ltm biologi molekuler pemicu 3

8/16/2019 Ltm Biologi Molekuler Pemicu 3

1/15

LTM BIOLOGI MOLEKULER PEMICU 3

DETEKSI ASAM NUKLEAT

RENNO AFRIANSYAH (1406577783)

ABSTRAK

Asam nukleat adalah senyawa organik kompleks yang ditemukan di semua organisme hidup. Asam

nukleat ditemukan pada tahun 1869 oleh ahli biokimia Swiss Johann Friedrich Miescher 18!!"189#$.

Asam nukleat ditemukan di kromosom dari setiap sel hidup. %romosom ditemukan di inti setiap sel

hidup. Asam nukleat merupakan bagian penting dari kromosom karena mereka memegang semua

gen yang terdiri dari &'A organisme. &'A terus"menerus mengarahkan dan memelihara kesehatan

organisme dan lingkungan internal dengan mengarahkan produksi protein( yang mengarahkan

produksi hormon( protein lain dan en)im. &alam deteksi asam nukleat( secara umum( dibagi men*adi

dua yaitu analisis kualitati+ dan analisis kuantitati+.. Analisis kualitati+ asam nukleat dilakukan untuk

mengetahui keberadaan &'A,-'A. Sedangkan analisis kuantitati+ asam nukleat dilakukan untuk

mengetahui kandungan atau *umlah &'A,-'A yang ada dalam suatu sampel. erdapat beberapa

cara analisis kualitati+ asam nuklat( yaitu staining( sentri+ugasi( &'A se/uencing( elektro+oresis gel(hibridisasi( blotting( -estriction Fragment 0ength olymorphism( dan &'A microarray(. Sedangkan

analisis kuantitati+ dapat dilakukan dengan metode olymerase 2hain -eaction( SA34 methode( dan

spektroskopi 5"7S. endeteksian dari asam nukleat banyak sekali diman+aatkan dalam bidang

kedokteran dan biokimia( umumnya analisis gen"gen sel abnormal.

K! "#$%& &eteksi asam nukleat( analisis kualitati+( analisis kuantitati+( staining( sentri+ugasi( &'A

se/uencing( elektro+oresis gel( hibridisasi( blotting( -estriction Fragment 0ength olymorphism( &'A

microarray( olymerase 2hain -eaction( SA34 methode( spektroskopi 5"7S.

A' A$&& K#&!!&* A+ N#",!

Secara sederhana metode ini bertu*uan untuk mengetahui keberadaan gen tertentu di dalam asamnukleat( di berat molekul dari &'A,-'A( dan urutan kode genetic dari &'A,-'A. Metode ini terdiridari staining( sentri+ugasi( &'A se/uencing( elektro+oresis gel( hibridisasi( blotting( -estrictionFragment 0ength olymorphism( dan &'A microarray.

1' S!&$&$- Staining atau pewarnaan digunakan untuk mengidenti+ikasi &'A dan -'A dengan

memberikan pewarna dye$ sehingga meningkatkan hasil isualisasi pengamatan di bawahmiksroskop:

rosedur umum staining yaitu persiapan +i;ation( permeabili)ation( mounting$( pewarnaan

yang tepat( dan pewarnaan negati+:

erdapat dua macam metode staining( yaitu in io pewarnaan *aringan hidup$ dan in itropewarnaan pada sel atau struktur yang sudah diisolasi dari komponen biologinya$:


2/15

Aplikasi


3/15

&'A se/uencing merupakan suatu metode untuk mengetahui secara tepat urutan nukleotidayang ada di dalam &'A. &'A se/uencing ini terbagi men*adi metode( yaitu metode Sanger danmetode Ma;am"3ilbert. ada metode Sanger proses se/uencing meman+aatkan en)im &'Apolymerase( sedangkan pada metode Ma;am"3ilbert proses se/uencing berdasar pada reaksipeluruhan kimia.

ahapan ker*a metode Sanger

1. Mendenaturasi &'A yang telah diisolasi dari sampel dengan pemberian panas atau menggunakanen)im restriksi( sehingga rantai ganda &'A akan terpisah men*adi rantai tunggal

. Sekuens primer dihubungkan dengan rantai tunggal &'AD. erbentuk empat pasang potongan rantai primer yang terputus akibat bantuan &'A polymerase

dan dideo;ynukleotida!. otongan rantai primer yang terputus ini akan tetap terikat pada rantai tunggal &'A yang berasal

dari sampel( untuk memutuskannya perlu tambahan panas dan +ormamida#. otongan rantai primer yang telah terpisah ini dipisahkan kembali dengan metode elektro+oresis

gel6. 5rutan sekuens pada &'A sampel bisa diketahui dengan menganalisis dideo;ynukleotida yang

terdapat pada potongan rantai primer

rinsip ker*a metode Ma;am"3ilbert

1. -antai &'A yang telah diisolasi ditandai dengan radioisotop D pada u*ung #E. &'A tersebut di denaturasi dan masing"masing rantai tunggal &'A yang telah terpisah diisolasi

untuk di se/uencing secara terpisahD. Mereaksikan tiap rantai tunggal &'A yang telah diisolasi dengan dimetil sul+at dan hidra)in.

'antinya dimetil sul+at akan bereaksi dengan purin( dan hidra)in bereaksi dengan pirimidin untukmematahkan ikatan glikosida antara gula ribosa dengan basa

!. iperidin akan men*adi katalis untuk ikatan +os+odiester( yaitu tempat dimana basa pada ikatanglikosida sebelumnya telah digantikan

#. Masing"masing +ragmen rantai tunggal hasil reaksi pada tahap sebelumnya dipisahkan denganmetode elektro+oresis gel

6. Casil pemisahan ini dibaca dengan autoradiogram untuk menentukan sekuens &'A sampel

ada -'A se/uencing dengan metode Sanger ada sedikit perbedaan dengan yang sudahdi*elaskan sebelumnya. Si+at -'A kurang stabil bila dibandingkan dengan &'A( oleh karena itu -'Aini harus diubah terlebih dahulu men*adi c&'A dengan menambahkan en)im transcriptase. Setelahberubah men*adi c&'A maka proses selan*utnya adalah sama mulai dari tahap awal.

S$-,/ T,/+&$& R$!& M+G&.,/! D,-/& K&+&

4n)imatik %imiawi

Membutuhkan sedikit &'A puri+ikasi Membutuhkan banyak &'A puri+ikasi( danbanyak langkah puri+ikasi intermediet

idak ada pelabelan untai &'A Menggunakan pelabelan untai &'A


4/15

T., 1' erbedaan antara Sanger dan Ma;am"3ilbert

G+./ 3' Casil &'A se/uencing

4' E,"!/*/,& G, 4lektro+oresis digunakan untuk memisahkan +ragmen &'A,-'A berdasarkan tingkat migrasi

dalam medan listrik yang ditentukan oleh muatan( bentuk( dan ukuran. Misal semakin pendek

+ragmen &'A maka gerakkannya semakin cepat: rinsip dasar elektro+oresis adalah pergerakkan molekul bermuatan dalam medan listrik(

dimana diketahui bahwa &'A bermuatan negati+. &alam hal ini asam nukleat yang bermuatannegati+ akan menu*u elektroda positi+:

rosedur umum elektro+oresis gel yaitu menuangkan gel( memasukkan sampel( elektro+oresis(

pewarnaan dan isualisasi( dan,atau prosedur lan*utan.


5/15

T., ' erbedaan elektro+oresis gel agarosa dan elektro+oresis gel poliakrilamida

G+./ 5. Casil elektro+oresis gel

#. HIBRIDISASI

Cibridisasi merupakan metode untuk menemukan gen tertentu di dalam &'A terdenaturasi

yang berasal dari kromosom utuh dengan menggunakan suatu probe. Metode inimeman+aatkan

kemampuan asam nukleat untuk membentuk molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantaitunggal dengan basa yang komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai. Metode ini

dilakukan pada media wadah tertentu misal kaca preparat atau cawan petri$. Probe adalah sekuensasam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen

dalam sekuens sampel &'A ataupun -'A. Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan basa nitrogen &'A dan -'A sampel. Probe biasanya berupa m-'A atau single

strained &'A ss&'A$. Probe biasanya terdiri dari @"D@ untaian basa dan diberi penanda radioakti+

atau penanda pendar. -adioakti+ isotop +os+or atau +os+odiester yang berikatan pada &'A.

eknik hibridisasi meliputi dua proses( yaitu

&enaturasi pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer$

&'A sampel dipisahkan men*adi rantai tunggal. &'A biasanya dipanaskan pada suhu 1@@2 atau

dengan mengubah larutan tersebut dengan pC yang sangat tinggi pC G 1D$ untuk memecah

ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat akan

terpisah. Selain itu( pemisahan *uga dapat menggunakan en)im restriksi.

-enaturasi perpaduan kembali dua rantai asam nukleat$.Probe dipasangkan dengan &'A sampel dan kemudian dia analisis. &ilakukan dengan carapendinginan.


6/15

Metode ini menggunakan probe yang mengandung komponen ber"+luoresen. %omponen ini dapatberpendar *ika dikenakan sinar 5 sehingga lokasi gen yang dicari dapat diketahui. Adapun probeyang digunakan hanya berupa potongan asam nukleat pendek untuk *enis gen tertentu sa*a.

Genomic In Situ Hybridization 37SC$

rinsip dasarnya hampir sama dengan F7SC( hanya sa*a komponen yang men*adi probe adalahkeseluruhan genom &'A dari suatu spesies. Metode ini digunakan untuk memeriksa penyebarangenomic &'A interspesies dan organisasi sekuensnya.

5ntuk pengu*ian dengan hibridisasi( diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer

dicampur dengan +ragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid pada kondisi yang

mendukung ter*adinya hibridisasi. roses hibridisasi dapat *uga dilakukan dalam larutan bukan bahan

solid$.


7/15

G+./ 6'


8/15


9/15

G+./ :. 0angkah Analisis SA34

SA34 memiliki beberapa kelebihan seperti tidak diperlukannya hibridisasi( gen yang dideteksi

dapat diketahui setelah percobaan yang berarti gen yang tidak diketahui sebelumnya dapat dianalisisdan ditemukan apa gen tersebut( dapat mengidenti+ikasi gen"gen baru menggunakan tag sebagai2- primer. 'amun( SA34 *uga memiliki beberapa kekurangan berikut( yaitu SA34 tidak mampumengukur leel ekspresi gen aktual( ukuran rata"rata tag yang diproduksi selama analisis SA34adalah sepuluh basis dan ini dapat membuat memasangkan tag kepada transkrip spesi+ik dengantepat men*adi sulit( dan memasangkan tiap tag kepada transkrip m-'A dapat men*adi lebih susahdan ambigu *ika kesalahan sequencing *uga diperhitungkan dalam proses.

10' POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

2- merupakan teknik perbanyakan ampli+ikasi$ potongan &'A secara in itro dalam tabung

reaksi$ pada daerah spesi+ik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. rimer yangdigunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah &'A untai tunggal yang urutannyakomplemen dengan &'A cetakannya. Metode ini merupakan metode yang paling sensiti+ untukmendeteksi asam nukleat karena primer perbanyakan yang sesuai dapat diatur. Sensitiitas 2-mengikuti persamaan eksponensial berikut

'n H '@ ; 1?4$n

&imana 'n H *umlah molekul &'A setelah n siklus dari 2- '@ H *umlah molekul sebelum 2-

4 H e+isiensi dari ampli+ikasi @I4I1$. 'ilai 4 yang mendekati @ menandakan 2-mendekati plateau p!ase

n H banyak siklus

2- melakukan perbanyakan &'A antara dua primer tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel in

io$. &ibutuhkan &'A untai ganda yang ber+ungsi sebagai cetakan template$ yang mengandung

&'A"target yang akan diampli+ikasi$ untuk pembentukan molekul &'A baru( en)im &'A


10/15

polimerase( deoksinukleosida tri+os+at d'$( dan sepasang primer oligonukleotida. Selan*utnya(

kedua primer akan saling mengenali dan berikatan dengan untaian &'A komplemennya yang terletak

pada awal dan akhir +ragmen &'A target sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus

hidroksil bebas pada karbon DE. Setelah kedua primer menempel pada &'A cetakan( &'A polimerase

mengatalisis proses peman*angan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen

dengan urutan nukleotida cetakan. &'A polimerase mengatalisis pembentukan ikatan +os+odiester

antara >C pada karbon DE dengan gugus #E +os+at d' yang ditambahkan sehingga proses

penambahan d' yang dikatalisis oleh en)im &'A polimerase ini berlangsung dengan arah #EDE.eristiwa ini disebut reaksi polimerisasi. 4n)im &'A polimerase hanya akan menambahkan d'

yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai &'A cetakan.

%omponen proses 2-

1. 4n)im &'A olymerase

. rimer oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan &'Atemplate yang akan diperbanyak.

D. -eagen lainnya d' untuk reaksi polimerisasi dan bu++er yang mengandung Mg2l.%onsentrasi ion Mg? sangat penting untuk mempengaruhi proses primer annealing ( denaturasi(spesi+isitas produk( aktiitas en)im( dan +idelitas reaksi.


11/15

G+./ 10' Ampli+ikasi otongan &'A

ahapan 2-

1. &enaturasi

Selama proses denaturasi( &'A untai ganda membelah men*adi dua untai tunggal. Cal inidisebabkan suhu denaturasi yang tinggi mampu memutuskan ikatan hidrogen antara basa"basayang komplemen. Akibat denaturasi( seluruh reaksi en)im tidak ber*alan( misalnya reaksipolimerisasi pada siklus sebelumnya. &enaturasi biasanya dilakukan antara suhu 9@o2 K 9#o2.

. enempelan rimer Annealing $

ada tahap ini( primer menu*u ke daerah spesi+ik yang berkomplementer dengan urutan primer.7katan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplementernya pada template.roses ini ter*adi pada suhu #@o2 K 6@o2. Selan*utnya( &'A polimerase akan berikatan sehinggaikatan hidrogen tersebut akan men*adi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukanreaksi polimerisasi selan*utnya( misalnya pada Lo2.

D. -eaksi polimerisasi extension$

-eaksi polimerisasi perpan*angan rantai$ ter*adi pada suhu Lo2. rimer yang telah menempel

tadi akan mengalami perpan*angan pada sisi DEnya dengan penambahan d' yang komplemendengan templat oleh &'A polimerase. Jika siklus dilakukan berulang"ulang maka daerah yangdibatasi oleh dua primer akan diampli+ikasi secara eksponensial disebut amplikon yang berupauntai ganda$ sehingga mencapai *umlah salinan yang dapat dirumuskan dengan n$; dimana nadalah *umlah siklus dan ; adalah *umlah awal molekul &'A.

2- terbagi men*adi macam( yaitu -eal"ime 2- dan -eal 2ompetitie 2-.

R,T&+, PCR

"eal #ime P$" adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi 2-. &alam ilmu biologimolekular( "eal #ime P$" %uantitatie "eal #ime Polymerase $!ain "eaction atau &inetic Polymerase $!ain "eaction$ adalah suatu teknik penger*aan 2- di laboratorium untukmengampli+ikasi memperbanyak$ sekaligus menghitung kuanti+ikasi$ *umlah target molekul &'Ahasil ampli+ikasi tersebut. "eal #ime 2- memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuanti+ikasisebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan &'A atau *umlah relati+ setelah dinormalisasi terhadapinput &'A atau gen"gen penormal yang ditambahkan$ sekaligus terhadap sekuens spesi+ik darisampel &'A yang dianalisa.


12/15

2ara ker*a -eal ime 2- yang utama adalah &'A yang telah diampli+ikasi dihitung setelahdiakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus ampli+ikasi selesai. erdapat duacara yang umum digunakan

Menggunakan )at pewarna +luoresensi yang akan terinterkalasi dengan &'A rantaiganda ds&'A$ misalnya S=


13/15

G+./ 11' -eal competitie 2- mendekati analisis gen. otal-'A dicatat dengan heksamer yang random. Selan*utnya( sebuah

&'A kompetiti+ oligonukelotida dengan basa yg berbeda 1 darigen$ ditambahkan pada 2-. -eaksi penambahan basa ini

dilakukan dengan menamg berbeda.

10' S9,"!/"9&

Spektroskopi digunakan untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian &'A,-'A suatu sampel

berdasarkan kemampuan pita basa purin dan pirimidin$ dalam menyerap cahaya( dimanalarutan akuades ddC>$ sebagai pelarut dan blanko:

erdapat *enis spektroskopi yang sering digunakan( yaitu

S9,"!/"9& S&$/ T+9" S9,"!/"9& U


14/15

KESIMPULAN

&eteksi asam nukleat dapat dilakukan melalui u*i kualitati+ dan u*i kuantitati+. 5*i kualitati+ bertu*uan

mengetahui urutan &'A atau -'A yang ingin diu*i dan mengidenti+ikasi keberadaan makromolekul.

Sedangkan u*i kuantitati+ bertu*uan mengetahui konsentrasi &'A atau -'A sampel dan melakukan

identi+ikasi &'A atau -'A tertentu terhadap molekul"molekul &'A atau -'A lain.


15/15

%arp( 3erald. @1@. $ell and Molecular )iology $oncepts and 0xperiments( * t! ed . 'ew JerseyJohn Biley Q Sons.

%umar( Anand dan Siddi/ue( -.A. NSage echnology and 7ts ApplicationO. Pitt(edu. &iakses 16Februari @1!:

Mashek( Jamie. N&'A microarrayO. $!emistry(montana(edu. &iakses 16 Februari @1!:

Stains+ield( Billiam.( Jaime( S. 2olome( -aul( J. 2ano. @@D. Sc!aum3s 0asy 4utlines Molecular and $ell )iology( 'ew =ork he Mc3raw"Cill 2ompanies( 7nc.

Strachan ( -ead A. 1999. Human Molecular Genetics . nd ed . 'ew =ork Biley"0iss.

ltm biologi molekuler pemicu 3

Documents