130833535 tugas uji preklinik metode uji antimikroba amelia febriani 1206179170

Tugas Uji Preklinik: Metode Uji Antimikroba Obat HerbalDosen: Dr. Anton Bahtiar, M.Biomed

2013

TUGAS

Mata Kuliah

UJI PREKLINIK

METODE UJI ANTIMIKROBA

OBAT HERBAL

Oleh :

AMELIA FEBRIANI

1206179170

Program Magister HerbalFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Universitas Indonesia 2012 / 2013

1 Amelia Febriani S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170


2013

METODE UJI ANTIMIKROBA OBAT HERBAL

I. PENGERTIAN

Antimikroba adalah senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan

mikroorganisme atau membunuh mikroorganisme, khususnya

mikroorganisme yang merugikan manusia. Mikroorganisme adalah setiap

organisme yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop yaitu protozoa,

bakteri, jamur, dan virus adalah contoh dari mikroorganisme.

Berdasarkan sifat toksisitas selektif , ada anti mikroba yang bersifat

menghambat pertumbuhan mikroba , dikenal sebagai aktifitas bakteriostatik

dan ada yang bersifat membunuh mikroba , dikenal sebagai aktivitas

bakterisid.

Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti

bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak membahayakan inang.

Seringkali, toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan bukan absolut; ini

berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu dapat ditoleransi

oleh inang, dapat merusak parasit.

Antibiotika yang ideal sebagai obat harus memenuhi syarat-syarat berikut:

a. Mempunyai kemampuan untuk mematikan atau menghambat

pertumbuhan mikroorganisme yang luas (broad spectrum antibiotic)

b. Tidak menimbulkan terjadinya resistensi dari mikroorganisme

pathogen

c. Tidak menimbulkan pengaruh samping (side effect) yang buruk pada

host, seperti reaksi alergi, kerusakan syaraf, iritasi lambung, dan

sebagainya

d. Tidak mengganggu keseimbangan flora yang normal dari host seperti

flora usus atau flora kulit.



2013

II. MEKANISME

Keefektifan penghambatan merupakan salah satu kriteria pemilihan suatu

senyawa antimikroba pada obat herbal. Semakin kuat penghambatannya

semakin efektif digunakan. Kerusakan yang ditimbulkan komponen

antimikroba dapat bersifat mikrosidal (kerusakan tetap) atau mikrostatik

(kerusakan sementara yang dapat kembali). Suatu komponen akan bersifat

mikrosidal atau mikrostatik tergantung pada konsentrasi dan kultur yang

digunakan.

Mekanisme penghambatan mikroorganisme oleh senyawa antimikroba dapat

disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain:

1. Gangguan pada senyawa penyusun dinding sel,

2. Peningkatan permeabilitas membran sel yang dapat menyebabkan

kehilangan komponen penyusun sel,

3. Menginaktivasi enzim, dan

4. Destruksi atau kerusakan fungsi material genetik.

1. Menggangu pembentukan dinding sel

Mekanisme ini disebabkan karena adanya akumulasi komponen lipofilat

yang terdapat pada dinding atau membran sel sehingga menyebabkan

perubahan komposisi penyusun dinding sel. Terjadinya akumulasi

senyawa antimikroba dipengaruhi oleh bentuk tak terdisosiasi. Pada

konsentrasi rendah molekul-molekul phenol yang terdapat pada minyak

thyme kebanyakan berbentuk tak terdisosiasi, lebih hidrofobik, dapat

mengikat daerah hidrofobik membran protein, dan dapat melarut baik

pada fase lipid dari membran bakteri.

Beberapa laporan juga meyebutkan bahwa efek penghambatan senyawa

antimikroba lebih efektif terhadap bakteri Gram positif daripada dengan

bakteri Gram negatif. Hal ini disebabkan perbedaan komponen penyusun

dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Pada bakteri Gram posiitif 90 3 Amelia Febriani

S2 Farmasi Herbal MedikNPM. 1206179170


2013

persen dinding selnya terdiri atas lapisan peptidoglikan, selebihnya adalah

asam teikoat, sedangkan bakteri Gram negatif komponen dinding selnya

mengandung 5-20 persen peptidoglikan, selebihnya terdiri dari protein,

lipopolisakarida, dan lipoprotein.

2. Bereaksi dengan membran sel

Komponen bioaktif dapat mengganggu dan mempengaruhi integritas

membran sitoplasma, yang dapat mengakibatkan kebocoran materi

intraseluler, seperti senyawa phenol dapat mengakibatkan lisis sel dan

meyebabkan deaturasi protein, menghambat pembentukan protein

sitoplasma dan asam nukleat, dan menghambat ikatan ATP-ase pada

membran sel.

3. Menginaktivasi enzim

Mekanisme yang terjadi menunjukkan bahwa kerja enzim akan terganggu

dalam mempertahankan kelangsungan aktivitas mikroba, sehingga

mengakibatkan enzim akan memerlukan energi dalam jumlah besar untuk

mempertahankan kelangsungan aktivitasnya. Akibatknya energi yang

dibutuhkan untuk pertumbuhan menjadi berkurang sehingga aktivitas

mikroba menjadi terhambat atau jika kondisi ini berlangsung lama akan

mengakibatkan pertumbuhan mikroba terhenti (inaktif).

Efek senyawa antimikroba dapat menghambat kerja enzim jika

mempunyai spesifitas yang sama antara ikatan komplek yang menyusun

struktur enzim dengan komponen senyawa antimikroba.

4. Menginaktivasi fungsi material genetik

Komponen bioaktif dapat mengganggu pembentukan asam nukleat (RNA

dan DNA), menyebabkan terganggunya transfer informasi genetik yang

selanjutnya akan menginaktivasi atau merusak materi genetik sehingga

terganggunya proses pembelahan sel untuk pembiakan

III. KOMPONEN-KOMPONEN ANTIMIKROBA TUMBUHAN4 Amelia Febriani



2013

Komponen antimikroba adalah suatu komponen yang bersifat dapat

menghambat pertumbuhan bakteri atau kapang (bakteristatik atau

fungistatik) atau membunuh bakteri atau kapang (bakterisidal atau

fungisidal). Zat aktif yang terkandung dalam berbagai jenis ekstrak

tumbuhan diketahui dapat menghambat beberapa mikroba patogen

maupun perusak makanan. Zat aktif tersebut dapat berasal dari bagian

tumbuhan seperti biji, buah, rimpang, batang, daun, dan umbi.

Komponen aktif yang terdapat pada bawang putih mempunyai efek

penghambatan terhadap beberapa mikroba patogen seperti

Staphylococcus aureus, E. coli, dan Bacillus cereus dan menghambat

produksi toksin dari Clostridium botulinum tipe A dengan menurunkan

produksi toksinnya sebanyak 3 log cycle.

C. Botulinum adalah bakteri berspora yang dapat memproduksi toksin

pada kondisi yang memungkinkan, dapat dihambat pertumbuhannya oleh

minyak bunga dan biji pala, minyak daun salam, minyak lada hitam dan

lada putih dengan konsentrasi 125 ppm. Laporan lain juga menyebutkan

bahwa ekstrak minyak lada dapat menghambat pertumbuhan S. aureus,

E. coli, dan Candida albicans.

Komponen aktif yang terdapat pada minyak thyme diantaranya thymol,

carvacrol, (ro)-cymene, dan (gamma)-terpiene diketahui mempunyai efek

sebangai senyawa antimikroba terhadapa pertumbuhan bakteri. Bakteri-

bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya antara lain Salmonella sp.,

S. aureus, E. coli, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, dan B.

cereus. Dari laporan tersebut dapat juga diperoleh informasi bahwa

bakteri gram positif lebih sensitif dibanding dengan bakteri gram negatif.

Efek penghambatan senyawa antimikroba dari rempah-rempah tidak

hanya dapat menghambat pertumbuhan bakteri, tetapi dapat juga

menghambat pertumbuhan khamir seperti Candida albican dan

Sacharomyces cerevisiae. Komponen-komponen aktif pada minyak 5 Amelia Febriani



2013

thyme, minyak sage, minyak rosemary, minyak cumin, minyak caraway,

dan minyak cengkeh dapat menghambat khamir dengan konsentrasi 0,5-

2.0 (mg/mL).

Bakteri dalam bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding dalam bentuk

sporanya, hal ini dibuktikan oleh Ultee et al. (1998) yang meneliti efek

penghambatan komponen carvacrol yang terdapat pada minyak thyme

dan oregano terhadap pertumbuhan bakteri B. cereus.

Pada konsentrasi 1,75 mmol/L bentuk sel vegetatif lebih sensitif dibanding

bentuk sporanya. Hal ini disebabkan struktur spora yang lebih komplek

dibanding bentuk sel vegetatif, seperti adanya komponen asam

dipikolinat yang dapat melindungi spora terhadap gangguan faktor

lingkungan (suhu dan pH ekstrim). Lebih lanjut Ultee et al. (1998)

menyebutkan bahwa pada konsentrasi 1.75 mmol/L dapat mneghambat

kecepatan pertumbuhan B. cereus sehingga fase lag diperpanjang.

Semakin lama fase lag maka aktivitas B. cereus sebagai penyebab

kerusakan bahan pangan dapat dicegah.

Komponen-komponen antimikroba yang terdapat pada minyak cengkeh,

minyak kayu manis, minyak oregano, minyak thyme, minyak bawang

putih, dan bawang merah dapat menghambat spesies kapang

diantaranya adalah Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. versicolor, A.

ochraceus, Candida sp., Crytococcus sp., Rhodotorulla sp., Torulopsis sp.,

dan Tricosporon sp.

Kapang adalah mikroorganisme penyebab kerusakan bahan pangan

terutama biji-bijian dan produk tepung-tepungan dengan kadar air

rendah. Beberapa spesies kapang dapat menghasilkan toksin

(mikotoksin) adalah Aspergillus sp., Penicllium sp., dan Fusarium sp., yang

dapat menghasilkan aflatoksin, patulin, okratoksin, zearalenon, dan

okratoksin. — (bersambung).



2013

IV. UJI AKTIVITAS dan POTENSI ANTIMIKROBA

Potensi antimikroba adalah kekuatan suatu antibiotika dalam

menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam

IU/mg (iu=international unit) atau µg/mg

Prinsipnya yaitu membandingkan respon mikroba uji yang peka terhadap

percobaan dalam kondisi yang sama terhadap zat baku pembanding

(standar) atau zat uji. Baku standar yang digunakan adalah zat/senyawa yg

sudah diketahui kemurnian dan kekuatan / potensinya.

Uji aktivitas antimikroba dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu melalui

metode turbidimetri (dilusi) dan metode difusi agar. Caranya sama dengan

penentuan potensi antibiotika, tetapi hanya 1 dosis, umumnya 50%.

Perbedaannya :

• uji aktivitas bersifat kualitatif, hanya menentukan ada/tidaknya

aktivitas atau mencari aktivitas antimikroba terbaik dari suatu

kelompok bahan

• Uji potensi antibiotika bersifat kuantitatif yang menghasilkan

prosentase kekuatan suatu antibiotika terhadap antibiotika

pembanding dari jenis yang sama

Penentuan aktivitas antimikroba suatu ekstrak tanaman dapat dilakukan

bila terpenuhi tiga syarat, yaitu:

a) Ekstrak tanaman harus bisa kontak dengan dinding sel

mikroorganisme,

b) Kondisi pengujian diatur sedemikian rupa sehingga mikroorganisme

dapat tumbuh saat tidak ada bahan antimikroba, dan

c) Ada parameter ukur tingkat pertumbuhan mikroorganisme

(Hostettmann, 1991).

Aktivitas antibakteri ditentukan oleh spektrum kerja, cara kerja dan

ditentukan pula oleh konsentrasi hambat minimum (KHM). Konsentrasi



2013

Hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi minimum dari suatu zat yang

mempunyai efek daya hambat pertumbuhan mikroorganisme.

Penetapan KHM dapat dilakukan dengan dua cara yaitu

a) Cara cair

Pada cara ini digunakan media cair yang telah ditambahkan zat yang dapat

menghambat pertumbuhan bakteri atau jamur dengan pengenceran tertentu

kemudian diinokulasikan biakan bakteri atau jamur dalam jumlah yang

sama. Respon zat uji ditandai dengan kejernihan atau kekeruhan pada

tabung setelah diinkubasi.

b) Cara padat

Pada cara ini digunakan media padat yang telah dicampur dengan larutan

zat uji dengan berbagai konsentrasi. Dengan cara ini satu cawan petri dapat

digores lebih dari satu jenis mikroba untuk memperoleh nilai KHM.

Banyak metode yang dapat diterapkan untuk menentukan aktivitas

antimikroba dimana masing-masing metode memiliki kelebihan dan

kekurangan. Metode-metode yang digunakan antara lain metode difusi,

metode pengenceran, metode bioautografi, dan lain-lain. Namun, perlu

diperhatikan dahulu cara preparasi bahan uji (ekstrak) agar terpenuhi syarat

pertama dalam penentuan aktivitas antijamur seperti tersebut sebelumnya.

Preparasi sampel uji (ekstrak) yang bersifat tidak larut air (lipofilik) seperti

minyak atsiri atau ekstrak non-polar dapat dilakukan dengan menggunakan

pelarut selain-air atau membuat dispersi air atau emulsi dengan bahan

surfaktan. Pada prinsipnya tidak disyaratkan dispersi yang homogen pada

metode difusi dan pengenceran agar, kecuali pada metode pengenceran cair

(dalam tabung). Dispersi air yang mengandung pendispersi dengan berat

molekul (BM) yang tinggi (>100.000) harus dihindari dalam metode difusi



2013

karena bahan tersebut tidak dapat berdifusi ke dalam media agar 1%

(Hostettmann, 1991).

V. METODE UJI ANTIMIKROBA

Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan

yang efektif dan efisien. Terdapat macam–macam metode uji antimikroba

seperti berikut:

1. Metode Penyebaran/Difusi (Diffusion Methods)

Prinsip metode difusi uji potensi yang berdasarkan pengamatan luas

daerah hambatan pertumbuhan bakteri karena berdifusinya antibakteri

dari titik awal pemberian kedaerah difusi. Metode difusi-agar cakram

kertas merupakan teknik yang paling sering digunakan untuk

menentukan kepekaan bahan antimikroba sampai senyawa kemoterapi.

Dalam metode ini, ada beberapa cara yaitu cara Kirby Bauer, cara

sumuran dan cara pour plate.

1) Metode Kirby-Bauer

Untuk menentukan aktivitas agen antimikroba. Piringan yang berisi

agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami

mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area

jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan

mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media

agar.



2013

Cara kerja pengujian antimikroba dengan metode Kirby-Bauer :

1. Tanam mikroba dalam media agar padat yang sesuai.

Celupkan cotton bud (cotton swab) dalam biakan bakteri

kemudian tekan kapas ke sisi tabung agar air tiris. Bakteri

ditumbuhkan pada media agar miring dan diinkubasi pada

suhu 370C. Kemudian pembuatan suspensi bakteri dengan

menumbuhkan bakteri pada media cair Natrium Klorida

fisiologis dan diinkubasi pada suhu 370C

2. Ulaskan pada seluruh permukaan cawan Mueller-Hinton Agar

secara merata Biarkan cawan selama 5 menit.



2013

3. Kertas cakram dicelupkan dalam larutan obat herbal dengan

konsentrasi tertentu. Angkat, biarkan sejenak agar tiris,

selanjutnya letakkan kertas cakram pada permukaan agar.

Kertas cakram ditekan menggunakan pinset supaya menempel

sempurna di permukaan agar.

4. Inkubasi pada suhu 36- 37 0C selama 24-48 jam.



2013

5. Aktivitas antimikroba dilihat dengan mengukur daerah di

sekitar cakram, lubang, atau cangkir agar yang tidak

ditumbuhi miroba.



2013

6. Ukur diameter zona hambat (mm) dengan jangka sorong,

kemudian bandingkan dengan tabel sensitivitas antibiotik.

Makin besar diameter hambatan pertumbuhan tersebut berarti

aktivitas bahan yang diuji (obat herbal) terhadap mikroba

makin baik.



2013

Tabel 1. Tabel Standar Sensitifitas Antibiotik

Faktor yang mempengaruhi metode difusi agar (Kirby-Bauer):

a. Ingredien / komposisi medium pertumbuhan

-Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi

pertumbuhan mo adalah ; pepton, tripton, ekstrak ragi,

agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)

-NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol aminoglikosida

dan menahan aktivitas ferosidin

-KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas

nitrofurantoin atau ampisilin



2013

b. Pemilihan medium pertumbuhan

- Pemilihan medium pertumbuhan; dimana diperlukan

persiapan medium yg cocok bagi pertumbuhan mo

demikian pula ketebalan dan konstituen harus merata

pada medium agar

- Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan disebabkan

oleh aktivitas antibiotik yg tergantung pada pH medium.

Misalnya aktivitas aminoglikosida diperkuat dalam suasana

asam sedangkan tetrasiklin dalam suasana basa

- Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi diturunkan dgn

menambahkan HCl 0,1N, pH yg rendah dinaikkan dgn

penambahan NaOH 0,1N

c. Pengaruh pH

Perbedaan pH media yang digunakan dapat menyebabkan

perbedaan jumlah zat uji yang berdifusi, pH juga menentukan

jumlah molekul zat uji yang mengion. Selain itu pH

berpengaruh terhadap pertumbuhan bakteri.

d. Ukuran inokulum

- Inokulum adalah campuran antara suspensi dan media.

- Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika inokulum

semakin besar kandungan mikroorganismenya.

- Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan

mikroorganismenya homogen, misal 1-10%

- Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan

terjadinya penumpukan pada tempat tertentu



2013

e. Stabilitas mikroba uji

Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat terjadi

dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh sebab itu

regenerasi mikroba perlu dilakukan secara periodik dan

sewaktu-waktu diuji kemurnian dan kepekaannya.

f. Aktivitas antibiotika

Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada suatu

penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan kadar hambat

minimum (KHM) dari antibiotik yang diuji. Pengaruh predifusi

larutan antibiotik yangg terjadi sebelum inkubasi harus

dihilangkan atau dikurangi dengan cara pengisian larutan

antibiotik ke dalam medium agar

g. Waktu inkubasi

Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang optimal,

sehingga keseimbangan antara aktivitas antibiotik dengan

daya tumbuh mikroba dapat menghasilkan daerah hambatan

yang baik untuk pengukuran zona bening yang muncul

sebagai daerah penghambatan pertumbuhan mikroba,

biasanya antara 18-24 jam

Metode Kirby-Bauer tidak bisa digunakan untuk mengukur derajat

antimikroba suatu zat sehingga metode ini tidak menjamin

diidentifikasinya bahan pembunuh antimikroba yang efektif untuk

terapi (bakterisida atau fungisida). Hal ini disebabkan adanya

perbedaan kecepatan difusi dari senyawa antimikroba yang

dipengaruhi berat molekulnya. Ukuran zona untuk suatu zat dapat

dibandingkan dengan standar, asalkan perbenihan, ukuran

inokulum, dan keadaan lain diatur secara seksama. Hal ini 16 Amelia Febriani



2013

memungkinkan ditetapkannya suatu diameter zona penghambat

minimum yang menunjukkan kepekaan dari suatu zat antimikroba.

Pada pengukuran standar seperti konsentrasi antimikroba

berkorelasi dengan diameter zona hambat sehingga bisa digunakan

untuk menentukan tingkat kepekaan, yaitu peka (sensitive,

susceptible), cukup peka (moderately sensitive, intermediate), dan

resisten (resistant.) Nilai kadar hambat minimum (KHM) berbanding

terbalik secara proporsional (linear) dengan diameter zona hambat

(Bauer et al., 1966)

2). Metode E- test

Black (2004) mengemukakan adanya versi terbaru metode difusi

yang disebut E-test (Epsilo Test). Pada E-test digunakan strip plastik

yang mengandung gradien konsentrasi antibiotik. Pada strip tercetak

nilai konsentrasi yang memungkinkan secara langsung membaca

konsentrasi minimum yang dibutuhkan untuk menghambat

pertumbuhan. Titik dimana mulai terjadi hambatan pertumbuhan

menunjukkan KHM untuk obat herbal yang memliki potensi antibiotik

yang diujikan.



2013

Gambar 1. Cawan Petri dan kertas reagan metode E-Test

Jamur yang bertipe koloni ragi atau tidak berfilamen (yeast-like

growth, non-mycelial growth) biasanya ditanam secara usapan atau

gores-coret (agar surface streak) Penanaman jamur berfilamen yang

tumbuh tidak merata pada media menggunakan teknik gores silang

3). Metode Ditch – plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antmikroba (obat herbal)

yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong

pada media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara

membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan kea rah

parit yang berisi agen antimikroba

4). Metode Cup – plate technique (Metode sumuran)

Metode ini serupa dengan metode disc diffusion, di mana dibuat

sumur pada media agar yang telah ditanami dengan

mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba

(obat herbal) yang akan diuji

5). Metode Gradient – plate technique

Pada metode ini kosentrasi agen antimikroba pada media agar

secara teoritis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar

dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang

ke dalam cawan petri dan di letakkan dalam posisi miring. Nutrisi

kedua selanjutnya ditung di atasnya.



2013

Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen

antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji

(maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari kosentrasi

tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total

pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin di

bandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan

2. Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods)

Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa

zat antimikroba secara simultan, tetapi memakan waktu dan mahal.

Metode ini memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai daya

antimikroba suatu zat . Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk

mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah yang

dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Kadar terkecil yang

menunjukkan hambatan terhadap pertumbuhan bakteri ditandai oleh

kejernihan media merupakan KHM. Data sifat kimia fisika dan data

aktivitas antibakteri (KHM) dianalisis secara statistik dengan uji regresi

liner dan non linier .Uji ini mampu dengan tepat mengukur konsentrasi

antimikroba yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan suatu

inokulum terstandarisasi di bawah kondisi yang ditentukan

Metode dilusi dibedakan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan

dilusi padat (solid dilution).

1). Metode dilusi cair (broth dilution) test (serial dilution)

Metode ini mengukur MIC (minimum inhibitory concentration atau kadar

hambat minimum, KHM) dan MBC (minimum bactericidal concentration

atau kadar bunuh minimum, KBM).

Cara kerja metode dilusi cair:



2013

1. Buat seri pengenceran agen antimikroba (obat herbal) pada

medium cair yang di tambahkan dengan mikroba uji. Cara

pengenceran dilakukan dalam tabung dengan mengencerkan

bahan uji (obat herbal) dengan media cair menjadi kelipatan dua

secara bertahap sehingga didapatkan konsentrasi dengan

kelipatan setengahnya

2. Inokulasi dengan suspensi bakteri dan diinkubasi selama 24 jam

pada temperatur 36-37oC dan kemudian diamati hambatan

pertumbuhan mikroba dengan membandingkan kekeruhan atau

pertumbuhannya dengan kontrol yang mengandung media.

3. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat

jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai

KHM.

4. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya

dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan pada mikroba

uji ataupun agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18–24 jam.

5. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan

sebagai KBM

2). Metode dilusi padat (solid dilution tes )

Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan

media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu kosentrasi agen

antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa

mikroba uji.

Pengujian terhadap jamur menggunakan media cair kurang bagus karena

sebagian besar jamur tidak tumbuh dan terdispersi dengan baik kecuali

beberapa jamur dengan pertumbuhan seperti ragi (yeast-like growth). Jamur

yang tumbuh seperti ragi antara lain Candida spp. (Bauer et al., 1966).20 Amelia Febriani



2013

3. Metode Bioautografi (Bioautography Methods) (Hostettmann, 1991)

Metode ini sangat berguna untuk mengetahui senyawa baru atau

senyawa yang belum diketahui aktivitas antimikrobanya. Bioautografi

kontak menggunakan prinsip difusi senyawa yang terpisah dengan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) atau Kromatografi Kertas (KK). Lempeng

kromatografi ditempatkan pada permukaan agar yang telah diinokulasi

dengan mikroba. Setelah kira-kira 30 menit, lempeng dipindahkan,

diinkubasi dan diamati, senyawa antimikroba akan berdifusi ke dalam

lapisan agar dan menghambat pertumbuhan mikroba. Pada bioautografi

langsung, zona hambatan diamati secara langsung pada lempeng

kromatografi yang sebelumnya telah disemprot dengan suatu suspensi

mikroba dalam media agar cair dan diinkubasi pada temperatur dan

waktu yang sesuai. Sedangkan metode bioautografi pencelupan

dilakukan dengan mencelupkan lempeng kromatografi ke dalam media

dan media dibiarkan mengeras. Lempeng kromatografi kemudian

diinkubasi dan daerah hambatannya diamati.

4. Metode metode lain

Metode-metode lain yang dapat digunakan terutama untuk menentukan efektivitas senyawa kemoterapi yaitu:

a. Metode daya bunuh serum (serum killing power method)

Pada metode daya bunuh serum digunakan sampel darah pasien

yang sedang menerima terapi antibiotik. Suspensi mikroba



2013

(bakteri) kemudian ditambahkan pada serum pasien.

Pertumbuhan (turbiditas) dalam serum setelah inkubasi

mengartikan bahwa antibiotik yang diberikan tidak efektif.

b. Metode otomatis (automated method).

Metode otomatis menggunakan sistem otomatis (instrumen) yang

dapat mengidentifikasi mikroorganisme dan menentukan

kepekaannya terhadap berbagai senyawa antimikroba.

5. Metode Gores Silang (Uji Antifungi)

Metode gores silang (Cross Scratching Method) merupakan metode baku

untuk menguji aktivitas penghambatan suatu bahan uji terhadap jamur

T. mentagrophytes (Anonim, 1993).

Cara kerja metode gores silang:

1. Celupkan kertas saring ke dalam larutan yang diuji lalu diletakkan

di atas lempeng agar yang telah digores dengan inokulum jamur.

2. Media agar kemudian diinkubasi selama 3-7 hari pada 24-25 oC.

3. Pertumbuhan jamur diamati, jarak yang tidak ditumbuhi jamur

diukur sebagai zona hambat.

4. Cara yang sama juga dilakukan pada waktu yang bersamaan

untuk antijamur pembanding.

DAFTAR PUSTAKA



2013

Ultee A, Gorris LGM, Smid EJ. 1998. Bacterial activity of carvacrol toward the food-borne pathogen Bacillus cereus. J. Appl. Microbiol: 213-218

Corner, DE. 1995. Naturally occuring compounds in Antimicrobial in Food. Eds., by Davidson PM & Branen AL, Eds. Marcell Dekker, Inc., New York, pp. 441-468.

Palmer, SA., Stewart J., Fyfe, L. 1998. Antimikrobial properties of plant essential oils and essences againts five important food-borne pathogen. Letters Appl. Microbiol. 26: 118-122.

Ting, EWT & Deibel, KE. 1992. Sensitivity of Listeria monocytogenes to spices at two temperature. J. Food Safety 12: 19-137.

Hostettmann K. 1991. Methods in Plant Biochemistry: Assays for Bioactivity v. 6 - Methods in Plant Biochemistry Vol 6

Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am J Clin Pathol. 1966 Apr;45(4):493-6.

Rostinawati T, 2009. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella (Hibiscus Sabdariffa L.) terhadap Escherichia coli, Salmonella typhi dan Staphylococcus aureus dengan Metode Difusi Agar. Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran , Jatinangor



2013


130833535 tugas uji preklinik metode uji antimikroba amelia febriani 1206179170

Documents