Tugas Biologi Molekuler

Rekombinasi Gen Penyandi -xilosidase asal Geobacillus Thermoleovorans IT-08 dalam Plasmid

Phis1525

Kelompok 1

1. Novita Sari (I21112001)

2. Arif Fathullah Fajri (I211120 )

3. Ade Putri Yulianti (I211120 )

4. Ridho Firja (I211120 )

5. Dini Siti (I211120 )

Tujuan•Untuk melakukan rekombinasi gen penyandi β-xilosidase asal Geobacillus thermoleovorans IT-08 ke dalam plasmid pHIS1525 dan dipropagasi di E.Coli DH10β

Masalah

pengoptimalkan produksi enzim β-

xilosidase ekstraseluler pada

ekspresi gen dalam sistem

pHIS1525/B.Megterium

Caranya

melakukan rekombinasi gen

penyandi β-xilosidase asal

Geobacillus thermoleovorans IT-08 ke dalam plasmid

pHIS1525 dan dipropagasi di E.Coli

DH10β

Isolasi Dan Pemurnian DNA Plasmid

Amplifikasi Gen Penyandi β-xilosidase Dalam pTP510

Rekombinasi Gen Penyandi β-xilosidase Dalam Plasmid pHIS1525

Seleksi Transforman

Sekuensing

Tahapan”

Rekombinasi Gen

1. Pemotongan ganda (double digest) amplikon xyl dan plasmid pHIS1525 dengan 2 jenis enzim restriksi SacI dan SphI

2.Rekombinasi (ligasi) amplikon dan plasmid pHIS1525 menggunakan enzim ligase

3. Transformasi plasmid rekombinan ke dalam sel kompeten E.Coli DH10β.

Proses rekombinasi gen penyandi β-xilosidase dalam plasmid pHIS1525 dan transformasi di E.Coli 10β dilakukan melalui beberapa tahapan

sebagai berikut:

Analisis

Plasmid rekombinan dianalisis dengan analisis restriksi dan sekuensing

a. Analisis RestriksiDengan melakukan pemotongan tunggal DNA plasmid menggunakan enzim restriksi, untuk mengetahui ukuran DNA plasmid rekombinan dan DNA sisipan.

b. SekuensingUntuk mengetahui struktur gen sisipan dalam plasmid pHIS1525 rekombinan dan tingkat homologinya terhadap gen penyandi β-xilosidase, maka dilakukan sekuensing dengan primer walking. Lima primer yang telah berhasil didesain dan digunakan untuk menentukan sekuen gen sisipan dalam plasmid pHIS1525 rekombinan adalah: Pxyl -1(F), Pxyl -1(R), Pxyl -2(F), Pxyl -2(R) dan Pxyl –tengah

Hasil dan Pembahasan

• Hasil analisis sekuen gen xyl yang terinsersi dalam plasmid pHIS1525, menunjukkan sekuen DNA dengan urutan sebagai berikut: start - signal peptide (SPlipA) - gen xyl - His6 - stop. Hal ini dapat dijelaskan melalui diagram berikut ini :

• Hasil analisis terhadap sekuen-sekuen secara komputasi

menggunakan program Bio Edit Sequence Alignment Editor

menunjukkan bahwa gen sisipan dalam plasmid pHIS1525

mempunyai sekuen yang sama dengan sekuen gen penyandi β-

xilosidase asal G.thermoleovorans IT-08 (Genbank nomor akses

DQ345777), dengan tingkat homologi sebesar 99,93%.

• Berdasarkan peta plasmid pHIS1525 dan data-data yang diperoleh

pada penelitian ini, maka dapat digambarkan peta plasmid

rekombinan yang mengandung gen penyandi β-xilosidase.

Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa rekombinasi gen penyandi β-xilosidase asal

G.thermoleovorans IT-08 dalam plasmid pJIS1525 berhasil dilakukan, menghasilkan plasmid rekombinan yang

dinamakan pSMX