Peralatan laboratorium biologi molekuler

dr. Syazili Mustofa, M. Biomed Kepala Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Biologi

Molekuler Fakultas Kedokteran

Universitas Lampung

Peralatan laboratorium biologi molekuler

• Autoklav

• Sentrifuga

• Air displacement pippete

• biosafety cabinet (BSC)

• Plate readers

• Thermal cycler

Autoklaf • Alat untuk mensterilkan

peralatan dan perlengkapan dengan memasukkannya ke uap bertekanan tinggi pada 121 ° C atau lebih selama kurang lebih 15 menit.

• Peningkatan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme.

Autoklaf • Autoklaf terutama

ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal.

https://id.wikipedia.org/wiki/Endosporahttps://id.wikipedia.org/wiki/Selhttps://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri

Autoklaf • Pada suhu 121 °C,

endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, di mana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C

• Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C].

https://id.wikipedia.org/wiki/Autoklaf#cite_note-Spry-3

Autoklaf • Jika objek yang disterilisasi

cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit.

• Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi[. Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus stearothermophilus.

https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacillus_stearothermophilus&action=edit&redlink=1https://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bacillus_stearothermophilus&action=edit&redlink=1

jangan mengautoklaf

• bahan yang mudah terbakar, reaktif, korosif, beracun atau radioaktif.

• Jangan pernah mengautoklaf pemutih kering atau bahan terkait pemutih atau nitroselulosa karena kedua senyawa tersebut menimbulkan risiko kebakaran atau ledakan.

• Jas lab yang telah terkontaminasi bahan kimia tidak boleh diautoklaf tetapi dibersihkan oleh layanan binatu yang disetujui atau dibuang sebagai limbah kimia.

• Bahan radioaktif • Limbah patologis: Termasuk bangkai hewan, jaringan

dan organ serta jaringan dan organ manusia.

Sentrifugasi • Teknik sentrifugasi telah

dimanfaatkan baik untuk keperluan penelitian misalnya pada bidang biologi sel dan bioloi molekuler, maupun untuk industri, misalnya dalam pengayaan uranium dan pengolahan anggur.

Sentrifugasi • Proses yang melibatkan

penggunaan gaya sentrifugal untuk pemisahan campuran dan menghasilkan sedimentasi dengan menggunakan mesin sentrifuga.

• Komponen campuran yang lebih rapat akan bergerak menjauh dari sumbu sentrifuga dan membentuk endapan (pelet) menyisakan cairan supernatan yang dapat diambil dengan dekantasi.

Sentrifugasi • Komponen yang lebih padat dari campuran bermigrasi menjauh dari sumbu sentrifus, sementara komponen yang kurang padat dari campuran bermigrasi ke arah sumbu.

• Peningkatan gaya gravitasi efektif pada tabung reaksi lebih cepat dan sempurna menyebabkan endapan ("pelet") berkumpul di bagian bawah tabung.

Sentrifugasi • Solusi yang tersisa dengan tepat disebut "supernate" atau "supernatant liquid".

• Cairan supernatan kemudian dengan cepat tertuang dari tabung tanpa mengganggu endapan, atau ditarik dengan pipet Pasteur.

Sentrifugasi

• Laju sentrifugasi ditentukan oleh percepatan yang diterapkan pada sampel, biasanya diukur dalam putaran per menit (RPM) atau g.

• Kecepatan pengendapan partikel dalam sentrifugasi bergantung pada ukuran dan bentuknya, percepatan sentrifugal, fraksi volume padatan yang ada, perbedaan densitas antara partikel dan cairan, dan viskositas.

Homogenat sel Mitokondria, lisosom, peroksisom

Mikrosom dan vesikel kecil lainnya

Sel utuh, nukleus, sitoskeleton

Ribosom , virus, makromolekul besar

mikropipet

• alat yang digunakan untuk mengambil dan/atau memindahkan cairan dalam jumlah kecil secara akurat.

• Sebenarnya mikropipet mempunyai fungsi seperti pipet biasa, yaitu untuk memindahkan cairan atau larutan. Hanya saja beda akurasi antara mikropipet dengan pipet biasa.”

mikropipet

• Fungsi dari mikropipet ini digunakan untuk memindahkan cairan dalam jumlah yang kecil(mikro) secara akurat.

• Jika kita sebelumnya pernah pakai pipet ukur gelas, tentu akurasinya kurang presisi

• Mikropipet juga sering disebut dengan pipet otomatis. Selain tingkat ke-presisiannya yang tinggi dan volume yang bisa di setting, alat yang satu ini juga mudah dan nyaman dalam genggaman.

• Penggunaan mikropipet sebagai alat bantu di laboratorium tentu sangat penting guna mendukung aplikasi atau expertiment yang sedang di kerjakan.

Jenis

• berdasarkan jumlah channel pada mikropipet: – Single channel(hanya memiliki satu ujung masuk dan keluar) – Multi channel(memiliki banyak ujung masuk dan keluar)

• berdasarkan teknologi : – Mikropipet Manual(butuh penekanan) – Mikropipet Otomatis(dilengkapi dengan motor, modul

elektronik, display elektronik)

• berdasarkan volume : – Fixed volume mikropipet – Variable volume mikropipet

• fiturnya: – Mikropipet tanpa fitur autoclavable – Mikropipet dengan fitur autoclavable

• Tombol penekan / button / Plunger button, berfungsi untuk menyedot atau memompa larutan atau cairan dengan cara menekannya.

• Scale volume / parameter knob / tuas penyetel volume cairan, hanya terdapat di mikropipet dengan tipe variable volume.

• Tuas fungsi / function wheel, tuas yang digunakan untuk memilih menu pada mikropipet, karena beberapa mikropipet bisa saja memiliki beberapa fungsi seperti(menyedot, memompa, mencampur)

• Pipet tip / pipet tipcone / tips, merupakan aksesoris tambahan yang sangat penting karena mempengaruhi ke akuratan cairan dalam proses menyedot dan memompa larutan.

• Display / elektronik display / parameter volume, merupakan bagian yang memberikan gambaran berapa volume yang sedang di set.

Air displacement pipette

https://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipettehttps://en.wikipedia.org/wiki/Air_displacement_pipette

Mikropipet dapat mengambil volume minimum 0,2 µL dan volume maksimum 10.000 µL (10 mL).

Volume pipet yang tersedia secara umum

Rentang volume pipet yang kecil seperti 10–100 µL menghasilkan akurasi yang jauh lebih tinggi daripada rentang luas dari 0,1–1.000 µL per pipet. Sebaiknya pilih pipet terkecil yang dapat menangani volume yang dibutuhkan. Ini penting karena keakuratan menurun jika volume yang disetel mendekati kapasitas minimum pipet. Misalnya, jika 50 µl dibagikan dengan menggunakan pipet 5.000 µl, hasilnya akan kurang akurat dibandingkan penggunaan pipet 300 µl akan memberikan hasil yang lebih baik, sedangkan penggunaan pipet 50 µl akan lebih ideal

Cara Menggunakan Mikropipet

• Atur volume mikropipet dengan memutar/menekan tombol volume navigasi sesuai dengan yang dibutuhkan.

• Pasang Tips mikropipet sesuai dengan kebutuhan, proses pemasangan tips yang dianjurkan adalah dengan memutar-mutarnya, bukan mengetuk-ketukannya.

Cara Menggunakan Mikropipet

• Memegang mikropipet dengan kondisi tangan yang nyaman, beberapa artikel menyebutnya menyerupai simbol tangan like di facebook.

• Menyedot masuk dan memompa keluar cairan sesuai dengan kebutuhan. Pastikan anda melakukannya dengan cara yang benar dan tidak terburu-buru. Beberapa jenis mikropipet memiliki sensitifitas yang berbeda-beda pada setiap buttonnya. Jika anda pernah menggunakan beberapa jenis mikropipet, tentu anda bisa merasakan perbedaan pada setiap jenis mikropipet dan merk mikropipet seperti scilogex, thermo dan fischerbrand.

biosafety cabinet (BSC)

• ruang kerja laboratorium tertutup dan berventilasi untuk bekerja dengan aman dengan bahan yang terkontaminasi (atau berpotensi terkontaminasi) patogen yang memerlukan tingkat keamanan hayati yang ditentukan.

• Tujuan utama BSC adalah berfungsi sebagai sarana untuk melindungi pekerja laboratorium dan lingkungan sekitarnya dari patogen. Semua udara buangan disaring HEPA saat keluar dari BSC, menghilangkan bakteri dan virus berbahaya

Tipe 1. Biosafety Kelas I kecepatan minimum 0,38 m/s. Sementara, jendela depan ruangan tetap dibiarkan terbuka agar udara dapat masuk dan disaring dengan HEPA Filter. Dalam kelas ini, memang akan ada risiko kontaminasi pada sampel. Biasanya, biosafety ini digunakan untuk peralatan khusus seperti centrifuge. 2. Biosafety Kelas II Di kelas ini, biosafety yang diproteksi ada dua, yaitu produk sampel dan lingkungan. Cara kerjanya, udara dari luar + chamber ditarik oleh kipas hisap yang dipasang di atas lemari, kemudian disaring dengan HEPA Filter, baru digunakan untuk sirkulasi atau balik keluar kembali. Dengan sistem seperti ini, personel tetap aman karena udara diarahkan pada sistem saringan. 3. Biosafety Kelas III Pada kelas ini, perlindungan yang diberikan sangat maksimal, meliputi personel, produk sampel, dan lingkungan. Ruangan didesain sedemikian rupa sehingga sirkulasi udara di dalam chambar tertutup rapat. Semua material yang keluar masuk harus menggunakan pass box. Personel juga harus menggunakan sarung tangan agar tidak langsung dengan produk sampel saat bekerja.

Plate readers

• adalah instrumen yang digunakan untuk mendeteksi peristiwa biologis, kimiawi, atau fisik sampel di pelat mikrotiter.

• banyak digunakan di laboratorium untuk berbagai aplikasi, mulai dari enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) hingga pengukuran NADH, deteksi interaksi protein-protein hingga pengujian anggur. Microplate reader juga banyak digunakan dalam penelitian dasar, imunologi, validasi bioassay, pengembangan obat dan proteomik.

Plate readers • Instrumen multiguna

ini memfasilitasi penelitian dengan meminimalkan waktu operasional, meningkatkan proses dan efisiensi dan menghemat biaya.

• Reaksi sampel dapat diuji dalam pelat mikrotiter format 1-1536 dengan baik.

Plate readers • Format pelat mikro yang paling

umum digunakan di laboratorium penelitian akademis atau laboratorium diagnostik klinis adalah 96 lubang (matriks 8 kali 12) dengan volume reaksi tipikal antara 100 dan 200 µL per sumur.

• Pelat mikro dengan kepadatan lebih tinggi (pelat mikro 384 atau 1536 sumur) biasanya digunakan untuk aplikasi skrining, ketika banyak jumlah sampel per hari yang diproses dan biaya pengujian per sampel menjadi parameter penting, dengan volume pengujian tipikal antara 5 dan 50 µL per sumur .

Plate readers • Format pelat mikro yang paling

umum digunakan di laboratorium penelitian akademis atau laboratorium diagnostik klinis adalah 96 lubang (matriks 8 kali 12) dengan volume reaksi tipikal antara 100 dan 200 µL per sumur.

• Pelat mikro dengan kepadatan lebih tinggi (pelat mikro 384 atau 1536 sumur) biasanya digunakan untuk aplikasi skrining, ketika banyak jumlah sampel per hari yang diproses dan biaya pengujian per sampel menjadi parameter penting, dengan volume pengujian tipikal antara 5 dan 50 µL per sumur .

• Banyak mode pendeteksian – absorbansi – intensitas fluoresensi – Luminesensi – fluoresensi yang

diselesaikan waktu – polarisasi fluoresensi)

• tersedia berdiri sendiri di pembaca pelat khusus, tetapi sangat sering ditemukan saat ini digabungkan menjadi satu instrumen (pembaca pelat multi-mode).

• Ada juga instrumen untuk mengukur cahaya dinamis atau statis yang tersebar dari sampel dalam pelat mikro.

• Kisaran aplikasi untuk pembaca pelat multi-mode sangat besar.

CARA KERJA

• Pembaca pelat mikro mendeteksi sinyal cahaya yang dihasilkan oleh sampel yang telah dipipet ke dalam pelat mikro.

• sinyal cahaya yang dihasilkan oleh sampel, diubah oleh sampel atau dikirim melalui sampel kemudian diukur dengan detektor, biasanya photomultiplier tube (PMT).

• PMT mengubah foton menjadi listrik yang kemudian diukur oleh microplate reader. Keluaran dari proses ini adalah angka-angka dimana sampel dihitung.

CARA KERJA

• Beberapa tes yang paling umum adalah: – ELISA – Tes pertumbuhan protein dan sel Protein – interaksi protein – Tes reporter – Kuantitasi asam nukleat – Interaksi molekuler – Aktivitas enzim – Toksisitas sel, proliferasi, dan viabilitas – Kuantifikasi ATP – Immunoassay

Thermal cycler

• juga dikenal sebagai thermocycler, mesin PCR atau penguat DNA

• peralatan laboratorium yang paling umum digunakan untuk memperkuat segmen DNA melalui polymerase chain reaction (PCR).

• juga dapat digunakan di laboratorium untuk memfasilitasi reaksi sensitif suhu lainnya, termasuk pencernaan enzim restriksi atau diagnosis cepat.

• Perangkat memiliki blok termal dengan lubang di mana tabung yang menahan campuran reaksi dapat dimasukkan. Mesin ini kemudian menaikkan dan menurunkan suhu blok secara terpisah, langkah-langkah yang telah diprogram sebelumnya.

• blok termal dengan lubang dapat menampung tabung reaksi (tube) yang menampung reagensia. Thermal Cycler kemudian mengontrol suhu, naik dan turun sesuai dengan program yang dimasukan kedalam komputer PCR tersebut, sehingga proses polymerase chain reaction (PCR) terjadi

Komponen pelengkap mesin PCR

• Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.

• Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam reaksi berantai (Polimerase Chain Reaction) PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan dikopi dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.

Komponen pelengkap mesin PCR

• rDNA templat

• nukleotida (blok pembangun DNA).

• Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.

Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:

• Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).

• Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.

• Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.