tugas uji preklinik- metode uji antimikroba- amelia febriani (1206179170)

Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

2013

TUGAS

Mata Kuliah

UJI PREKLINIK

METODE UJI ANTIMIKROBA

OBAT HERBAL

Oleh :

AMELIA FEBRIANI

1206179170

Program Magister HerbalFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Universitas Indonesia 2012 / 2013

1 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170


2013

METODE UJI ANTIMIKROBA OBAT HERBAL

I. PENGERTIAN

Antimikroba adalah senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme atau

membunuh mikroorganisme, khususnya mikroorganisme yang merugikan manusia.

Mikroorganisme adalah setiap organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop yaitu

protozoa, bakteri, jamur, dan virus adalah contoh dari mikroorganisme.

Berdasarkan sifat toksisitas selektif , ada anti mikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan

mikroba , dikenal sebagai aktifitas bakteriostatik dan ada yang bersifat membunuh mikroba ,

dikenal sebagai aktivitas bakterisid.

Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti bahwa suatu obat

berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang. Seringkali, toksisitas selektif lebih

bersifat relatif dan bukan absolut; ini berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu

dapat ditoleransi oleh inang, dapat merusak parasit.

Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut:

a. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat pertumbuhan

mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic)

b. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme pathogen

c. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada host, seperti reaksi

alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan sebagainya

d. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti flora usus atau

flora kulit.

II. MEKANISME



2013

Keefektifan penghambatan merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu senyawa antimikroba

pada obat herbal. Semakin kuat penghambatannya semakin efektif digunakan. Kerusakan yang

ditimbulkan komponen antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau

mikrostatik (kerusakan sementara yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat

mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang digunakan.

Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikroba dapat disebabkan oleh

beberapa faktor, antara lain:

1. Gangguan pada senyawa penyusun dinding sel,

2. Peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan kehilangan

komponen penyusun sel,

3. Menginaktivasi enzim, dan

4. Destruksi atau kerusakan fungsi material genetik.

1. Menggangu pembentukan dinding sel

Mekanisme ini disebabkan karena adanya akumulasi komponen lipofilat yang terdapat pada

dinding atau membran sel sehingga menyebabkan perubahan komposisi penyusun dinding

sel. Terjadinya akumulasi senyawa antimikroba dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi.

Pada konsentrasi rendah molekul-molekul phenol yang terdapat pada minyak thyme

kebanyakan berbentuk tak terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat mengikat daerah hidrofobik

membran protein, dan dapat melarut baik pada fase lipid dari membran bakteri.

Beberapa laporan juga meyebutkan bahwa efek penghambatan senyawa antimikroba lebih

efektif terhadap bakteri Gram positif daripada dengan bakteri Gram negatif. Hal ini

disebabkan perbedaan komponen penyusun dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut.

Pada bakteri Gram posiitif 90 persen dinding selnya terdiri atas lapisan peptidoglikan,

selebihnya adalah asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya

mengandung 5-20 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein, lipopolisakarida, dan

lipoprotein.

2. Bereaksi dengan membran sel



2013

Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas membran sitoplasma,

yang dapat mengakibatkan kebocoran materi intraseluler, seperti senyawa phenol dapat

mengakibatkan lisis sel dan meyebabkan deaturasi protein, menghambat pembentukan

protein sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada membran sel.

3. Menginaktivasi enzim

Mekanisme yang terjadi menunjukkan bahwa kerja enzim akan terganggu dalam

mempertahankan kelangsungan aktivitas mikroba, sehingga mengakibatkan enzim akan

memerlukan energi dalam jumlah besar untuk mempertahankan kelangsungan aktivitasnya.

Akibatknya energi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan menjadi berkurang sehingga

aktivitas mikroba menjadi terhambat atau jika kondisi ini berlangsung lama akan

mengakibatkan pertumbuhan mikroba terhenti (inaktif).

Efek senyawa antimikroba dapat menghambat kerja enzim jika mempunyai spesifitas yang

sama antara ikatan komplek yang menyusun struktur enzim dengan komponen senyawa

antimikroba.

4. Menginaktivasi fungsi material genetik

Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (RNA dan DNA),

menyebabkan terganggunya transfer informasi genetik yang selanjutnya akan menginaktivasi

atau merusak materi genetik sehingga terganggunya proses pembelahan sel untuk

pembiakan

III. KOMPONEN-KOMPONEN ANTIMIKROBA TUMBUHAN

Komponen antimikroba adalah suatu komponen yang bersifat dapat menghambat

pertumbuhan bakteri atau kapang (bakteristatik atau fungistatik) atau membunuh bakteri

atau kapang (bakterisidal atau fungisidal). Zat aktif yang terkandung dalam berbagai jenis

ekstrak tumbuhan diketahui dapat menghambat beberapa mikroba patogen maupun

perusak makanan. Zat aktif tersebut dapat berasal dari bagian tumbuhan seperti biji, buah,

rimpang, batang, daun, dan umbi.



2013

Komponen aktif yang terdapat pada bawang putih mempunyai efek penghambatan

terhadap beberapa mikroba patogen seperti Staphylococcus aureus, E. coli, dan Bacillus

cereus dan menghambat produksi toksin dari Clostridium botulinum tipe A dengan

menurunkan produksi toksinnya sebanyak 3 log cycle.

C. Botulinum adalah bakteri berspora yang dapat memproduksi toksin pada kondisi yang

memungkinkan, dapat dihambat pertumbuhannya oleh minyak bunga dan biji pala, minyak

daun salam, minyak lada hitam dan lada putih dengan konsentrasi 125 ppm. Laporan lain

juga menyebutkan bahwa ekstrak minyak lada dapat menghambat pertumbuhan S. aureus,

E. coli, dan Candida albicans.

Komponen aktif yang terdapat pada minyak thyme diantaranya thymol, carvacrol, (ro)-

cymene, dan (gamma)-terpiene diketahui mempunyai efek sebangai senyawa antimikroba

terhadapa pertumbuhan bakteri. Bakteri-bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya

antara lain Salmonella sp., S. aureus, E. coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni,

dan B. cereus. Dari laporan tersebut dapat juga diperoleh informasi bahwa bakteri gram

positif lebih sensitif dibanding dengan bakteri gram negatif.

Efek penghambatan senyawa antimikroba dari rempah-rempah tidak hanya dapat

menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi dapat juga menghambat pertumbuhan khamir

seperti Candida albican dan Sacharomyces cerevisiae. Komponen-komponen aktif pada

minyak thyme, minyak sage, minyak rosemary, minyak cumin, minyak caraway, dan minyak

cengkeh dapat menghambat khamir dengan konsentrasi 0,5-2.0 (mg/mL).

Bakteri dalam bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding dalam bentuk sporanya, hal ini

dibuktikan oleh Ultee et al. (1998) yang meneliti efek penghambatan komponen carvacrol

yang terdapat pada minyak thyme dan oregano terhadap pertumbuhan bakteri B. cereus.

Pada konsentrasi 1,75 mmol/L bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding bentuk sporanya.

Hal ini disebabkan struktur spora yang lebih komplek dibanding bentuk sel vegetatif, seperti

adanya komponen asam dipikolinat yang dapat melindungi spora terhadap gangguan faktor

lingkungan (suhu dan pH ekstrim). Lebih lanjut Ultee et al. (1998) menyebutkan bahwa

pada konsentrasi 1.75 mmol/L dapat mneghambat kecepatan pertumbuhan B. cereus



2013

sehingga fase lag diperpanjang. Semakin lama fase lag maka aktivitas B. cereus sebagai

penyebab kerusakan bahan pangan dapat dicegah.

Komponen-komponen antimikroba yang terdapat pada minyak cengkeh, minyak kayu

manis, minyak oregano, minyak thyme, minyak bawang putih, dan bawang merah dapat

menghambat spesies kapang diantaranya adalah Aspergillus flavus, A. parasiticus, A.

versicolor, A. ochraceus, Candida sp., Crytococcus sp., Rhodotorulla sp., Torulopsis sp., dan

Tricosporon sp.

Kapang adalah mikroorganisme penyebab kerusakan bahan pangan terutama biji-bijian dan

produk tepung-tepungan dengan kadar air rendah. Beberapa spesies kapang dapat

menghasilkan toksin (mikotoksin) adalah Aspergillus sp., Penicllium sp., dan Fusarium sp.,

yang dapat menghasilkan aflatoksin, patulin, okratoksin, zearalenon, dan okratoksin. —

(bersambung).

IV. UJI AKTIVITAS dan POTENSI ANTIMIKROBA

Potensi antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau

membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg

Prinsipnya yaitu membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap percobaan dalam

kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji. Baku standar yang

digunakan adalah zat/senyawa yg sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya.

Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui metode turbidimetri

(dilusi) dan metode difusi agar. Caranya sama dengan penentuan potensi antibiotika, tetapi

hanya 1 dosis, umumnya 50%.

Perbedaannya :

uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya aktivitas atau mencari

aktivitas antimikroba terbaik dari suatu kelompok bahan

Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan prosentase kekuatan suatu

antibiotika terhadap antibiotika pembanding dari jenis yang sama



2013

Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan bila terpenuhi

tiga syarat, yaitu:

a) Ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel mikroorganisme,

b) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme dapat tumbuh saat

tidak ada bahan antimikroba, dan

c) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme (Hostettmann, 1991).

Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja, cara kerja dan ditentukan pula oleh

konsentrasi hambat minimum (KHM). Konsentrasi Hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi

minimum dari suatu zat yang mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme.

Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara yaitu

a) Cara cair

Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat menghambat

pertumbuhan bakteri atau jamur dengan pengenceran tertentu kemudian diinokulasikan

biakan bakteri atau jamur dalam jumlah yang sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan

atau kekeruhan pada tabung setelah diinkubasi.

b) Cara padat

Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan zat uji dengan

berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri dapat digores lebih dari satu jenis

mikroba untuk memperoleh nilai KHM.

Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas antimikroba dimana

masing-masing metode memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode-metode yang digunakan

antara lain metode difusi, metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun,

perlu diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat pertama

dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya. Preparasi sampel uji

(ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat



2013

dilakukan dengan menggunakan pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi

dengan bahan surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada

metode difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair (dalam tabung).

Dispersi air yang mengandung pendispersi dengan berat molekul (BM) yang tinggi (>100.000)

harus dihindari dalam metode difusi karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam

media agar 1% (Hostettmann, 1991).

V. METODE UJI ANTIMIKROBA

Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan

efisien. Terdapat macam–macam metode uji antimikroba seperti berikut:

1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods)

Prinsip metode difusi uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas daerah hambatan

pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri dari titik awal pemberian kedaerah

difusi. Metode difusi-agar cakram kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan

untuk menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi. Dalam

metode ini, ada beberapa cara yaitu cara Kirby Bauer, cara sumuran dan cara pour plate.

1) Metode Kirby-Bauer

Untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba

diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi

pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan

pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media agar.



2013

Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer :

1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai. Celupkan cotton bud

(cotton swab) dalam biakan bakteri kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar

air tiris. Bakteri ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi pada

suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan menumbuhkan

bakteri pada media cair Natrium Klorida fisiologis dan diinkubasi pada suhu

370C

2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar secara merata

Biarkan cawan selama 5 menit.



2013

3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan konsentrasi

tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris, selanjutnya letakkan kertas

cakram pada permukaan agar. Kertas cakram ditekan menggunakan pinset

supaya menempel sempurna di permukaan agar.

4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.



2013

5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di sekitar cakram,

lubang, atau cangkir agar yang tidak ditumbuhi miroba.



2013

6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong, kemudian

bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik. Makin besar diameter

hambatan pertumbuhan tersebut berarti aktivitas bahan yang diuji (obat

herbal) terhadap mikroba makin baik.



2013

Tabel 1. Tabel Standar Sensitifitas Antibiotik

Faktor yang mempengaruhi metode difusi agar (Kirby-Bauer):

a. Ingredien / komposisi medium pertumbuhan

-Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi pertumbuhan mo

adalah ; pepton, tripton, ekstrak ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl,

KH)

-NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida dan menahan

aktivitas ferosidin

-KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas nitrofurantoin atau

ampisilin



2013

b. Pemilihan medium pertumbuhan

- Pemilihan medium pertumbuhan; dimana diperlukan persiapan medium

yg cocok bagi pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan konstituen

harus merata pada medium agar

- Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan oleh aktivitas

antibiotik yg tergantung pada pH medium. Misalnya aktivitas

aminoglikosida diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin

dalam suasana basa

- Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn

menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH

0,1N

c. Pengaruh pH

Perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan perbedaan jumlah

zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan jumlah molekul zat uji yang

mengion. Selain itu pH berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri.

d. Ukuran inokulum

- Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.

- Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum semakin besar

kandungan mikroorganismenya.

- Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan mikroorganismenya

homogen, misal 1-10%

- Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan terjadinya

penumpukan pada tempat tertentu



2013

e. Stabilitas mikroba uji

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi dalam kondisi

pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan

secara periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.

f. Aktivitas antibiotika

Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu penetapan,

terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat minimum (KHM) dari

antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi

sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian

larutan antibiotik ke dalam medium agar

g. Waktu inkubasi

Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal, sehingga

keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat

menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk pengukuran zona bening

yang muncul sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya

antara 18-24 jam

Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat antimikroba suatu

zat sehingga metode ini tidak menjamin diidentifikasinya bahan pembunuh

antimikroba yang efektif untuk terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan

adanya perbedaan kecepatan difusi dari senyawa antimikroba yang dipengaruhi berat

molekulnya. Ukuran zona untuk suatu zat dapat dibandingkan dengan standar,

asalkan perbenihan, ukuran inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal

ini memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat minimum yang

menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba. Pada pengukuran standar seperti

konsentrasi antimikroba berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa

digunakan untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive, susceptible),

cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan resisten (resistant.) Nilai kadar



2013

hambat minimum (KHM) berbanding terbalik secara proporsional (linear) dengan

diameter zona hambat (Bauer et al., 1966)

2). Metode E- test

Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi yang disebut E-test

(Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik yang mengandung gradien

konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak nilai konsentrasi yang memungkinkan

secara langsung membaca konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk

menghambat pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan

menunjukkan KHM untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik yang diujikan.

Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test

Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like growth, non-mycelial

growth) biasanya ditanam secara usapan atau gores-coret (agar surface streak)

Penanaman jamur berfilamen yang tumbuh tidak merata pada media menggunakan

teknik gores silang



2013

3). Metode Ditch – plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal) yang diletakkan

pada parit yang dibuat dengan cara memotong pada media agar dalam cawan petri

pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam)

digoreskan kea rah parit yang berisi agen antimikroba

4). Metode Cup – plate technique (Metode sumuran)

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat sumur pada media

agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi

agen antimikroba (obat herbal) yang akan diuji

5). Metode Gradient – plate technique

Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoritis

bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan.

Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan di letakkan dalam posisi

miring. Nutrisi kedua selanjutnya ditung di atasnya.

Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan

permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah

mulai dari kosentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total

pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di bandingkan dengan

panjang pertumbuhan hasil goresan

2. Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods)

Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa zat antimikroba

secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal. Metode ini memungkinkan

dilakukannya uji kedua untuk menilai daya antimikroba suatu zat . Kegunaan dari metode



2013

dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah

yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang menunjukkan

hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh kejernihan media merupakan

KHM. Data sifat kimia fisika dan data aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik

dengan uji regresi liner dan non linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi

antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu inokulum

terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat

(solid dilution).

1). Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution)

Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar hambat

minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration atau kadar bunuh

minimum, KBM).

Cara kerja metode dilusi cair:

1. Buat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada medium cair yang di

tambahkan dengan mikroba uji. Cara pengenceran dilakukan dalam tabung dengan

mengencerkan bahan uji (obat herbal) dengan media cair menjadi kelipatan dua

secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi dengan kelipatan setengahnya

2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam pada temperatur

36-37oC dan kemudian diamati hambatan pertumbuhan mikroba dengan

membandingkan kekeruhan atau pertumbuhannya dengan kontrol yang

mengandung media.

3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya

pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM.

4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada

media cair tanpa penambahan pada mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan

diinkubasi selama 18–24 jam.

5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM



2013

2). Metode dilusi padat (solid dilution tes )

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid).

Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen antimikroba yang diuji dapat

digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.

Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena sebagian besar jamur

tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti

ragi (yeast-like growth). Jamur yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al.,

1966).

3. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)

Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau senyawa yang belum

diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi kontak menggunakan prinsip difusi

senyawa yang terpisah dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas

(KK). Lempeng kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi

dengan mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan, diinkubasi dan diamati,

senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam lapisan agar dan menghambat pertumbuhan

mikroba. Pada bioautografi langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada

lempeng kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi mikroba

dalam media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan waktu yang sesuai. Sedangkan

metode bioautografi pencelupan dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke

dalam media dan media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian diinkubasi

dan daerah hambatannya diamati.



2013

4. Metode metode lain

Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas senyawa kemoterapi yaitu:

a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)

Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien yang sedang

menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba (bakteri) kemudian ditambahkan

pada serum pasien. Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum setelah inkubasi

mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.

b. Metode otomatis (automated method).

Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang dapat

mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan kepekaannya terhadap

berbagai senyawa antimikroba.

5. Metode Gores Silang (Uji Antifungi)

Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku untuk menguji

aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur T. mentagrophytes (Anonim,

1993).

Cara kerja metode gores silang:

1. Celupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan di atas lempeng

agar yang telah digores dengan inokulum jamur.

2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.

3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur diukur sebagai zona

hambat.

4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan untuk antijamur

pembanding.



2013

DAFTAR PUSTAKA

Ultee A, Gorris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol toward the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol: 213-218

Corner, DE. 1995. Naturally occuring compounds in Antimicrobial in Food. Eds., by Davidson PM & Branen AL, Eds. Marcell Dekker, Inc., New York, pp. 441-468.

Palmer, SA., Stewart J., Fyfe, L. 1998. Antimikrobial properties of plant essential oils and essences againts five important food-borne pathogen. Letters Appl. Microbiol. 26: 118-122.

Ting, EWT & Deibel, KE. 1992. Sensitivity of Listeria monocytogenes to spices at two temperature. J. Food Safety 12: 19-137.

Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in Plant Biochemistry Vol 6

Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):493-6.

Rostinawati T, 2009. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Agar. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran , Jatinangor



2013


tugas uji preklinik- metode uji antimikroba- amelia febriani (1206179170)

Documents