Page 1Tes molekuler untuk MenentukanMycobacteriumlepraeViabilitas di Jaringan dari eksperimental TerinfeksiTikusRahmat L. Davis1, Nashone A. Ray2, Ramanuj Lahiri2, Thomas P. Gillis2, James L. Krahenbuhl2.Diana L. Williams2, Linda B. Adams2*1 Sekolah Kedokteran Hewan, Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana, Amerika Serikat, 2 Departemen Kesehatan dan Layanan Kemanusiaan, KesehatanSumber Daya dan Jasa Administrasi, Sistem Kesehatan Biro, National Hansen Disease Program, Baton Rouge, Louisiana, Amerika SerikatAbstrakLatar Belakang:Ketidakmampuan Mycobacterium leprae tumbuh pada media axenic telah mengharuskan teknik khusus dalammemesan untuk menentukan kelangsungan hidup organisme ini.Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan sederhana dan sensitif molekulassay untuk menentukan M. leprae kelangsungan langsung dari jaringan yang terinfeksi.Metodologi / Temuan Prinsip:Transkripsi terbalik kuantitatif PCR (QRT-PCR) tes dua M. leprae-tertentu berdasarkantingkat ekspresi esxA, pengkodean protein ESAT-6, dan hsp18, pengkodean heat shock protein 18 kDa, yangmaju dan diuji menggunakan perampok yang terinfeksi (FP) jaringan dari kedua imunokompeten dan immunocompromised (athymic

nu / nu) tikus. Selain itu, kemampuan tes ini untuk mendeteksi efek terapi obat anti-kusta pada M. leprae viabilitasditentukan dengan menggunakan rifampisin dan rifapentin, masing-masing pada 10 mg / kg selama 1, 5, atau 20 dosis harian, dalam nu athymic / nu Model FP.Pencacahan molekul (RLEP PCR) dan kelangsungan hidup penentuan (QRT-PCR) dilakukan melalui metodologi TaqMan diDNA dan RNA, masing-masing, dimurnikan dari etanol-tetap jaringan FP dan dibandingkan dengan pencacahan konvensional(Penghitungan mikroskopis BTA) dan tes kelayakan (radiorespirometry, kelayakan pewarnaan) yang digunakan basilbaru dipanen dari kontralateral FP. Kedua tes molekuler dan konvensional menunjukkan pertumbuhan dan kelangsungan hidup yang tinggiM. leprae di nu / nu FP selama infeksi 4 bulan. Sebaliknya, kelangsungan hidup adalah nyata menurun 8 minggu ditikus imunokompeten. Rifapentin signifikan mengurangi kelangsungan hidup bakteri setelah 5 perawatan, sedangkan rifampisin diperlukanhingga 20 pengobatan untuk khasiat yang sama. Obat tidak efektif setelah pengobatan tunggal. Selain itu, gen tuanEkspresi dipantau dengan persiapan RNA yang sama.Kesimpulan:hsp18 dan esxA QRT-PCR merupakan indikator molekul sensitif, andal mendeteksi viabilitas M. leprae pada jaringantanpa perlu untuk isolasi bakteri atau pemrosesan langsung, membuat tes ini berlaku untuk in vivo skrining obatdan menjanjikan untuk aplikasi klinis dan lapangan.Citation: Davis GL, Ray NA, Lahiri R, Gillis TP, Krahenbuhl JL, et al.(2013) Molekuler Tes untuk Menentukan Mycobacterium leprae Viabilitas di Jaringan dariEksperimental Terinfeksi Mice. PLoS Negl Trop Dis 7 (8): e2404. doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404Editor: Christian Johnson, Fondation Raoul Follereau, PrancisMenerima 17 Mei 2013; Diterima 23 Juli 2013; Diterbitkan 22 Agustus 2013Ini adalah sebuah artikel akses terbuka, bebas dari semua hak cipta, dan dapat secara bebas direproduksi, didistribusikan, ditransmisikan, dimodifikasi, dibangun di atas, atau digunakan oleh siapa saja untuktujuan yang sah. Karya ini dibuat tersedia di bawah Creative Commons cc0 dedikasi domain publik.Pendanaan: GLD adalah penerima National Institutes of Health Biomedical Research Pengalaman Veteriner Mahasiswa Award.Proyek ini didanai sebagianoleh HRS, Misi Kusta Amerika, dan Society of St. Lazarus Yerusalem.Para penyandang dana tidak memiliki peran dalam desain penelitian, pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk

mempublikasikan, atau penyusunan naskah.Bersaing Interests: Para penulis telah menyatakan bahwa tidak ada kepentingan bersaing ada.* E-mail: ladams@hrsa.govPengenalanMycobacterium leprae, patogen intraseluler obligat danagen etiologi penyakit kusta, tidak dapat tumbuh di media axenic.Karakteristik ini, bersama dengan yang sangat lambatwaktu generasi 12-14 hari, menghalangi eksperimenmenangani bahkan pertanyaan yang paling mendasar tentang nyagenetika, metabolisme, kepekaan terhadap anti-mikroba, dan patologisgenicity. Model hewan hidup yang diperlukan untuk bakteribudidaya. Pertumbuhan terbatas terjadi di footpads (FP) daritikus konvensional [1,2], sedangkan pertumbuhan yang lebih produktif adalahdicapai pada hewan pengerat imunosupresi [3-6] dan armadillo[7]. Dalam model ini multiplikasi bakteri diukur dalamhal bulan ke tahun.Penghitungan mikroskopis BTA (AFB) digunakan untukmenghitung M. leprae [2,8,9]. Meskipun metode ini dianggapstandar emas, sekarang saatnya mengkonsumsi, tenaga kerja danPembatasan berkaitan dengan kekhususan. Ini menyampaikan jumlahbakteri hadir dan tidak membedakan antara hidup dan matibasil. Baru-baru ini, teknik molekuler untuk pencacahanM. leprae berdasarkan real time PCR amplifikasi berulangelemen, RLEP, dijelaskan [10]. RLEP PCR memiliki korelatifHasil penghitungan dengan mikroskopis dan memungkinkan untuk cepat dankuantifikasi spesifik M. leprae dari kedua mouse dan armadillojaringan. Seperti menghitung mikroskopis, tidak menyediakan mutlakdata pada kelangsungan hidup M. leprae. Jumlah AFB dan RLEP PCR hasilInformasi viabilitas hanya secara tidak langsung, seperti nomor bakteri meningkatdari waktu ke waktu dalam pertumbuhan populasi.PLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org1Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 2Selama bertahun-tahun, satu-satunya cara untuk benar-benar menilai kelayakan daripopulasi tertentu dari M. leprae adalah untuk menyuntik pengenceran serialdari yang baru dipanen basil ke FP tikus bagian [11,12].Membutuhkan ratusan tikus dan setidaknya satu tahun subkultur kelengkap, metode ini, sementara efektif, sangat tidak praktis karena

lamanya waktu untuk mendapatkan hasil, serta biaya dan nomorhewan percobaan diperlukan. Dalam upaya untuk menyederhanakan danmempercepat penentuan kelayakan untuk M. leprae, sejumlah testelah dikembangkan yang menyelidiki penanda pengganti darikelangsungan hidup, seperti integritas dinding sel atau metabolisme. Ini termasukpengukuran indeks morfologi [13,14], PGL-1 sintesis[15,16], generasi intraseluler ATP [16-20], asam palmitatoksidasi dalam sistem BACTEC [9,21] dan oleh radiorespirometry(RR) [9,18,20,22,23], dan berbagai noda kelayakan [17,24-27].Saat ini, teknik yang paling umum digunakan adalah RR danBacLight viabilitas noda [27].Metode ditingkatkan untuk penentuan kelayakan yang lebihsensitif dan user friendly akan membantu untuk klinis dantujuan penelitian. Sejumlah tes molekuler telahdiusulkan untuk menentukan M. leprae kelayakan di lingkungan atausampel klinis berdasarkan 16S ribosom RNA [28-30] ataumessenger RNA (mRNA) ([31,32]. Baru-baru ini, sebuah kuantitatifuji molekul reverse transkripsi berdasarkan (QRT) -PCR adalahdikembangkan untuk M. leprae yang digunakan transkrip gen untuk sodamRNA [30]. Pengujian ini adalah 100% khusus untuk M. leprae danberlaku sebagai indikator kelayakan untuk basil pulih dari singkatbudaya makrofag jangka. Selanjutnya, data molekuler dariin vitro percobaan menunjukkan korelasi yang kuat dengan RR danBacLight viabilitas pewarnaan.Studi saat ini dibangun di atas prinsip-prinsip ini dengan tigatujuan dalam pikiran. Pertama, kami berusaha untuk mengembangkan sensitif danuji molekul sederhana yang dapat secara akurat menentukan kelayakanM. leprae dalam jaringan yang terinfeksi. Kedua, kami menguji kelayakanmenghilangkan langkah-langkah isolasi bakteri dan menentukanviabilitas menggunakan asam nukleat diisolasi dari jaringan FP etanol-tetap.Terakhir, kami mengevaluasi kapasitas tes molekuler untukmemonitor khasiat obat dengan membandingkan dua obat kusta di tinggibeban bakteri, athymic Model FP tikus. Hasil penelitian menunjukkan bahwabila dibandingkan dengan metode konvensional RR dan BacLightviabilitas pewarnaan, yang hsp18 dan esxA QRT-PCR tes yangindikator biologis sensitif dan dapat diandalkan M. leprae kelayakan dijaringan, dan bahwa ekspresi gen tuan bersamaan bisa menjadidipantau dari persiapan RNA yang sama.Bahan dan MetodePernyataan EtikaStudi ini dilakukan di bawah protokol ilmiah

dan disetujui oleh Penyakit Program Hansen NasionalGunakan Komite Kelembagaan Perawatan Hewan dan (Jaminan# A3032-01), dan dilakukan sesuai dengan semua negaradan undang-undang federal dalam kepatuhan dengan kebijakan PHS dan yang dituangkan dalamPanduan untuk Perawatan dan Penggunaan Laboratorium Hewan, Edisi Kedelapan.M. leprae dan infeksi tikusM. leprae, saring Thai-53, dipertahankan di athymic nu / tikus numelalui bagian serial. Basil yang baru dipanen disimpan di 4uCdan digunakan dalam waktu 24 jam dari panen [9]. Dalam penelitian ini, BALB / cdan tikus nu / nu athymic (Harlin Sprague Dawley-, Inc., Indianap-olis, IN) terinfeksi oleh inokulasi masing-masing belakang FP dengan 36107M.leprae di 0,03 ml PBS (Irvine Ilmiah, Santa Ana, CA) [33,34].FP dipanen pada Hari 1 infeksi pasca dan pada 4, 8, 12 dan 17minggu.Terapi obatPada 18 minggu pasca infeksi, kelompok M. leprae yang terinfeksi nu / nutikus diperlakukan, oleh gavage, dengan rifampisin (RMP, 10 mg / kg) ataurifapentin (RPT, 10 mg / kg) emulsi di hidroksipropil-b-siklodekstrin / La-fosfatidilkolin. Semua obat yang dibelidari Sigma-Aldrich (St Louis, MO). Masing-masing obat diberikansebagai dosis tunggal, lima dosis harian, atau dua puluh dosis harian (5 hari perminggu selama 4 minggu). Tikus kontrol diberi kendaraan saja. FP yangdipanen 1 bulan setelah menyelesaikan pengobatan untuk setiap rejimen.Tikus FP panenKaki yang didesinfeksi dengan 70% etanol dan Betadine, yangkulit dihapus, dan jaringan FP dipotong. Layak M. leprae yangdikumpulkan segera dari FP yang tepat. Jaringan FP kiri yangdisimpan dalam 70% etanol di 220uC sampai diproses untuk DNA danPemurnian RNA.M. leprae isolasiUntuk panen basil, jaringan FP yang tepat yang cincang danlembut homogen di Tenbroeck penggiling kaca jaringan genggam(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) dalam 2,5 ml RPMI (Hidup Technol-ogies, Grand Island, NY) yang berisi 50mg / ml ampisilin (Sigma-Aldrich) dan tripsin. Setelah inkubasi pada 37uC selama 15 menit dan

lambat kecepatan sentrifugasi (1006g) selama 1 menit untuk menghilangkan sebagian besarpuing-puing jaringan, supernatan yang pellet (10,0006 g untuk30 menit), disuspensi, dan disonikasi di RPMI + 10% FBS(HyClone Laboratories, Logan, UT) + ampisilin. Bakteri inisuspensi menjadi sasaran penghitungan mikroskopis, BacLightviabilitas pewarnaan, dan RR.Penghitungan mikroskopis AFBTiga smear dibuat dari setiap sampel FP dan jumlahbasil dalam dua puluh bidang mikroskopis per smear dihitung untukmenentukan jumlah AFB hadir dalam FP tertentu [8].Data dilaporkan sebagai mean + / 2 SD dari 4-10 tikus per kelompok.Radiorespirometry (RR)RR dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [9]. Secara singkat, M. lepraedari FP individu dihentikan dalam 1,0 ml BACTECPenulis RingkasanM. leprae, agen penyebab kusta, tidak dapat tumbuhpada media kultur laboratorium. Karakteristik ini, bersama denganwaktu generasi yang sangat panjang dari 12-14 hari, membuatstudi tentang patogenisitas organisme ini danpengujian eksperimental obat baru untuk pengobatankusta sangat sulit. Kami mengembangkan dua M. leprae-transkripsi terbalik tes PCR spesifik kuantitatif dandiuji utilitas mereka sebagai penanda biologis M. lepraeviabilitas dalam spesimen jaringan. Tes ini bisa mendeteksiviabilitas tinggi basil tumbuh di imunosupresitikus serta efek penghambatan obat anti-kustapengobatan, atau sistem kekebalan tubuh inang di immunocom-tikus petent. Persiapan RNA juga berhasildigunakan untuk mendeteksi ekspresi gen tuan rumah. Applica- Thetion dari tes ini untuk berbagai model eksperimental akankarakterisasi manfaat dari infeksi atau obat baruscreening. Selanjutnya, karena tes ini memanfaatkan tetapjaringan, aplikasi potensi mereka untuk klinis dan lapanganpengaturan dapat memungkinkan pemantauan M. leprae kelayakan dihubungannya dengan respon imun host selamapengobatan.Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org2Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 37H12B menengah (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) dalam 6 mlkaca shorty vial (Wheaton Industries Inc, Millville, NJ) dengantopi tersisa. Vial ditempatkan ke dalam botol cairan kilaudengan 20.640 strip Whatman # 42 kertas filter (Fisher Scientific)yang telah direndam dalam Kodak konsentrat I (Eastman KodakCo, Rochester, NY) dan dikeringkan.14CO2evolusi diukursetiap hari selama tujuh hari. Hasil dihitung sebagai cpm14CO2per 106basil dan dilaporkan sebagai mean + / 2 SD dari 4-10 tikus per kelompok.Viabilitas pewarnaanM. leprae dari FP individu dicuci dua kali dalam garam sterildan bernoda menggunakan BacLight Viabilitas Pewarnaan Kit (HidupTeknologi) seperti yang dijelaskan sebelumnya [27]. Secara singkat, bakteriSuspensi diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar di6mM Syto9 dan 30mM propidium yodium. Bakteri yangdicuci dengan saline steril dan pelet disuspensikan dalam 5%gliserol dalam garam. Limaml suspensi tersebar ke slide,dan kelangsungan hidup ditentukan dengan menghitung basil merah dan hijau,menunjukkan bakteri mati dan hidup, masing-masing, di bawah Nikonmikroskop fluoresensi. Maxima eksitasi / emisi yang480 nm / 500 nm untuk Syto9 dan 490 nm / 635 nm untuk propidiumiodida. Hasil dihitung sebagai persen kelangsungan hidup dan dilaporkan sebagaiberarti + / 2 SD dari 4-10 tikus per kelompok.Pemurnian asam nukleatRNA dan DNA dimurnikan dari FP kiri menggunakan

dijelaskan sebelumnya protokol [30]. FP tetap individu yangdihapus dari etanol, direhidrasi, cincang, ditangguhkan di1,0 ml Trizol reagen, dan homogen dua kali dalam FastRNAtabung biru menggunakan FastPrep FP 24 instrumen (MP Biomed-icals, Solon, OH). Tabung yang dingin di atas es selama 5 menit, setelahyang 200ml kloroform-isoamil alkohol ditambahkan. Setelahvortexing selama 10 detik dan sentrifugasi pada 7006g di 4uC untuk5 menit, supernatan dipindahkan ke tabung baru, berputarlagi di 14,0006g selama 10 menit, dan RNA yang dikumpulkan dari300ml dari fase air. Setelah inkubasi pada 270uCsemalam, RNA endapan itu disuspensi di 30mlDEPC diperlakukan air, dan mencemari DNA telah dihapusmenggunakan Turbo kit DNA bebas (Life Technologies). The dimurnikanRNA (150ml) disimpan di 270uC. DNA dimurnikan denganmenambahkan 100ml dari 10 mM Tris-EDTA dan 150ml dari chloroform-alkohol isoamil ke fasa air yang tersisa dan interfasematerial, homogenisasi di FastPrep 24 FP instrumen dua kali,dan pemusingan pada 14,0006 g selama 10 menit. Berairfase (200ml) diendapkan dengan 5 M amonium asetatdan dua volume etanol dingin, diinkubasi pada 270uC semalam,dicuci di 70% etanol, dilarutkan dalam 30ml 16TE, dan disimpan di270uC.Terbalik transkripsiRNA dari 36103

M. leprae, seperti yang ditetapkan dari jumlahRLEP setara genom dari setiap spesimen, adalah sebaliknyaditranskrip. Percobaan titrasi telah menunjukkan bahwa RNA dari inijumlah nu / nu tikus yang diturunkan basil layak akan konsistenmemberikan sinyal yang kuat dalam reaksi RT-PCR. RNA itudikonversi ke cDNA menggunakan Keuntungan RT-PCR untuk-kit(CLONTECH, Mountain View, CA) yang terdiri dari reverse transcriptase,Keuntungan cDNA campuran polimerase, dan primer heksamer acakdi 42uC selama 1 jam, 94uC selama 5 menit, dan 4uC selama 5 menit.Untuk ekspresi gen mouse, 1mg RNA sebaliknya ditranskrip kecDNA menggunakan kondisi yang sama. Kontrol kontaminasi DNAterdiri dari jumlah setara dengan RNA, campuran polimerase, danprimer tanpa reverse transcriptase.TaqManPencacahan molekul M. leprae ditentukan dengan menggunakanfraksi DNA dimurnikan dari setiap spesimen melalui TaqMan technol-ogy menggunakan primer dan probe untuk wilayah umum dari RLEPkeluarga mengulangi tersebar di M. leprae seperti yang dijelaskan sebelumnya [10].Kelangsungan hidup molekul M. leprae ditentukan dengan menggunakan cDNA yangdihasilkan dari fraksi RNA untuk setiap spesimen dan qRT-PCR. Primer dan probe untuk setiap urutan target yang dirancangmenggunakan Primer Express 2.0 software (Life Technologies): hsp18primer: maju - cgatcgggaaatgcttgc, membalikkan - cgagaaccagct-gacgattg, penyelidikan - 6Fam-acaccgcgtggccgctcg; esxA primer: untuk-bangsal - ccgagggaataaaccatgca, reverse - cgtttcagccgagtgattga,Probe - 6Fam-tgcttgcaccaggtcgccca. Limaml cDNA ditambahkanke dalam campuran reaksi dan real time PCR dilakukan dengan menggunakankondisi bersepeda dari 40 siklus 60uC anil, ekstensi untuk60 detik, dan 95uC denaturasi selama 15 detik. PCR dan dataanalisis untuk semua tes dilakukan pada 7300 RealTime PCRSystem (Life Technologies). Hasil tes TaqMan yangditerapkan pada kurva standar yang dihasilkan oleh mempersiapkan 4 kali lipat seripengenceran sejumlah diketahui dari M. leprae. Hasil dilaporkan sebagaisetara mRNA untuk setiap transkrip gen dianalisis.Ekspresi gen tikus dievaluasi menggunakan cDNA dantersedia secara komersial set primer spesifik dan probe untuk TNF,IFNc, dan CCL-2, dan Universal Guru Mix (Life Technologies).

Data dianalisis dengan DDCTMetode dan dinyatakan sebagai logging sebuahlipat peningkatan dalam ekspresi lebih terinfeksi FP. GAPDH digunakanmenormalkan variasi template yang. Hasil dilaporkan sebagai rata-rata+ / 2 SD dari 4-10 tikus per kelompok.Analisis statistikData dianalisis menggunakan uji t tidak berpasangan atau non-parametrikUji Mann-Whitney dan dibandingkan dengan kelompok dan dalam kelompokdari waktu ke waktu menggunakan SigmaPlot 12.0 software (Systat Software, Inc,Chicago, IL). Data dianggap signifikan pada P, 0,05.HasilEvaluasi M. leprae kelayakan di FP tikus menggunakantes konvensionalPenghitungan mikroskopis BTA ditunjukkan pada Gambar 1A. Pada hari 1infeksi pasca, 4,78610661,306106dan 5,03610662,236106AFB yang pulih dari BALB / c dan nu / nu FP, daerah masing-masing. Ini pemulihan sekitar 16% dari inokulum adalahkhas mengingat arsitektur FP tikus dankonsisten dengan laporan sebelumnya [10,35]. Dalam nu / nu FP, yangjumlah M. leprae terus meningkat selama periode infeksimencapai 4,25610863,466108oleh 17 minggu pasca infeksi(P, 0,001). Sebaliknya, jumlah AFB di BALB / c FPtetap stabil pada 4 minggu dan kemudian menurun pada 8 (p, 0,001), 12(P = 0,006), dan 17 (p = 0,035) minggu.Alat tes kelayakan konvensional, BacLight pewarnaan dan RR,dilakukan pada M. leprae terisolasi dari BALB / c dan nu / nutikus FP selama periode infeksi untuk menentukan nyakelangsungan hidup.Menggunakan metode BacLight pewarnaan (Gambar 1B), M. leprae

dari BALB / c dan nu / nu FP yang 78.71610.53 dan 82.3467.87persen yang layak, masing-masing, pada Hari 1. Persen viabilitas meningkatuntuk 90.5164.90 di nu / nu FP oleh 12 minggu (p = 0,029) pascainfeksi. Dalam BALB tikus / c, M. leprae viabilitas menurun menjadi60.7267.16 persen oleh 4 minggu (p, 0,001) dan 29.7968.90persen 8 minggu (p, 0,001) pasca infeksi. Persen viabilitas diadakanpada tingkat ini untuk sisa periode infeksi.Menggunakan uji RR (Gambar 1C), M. leprae viabilitas dilaporkan sebagai14CO2dihasilkan per 106basil menunjukkan sedikit peningkatan oleh4weeks (p = 0.049) di nu / nu tikus. Sebaliknya, M. leprae dariPenentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org3Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 4BALB / c FP dipamerkan penurunan 1,5 log aktivitas metabolik oleh4weeks infeksi pasca (p, 0,001).Evaluasi molekul M. leprae viabilitas pada tikus FPRLEP pencacahan, dilakukan pada DNA dimurnikan dari kiriJaringan FP, menunjukkan bahwa 6,27610665,886106M. leprae yangpulih dari BALB / c FP dan 4,07610663,786106adalahpulih dari nu / nu FP pada Hari 1 (Gambar 2A). Sebuah lag awalfase jelas di nu / nu FP belum mencapai pertumbuhan9,70610761,356108

(P = 0,015) dengan 17 minggu pasca infeksi. Diyang BALB / c FP, ada penurunan yang signifikan dalam jumlahM. leprae pada 4 (p = 0,022), 8 (p = 0,003), 12 (p, 0,001) dan 17(P = 0,002) minggu.hsp18 dan esxA QRT-PCR tes menghasilkan sinyal yang kuat ketikadievaluasi untuk digunakan sebagai indikator dari M. leprae viabilitas dalam model kami.Dalam kedua tes, ekspresi transkrip dipertahankan dinu / nu FP pada urutan, 105hsp18 (Gambar 2B) atau esxA(Gambar 2C) Setara per 36103M. leprae selamainfeksi. Sebaliknya, tes ini menunjukkan penurunan tajam dalamkelangsungan hidup di BALB / c FP oleh 8 minggu untuk 1,95610368,766102untuk hsp18 (p, 0,001) dan 4,30610361,696103untuk esxA (p, 0,001),dan tetap di urutan 103setara untuk sisaperiode infeksi.RMP dan RPT Pengobatan tikus M. leprae yang terinfeksiAlat tes konvensional dan molekuler dibandingkan dalamModel FP multibasiler untuk kapasitas mereka untuk memonitor obatkhasiat. Nu athymic / tikus nu terinfeksi 36107M. leprae.Pada 18 minggu pasca infeksi, rifampisin atau rifapentin (masing-masing di10 mg / kg) diberikan ke kelompok tikus selama 1 pengobatan(16), 5 perawatan harian (56) atau 20 dosis pada 5 hari per minggu selama 4minggu (206). FP dipanen 1 bulan pengobatan pasca untuk setiaprejimen.Hasil tes kelayakan konvensional ditunjukkan padaGambar 3. Salah satu pengobatan dengan rifampisin atau rifapentin tidak

menurunkan M. leprae kelangsungan hidup ketika diukur dengan BacLight pewarnaan(Gambar 3A) atau RR (Gambar 3B). Rifapentin mengurangi M. lepraeviabilitas untuk 56.8364.11 persen (p, 0,001) setelah 5 perawatan sehari-haridan untuk 27.7866.05 persen (p, 0,001) dengan 20 dosis yang diukuroleh BacLight pewarnaan (Gambar 3A). Dua puluh dosis rifampisinmenurun kelayakan untuk 37.7166.79 persen (p = 0,057). Rifampisinlebih efektif bila dinilai dengan menggunakan uji RR (Gambar 3B)dan penurunan aktivitas metabolik M. leprae sekitar 1 log(P, 0,001) setelah 5 perawatan. Pengobatan rifapentin berkurangmetabolisme 0,2 log (p = 0,016). Kedua rifampisin dan rifapentinaktif di 206 (p = 0,016).Dalam perjanjian dengan tes kelayakan konvensional, tidakrifampisin atau rifapentin dengan dosis tunggal menurun M. lepraeviabilitas ketika dinilai oleh hsp18 (Gambar 4A) atau esxA (Gambar 4B)QRT-PCR. Kontrol FP menyatakan, 105hsp18 atau esxA setaraper 36103M. leprae. Lima dosis rifapentin berkurang ini1,88610361,376103hsp18 (p = 0,001) dan 3,04610361,336103Gambar 1. Pencacahan dan kuantifikasiM. lepraepada tikusFP menggunakan tes konvensional. BALB / c (bar abu-abu) dan athymic nu / nu(Bar hitam) mencit terinfeksi di FP dengan 36107M. leprae. Basildipanen pada hari 1 dan pada 4, 8, 12, dan 17 minggu pasca infeksi dandisebutkan oleh penghitungan langsung (A). Viabilitas M. leprae ditentukanoleh BacLight viabilitas pewarnaan (B) dan RR (C). Garis putus-putus mewakiliBatas deteksi yang lebih rendah dari pengujian tersebut.Bar merupakan rata-rata dan standardeviasi untuk setiap kelompok. Nilai pada setiap titik waktu dibandingkan dengan

nilai masing-masing pada 1 hari. * = Probabilitas signifikansi statistik(P), 0,05, ** = probabilitas signifikansi statistik (p), 0,01, dan*** = Probabilitas signifikansi statistik (p), 0,001.doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404.g001Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org4Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 5esxA (p = 0,001) setara, sementara 56 rifampisin tidak menunjukkanpenurunan yang signifikan dalam ekspresi baik assay. Namun, inites molekuler menunjukkan bahwa kedua rifampisin dan rifapentinyang sangat efektif pada 20 dosis bila diukur dengan hsp18ekspresi (p = 0,016 dan p = 0,019, masing-masing) atau esxA expressionsion (p, 0,001 dan p = 0,009, masing-masing).Tuan rumah ekspresi gen dalam M. leprae yang terinfeksi FPPersiapan RNA juga diperiksa untuk sitokin danekspresi kemokin. Seperti terlihat pada Tabel 1, tingkat tinggi TNFdiungkapkan oleh Hari 1Pada FP kedua strain tikus. TNFekspresi meningkat di BALB / c FP oleh 8 minggu (p = 0,031), tetapimenurun di nu / nu FP (p = 0,028). Sedikit atau tidak ada IFNc adalahdiungkapkan oleh baik ketegangan pada Hari 1, namun ekspresi meningkat0,2 log di BALB / c (p, 0,001). Ekspresi IFNc juga meningkat dinu / nu FP (p = 0,005) tetapi tidak sampai sebatas BALB / c. Miriptingkat CCL-2 yang diungkapkan oleh kedua strain pada kedua titik waktu.DiskusiKurangnya sistem budidaya vitro in untuk M. leprae telah membuatpenentuan kelangsungan hidup sangat sulit di eksperimentalmodel penyakit dan pada lesi manusia karena saat initeknik memerlukan sejumlah besar dimurnikan, bakteri hidup. Inimembatasi penyelidikan patogenisitas M. leprae sertapengujian eksperimental obat baru untuk pengobatankusta. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkanuji molekul sederhana dan sensitif untuk menentukan M. lepraeviabilitas langsung dari jaringan yang terinfeksi. Dua M. leprae khusus qRT-Tes PCR berdasarkan tingkat ekspresi esxA dan hsp18 yangdikembangkan dan diuji dalam model FP tikus menggunakan keduaimunokompeten dan tikus immunocompromised. QRT- iniTes PCR bisa mendeteksi viabilitas tinggi di nu athymic / nu FP sebagaiserta membunuh M. leprae oleh sistem kekebalan tubuh inang di

BALB / c mouse, atau dengan pengobatan antimikroba dari nu / tikus numemiliki sangat multibasiler FP. Persiapan RNA jugaberhasil digunakan untuk mendeteksi ekspresi tuan sitokin.Hipotesis yang diuji dalam penelitian ini adalah bahwa kelangsungan hidup terkait denganekspresi gen tertentu; Oleh karena itu, pemantauan M. tertentuleprae transkrip gen (s) oleh QRT-PCR harus menyediakan sederhana danassay sensitif untuk menentukan kelangsungan hidup. Metode molekulertelah dikembangkan untuk memastikan kelangsungan hidup beberapa menularorganisme [36]. Studi awal digunakan tingkat RNA ribosom sebagaipenanda kelayakan [37-40]. Namun, paruh panjang danretensi konsisten membuatnya agak kurang akurat, terutamauntuk eksperimen jangka pendek. Karena setengah relatif singkathidup, mRNA telah berhasil digunakan sebagai indikator kelayakan untukjumlah patogen [41-43] termasuk M. tuberculosis [44-46].Pilihan transkrip merupakan pertimbangan penting dalam semuastudi ini, tidak hanya untuk sensitivitas tetapi juga untuk ekspresidi bawah berbagai kondisi. Selain itu, kelangsungan hidup yang berbedaGambar 2. Pencacahan dan kuantifikasiM. lepraepada tikusFP dengan tes molekuler. BALB / c (bar abu-abu) dan athymic nu / nu (hitambar) mencit terinfeksi dengan 36107M. leprae. Jaringan FP yang tetap di70% etanol pada hari 1 dan pada 4, 8, 12, dan 17 minggu pasca infeksi. DNAdan RNA dimurnikan menggunakan protokol FastPrep. M. leprae yangdisebutkan oleh RLEP PCR pada fraksi DNA (A). cDNA disiapkandari setara RNA dari 36103M. leprae untuk penentuan kelayakanoleh hsp18 (B) dan esxA (C) QRT-PCR. Bar merupakan rata-rata dan standardeviasi untuk setiap kelompok. Nilai pada setiap titik waktu dibandingkan dengannilai masing-masing pada 1 hari. * = Probabilitas signifikansi statistik(P), 0,05, ** = probabilitas signifikansi statistik (p), 0,01, dan*** = Probabilitas signifikansi statistik (p), 0,001.doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404.g002Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org5Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 6tes memiliki berbagai kemampuan untuk membedakan kematian sel, yang merupakansering sangat tergantung pada bagaimana organisme terbunuh dan bagaimana selkematian didefinisikan [41,47].Awalnya kami menguji profil ekspresi beberapa M. lepraegen sebagai indikator potensi kelangsungan hidup dalam sistem kami. Initermasuk: soda, encoding superoxide dismutase A dan yangberhasil digunakan dalam budaya makrofag M. leprae yang terinfeksi[30]; gap, encoding dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat;ML2138C, pengkodean protein transmembran kemungkinan; hsp18,pengkodean protein 18 kD panas sengatan; dan esxA, pengkodeanESAT-6 protein. Transkrip ini dipilih berdasarkan merekatingkat ekspresi yang tinggi dalam percobaan DNA microarray pada 6bulan pasca infeksi pada athymic nu / nu FP Model [48].Namun, Soda, kesenjangan, dan gen ML2138C tidak ditranskripsikan dalamjumlah yang cukup pada waktu awal dalam model FP danOleh karena itu tidak memiliki sensitivitas yang diperlukan (data tidak ditampilkan).Sebaliknya, tes hsp18 dan esxA berbasis yang sangat diekspresikanGambar 3. Pencacahan dan kuantifikasi menggunakan konvensionaltes dariM. lepraedari RMP dan RPT diperlakukan tikus. Nu athymic /nu (bar hitam) mencit terinfeksi di FP dengan 36107M. leprae. Di18 minggu pasca infeksi, kelompok tikus diobati dengan dosis 1 (16),5 dosis harian (56), atau 20 dosis harian (206) dari RMP (bergaris bar) atau RPT(Crosshatched bar), masing-masing pada 10 mg / kg. Tikus kontrol menerima kendaraansendiri (abu-abu bar). Satu bulan setelah dosis terakhir setiap rejimen, basildipanen dan kelangsungan hidup M. leprae ditentukan oleh BacLightviabilitas pewarnaan (A) dan RR (B). Garis putus-putus mewakili lebih rendahBatas deteksi pengujian tersebut. Bar merupakan rata-rata dan standardeviasi untuk setiap kelompok. * = Probabilitas signifikansi statistik(P), 0,05, dan *** = probabilitas signifikansi statistik (p), 0,001.doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404.g003Gambar 4. Pencacahan dan kuantifikasi melalui tes molekulerdariM. lepraedari RMP dan RPT diperlakukan tikus. Nu athymic / nu (hitam

bar) mencit terinfeksi di FP dengan 36107M. leprae. Pada 18 mingguinfeksi pasca, kelompok tikus diobati dengan dosis 1 (16), 5 haridosis (56), atau 20 dosis harian (206) dari RMP (bergaris bar) atau RPT(Crosshatched bar), masing-masing pada 10 mg / kg.Tikus kontrol menerima kendaraansendiri (abu-abu bar). Satu bulan setelah dosis terakhir setiap rejimen, FPjaringan yang tetap di 70% etanol. DNA dan RNA dimurnikan menggunakanProtokol FastPrep. M. leprae yang disebutkan oleh RLEP PCR pada DNAfraksi, dan cDNA dibuat dari setara RNA dari 36103M.leprae untuk penentuan kelayakan oleh hsp18 (A) dan esxA (B) QRT-PCR.Bar merupakan rata-rata dan standar deviasi untuk setiap kelompok.* = Probabilitas signifikansi statistik (p), 0,05, ** = probabilitassignifikansi statistik (p), 0,01, dan *** = probabilitas statistiksignifikansi (p), 0,001. 56 RPT vs 206 RPT: (p) = 0,396 untuk hsp18;(P) = 0,569 untuk esxA.doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404.g004Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org6Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 7di kedua tikus imunokompeten dan imunosupresi. Lebih-lebih, mereka berdua mampu secara akurat menentukan hilangnya viabilitasketika menggunakan dua metode yang berbeda dari pembunuhan bakteri, yaituimunologi dan anti-mikroba obat, yangmemperkuat validitas dan kegunaan tes ini.Dalam penelitian ini, nu athymic / nu dan BALB / c tikus FPdiinokulasi dengan dosis yang relatif tinggi M. leprae. Kami memilihdosis ini untuk infeksi karena, sebagai dosis imunisasi di BALB / ctikus imunokompeten, itu akan diakui dan dibunuh dipertama 1-2 bulan infeksi; Namun, dalam immunocompromisedathymic nu / nu tikus inokulum akan terus tumbuh. Kapandiinokulasi dengan sedikit M. leprae, (misalnya, 103untuk 104

), MaksimumPertumbuhan dicapai dalam mouse imunokompeten FP adalah kira-kira 106basil [1]. Dataran tinggi pertumbuhan ini, yang terlihat disekitar 6 bulan pasca infeksi, karena kematianbasil oleh respon imun. Setelah nomor bakteri puncak,kelangsungan hidup menurun dengan setengah-waktu kehilangan 25 hari [12]. Menggunakanyang hsp18 dan esxA QRT-PCR tes, sinyal yang kuat bisa menjadidiperoleh dengan RNA dari 36103M. leprae.Selama bertahun-tahun berbagai teknik telah dikembangkan diupaya untuk menghindari ketidakmampuan untuk budaya organisme ini.Setiap uji mengukur aspek yang berbeda dari M. leprae kelangsungan hidup dan memilikiwawasan tersedia dalam sifat unik. Untuk konvensional kamipenentuan kelayakan, kami menggunakan RR [9,18,20,22,23] dan Bac-Cahaya viabilitas pewarnaan [27]. RR mengukur oksidasi14C-asam palmitat ke14CO2; dengan demikian, kelangsungan hidup didefinisikan dalam halaktivitas metabolik dari populasi bakteri. Viabilitas pewarnaanmenggunakan pewarna fluorescent yang mengikat asam nukleat, dengan satu pewarna yang bisamenembus membran sel dan salah satu yang tidak bisa. Sebuah diferensialPola pewarnaan dipamerkan oleh bakteri hidup dengan sel utuhmembran dibandingkan bakteri mati dengan membran yang rusak.Dengan demikian, kelangsungan hidup dalam pengujian ini dinilai dalam hal membranintegritas bakteri individu. Sementara tes ini bekerja sangat baikuntuk in vitro penentuan kelayakan, dan untuk ex vivo digunakan, mereka jugamemiliki keterbatasan mereka. Keduanya membutuhkan segera, padat karyapemurnian M. leprae dan pengolahan sampel sebagai basilcepat kehilangan viabilitas setelah dikeluarkan dari tuan rumah. Bakteri yangpopulasi harus relatif bersih dan bebas dari paling jaringan host

puing-puing untuk mendapatkan hasil yang jelas, terutama untuk pengujian BacLight. UntukRR, minimal 106organisme yang diperlukan untuk akuratbacaan. Selanjutnya, hal-hal mengenai penggunaan radioisotop,termasuk keselamatan pekerja dan pembuangan limbah, harus dipertimbangkan.Meskipun berharga di laboratorium, kondisi ini membuat inites praktis untuk mengevaluasi M. leprae kelangsungan hidup di biopsispesimen dalam pengaturan klinis atau lapangan di mana reagen danperalatan yang dibutuhkan untuk isolasi bakteri dan penilaian kelayakantidak tersedia.Oleh karena itu, dalam hubungannya dengan pengembangantes molekuler, kami mengevaluasi kelayakan menghilangkanlangkah isolasi bakteri dan menilai kelayakan pada asam nukleatdimurnikan langsung dari etanol-tetap jaringan FP. Kesuksesan kami dengan iniprotokol pasti menunjukkan potensi untuk digunakan dengan spesimen biopsidi klinik atau lapangan. Meskipun kita belum dievaluasi formalin--parafin tertanam jaringan tetap (FFPE) untuk RT-PCR, Su, et al. [49]telah menunjukkan bahwa fiksasi etanol untuk sampel dijadwalkan untuk RT-PCR adalahjauh lebih unggul FFPE dan bahwa jaringan ini dapat disimpan selama berminggu-minggu.Hasil yang tidak dipublikasikan kami menunjukkan bahwa RNA dapat dipertahankan untukbulan di 70% etanol pada suhu kamar. Dengan demikian, jaringan dapatmudah diperbaiki dan disimpan dalam 70% etanol untuk transportasi kembali kelaboratorium untuk pengolahan [50,51].Sebuah aplikasi potensial untuk tes kelayakan molekul ini dalampemantauan pengobatan. Lesi pasien multibasilersering mengandung banyak basil bahkan bertahun-tahun setelah selesaiTerapi multidrug, menghasut kekhawatiran atas kemungkinanpengobatan yang tidak memadai, kurangnya kepatuhan, atau resistensi obat.Studi kami menggunakan model didefinisikan dengan baik, yaitu imunokompeten dantikus nu / nu athymic terinfeksi dengan inokulum baik ditandai[9] viabilitas diketahui dan durasi infeksi, telah memungkinkankarakterisasi parameter optimal untuk penggunaan hsp18 yangdan esxA transkrip sebagai indikator kelayakan untuk M. leprae dalam jaringan.Penelitian lebih lanjut, tentu saja, harus dilakukan untuk menentukan apakahparameter ini akan cukup untuk menilai kelayakan M. leprae disampel pasien.

RMP adalah obat anti-lepra sangat efektif dan merupakan bagian integral dariWHO multidrug regimen [52]. Penyelidikan awal dengan RMPditemukan untuk menjadi lebih cepat bakterisida dari dapson [53,54], denganlaporan bahwa bahkan pengobatan tunggal pasien diberikan M. lepraenon-infeksius untuk tikus [55]. Demikian pula, pengobatan M. leprae-tikus imunokompeten yang terinfeksi dengan dosis tunggal RMP memilikiefek bakterisida yang signifikan [54,56-58]. Selanjutnya, beberapapeneliti meneliti berbagai regimen terapi, dengan dantanpa RMP, menggunakan infeksi M. leprae dari tikus nu / nu athymic. Itunu / model nu menghapus kontribusi kemungkinan dari sistem kekebalan tubuhuntuk membantu terapi obat efek bakterisida dan pengobatan daribeban bakteri tinggi, '' lepromatosa '' infeksi dapat diuji. Itukhasiat rifampisin dalam model ini telah variabel [59-63]. AwalStudi menunjukkan bahwa satu [60] atau intermiten [59] dosis denganRMP tidak efektif dan bahwa pembunuhan 99,99% tidak tercapaidengan dosis masing-masing.Dalam besar, percobaan yang terkendali dengan baik dirancang untuk menentukanefektivitas rifampisin dosis tunggal untuk mencegah kusta di dekatkontak di daerah endemik tinggi, Moet, et al. [64] menemukan 57%pengurangan insiden keseluruhan kusta dalam pengobatankelompok di 2 tahun. Khasiat ini dipertahankan tapi tidak membaik di4 dan 6 tahun follow-up [64,65]. Namun, ketika mereka mengevaluasisubkelompok kontak, kemoprofilaksis dengan dosis tunggalrifampisin kurang efektif dalam kontak pasien dengan multiPenyakit basiler dan kontak yang seropositif untuk-PGL 1.Mereka mendalilkan bahwa beban basiler di kontak ini disaat pengobatan mungkin sudah terlalu tinggi untuk menjadidieliminasi.Dalam penelitian ini kami, tujuan dari RMP dan RPTperawatan adalah untuk memvalidasi tes kelayakan molekul, dan kamidigunakan beban bakteri tinggi, model yang lepromatosa. Baik satudosis atau 5 dosis harian RMP yang efektif bila diukur denganbaik BacLight pewarnaan atau tes molekuler, meskipunpenurunan aktivitas metabolik terdeteksi oleh RR setelah 5 dosis.Pengobatan dengan 20 dosis harian, bagaimanapun, menunjukkan penghambatan yang kuatTabel 1. host ekspresi gen pada tikus M. leprae yang terinfeksiFP.Regangan / WaktusebuahTNF

bpIFNcbpCCL-2bpBALB / cT01.6560.400.4460.361.1060.34T + 8 minggu2.0460.300,0312.2160.31, 0,001 1.4060.88 NSnu / nuT01.5360.460.0060.270.9360.42T + 8 minggu1.1660.260,0280.5060.410,0052.1261.08 NSsebuahTikus yang terinfeksi 36107M. leprae. Jaringan FP dipanen dan tetapdi 70% etanol pada Hari 1 dan 8 minggu pasca infeksi. RNA dimurnikan menggunakanprotokol FastPrep, dan cDNA dibuat dari 1mg RNA dan sasaranPCR untuk TNF, IFNc dan CCL-2.b

Data itu dinormalisasi untuk GAPDH dan dinyatakan sebagai peningkatan log-kali lipat lebihterinfeksi FP.doi: 10.1371 / journal.pntd.0002404.t001Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org7Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 8dalam semua tes. RPT, berbeda efektif pada 5 dosis harian, kemungkinankarena retensi lebih lama dan lebih kuat anti-mikobakteriKegiatan [58,66-69]. Secara keseluruhan, temuan ini kolektif bawah-skor peran ajuvan dimainkan oleh kekebalan di sukseskemoterapi dan menekankan isu-isu yang harus dipertimbangkanketika merawat host rentan.Bonus tambahan untuk memantau ekspresi gen in situ adalah bahwaekspresi gen host dapat ditentukan dengan menggunakan RNA yang samapersiapan. Jika menggunakan alat tes konvensional di eksperimental kamistudi, kelompok yang terpisah dari tikus harus digunakan untuk gen tuan rumahekspresi dan M. leprae pencacahan dan kelangsungan hidup penentuan.Dengan tes molekuler, kedua host dan ekspresi bakteri dapatditentukan dengan menggunakan sampel RNA yang sama, sehingga sangatmengurangi jumlah hewan yang diperlukan untuk percobaan.Demikian juga, keberhasilan penerapan teknik ini dalam klinispengaturan dapat memungkinkan pemantauan M. leprae kelangsungan hidup dankorelasi dengan respon imun. Sebuah kebutuhan tertentu akanselama pengobatan episode reaksional, aspek kustayang masih kurang dipahami.Kesimpulannya, hasil ini menunjukkan bahwa hsp18 dan esxA qRT-Tes PCR merupakan indikator yang dapat diandalkan untuk menentukan M. lepraeviabilitas dalam spesimen jaringan. Mereka sensitivitas dan kesederhanaan makemereka berguna untuk awal in vivo skrining obat. Selain itu, kemudahanpenggunaan membuat mereka menarik untuk aplikasi potensial dalam klinisdan pengaturan lapangan, dan kedua M. leprae kelangsungan hidup serta tuan rumahrespon selama pengobatan dapat dipantau.Ucapan Terima KasihPenulis sangat berterima kasih atas bantuan teknis dari Baljit Randhawa,Angelina Deming, dan Vilma Marks.Penulis KontribusiDisusun dan dirancang percobaan: RL TPG JLK DLW LBA.

Melakukan percobaan: GLD NAR RL LBA. Menganalisis data: GLDRL DLW LBA. Menulis kertas: GLD RL TPG DLW LBA.Referensi1. Shepard CC (1962) Perkalian Mycobacterium leprae di kaki-pad daritikus. Int J Lepr 30: 291-306.2. Levy L, Ji B (2006) Mouse teknik kaki-pad untuk budidaya Mycobacteriumleprae. Lepr Rev 77: 5-24.3. Rees RJ, Waters MF, Weddell AG, Palmer E (1967) lepromatosa Eksperimentalkusta. Nature 215: 599-602.4. Colston MJ, Hilson GR (1976) Pertumbuhan Mycobacterium leprae dan M. marinum dikongenital athymic (telanjang) tikus. Nature 262: 399-401.5. Dawson PJ, Colston MJ, Fieldsteel AH (1983) Infeksi kongenitaltikus athymic dengan Mycobacterium leprae. Int J Lepr lain Mycobact Dis 51: 336-346.6. Chehl S, Ruby J, Job CK, Hastings RC (1983) Pertumbuhan Mycobacterium lepraepada tikus telanjang. Lepr Rev 54: 283-304.7. Kirchheimer WF, Storrs EE (1971) Upaya untuk membangun armadillo yang (Dasypusnovemcinctus linn.) sebagai model untuk studi kusta. I. Laporan lepromatoidkusta di armadillo eksperimental terinfeksi. Int J Lepr lain Mycobact Dis39: 693-702.8. Shepard CC, McRae DH (1968) Sebuah metode untuk menghitung bakteri asam-cepat.Int J Lepr lain Mycobact Dis 36: 78-82.9. Truman RW, Krahenbuhl JL (2001) yang layak M. leprae sebagai reagen penelitian.Int J Lepr lain Mycobact Dis 69: 1-12.10. Truman RW, Andrews PK, Robbins NY, Adams LB, Krahenbuhl JL, et al.(2008) Pencacahan Mycobacterium leprae menggunakan real-time PCR. PLoS Negl TropDis 2: E328.11. Colston MJ, Hilson GR, Banerjee DK (1978) The '' bakterisida proporsionaltest '': Sebuah metode untuk menilai aktivitas bakterisida narkoba terhadap Mycobacteriumleprae pada tikus. Lepr Rev 49: 7-15.12. Welch TM, Gelber RH, Murray LP, Ng H, O'Neill SM, et al. (1980) ViabilitasMycobacterium leprae setelah perkalian pada tikus. Menginfeksi Immun 30: 325-328.13. Shepard CC, McRae DH (1965) Mycobacterium leprae: Viabilitas pada 0 derajat C, 31derajat C, dan selama pembekuan. Int J Lepr 33: 316-323.

14. Kaur S, Minocha YC, Sengupta U, Naik S (1975) Evaluasi komparatifindeks bakteriologis dan morfologi dari Mycobacterium leprae pada kulit, kelenjar getah bening,sumsum tulang, saraf dan otot. Int J Lepr lain Mycobact Dis 43: 55-57.15. Ramasesh N, Hastings RC, Krahenbuhl JL (1987) Metabolisme Mycobacteriumleprae di makrofag. Menginfeksi Immun 55: 1203-1206.16. Franzblau SG, Harris EB (1988) optima Biofisik untuk metabolismeMycobacterium leprae. J Clin Microbiol 26: 1124-1129.17. Katoch VM, Katoch K, Ramanathan U, Sharma VD, Shivannavar CT, et al.(1989) Pengaruh kemoterapi pada kelangsungan hidup Mycobacterium leprae yang ditentukanoleh konten ATP, indeks morfologi dan FDA-EB pewarnaan neon.Int J Lepr lain Mycobact Dis 57: 615-621.18. Ramasesh N, Adams LB, Franzblau SG, Krahenbuhl JL (1991) Pengaruhmakrofag diaktifkan pada Mycobacterium leprae. Menginfeksi Immun 59: 2864-2869.19. Gupta UD, Katoch K, Natarajan M, Sharma VD, Sharma RK, et al. (1997)Penentuan viabilitas M. leprae: Perbandingan yang normal pad kaki mouse danbasiler uji bioluminescence ATP. Acta Leprol 10: 209-212.20. Agrawal VP, Shetty VP (2007) Perbandingan budemeyer radiorespirometricuji dengan uji ATP dan uji kaki tikus pad dalam mendeteksi Mycobacterium layakleprae dari sampel klinis. India J Med Microbiol 25: 358-363.21. Franzblau SG (1989) kerentanan pengujian obat Mycobacterium leprae dalamBACTEC 460 sistem. Antimicrob Agen Chemother 33: 2115-2117.22. Franzblau SG (1988) Oksidasi asam palmitat oleh Mycobacterium leprae dalammedia axenic. J Clin Microbiol 26: 18-21.23. Agrawal VP, Shetty VP (2007) Perbandingan tes pad kaki tikus denganJenis Buddemeyer uji radiorespirometric dalam mendeteksi layak Mycobacterium lepraedi biopsi lesi manusia. India J Dermatol Venereol Leprol 73: 384-388.24. Kvach JT, Munguia G, Strand SH (1984) Pewarnaan Mycobacterium jaringan yang diturunkanleprae dengan diasetat fluorescein dan ethidium bromide. Int J Lepr LainMycobact Dis 52: 176-182.25. Harshan KV, Prasad HK, Chopra NK, Mishra RS, Gogiya P, et al. (1987)Perbandingan uji makrofag radiometrik dan diasetat fluorescein /etidium bromida pewarnaan untuk evaluasi M. leprae kelangsungan hidup. Int J Lepr LainMycobact Dis 55: 316-321.26. Bhagria A, Mahadevan PR (1987) Sebuah metode cepat untuk kelangsungan hidup dan obat

sensitivitas Mycobacterium leprae dibudidayakan di makrofag dan menggunakan fluoresceindiasetat. India J Lepr 59: 9-19.27. Lahiri R, Randhawa B, Krahenbuhl J (2005) Aplikasi dari viabilitas-pewarnaanMetode untuk Mycobacterium leprae yang berasal dari athymic (nu / nu) kaki tikus pad.J Med Microbiol 54: 235-242.28. Lavania M, Katoch K, Katoch VM, Gupta AK, Chauhan DS, et al. (2008)Deteksi layak Mycobacterium leprae dalam sampel tanah: wawasan mungkinsumber penularan kusta. Menginfeksi Genet Evol 8: 627-631.29. Sharma R, Lavania M, Katoch K, Chauhan DS, Gupta AK, et al. (2008)Pengembangan dan evaluasi real-time RT-PCR assay untuk kuantitatifestimasi yang layak Mycobacterium leprae dalam sampel klinis. India J Lepr 80:315-321.30. Martinez AN, Lahiri R, Pittman TL, Scollard D, Truman R, et al. (2009)Penentuan molekul Mycobacterium leprae kelayakan dengan menggunakan real-time PCR.J Clin Microbiol 47: 2124-2130.31. Patel BK, Banerjee DK, Butcher PD (1993) Penentuan Mycobacterium lepraeviabilitas oleh amplifikasi PCR dari 71-kDa heat-shockmRNA protein. J Infect Dis 168: 799-800.32. Chae GT, Kim MJ, Kang TJ, Lee SB, Shin HK, et al. (2002) DNA-PCR danRT-PCR untuk gen 18-kDa dari Mycobacterium leprae untuk menilai efektivitasTerapi multi-obat untuk kusta. J Med Microbiol 51: 417-422.33. Hagge DA, Marks VT, Ray NA, Dietrich MA, Kearney MT, et al. (2007)Munculnya sel adaptif yang efektif dimediasi respon imun untukMycobacterium leprae tidak terganggu oksigen reaktif menengah-kekurangantikus. Janin Immunol Med Microbiol 51: 92-101.34. Adams LB, Pena MT, Sharma R, Hagge DA, Schurr E, et al. (2012) Wawasandari model hewan di immunogenetics kusta: Ulasan A. Mem InstOswaldo Cruz 107 Suppl 1: 197-208.35. Levy L, Bulan N, Murray LP, O'Neill SM, Gustafson LE, et al. (1974) Studipad teknik kaki tikus untuk budidaya Mycobacterium leprae. 1. Nasiborganisme diinokulasi. Int J Lepr lain Mycobact Dis 42: 165-173.36. Keer JT, Birch L (2003) metode molekuler untuk penilaian bakterikelangsungan hidup. J Microbiol Metode 53: 175-183.37. McKillip JL, Jaykus LA, Drake M (1998) stabilitas rRNA dalam panas-tewas dan UViradiasi enterotoksigenik Staphylococcus aureus dan Escherichia coli O157: H7.ApplLingkungan Microbiol 64: 4264-4268.38. Villarino A, Bouvet OM, Regnault B, Martin-Delautre S, Grimont PAD (2000)

Menjelajahi perbatasan antara hidup dan mati di Escherichia coli: Evaluasipenanda kelayakan yang berbeda dalam sel hidup dan panas atau dibunuh UV. Res Microbiol151: 755-768.39. Bergin PF, Doppelt JD, Hamilton WG, Mirick GE, Jones AE, et al. (2010)Deteksi infeksi periprosthetic dengan penggunaan ribosomal RNA berbasisreaksi berantai polimerase. J Tulang Bersama Surg Am 92: 654-663.40. Pengembangan Aarthi P, Bagyalakshmi R, Therese KL, Madhavan HN (2013)reaksi balik rantai transcriptase polymerase baru untuk menentukan gramreaksi dan viabilitas bakteri dalam spesimen klinis. Microbiol Res 168: 497-503.Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org8Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404

Halaman 941. Sheridan GE, Master CI, Shallcross JA, Mackey BM (1998) DeteksimRNA dengan reverse transkripsi-PCR sebagai indikator kelayakan di Escherichia colisel. Appl Lingkungan Microbiol 64: 1313-1318.42. Baque RH, Gilliam AO, Robles LD, Jakubowski W, Slifko TR (2011) A real-Metode waktu RT-PCR untuk mendeteksi layak Giardia lamblia kista di lingkunganperairan. Air Res 45: 3175-3184.43. Alum A, B Sbai, Asaad H, Rubino JR, Khalid Ijaz M (2012) ECC-RT-PCR: Ametode baru untuk menentukan kelayakan dan infektivitas Giardia kista. Int J MenginfeksiDis 16: E350-353.44. Hellyer TJ, Desjardin LE, Hehman GL, Cave MD, Eisenach KD (1999)Analisis kuantitatif mRNA sebagai penanda untuk kelangsungan hidup MycobacteriumTBC. J Clin Microbiol 37: 290-295.45. Desjardin LE, Perkins MD, Wolski K, Haun S, Teixeira L, et al. (1999)Pengukuran sputum Mycobacterium tuberculosis messenger RNA sebagai penggantiuntuk respon terhadap kemoterapi. Am J Respir Crit Perawatan Med 160: 203-210.46. Li L, Mahan CS, Palaci M, L Horter, Loeffelholz L, et al. (2010) sputumMycobacterium tuberculosis mRNA sebagai penanda izin bakteriologis direspon terhadap terapi antituberkulosis. J Clin Microbiol 48: 46-51.47. Villarino A, Rager MN, Grimont PA, Bouvet OM (2003) Apakah imbas UVnonculturable Escherichia coli K-12 sel hidup atau mati? Eur J Biochem 270: 2689-2695.

48. Williams DL, Torrero M, Wheeler PR, Truman RW, Yoder M, et al. (2004)Implikasi biologis ekspresi gen Mycobacterium leprae selama infeksi.J Mol Microbiol Biotechnol 8: 58-72.49. Su JM, Perlaky L, Li XN, Leung HC, Antalffy B, et al. (2004) Perbandinganetanol dibandingkan fiksasi formalin pada pelestarian histologi dan RNA di Lasermenangkap jaringan otak microdissected. Otak Pathol 14: 175-182.50. Fiallo P, Williams DL, Chan GP, Gillis TP (1992) Pengaruh fiksasi padadeteksi polymerase chain reaction dari I. J Clin Microbiol 30: 3095-3098.51. Williams DL, Oby-Robinson S, Pittman TL, Scollard DM (2003) PemurnianMycobacterium leprae RNA untuk analisis ekspresi gen dari kusta biopsispesimen. Biotechniques 35: 534-536, 538, 540-531.52. Scollard DM, Adams LB, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Truman RW, et al. (2006)Tantangan terus kusta. Clin Microbiol Rev 19: 338-381.53. Rees RJ, Pearson JM, Waters MF (1970) Eksperimental dan studi klinis padarifampisin dalam pengobatan kusta. Br Med J 1: 89-92.54. Shepard CC, Levy L, Fasal P (1972) Cepat efek bakterisida rifampisin padaMycobacterium leprae. Am J Trop Med Hyg 21: 446-449.55. Levy L, Shepard CC, Fasal P (1976) Pengaruh bakterisida dari rifampisin pada M.leprae pada manusia: A) dosis tunggal 600, 900 dan 1200 mg; dan B) dosis harian300 mg. Int J Lepr lain Mycobact Dis 44: 183-187.56. Ji B, Perani EG, Petinon C, Grosset JH (1992) kegiatan bakterisida tunggal ataubeberapa dosis berbagai kombinasi obat anti-lepra baru dan / atau rifampisinterhadap M. leprae pada tikus. Int J Lepr lain Mycobact Dis 60: 556-561.57. Ji B, Sow S, Perani E, Lienhardt C, Diderot V, et al. (1998) aktivitas bakterisidadari kombinasi dosis tunggal dari ofloksasin ditambah minocycline, dengan atau tanparifampisin, melawan Mycobacterium leprae pada tikus dan pada pasien lepromatosa.Antimicrob Agen Chemother 42: 1115-1120.58. Ji B, Grosset J (2000) Kombinasi rifapentin-moksifloksasin-minocycline(PMM) untuk pengobatan kusta. Lepr Rev 71 Suppl: S81-87.59. Hastings RC, Chehl SK (1991) Kemoterapi kusta di multibasiler telanjangtikus. India J Lepr 63: 350-355.60. Banerjee DK, McDermott-Lancaster RD (1992) Sebuah studi eksperimental untukmengevaluasi aktivitas bakterisidal ofloksasin terhadap Mycobacterium didirikaninfeksi leprae. Int J Lepr lain Mycobact Dis 60: 410-415.61. Tomioka H, Saito H (1993) efikasi terapeutik beberapa kuinolon baru danKombinasi ofloksasin dengan rifampisin terhadap infeksi Mycobacterium lepraediinduksi pada tikus telanjang athymic. Int J Lepr lain Mycobact Dis 61: 250-254.62. Ji B, Perani EG, Petinom C, Grosset JH (1996) kegiatan bakterisida darikombinasi obat baru terhadap Mycobacterium leprae pada tikus telanjang. AntimicrobAgen Chemother 40: 393-399.63. Banerjee DK, McDermott-Lancaster RD, McKenzie S (1997) Eksperimental

evaluasi kemungkinan obat jangka pendek baru rejimen untuk pengobatankusta multibasiler. Antimicrob Agen Chemother 41: 326-330.64. Moet FJ, Pahan D, Oskam L, Richardus JH (2008) Efektivitas dosis tunggalrifampisin dalam mencegah kusta di kontak dekat pasien dengan yang barudidiagnosis kusta: Cluster acak percobaan terkontrol. BMJ 336: 761-764.65. Feenstra SG, Pahan D, Moet FJ, Oskam L, Richardus JH (2012) Pasien-terkaitfaktor memprediksi efektivitas kemoprofilaksis rifampisin di kontak: 6tahun tindak lanjut dari kohort COLEP di Bangladesh. Lepr Rev 83: 292-304.66. Ji B, Chauffour A, Andries K, Jarlier V (2006) kegiatan bakterisida dari R207910dan agen antimikroba lainnya yang lebih baru terhadap Mycobacterium leprae pada tikus.Antimicrob Agen Chemother 50: 1558-1560.67. Burgos J, de la Cruz E, Paredes R, Andaya CR, Gelber RH (2011) Kegiatanbeberapa antimikroba baru terhadap logaritmik mengalikan M. leprae ditikus. Lepr Rev 82: 253-258.68. Rosenthal IM, Tasneen R, Peloquin CA, Zhang M, Almeida D, et al. (2012)Dosis-mulai perbandingan rifampisin dan rifapentin dalam dua patologismodel murine berbeda tuberkulosis. Antimicrob Agen Chemother 56: 4331-4340.69. Almeida DV, Converse PJ, Li SY, Tyagi S, Nuermberger EL, et al. (2013)Aktivitas bakterisida tidak memprediksi sterilisasi kegiatan: Kasus rifapentindalam model murine dari Mycobacterium penyakit ulcerans. PLoS Negl Trop Dis 7:E2085.Penentuan molekul M. leprae ViabilitasPLOS Neglected Tropical Diseases | www.plosntds.org9Agustus 2013 | Volume 7 | Isu 8 | e2404