Uji PreklinikUji Preklinik Dr. Lili Indrawati, MKesDr. Lili Indrawati, MKes

Uji Manfaat PreklinikUji Manfaat Preklinik

Pengujian sebelum pada manusiaPengujian sebelum pada manusia

In vitroIn vitro

Ex vivoEx vivo

In vivo pd hewan cobaIn vivo pd hewan coba

Bila diperkirakan bermanfaat pada Bila diperkirakan bermanfaat pada penelitian in vitro, dan atau ex vivo penelitian in vitro, dan atau ex vivo baru dilakukan penelitian in vivo pada baru dilakukan penelitian in vivo pada hewan cobahewan coba

In vitroIn vitro

pengujian pd tabung gelas, cawan petri pengujian pd tabung gelas, cawan petri

ContohContoh

(a) biakan sel / jaringan(a) biakan sel / jaringan

(b) komponen subseluler, mis. mitochondria (b) komponen subseluler, mis. mitochondria atau ribosome atau ribosome

(c) ekstrak sel /subseluler(c) ekstrak sel /subseluler

(d) molekul2 yg dimurnikan, mis. (d) molekul2 yg dimurnikan, mis. DDNA,RNA NA,RNA

In vitroIn vitro

pengujian pd tabung gelas, cawan petri pengujian pd tabung gelas, cawan petri

ContohContoh

(a) biakan sel / jaringan(a) biakan sel / jaringan

(b) komponen subseluler, mis. mitochondria (b) komponen subseluler, mis. mitochondria atau ribosome atau ribosome

(c) ekstrak sel /subseluler(c) ekstrak sel /subseluler

(d) molekul2 yg dimurnikan, mis. DNA,RNA (d) molekul2 yg dimurnikan, mis. DNA,RNA

Kuntungan studi in vitro Kuntungan studi in vitro

penyederhanaan sistempenyederhanaan sistem

Lebih cepat, lebih murah, dan dpt Lebih cepat, lebih murah, dan dpt dilakukan dgn masalah etis dan dilakukan dgn masalah etis dan keamanan< dibandingin vivo. keamanan< dibandingin vivo.

Kerugian:Kerugian:

tdk bisa diekstrapolasikan lgs ke sistemtdk bisa diekstrapolasikan lgs ke sistem

biologis, organismebiologis, organisme

organisme hidup sgt kompleks, banyak organisme hidup sgt kompleks, banyak komponen (ribuan gen, mol.protein, komponen (ribuan gen, mol.protein, mol.RNA, seny. organik, inorganik,dll dan mol.RNA, seny. organik, inorganik,dll dan pengaruh lingkungan) yg hrs saling pengaruh lingkungan) yg hrs saling berinteraksiberinteraksi

interpretasi hasil bisa >>interpretasi hasil bisa >>

Banyak calon obat yang efektif in vitro Banyak calon obat yang efektif in vitro tetapi tidak efektif in vivotetapi tidak efektif in vivo

penyebab mis. masalah transport obat penyebab mis. masalah transport obat kejaringan yang dituju.kejaringan yang dituju.

Contoh: Contoh:

suatu senyawa secara in vitro pd biakan suatu senyawa secara in vitro pd biakan mencegah replikasi virus, tetapi in vivo mencegah replikasi virus, tetapi in vivo pd hewan coba, manusia ternyata tdk pd hewan coba, manusia ternyata tdk efektif.efektif.

Ex vivoEx vivo

Penelitian dilakukan pd jaringan (sebagian atau Penelitian dilakukan pd jaringan (sebagian atau seluruh organ) diluar organisme hidup, pd seluruh organ) diluar organisme hidup, pd lingkungan buatan yg mendekati kondisi alamiahlingkungan buatan yg mendekati kondisi alamiah Biakan sel yg berasal dari biopsi.Biakan sel yg berasal dari biopsi. Keuntungan: Keuntungan: dpt melakukan pengujian yg tdk mgkdpt melakukan pengujian yg tdk mgk dilakukandilakukan

atauatau tidaktidak etisetis dilakukandilakukan pdpd organismeorganisme hidup. hidup. JaringanJaringan dikeluarkandikeluarkan sebagiansebagian atauatau seluruhseluruh organorgan

In vivoIn vivo

Penelitian dilakukan pada organisme Penelitian dilakukan pada organisme hiduphidup

pada hewan coba, manusia (sebelum pada hewan coba, manusia (sebelum digunakan di klinik) digunakan di klinik)

> baik dari in vitro> baik dari in vitro

Hasil uji pd hewan cobaHasil uji pd hewan coba UUtktk memprediksimemprediksi efekefek padapada manusiamanusia TTdkdk bisabisa diekstrapolasikandiekstrapolasikan lgslgs pdpd manusiamanusia PerbedaanPerbedaan spesiesspesies perbedaanperbedaan Cara danCara dan kecepatankecepatan metabolisme, ekskresimetabolisme, ekskresi SensitivitasSensitivitas reseptor, anatomireseptor, anatomi atauatau fisiologifisiologi UtkUtk memastikanmemastikan efekefek obatobat padapada manusiamanusia uujiji

klinikklinik

ContohContoh UjiUji ManfaatManfaat in vitroin vitro

Untuk aktivitasUntuk aktivitas asam urat dalam darah denganasam urat dalam darah dengan xantin oksidase(diisolasixantin oksidase(diisolasi biasanya darisusubiasanya darisusu sapi,sapi, kdg hati tikus atau usus halus)kdg hati tikus atau usus halus) ProcedureProcedure Senyawa uji diinkubasi dg xantin oksidase, Senyawa uji diinkubasi dg xantin oksidase, EDTA dan larutan buffer fosfat (pH 7,8) pd 37EDTA dan larutan buffer fosfat (pH 7,8) pd 37C C JJuga lrt kontroluga lrt kontrol Stlh penambahan xantin, produksi asam urat Stlh penambahan xantin, produksi asam urat ditentukan dengan pengukuran densitas optikditentukan dengan pengukuran densitas optik

Evaluasi : % inhibisi xantin oksidase Evaluasi : % inhibisi xantin oksidase dibanding lrt kontroldibanding lrt kontrol

utk aktivitas anti osteoartitis digunakan utk aktivitas anti osteoartitis digunakan homogenat chondrocyt tulang rawan sendihomogenat chondrocyt tulang rawan sendi

Untuk aktivitas antiaggregasi digunakan Untuk aktivitas antiaggregasi digunakan plasma kaya trombosit yg dipersiapkan plasma kaya trombosit yg dipersiapkan dari darah manusiadari darah manusia

Contoh uji manfaat ex vivoContoh uji manfaat ex vivo

Uji penghambatan biosintesis kolesterol Uji penghambatan biosintesis kolesterol pada potongan hati tikus yg diisolasi pada potongan hati tikus yg diisolasi (menggunakan 14(menggunakan 14 C sodium octanoate)C sodium octanoate)

Uji pada ileum guinea pig terisolasi utk Uji pada ileum guinea pig terisolasi utk melihat aktivitas spasmolitikmelihat aktivitas spasmolitik

Uji manfaat in vivoUji manfaat in vivo

Uji manfaat pada hewan cobaUji manfaat pada hewan coba

TahapanTahapan

1. Menginduksi gejala/penyakit yang menjadi 1. Menginduksi gejala/penyakit yang menjadi indikasi pada hewan cobaindikasi pada hewan coba

2. Senyawa diberikan pada hewan coba secara 2. Senyawa diberikan pada hewan coba secara acak, buta ganda, berpembandingacak, buta ganda, berpembanding

3. Membuat3. Membuat curvacurva dosedose--responseresponse

Uji manfaat obat herbal pada Uji manfaat obat herbal pada

hewan cobahewan coba

Sumber bahan uji seragam: usia tanaman, Sumber bahan uji seragam: usia tanaman, bagian tanaman yg digunakan, tempat bagian tanaman yg digunakan, tempat tumbuh, bila ekstraktumbuh, bila ekstrak tersandardtersandard BBentuk sediaan: tgt perkiraan zat aktifentuk sediaan: tgt perkiraan zat aktif Dosis minimal 10 X dosis manusia,bbrp Dosis minimal 10 X dosis manusia,bbrp tingkatan dosistingkatan dosis Cara penggunaan spt penggunaannya untuk Cara penggunaan spt penggunaannya untuk manusiamanusia

Ada pembanding: plasebo/ obat standarAda pembanding: plasebo/ obat standar

Dilakukan acakDilakukan acak

Hewan coba tergantung jenis Hewan coba tergantung jenis pemeriksaanpemeriksaan

Paw edemaPaw edema

Utk skrining obat antiinflamasiUtk skrining obat antiinflamasi Salah satu yg plg sering digunakanSalah satu yg plg sering digunakan Dasar: Dasar: kemampuan menghambat pembentukan kemampuan menghambat pembentukan edema yg ditimbulkan pd kaki belakang tikus edema yg ditimbulkan pd kaki belakang tikus setelah penyuntikan suatu phlogistic agents setelah penyuntikan suatu phlogistic agents (iritan), mis: formaldehide, dekstran, (iritan), mis: formaldehide, dekstran, carrageenin, albumin telur. carrageenin, albumin telur. Lama inflamasi yg ditimbulkan berbedaLama inflamasi yg ditimbulkan berbeda--bedabeda

Vol. kaki yang Vol. kaki yang disuntikdisuntik diukurdiukur sebelumsebelum dandan sesudahsesudah penyuntikanpenyuntikan iritaniritan

% % penghambatanpenghambatan edema edema dibandingkandibandingkan antaraantara kelkel.. hewanhewan cobacoba ygyg diobatidiobati dgndgn kel.kontrolkel.kontrol

BanyakBanyak metodemetode pengukuranpengukuran vol. vol. kkakiaki ProsedurProsedur

TikusTikus SpragueSprague--DawleyDawley jantanjantan/betina,BB100/betina,BB100--150 g150 g

DipuasakanDipuasakan semalamsemalam

DDiberiiberi air 5 ml mel. sonde lambung utk kel. kontrol air 5 ml mel. sonde lambung utk kel. kontrol atau obat uji dilarutkan/disuspensi dlm vol.samaatau obat uji dilarutkan/disuspensi dlm vol.sama 30 menit kmd, tikus disuntik sk 0,05 ml lrt1 % 30 menit kmd, tikus disuntik sk 0,05 ml lrt1 % carrageenan pada tapak kaki kiricarrageenan pada tapak kaki kiri Kaki ditandai dg tinta pd level malleolus lateral Kaki ditandai dg tinta pd level malleolus lateral (matakaki luar)dan dicelupkan pd air raksa sampai (matakaki luar)dan dicelupkan pd air raksa sampai tanda. tanda. VoVolume kaki diukur dg pletismograf segera setelah lume kaki diukur dg pletismograf segera setelah suntikan, selanjutnya setelah 3, 6 jam, setelah suntikan, selanjutnya setelah 3, 6 jam, setelah suntikan atau bahkan setelah 24 jam suntikan atau bahkan setelah 24 jam

Paw edemaPaw edema

EvaluasiEvaluasi

Persentase peningkatan vol. kaki stlh 3 dan 6 Persentase peningkatan vol. kaki stlh 3 dan 6 jam dibandingkan dengan vol yg diukur jam dibandingkan dengan vol yg diukur segera setelah suntikan iritansegera setelah suntikan iritan

Efektif bila edema

Iritan utk induksi edema kaki tikus, mencit banyak.

Mis. 0,1 ml formalin 1 %, carrageenan sol.

0,2 %, 5 % suspensi kaolin,dll Berakhirnya edema yg ditimbulkan berbagai

iritan berbeda bbrp jam sp 2 hari(mis.kaolin) Tgt iritan yg digunakan, steroid, anti inflamasi

non steroid, antiserotonin, antihistamin aktif thd edema kaki

Beda iritan hsl sulit dibandingkan

Writhing testWrithing test

Metode plg sering utk menilai aktivitas analgesik

(meskipun zat psikoaktif juga memperlihatkan

aktivitas)

Nyeri ditimbulkan dengan menyuntikkan iritan seperti phenylquinone atau asam asetat ke dalam ruang intraperitoneal mencit

Hewan bereaksi dg peregangan yg khas disebut writhing(menggeliat)

ProsedurProsedur

Digunakan mencit berat 20-25 g. Kelompok kontrol, kelompok diobati, masing2 kelompok terdiri dr 6 mencit Phenylquinone kadar 0,02 % disuspensi dlm suspensi carboxymethyl cellulose1 %. O,25 ml suspensi disuntik ip Obat, atau kontroldiberikan pd berbagai waktu sebelum pemberian phenylquinone

Masing2 mencit dimasukkan ke beaker glass. Setelah 5 menit, mencit di observasi selama 10 menit dan jumlah geliat dicatat untuk tiap binatang Utk scoring :

satu geliat adalah peregangan abdomen bersamaan dengan peregangan sekurangnya1

kaki belakang % inhibisi:

rata2 geliat kel. kontrol-kelompok obatX 100 % geliat pd kel.kontrol

Waktupuncak: periode dimana inhibisi paling besar

Senyawa dengan inhibisi

Lain obat spt klonidin, haloperidol juga Lain obat spt klonidin, haloperidol juga aktivitasnya menonjolaktivitasnya menonjol

ttest tdk spesifikest tdk spesifik

KonfirmasiKonfirmasi dg lain pengujiandg lain pengujian

Iritant lain: 0,1 ml lrt 0,6% asam asetat, Iritant lain: 0,1 ml lrt 0,6% asam asetat, disuntikan ipdisuntikan ip pd mencit pd mencit

Formalin testFormalin test

Pada tikus

Utk model nyeri kronik, yg sensitif thd analgesik sentral

Prosedur

Tikus Wistar jantan 180-300 g

Disuntikkan 0,05 ml formalin 10 % ke dalam bagian dorsal kaki depan.

Bahan uji diberikan bersamaan secara oral atau sc

Masing 2 tikus dimasukkan pd kandang plastik dan diobservasi. Penilaian dilakukan pada 30 dan 60 menit dan dinilai

menurut skala nyeri Respons thd nyeri ditunjukkan dgn pengangkatan kaki

atau memagut kaki >> 20-30 menit Response biphasic : faseawal0-5 mnt, faselate 20-30

mnt Respons analgesik atau proteksi ditunjukkan bila

kedua kaki istirahat diatas lantai dgn tidak ada pengangkatan yg nyata dr kaki yg disuntik

Mnggunakan beberapa dosisMnggunakan beberapa dosis Formalin test mengidentifikasi terutama Formalin test mengidentifikasi terutama analgesik yang bekerja sentral, sedangkan analgesik yang bekerja sentral, sedangkan analgesik yang bekerja perifer hampir tdk analgesik yang bekerja perifer hampir tdk efektifefektif dpt memisahkan nyeri inflamasi dan non dpt memisahkan nyeri inflamasi dan non inflamasiinflamasi

Analgesik sentral aktif pd fase awal dan lanjut, Analgesik sentral aktif pd fase awal dan lanjut, NSAID & kortikosteroid aktif hanya pd fase NSAID & kortikosteroid aktif hanya pd fase lanjutlanjut