakinkan pola/puncak yang dihasilkan sampel, yaitu dengan cara

menginjeksikan kembali subfraksi yang telah diuji inhibisinya kedalam sistem

HPLC. Analisis dilakukan terhadap subfraksi yang menghasilkan nilai inhibisi

lebih dari 50% yaitu subfraksi aktif nomor 25, 26, 27, dan 28.

58,83 63,1

96,34 94,05

18,77

0

50

100

25 26 27 28 29

% In

hib

itio

n

Subfraksi aktif

12,5 ppm 2,5 ppm 1,25 ppm 0,625 ppm

49


Tabel 4.5 Program waktu gradien eluen HPLC untuk subfraksi aktif

Waktu (menit) Eluen Komposisi (%)

0.01 Metanol : Air 95% - 5%

20.00 Metanol 100%

25.00 Metanol 100%

25.50 Metanol : Air 5% - 95%

30.00 Metanol : Air 5% - 95%

30.00 Stop

Hasil kromatogram HPLC subfraksi nomor 26, 27, 28, dan 29 terdapat

pada (lampiran 15). Hasil kromatogram menunjukkan peak/senyawa yang dapat

dipisahkan, namun kromatogram subfraksi nomor 25 dan 26 menunjukkan skala

intensitas yang rendah sehingga lebar peak yang dihasilkan sangat kecil. Pada

hasil kromatogram subfraksi nomor 26 dan 27 menunjukkan peak yang sudah

tunggal namun senyawa yang di dapat belum tunggal. Perlu dilakukan teknik

kromatografi lapis tipis (KLT) analitis untuk mengetahui kandungan senyawa


gelombang 254 nm


gelombang 254 nm

50


Hasil kromatogram subfraksi nomor 27 dan nomor 28 pada konsentrasi

12,5 ppm sudah menunjukkan satu puncak yang tunggal dan dominan pada

masing-masing retensi waktu ke 26,09 menit dan 18,57 menit dengan skala

intensitas yang tinggi. Eluasi pada hasil kromatogram tersebut dilakukan secara

gradien dengan metanol dan air. Eluasi gradien baik digunaan untuk kondisi

pemisahan dengan sampel yang komplek seperti bahan alam yang memiliki

derajat polaritas yang beragam (Sarker et al; 2006). Detektor yang digunakan

adalah detektor PDA yang dapat mendeteksi senyawa organik pada rentang

panjang gelombang 200-600 nm, detektor PDA dapat mendeteksi absorbansi UV-

Vis pada beberapa panjang gelombang sekaligus (Sarker et al; 2006).

51


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 KESIMPULAN

Berdasarkan data penelitian yang telah diperoleh, dapat disimpulkan

sebagai berikut :

1. Ekstraksi kulit batang tanaman asam kandis dengan n-heksan, etil asetat

dan 96% etanol ekstrak masing-masing sebesar 5,7 gram, 43,87 gram,

78,14 gram. Dari ketiga hasil tersebut ekstrak etil asetat memiliki tingkat

inhibisi aktivitas PfMQO sebesar 97,95%.

2. Setelah dilakukan fraksinasi dengan kolom kromatografi, ekstrak etil

asetat diperoleh 8 fraksi. Dari kedelapan fraksi tersebut, fraksi F1, F2, dan

F3 yang menunjukkan tingkat inhibisi lebih dari 50%.

3. Fraksinasi fraksi F2 dengan HPLC preparatif, menghasilkan 30 subfraksi.

Subfraksi nomor 25, 26, 27, 28 menunjukkan tingkat inhibisi lebih dari

50%.

4. Analisis subfraksi aktif no.27 dan no.28 dengan HPLC, menunjukkan

puncak yang tunggal masing-masing pada retensi waktu ke 26,09 menit

dan 18,57 menit.

5.2 SARAN

Perlu dilakukan pemurnian skala besar terhadap subfraksi aktif ekstrak

kulit batang tanaman asam kandis guna memperoleh senyawa murni yang

menghambat aktivitas PfMQO. Pembuktian terhadap senyawa murni yang di

peroleh dapat dilanjutkan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Preparatif, untuk kemudian dielusidasi strukturnya dan diukur tingkat inhibisinya

(IC50).

52


DAFTAR PUSTAKA

A.H, A. A. K. a. L. (2005). Cellular and Molecular Immunology. Fifth Edition.

Elsevier Saunders, Philadelphia.

Abd Majid, R. (2011). Molecular and biochemical pharmacology of mitochondrial

enzymes in the malaria parasite Plasmodium falciparum. Newyork:

EThOS: e-these online service.

Arsin, A. A. (2012). MALARIA DI INDONESIA Tinjauan Aspek Epidemiologi.

Makassar: MASAGENA PRESS.

Baggett, S., Protiva, P., Mazzola, E. P., Yang, H., Ressler, E. T., Basile, M. J., . . .

Kennelly, E. J. (2005). Bioactive Benzophenones from Garcinia x

anthochymus Fruits. Journal of natural products, 68(3), 354-360.

Bates, A. ( 1990). The Natural History of Mosquitoes and Plasmodium

Parasites. New York: Gloucester. Mass. Peter. Smith.

Burke E, D. J., Hasson R. (2003). Antimalarial Drug From Nature. J Trinity

Student Med.

Carter, R., Mendis, K. N., Miller, L. H., Molineaux, L., & Saul, A. (2000).

Malaria transmission-blocking vaccines—how can their development be

supported?

Chang, H., & Tahun, T. (2009). Heme Detoxification in P. falciparum. The

Marletta lab Universityof California, Berkeley.

Ciulei, J. (1984). Metodology for Analysis of vegetable and Drugs. Bucharest

Rumania: Faculty of Pharmacy.

Clark, J. 2007. High Performance Kromatografi Cair-HPLC.

http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.htm . Diakses

tanggal 20 Agustus 201

D.K. Inaoka, Endah DH, Yukiko Miyazaki, Danang Waluyo (2017). Biochemical

Studies of Membrane Bound Plasmodium falciparum Mitochondrial L-

Malate : Quinone Oxidoreductase, a potential drug target. BBA-

Bioenergetics 1859 (2018) 191-200.

Darlina, H. N. E. S., Dita M.E Dan Siti Nurhayati. (2011). Pengaruh Radiasi

Terhadap Pertumbuhan Plasmodium Falciparum Strain Nf54 Stadium

53


Eritrositik Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi -BATAN

Institut Sains dan Teknologi Nasional, Jakarta.

Darwati, D., Anggraeni, A., & Adisumiwi, S. (2016). Santon Dari Kulit Batang

Tumbuhan Asam Kandis (Garcinia cowa). CHEMPUBLISH JOURNAL,

1(1), 25-31.

Depkes, R. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta:

Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan.

Dewick, P. M. (2002). Medicinal natural products: a biosynthetic approach: John

Wiley & Sons.

Doctors and Experts At WebMD 2010. Kamus Kedokteran Webster's New

World. Jakarta: PT Indeks

Finch, R., Moss, P., Jeffries, D., & Anderson, J. (2005). Infectious diseases,

tropical medicine and sexually transmitted diseases. Clinical Medicine,

London, Elsevier Saunders, 19-152.

Gunawan, D., & Mulyani, S. (2004). Ilmu Obat Alam (Farmakognosi). Jilid, 1,

31-34.

Hangjun Ke, Joanne M. Morissey, Suresh M. Ganesan, Heather J. Painter (2011).

Variation Among Plasmodium falciparum Strains in Their Reliance on

Mitochondrial Transport Chain Function : American Society for

Microbiology

Harborne, J. (1987). Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro.

Penerbit ITB, Bandung, 9-71.

Harborne, J. B. (1987). Metode fitokimia." Edisi ke-2. Padmawinata K, Soediro I,

penerjemah. Bandung: Institut Teknologi Bandung.

Harijanto, P. N. (2000). Malaria: Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi klinis

dan Penanganannya. Jakarta: Buku Kedokteran.

iinuma, M., tanaka, T., & riswan, S. (1996). Three new xanthones from the bark

of Garcinia dioica. Chemical and pharmaceutical bulletin, 44(1), 232-234.

Inaoka DK. 2017. Supression of experimental cerebral malaria by disruption of

malate:quinone oxidoreductase. doi 1186/s 12936-017-1898-5

Karmana, O. (2007). Cerdas Belajar Biologi Bandung: Grafindo Media Pratama.

54


Kastianti, N. d. A., Z.Q. (2008). Laporan Penelitian Pengambilan Minyak

Atsiri Kulit Jeruk dengan Metode Ekstraksi Distilasi VakumSemarang:

Jurusan Teknik Kimia Fakultas Teknik Undip.

Kayser, O., A. F. Kiderlen, and S.L. Croft. (2000). Natural Products as

PotentialAntiparasitic Drugswww.fu

berlin.de/akkayscr/antiparasiticsfromnature.pdf.

Kementerian, P. K. P. S. J., & Kesehatan, R. (2010). Bersama kita berantas

malaria. Available online on: http://www. depkes. go. id/index.

php/berita/press-release/1055-bersama-kita-berantas-malaria. html.

Kenji Hikosaka, K. K., Shigeo Suzuki and Kiyoshi Kita. (2015). Mitochondria of

Malaria Parasites as a Drug Target. INTECH, open science, open mind,

Chapter 2.

Lang-Unnasch, N., & Murphy, A. (1998). Metabolic changes of the malaria

parasite during the transition from the human to the mosquito host. Annual

Reviews in Microbiology, 52(1), 561-590.

Larry, J. J. ((1996)). Faoundations of Parasitology. 5th ed.W.M. C. Brown

Publisher, 149151.

Likhitwitayawuid, K., Chanmahasathien, W., Ruangrungsi, N., & Krungkrai, J.

(1998). Xanthones with antimalarial activity from Garcinia dulcis. Planta

medica, 64(03), 281-282.

M.F, W. (2006a). Cellular and Molecular of Plasmodium. (online).

MacRae, J. I., Dixon, M. W., Dearnley, M. K., Chua, H. H., Chambers, J. M.,

Kenny, S., . . . McConville, M. J. (2013). Mitochondrial metabolism of

sexual and asexual blood stages of the malaria parasite Plasmodium

falciparum. BMC biology, 11(1), 67.

Mahabusarakam, W., Chairerk, P., & Taylor, W. (2005). Xanthones from

Garcinia cowa Roxb. latex. Phytochemistry, 66(10), 1148-1153.

Malaria, W. E. C. o., & Organization, W. H. (2000). WHO expert committee on

malaria: twentieth report: World Health Organization.

Muti’ah, R. (2013). PENYAKIT MALARIA DAN MEKANISME KERJA

OBAT-OBAT ANTIMALARIA. ALCHEMY: Journal of Chemistry.

http://www/

55


Panggabean, W. (2010). Karakteristik Penderita Malaria Di Kota Dumai Tahun

2005-2009Universitas Sumatera Utara: Skripsi.FMIPA

Parmet, S. L., C, Glass, R.M. (2007). Malaria. The Journal of the American

Medical Association, CCXCVI (20): 2310.

Prabowo, A. (2004). Malaria ; Mencegah & Mengatasinya. Barito Kuala: Puspa

Swara.

Radloff, P. D., Philips, J., Nkeyi, M., Kremsner, P., & Hutchinson, D. (1996).

Atovaquone and proguanil for Plasmodium falciparum malaria. The

Lancet, 347(9014), 1511-1514.

RI, D. (2009). Pedoman Penatalaksanaan Kasus Malaria di Indonesia.

Departemen Kesehatan, Direktorat Jendral P2PL.

RI, K. (2016). MALARIA. Pusdatin 2016.

Ridley, H. N. (1922). The Flora of the Malay Peninsula, Vol. I. The Flora of the

Malay Peninsula, Vol. I.

Rizani, K. Z. (2000). Pengaruh Konsentrasi Gula Reduksi dan Inokulum

(Saccharomyces cerevisiae) pada Proses Fermentasi Sari Kulit

Nanas (Ananas comosus L.Merr) untuk Produksi Etanol

Malang: Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Universitas Brawijaya.

Russell, P. F. (1983). Practical Malariology. London: Oxford University Press.

Sarker, S.D., Latif, Z., Gray, A.I.,2006. Methods in Biotechnology : Natural

Products Isolation 2nd

. Humana Press Inc.,p. 19-21.

Saxena, S., Pant, N., Jain, D., & Bhakuni, R. (2003). Antimalarial agents from

plant sources. Current Science, 85(9), 1314-1329.

Simamora, D., & Loeki, F. E. (2007). Resistensi Obat Malaria: Mekanisme Dan

Peran Obat Kombinasi Obat Antimalaria Untuk Mencegah: Jurnal

Kedokteran Brawijaya, 23(2): 82-91.

Sjafruddin, D., Siregar, J., & Asih, P. (2004). Antimalarial drug resistance in

Indonesia: A molecular analysis. Symposium of malaria control in

Indonesia. Proceeding. Surabaya: TDC Airlangga University.

Staalsoe, T., Nielsen, M. A., Vestergaard, L. S., Jensen, A. T., Theander, T. G., &

Hviid, L. (2003). In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for

56


expression of variant surface antigens associated with severe malaria in

African children. Parasite immunology, 25(8‐9), 421-427.

Sundari, S. (2001). Pengobatan Malaria Melalui Target Enzim (Vol. 1).

Yogyakarta: Mutiara Medika, FK UMY.

Suryawati, S., & Suprapti, H. (2007). Efek Anti Malaria Ekstrak Brotowali

(Tinospora crispa) Pada Mencit Yang Di Infeksi Plasmodium berghei:

Wijaya Kusuma.

Sutisna, P. (2004). Malaria secara ringkas dari pengetahuan dasar sampai terapan.

EGC. Jakarta.

Syamsudin, S. T. (2007). Invitro and invivo Antiplasmodial activity of stem

bark extract of Garcinia parvifolia Miq (Guttiferae). Internasional

Journal of Tropical Medicine, 22, 41-44.

Syamsudin, S. T., Subagus Wahyuono dan Mustofa (2007). Antiplasmodial

activity of two fractions obtained from n-hexane extract of Garcinia

parvifolia Miq stem bark. Majalah Farmasi Indonesia, 18 (4), 210-215.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., & Kaur, H. (2011). Phytochemical

screening and extraction: a review. Internationale pharmaceutica sciencia,

1(1), 98-106.

Tjitra. (2000). Obat anti-malaria, Dalam : Harijanto PN (editor) Malaria,

Epidem iolo gi, Patogenesis, Manifestasi Klinis, & Penanga nan. Jakarta:

Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Uji, T., Keanekaragaman, persebaran, dan potensi jenis-jenis Garcinia di

Indonesia, Berkala Penelitian Hayati. 2007; 12:129–135.

Unknown. (Dipublikasikan pada 17 Maret 2009. ).

http://clearinghouse.bplhdjabar.go.id/index.php?option=com_content&vie

w=article&id=267%3Aceuri&catid=58%3Acagar-alam-gunung

tilu&Itemid=182&lang=enBalaikliring Kehati Jawa Barat. Ceuri

(Garcinia dioica Blume). .

Vial, H. d. A., M.L. (1994). Reserch of Antimalaria Molecules. Pathol. Biol, 42,

138-144.

http://clearinghouse.bplhdjabar.go.id/

57


Yawan, S. F. (2006). Analisis Faktor Risiko Kejadian Malaria di Wilayah Kerja

Puskesmas Bosnik Kecamatan Biak Timur Kabupaten Biak–Numfor

Papua. program Pascasarjana Universitas Diponegoro.

58


Lampiran 1 Hasil Determinasi Tumbuhan

59


Lampiran 2 Alur kerja penelitian

Ekstraksi kulit batang G.dioica Blume

Fraksinasi dengan Kromatografi

Kolom

Fase diam silika gel 60 F254

250 g. Kolom t:130cm d:4cm

Total penggabungan fraksi

berjumlah 8 berdasarkan hasil

KLT

F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8

Hasil fraksi di uji terhadap daya hambat enzim PfMQO Nilai % inhibisi tertinggi

Fraksi F1 Fraksi

F2

Fraksi F3

Profiling HPLC Analitis

Fraksi F2

Pemisahan dengan HPLC Preparatif

Subfraksi

No 25

Subfraksi

No 26

Subfraksi

No 27

Subfraksi

No 28

Subfraksi

No 29

Uji daya inhibisi terhadap terhadap aktivitas PfMQO

30 subfraksi

Subfraksi

No 25

Subfraksi

No 26

Subfraksi

No 27

Subfraksi

No 28

Profiling HPLC Analitis

menghasilkan

Subfraksi Aktif No 27 Subfraksi Aktif No 28

60


lampiran 3 Bagan alur ekstraksi dari kulit batang Garcinia dioica Blume

2 kg Kulit batang G.

dioica Blume

1 kg serbuk kering Kulit batang

G. dioica Blume

Maserasi dengan 1,4 L n-heksan disaring,

dievaporasi

Ekstrak n-heksan Ampas

Uji terhadap enzim

PfMQO

Maserasi dengan

1,4 L etil asetat

disaring,

dievaporasi

Ekstrak etil asetat

Uji terhadap enzim

PfMQO

Ampas

Maserasi

dengan 2 L

etanol 96%

disaring,

dievaporasi

Ekstrak etanol 96%

Uji terhadap enzim

PfMQO

Ampas

Disortasi, dirajang,

dikeringkan, dihaluskan

dengan blender

61


Lampiran 4 Alur kerja uji aktivitas inhibisi ekstrak dan fraksi

Enzim PfMQO disediakan oleh Balai Bioteknologi –

Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT)

Pembuatan sampel uji dari konsentrasi 10.000 ppm, disediakan dalam

plate sebanyak 50 µl dan dilakukan pengeceran 1x, 10x, 100x, dan 1000x

hingga konsentrasi akhir 100; 10; 1; 0,1 ppm

Pembuatan assay mix yang terdiri dari HEPES, d-ubiquinone,

DCIP, enzim PfMQO dan substrat malate

Penambahan assay mix kedalam plat da dilakukan mixing dengan

kecepatan 1300 rpm selama 30 detik

Pengujian enzim PfMQO dengan menggunakan microplate reader

dengan panjang gelombang 600 nm dengan suhu 37⁰C selama 10

menit

62


Lampiran 5 Alur kerja fraksinasi kolom kromatografi

Disiapkan bahan uji dan kromatografi kolom

Ditimbang silica sebanyak 25 gr lalu dicampurkan dengan n-heksan sampai

terbetuk bubur silica yang dapat dituang kedalam kolom

Dimasukkan kapas kedalam kolom terlebih dahulu kemudian fase padat

sambil diketuk-ketuk sampai terbentuk massa yang padat

Disiapkan fase gerak dengan sistem gradient dengan kepolaran yang berbeda

mulai dari n-heksan 100% sampai dengan etil asetat 100%

Jumlah fase gerak yang disediakan adalah 300 ml

Dilakukan proses elusi mulai dari perbandingan pertama hingga selesai

perbandingan terakhir

Hasil elusi ditampung dengan vial dan diberi nomor secara berurutan

Fraksi yang bernomor ganjil dengan pemantauan KLT

63


Lampiran 6 Alur kerja pemurnian fraksi dengan HPLC analitis

Penyiapan instrumen HPLC

Fase gerak yang digunakan yaitu 5% air : 95% metanol dengan volume

1000 ml dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit

Penyiapan kolom C18 (oktadesil silika)

Penyiapan kulit batang Garcinia dioica Blume dengan konsentrasi

larutan induk 10.000 ppm dan diencerken 2000 ppm

Diinjeksikan sampel kedalam kolom dengan volume 20 µl dan data

dibaca selama 30 menit pada panjang gelombang 254 nm

64


Lampiran 7 Alur kerja pemurnian fraksi dengan HPLC preparatif

Penyiapan instrumen HPLC preparatif

Fase gerak yang digunakan yatu 5% air : 95% metanol dengan volume

1000 ml dengan kecepatan alir 1,0 ml/menit

Penyiapan kolom C18 (oktadesil silika)

Disiapkan bahan uji fraksi dengan konsentrasi 5000 ppm

Diinjeksikan sampel kedalam kolom dengan volume 100 µl dan data

pada panjang gelombang 254 nm

Hasil HPLC preparatif ditampung dengan subfraksi 10 ml selama 30

menit dan diberikan label secara berurutan

65


Lampiran 8 Alur kerja uji aktivitas inhibisi fraksi terhadap enzim PfMQO

Enzim PfMQO disediakan oleh Balai Bioteknologi – Badan Pengkajian dan

Penerapan Teknologi (BPPT)

Disiapkan sampel uji dengan konsentrasi 12,5 ppm, 2,5 ppm, 1,25 ppm dan

0,625 ppm kedalam plat well

Sampel dikeringkan dengan konsentrasi selama 1 jam

Ditambahkan 5 µl DMSO 100% kedalam plat well kemudian diaduk dengan

kecepatan 1300 rpm selama 1200 menit

Penambahan assay mix ke dalam plat dan dilakukan mixing

dengan kecepatan 1300 rpm selama 30 detik

Pengujian enzim PfMQO dengan menggunakan microplate reader

dengan panjang gelombang 600 nm dengan suhu 37⁰C selama 10

menit

66


Lampiran 9 Perhitungan Rendemen Ekstrak

Rumus perhitungan % rendemen

% rendemen ekstrak =

Ekstrak Bobot ekstrak Perhitungan % rendemen

n-heksan 5,7 gram =

Etil asetat 43,87 gram =

96% etanol 78,14 gram =

67


Lampiran 10 Perhitungan pengenceran konsentrasi ekstrak dan fraksi pengujian

inhibisi aktivitas enzim PfMQO

Ekstrak dan fraksi hasil kolom kromatografi ditimbang dan dilarutkan kembali

dengan DMSO dan dibuat larutan stock dengan konsentrasi 10.000 ppm

V1.C1 = V2.C2

Ket V1 = Volume yang diambil dari larutan stock

M1 = Konsentrasi larutan stock

V2 = Volume yang akan dibuat

M2 = Konsentrasi yang akan dibuat

Maka perhitungan pengenceran sebagai berikut :

a. Pembuatan larutan induk 10.000 ppm

X =

=

= 10.000 ppm

b. Pengenceran 1x, 10x, 100x, 1000x dari larutan induk 10.000 ppm

Pengenceran 1 x Pengenceran 10 x

V1.M1 = V2.M2 V1.M1 = V2.M2

2 µl. 10.000 ppm = 200 µl. M2 2 µl. 1000 ppm = 200 µl. M2

M2 = 100 ppm M2 = 100 ppm

Pengenceran 100 x Pengenceran 1000 x

V1.M1 = V2.M2 V1.M1 = V2.M2

2 µl. 100 ppm = 200 µl. M2 2 µl. 10 ppm = 200 µl. M2

M2 = 1 ppm M2 = 0,1 ppm

68


Lampiran 11 Perhitungan Penggunaan Assay Mix

No Volume Bahan Konsentrasi

Awal

Konsentrasi

Akhir

1 20 ml HEPES 50 mM 50 mM

2 20 µl KCN 1 M 1 mM

3 8,3 µl d-UQ 60 mM 25 µM

4 200 µl DCIP 12 mM 120 µM

5 3,1 µl PfMQO

membrane

2,778 µg/ml 0,43 mg/ml

6 4 µl Substrat Malate *ditambahkan setelah

bahan 1-5 dilakukan

pembacaan background

selama 5 menit

400 mM 10 mM

Hepes 20 ml, Konsentrasi 50 mM

20.000 µl . 50 mM = 20.000 µl . C2

C2 = 50 mM

KCN 20 µl , Konsentrasi 1 M

20 µl . 1000 mM = 20.000 µl . C2

C2 = 20.000 µl.mM

20.000 µl

C2 = 1 mM

d-UQ 8,3 µl , Konsentrasi 60 mM

8,3 µl . 60 mM = 20.000 µl . C2

C2 = 498 µl.mM

20.000 µl

C2 = 24,9 µM

DCIP 200 µl , Konsentrasi 12 mM

200 µl . 12 mM = 20.000 µl . C2

C2 = 2400 µl.mM

20.000 µl

C2 = 120 µM

PfMQO 3,1 µl , Konsentrasi 2,778

µg/ml

3,1 µl . 2,778 µg/ml = 20.000 µl . C2

C2 = 8,6118 µl.µg/ml

20.000 µl

C2 = 0,43 mg/ml

Malate 5 µl , Konsentrasi 400 mM

500 µl . 400 mM = 20.000 µl . C2

C2 = 200.000 µl.mM

20.000 µl

C2 = 10 mM

Keterangan :

1. Seluruh bahan yang disiapkan berjumlah 20,231 ml (20.000,231 µl)

dibulatkan menjadi 20.000 µl untuk 1 well plate dengan masing-masing

sumuran 200 µl

69


Lampiran 12 Perhitungan jumlah ekstrak dan fraksi pada pengujan inhibisi

aktivitas enzim PfMQO

1. Perhitungan jumlah ekstrak dan fraksi pada pengujan inhibisi aktivitas

enzim PfMQO

C = m

V

Pengenceran 1 x

Dik C = 10.000 µg/ml

V = 2 µl = 0,002 ml

Dit m = ....?

m = 10.000 µg/ml x 0,002 ml = 20

µg

Pengenceran 10 x

Dik C = 1.000 µg/ml

V = 2 µl = 0,002 ml

Dit m = ....?

m = 1.000 µg/ml x 0,002 ml = 2 µg

Pengenceran 100 x

Diketahui C = 100 µg/ml

V = 2 µl = 0,002 ml

Ditanya m = ....?

m = 100 µg/ml x 0,002 ml = 0,2 µg

Pengenceran 1000 x

Diketahui C = 10 µg/ml

V = 2 µl = 0,002 ml

Ditanya m = ....?

m = 10 µg/ml x 0,002 ml = 0,02 µg

2. Perhitungan konsentrasi dan bobot subfraksi pada pengujan inhibisi


V1.C1 = V2.C2

Volume 10 µl, Konsetrasi 250

µg/ml

10 µl x 250 µg/ml = 200 µl x C2

C2 = 12,5 µg/ml

Volume 2 µl, Konsetrasi 250 µg/ml

2 µl x 250 µg/ml = 200 µl x C2

C2 = 2,5 µg/ml

Volume 1 µl, Konsetrasi 250

µg/ml

1 µl x 250µg/ml = 200 µl x M2

C2 = 1,25 µg/ml

Volume 0,5 µl, Konsetrasi 250

µg/ml

0,5 µl x 250µg/ml = 200 µl x C2

C2 = 0,625 µg/ml

70


3. Perhitungan jumlah ekstrak dalam subfraksi pada pengujan inhibisi


Volume fraksi 10 µl Diketahui :

C = 250 µg/ml

V = 10 µl = 0,01 ml

m = ..?

m = 250 µg/ml x 0,01 ml = 2,5 µg


C = 250 µg/ml

V = 2 µl = 0,002 ml

m = ..?

m = 250 µg/ml x 0,002 ml = 0,5 µg


C = 250 µg/ml

V = 1 µl = 0,001 ml

m = ..?

m = 250 µg/ml x 0,001 ml = 0,25 µg

Volume fraksi 0,5 µl Diketahui :

C = 250 µg/ml

V = 0,5 µl = 0,0005 ml

m = ..?

m = 250 µg/ml x 0,0005 ml = 0,125 µg

71


Lampiran 13 Pembuatan seri konsentrasi dari subfraksi aktif F2 pada pengujan

inhibisi aktivitas enzim PfMQO

Bobot subfraksi yang diperoleh, masing-masing dilarutkan dalam 1 ml metanol

Seri konsentrasi yang dibuat diperoleh dari membandingkan bobot konsentrasi

subfraksi yang terendah yaitu 0,25 mg dengan konsentrasi akhir pengujian.

V1.C1 = V2.C2

Volume pengenceran 10 µl

10 µl . 250 µg/ml = 200 µl . C2

C2 = 2500 µg/ml.ml

200 µl

C2 = 12,5 ppm


2 µl . 250 µg/ml = 200 µl . C2

C2 = 500 µg/ml.ml

200 µl

C2 = 2,5 ppm


1 µl . 250 µg/ml = 200 µl . C2

C2 = 250 µg/ml.ml

200 µl

C2 = 1,25 ppm

Volume pengenceran 0,5 µl

0,5 µl . 250 µg/ml = 200 µl . C2

C2 = 125 µg/ml.ml

200 µl

C2 = 0,625 ppm

Nomor fraksi Bobot Konsentrasi

25 0,25 mg 250 µg/ml

26 0,34 mg 340 µg/ml

27 3,98 mg 3980 µg/ml

28 1,45 mg 1450 µg/ml

29 0,89 mg 890 µg/ml

72


Lampiran 14 Penyiapan sampel uji HPLC

HPLC Preparatif

1. Dibuat larutan induk 20.000 ppm (20 mg ekstrak dalam 1 ml metanol)

(20.000 ppm)

2. Pengenceran menjadi 5000 ppm

HPLC analitis

1. Dibuat larutan induk 10.000 ppm (10 mg ekstrak dalam 1 ml metanol)

(10.000 ppm)

2. Dibuat seri konsentrasi 1000, 2000, dan 5000 ppm

73


Lampiran 15 Profil HPLC Fraksi Aktif Etil Asetat Garcinia dioica Blume

Keterangan :

1) Hasil profiling dengan HPLC terhadap fraksi F1, F2, dan F3

menunjukkan puncak yang tunggal pada retensi waktu ke 26 menit.

2) Terlihat pada ketiga fraksi menunjukkan pola kromatogram yang mirip

sehingga, fraksi F2 saja yang dilanjutkkan untuk di fraksinasi dengan

preparatif HPLC karena memiliki bobot fraksi yang lebih besar

dibanding fraksi F2 dan fraksi F3

1. Sampel : Fraksi F1 (2000 ppm)



74


Lampiran 16 Hasil analisis HPLC subfraksi aktif hasil uji inhibisi dalam

menghambat aktivitas PfMQO

1. Sampel : Subfraksi aktif nomor 25 (5000 ppm)




Keterangan :

1. Fraksinasi dengan preparatif HPLC menunjukkan subfraksi aktif

No 25, 26, 27, dan 28 yang menghasilkan daya inhibisi terhadap aktivitas

enzim PfMQO lebih dari 50%.

2. Profiling dengan HPLC analitis terhadap subfraksi aktif no 27 dan 28

menunnjukkan puncak yang tunggal dengan skala intensitas yang besar.

75


Lampiran 17 Hasil uji inhibisi ekstrak kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO

Perhitungan aktivitas inhibisi enzim PfMQO

Ekstrak Kons

(µg/ml)

Abs

Sampel

Abs

kontrol

(-)

Abs

kontrol

(+)

%

Inhibisi

Rata2 %

inhibisi

Etil

asetat

100 ppm 0,00 -0,67 -0,01 101,59

101,61 0,00 -0,64 -0,00 101,64

10 ppm -0,02 -0,69 -0,00 96,83

94,54 -0,04 -0,66 -0,00 92,25

1 ppm -0,57 -0,68 -0,01 15,18

14,24 -0,59 -0,68 -0,00 13,31

0,1 ppm -0,67 -0,68 -0,02 2,73

-0,19 -0,64 -0,62 -0,00 -3,11

n-

heksan

100 ppm -0,11 -0,58 -0,00 79,39

80,3 -0,11 -0,58 -0,00 81,21

10 ppm -0,39 -0,63 -0,00 39,03

58,76 -0,37 -0,61 100E-04 39,47

1 ppm -0,59 -0,63 -0,00 6,25

9,35 -0,58 -0,62 -0,01 6,21

0,1 ppm -0,61 -0,62 -0,00 1,86

2,99 -0,59 -0,60 -0,00 2,26

96%

etanol

100 ppm -0,06 -0,58 -0,00 88,40

89,73 -0,05 -0,58 -0,00 91,06

10 ppm -0,12 -0,63 -0,00 81,11

80,80 -0,12 -0,61 100E-04 80,50

1 ppm -0,42 -0,63 -0,00 32,42

31,24 -0,44 -0,62 -0,01 30,06

0,1 ppm -0,6 -0,62 -0,00 3,29

2,14 -0,6 -0,60 -0,00 1,00

x 100%

76


Lampiran 18 Hasil uji inhibisi fraksi kulit batang G. dioica Blume dalam menghambat aktivitas enzim PfMQO

Fraksi Konsentrasi Abs

Sampel

Abs

kontrol

(-)

Abs

kontrol

(+)

%

Inhibisi

Fraksi Konsentrasi Abs

Sampel

Abs

kontrol

(-)

Abs

kontrol

(+)

%

Inhibisi

F1

100 ppm 0,04 -0,65 -0,00 108,19

F2

100 ppm 0,04 -0,65 -0,00 108,12

10 ppm -0,005 -0,68 -0,00 98,98 10 ppm -0,009 -0,68 -0,00 97,95

1 ppm -0,53 -0,68 -0,00 21,73 1 ppm -0,53 -0,68 -0,00 22,07

0,1 ppm -0,68 -0,65 -0,01 -0,64 0,1 ppm -0,60 -0,65 -0,01 7,34

F3

100 ppm 0,04 -0,65 -0,00 108,98

F4

100 ppm -0,23 -0,96 0,00 75,07

10 ppm -0,012 -0,68 -0,00 97,95 10 ppm -0,56 -0,96 -0,00 8,39

1 ppm -0,48 -0,68 -0,00 29,77 1 ppm -0,88 -0,94 -0,00 1,57

0,1 ppm -0,64 -0,65 -0,01 2,02 0,1 ppm -0,90 -0,94 -0,00 0,005

F5

100 ppm -0,58 -0,96 0,00 38,86

F6

100 ppm -0,99 -0,91 -0,01 -9,11

10 ppm -0,75 -0,96 -0,00 2,62 10 ppm -0,923 -0,90 -0,004 -1,51

1 ppm -0,93 -0,94 -0,00 0,37 1 ppm -0,927 -0,91 -0,00 -1,21

0,1 ppm -0,94 -0,94 -0,00 -0,45 0,1 ppm -0,919 -0,91 -0,002 -0,614

F7

100 ppm -0,05 -0,91 -0,01 5,02

F8

100 ppm -0,958 -0,91 -0,01 -4,86

10 ppm -0,95 -0,90 -0,004 -4,72 10 ppm -0,925 -0,90 -0,004 -1,70

1 ppm -0,93 -0,91 -0,00 -1,62 1 ppm -0,930 -0,91 -0,00 -1,48

0,1 ppm -0,91 -0,91 -0,002 -0,28 0,1 ppm -0,921 -0,91 -0,002 -0,77

77


Lampiran 19 Hasil uji inhibisi subfraksi kulit batang G. dioica Blume dalam

menghambat aktivitas enzim PfMQO (Pengujian 1)

Subfraksi Volume Abs Sampel

Abs kontrol

(-)

Abs kontrol

(+)

% Inhibisi

Nomor 25 100 µl -0,099 -0,707 -0,003 87,07

50 µl -0,427 -0,749 -0,002 41,73

Nomor 26 100 µl -0,313 -0,707 -0,003 57,51

50 µl -0,585 -0,749 -0,002 19,90

Nomor 27 100 µl 0,042 -0,707 -0,003 106,61

50 µl 0,003 -0,749 -0,002 101,16

Nomor 28 100 µl 0,023 -0,707 -0,003 104,02

50 µl 0,004 -0,749 -0,002 101,3

Nomor 29 100 µl -0,218 -0,707 -0,003 70,61

50 µl -0,002 -0,749 -0,002 27,75

78


Lampiran 20 Hasil uji inhibisi subfraksi aktif kulit batang G. dioica Blume dalam menghambat aktivitas enzim PfMQO

(Pengujian 2)

Subfraksi Kons Abs

Sampel

Abs

kontrol

(-)

Abs

kontrol

(+)

%

Inhibisi

Subfraksi Kons Abs

Sampel

Abs

kontrol

(-)

Abs

kontrol

(+)

%

Inhi

bisi

Nomor 25

12,5 ppm -0,34 -0,86 -0,00 58,83

Nomor 28

12,5 ppm -0,05 -0,86 -0,00 94,05

2,5 ppm -0,72 -0,80 -0,00 12,80 2,5 ppm -0,65 -0,80 -0,00 22,14

1,25 ppm -0,73 -0,80 -0,00 11,94 1,25 ppm -0,70 -0,80 -0,00 15,23

0,625 ppm -0,78 -0,82 -0,01 6,28 0,625 ppm -0,78 -0,82 -0,01 5,70

Nomor 26

12,5 ppm -0,31 -0,86 -0,00 63,10

Nomor 29

12,5 ppm -0,67 -0,86 -0,00 18,77

2,5 ppm -0,755 -0,80 -0,00 9,57 2,5 ppm -0,78 -0,80 -0,00 5,67

1,25 ppm -0,757 -0,80 -0,00 9,24 1,25 ppm -0,77 -0,80 -0,00 6,85

0,625 ppm -0,792 -0,82 -0,01 5,09 0,625 ppm -0,79 -0,82 -0,01 5

Nomor 27

12,5 ppm -0,03 -0,86 -0,00 96,34

2,5 ppm -0,39 -0,80 -0,00 52,85

1,25 ppm -0,48 -0,80 -0,00 42,08

0,625 ppm -0,71 -0,82 -0,01 13,95

uin syarif hidayatullah jakarta -...

Documents