Liposom yang mengandung garam empedu sebagai sistem pengiriman okular baru untuk tacrolimus (FK506): dalam karakterisasi in vitro dan ditingkatkan permeasi

(peresapan) kornea

Abstrak : Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki potensi liposom yang mengandung garam empedu sebagai sistem pengiriman oftalmik untuk tacrolimus untuk meningkatkan permeabilitas kornea . Liposom yang mengandung garam empedu , termasuk sodium taurocholate , natrium deoxycholate , dan natrium glycocholate , diproduksi dengan metode dispersi film tipis dengan ukuran partikel sekitar 100 nm dan efisiensi penjeratan lebih dari 90 % . Kurang dari 5% tacrolimus dibebaskan dari liposom konvensional dan dari liposom yang mengandung natrium taurocholate , natrium deoxycholate , atau natrium glycocholate lebih dari 12 jam . Penyerapan seluler liposom konvensional secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan liposom yang mengandung garam empedu . Namun , liposom yang mengandung garam empedu diberikan kenaikan 3-4 - kali lipat dari tacrolimus di ex vivo transportasi kornea tacrolimus dibandingkan dengan liposom konvensional . Ketika mata kelinci diobati dengan suspensi liposom perklorat -loaded Dii , liposom yang mengandung garam empedu menunjukkan penetrasi yang cepat dan berkelanjutan di seluruh kornea . Sayangnya , liposom mengandung natrium deoxycholate disebabkan racun atau iritasi pada kedua sel epitel kornea manusia spontan berasal dan kornea kelinci . Oleh karena itu , liposom yang mengandung natrium dan natrium taurocholate glycocholate adalah pembawa potensial dalam sistem pengiriman obat mata , mengingat toksisitas yang rendah dan jauh lebih baik permeabilitas .PengantarTransplantasi kornea memiliki tingkat keberhasilan tertinggi dari semua jenis organ manusia dan transplantasi jaringan , meskipun penolakan imunologi tetap menjadi faktor utama dalam kegagalan graft . Terapi obat dengan imunosupresan , seperti siklosporin A2 dan tacrolimus ( FK506 ) , merupakan strategi utama yang digunakan untuk menghambat penolakan imunologi . FK506 adalah agen imunosupresan baru diisolasi oleh fermentasi dari Streptomyces tsukubaensis dan mirip dengan siklosporin A, tapi lebih kuat ( hingga 100 kali potensi siklosporin A ) . Studi klinis telah menunjukkan bahwa FK506 disampaikan topikal mampu menghambat penolakan imunologi setelah cangkok kornea dan limbal berisiko tinggi . Namun , FK506 memiliki kesulitan menembus epitel kornea dan terakumulasi dalam stroma kornea karena kelarutan air yang buruk ( 1,3 mg / mL ) dan berat molekul yang relatif tinggi ( 804,02 g / mol ) . Untuk penghambatan penolakan imunologi setelah cangkok kornea , obat tetes mata adalah pilihan yang lebih baik atas formulasi dosis intraokular . Tetes mata dalam bentuk suspensi tacrolimus dan larutan minyak telah dilaporkan .Meskipun tetes mata memiliki keunggulan yang berbeda , seperti kemudahan administrasi dan kepatuhan yang baik , hambatan fisiologis pada kornea menyebabkan penyerapan yang buruk dari molekul obat dan kemanjuran terapi akibatnya miskin ketika digunakan secara topikal . Hambatan tersebut antara permeasi miskin kornea , eliminasi oleh air mata dan saluran nasolacrimal , dan transportasi ke sirkulasi sistemik oleh jalur penyerapan lainnya . Sementara itu, baik suspensi dan larutan minyak menunjukkan biokompatibilitas miskin dan iritasi kuat. Oleh karena itu , meningkatkan penetrasi kornea dan memperpanjang waktu retensi prekornea merupakan aspek penting yang harus dipertimbangkan ketika merancang

formulasi . Sistem penghantaran obat nano , seperti nanopartikel , cubosomes , nanoemulsions , dan liposom , telah ditunjukkan untuk meningkatkan penetrasi kornea dan meningkatkan waktu retensi . Karena kemiripannya dengan biomembranes , liposom telah meningkatkan biokompatibilitas .  Sebuah penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa liposom sarat dengan FK506 dapat memfasilitasi penetrasi obat melintasi kornea ke dalam aqueous humor dan bahwa obat tersebut akan menyebar ke seluruh jaringan okular , mirip dengan larutan minyak zaitun FK506 . Namun , fraksi liposomal FK506 yang diserap masih terlalu kecil untuk mencapai tingkat terapeutik , sehingga perembesan transcorneal dari FK506 membutuhkan perbaikan.Mengganti sebagian kecil dari kolesterol dalam liposom dengan garam empedu menyebabkan liposom menjadi lebih fleksibel, yang dapat mempermudah penetrasi kendaraan di seluruh biomembranes. Laporan terbaru menunjukkan bahwa liposom yang mengandung garam empedu meningkatkan penyerapan lisan dan transdermal molekul obat bila dibandingkan dengan liposom konvensional. Garam empedu digunakan dalam sistem pengiriman obat termasuk terutama natrium glycocholate, natrium deoxycholate, dan natrium taurocholate, karena mereka kurang mengiritasi.Dalam studi ini, liposom tacrolimus-loaded mengandung tiga jenis garam empedu (natrium glycocholate, natrium deoxycholate, atau natrium taurocholate) dipreparasi kemudian dikarakterisasi secara in vitro.Peresapan Transcorneal dievaluasi dalam vivo model sel difusi mantan menggunakan kornea dipotong. Selanjutnya, kami menggunakan sel epitel kornea manusia spontan berasal (SDHCECs) untuk mengevaluasi penyerapan dan toksisitas liposom yang mengandung garam empedu, untuk menilai potensi mereka untuk aplikasi mata. Akhirnya, in vivo serapan dan toksisitas dinilai setelah pemberian liposom mata kelinci.Bahan dan MetodeBahanTacrolimus dibeli dari Shanghai Baibo Perusahaan Bioteknologi (Shanghai, Republik Rakyat Cina). Sodium glycocholate dibeli dari Amresco (Solon, OH, USA). Kedelai fosfatidilkolin (S100) dan kolesterol yang disediakan oleh Lipoid (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Jerman). Sodium taurocholate dan natrium deoxycholate diperoleh dari Sigma (St Louis, MO, USA). Sephadex G-25 dibeli dari Pharmacia (Peapack, NJ, USA). Dii perklorat (1,1 '-dioctadecyl-3, 3', 3'-tertamethylin-docarbocyanine perklorat) diperoleh dari Fanbo Biokimia (Shanghai, Republik Rakyat Cina). Kinerja tinggi kelas asetonitril kromatografi cair dan metanol dibeli dari Suntuk Company Inc (Fairfield, CA, USA). Methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide (MTT) dipasok oleh Sigma. Semua reagen lainnya adalah bermutu analitis.Persiapan liposom tacrolimus - loaded yang mengandung garam empeduLiposom tacrolimus -loaded yang mengandung garam empedu disusun menggunakan metode dispersi film tipis . Secara singkat , fosfatidilkolin kedelai , garam empedu ( natrium glycocholate , natrium taurocholate , dan natrium deoxycholate ) dan tacrolimus dilarutkan dalam diklorometana / metanol ( 9:1 , v / v ) dalam labu alas bulat . Pelarut organik kemudian diangkat dengan menggunakan rotary evaporator ( RV 10 digital , IKA Works, Staufen , Jerman ) dalam 37 ° C air mandi di bawah vakum . Film lipid kering dipertahankan pada tekanan tereduksi selama dua jam untuk menghilangkan jejak pelarut . Film lipid kemudian terhidrasi dengan 10 mL buffer fosfat ( pH 7,4 ) selama 30 menit pada suhu 37 ° C untuk

memperoleh suatu dispersi kasar liposom. Ukuran partikel dari liposom selanjutnya menurun menggunakan probe ultrasonikator ( Scientz - IID , Ningbo Scientz Bioteknologi Co , Zhejiang , Republik Rakyat Cina) . Dispersi liposom disimpan pada 4 ° C sampai digunakan . Prosedur yang sama diikuti dengan kolesterol di tempat garam empedu untuk persiapan liposom konvensional.Karakterisasi liposomUkuran partikel dan potensial zetaUkuran partikel dan potensial zeta dari liposom tacrolimus-loaded ditentukan oleh hamburan cahaya dinamis menggunakan Nano ZS zeta Sizer (Malvern, Worcestershire, Inggris) pada 25 ° C. Tiga pengukuran dilakukan, dan jumlah berjalan dalam setiap pengukuran secara otomatis ditentukan oleh perangkat lunak, hasilnya dinyatakan sebagai deviasi rata-rata ± standar.Transmisi mikroskop elektronMorfologi liposom diamati menggunakan mikroskop elektron transmisi (JEM-1230, JEOL, Tokyo, Jepang). Setetes suspensi liposom dipindahkan ke berlapis karbon jaringan tembaga 300-mesh, dan tambahan air telah dihapus oleh blotting. Setetes 2% uranil asetat ditambahkan selama 60 detik untuk noda liposom, dan suspensi dikeringkan di bawah kondisi kamar. Sampel diperiksa pada tegangan 120 kV percepatan.Efisiensi penjeratanEfisiensi penjeratan tacrolimus dalam liposom ditentukan dengan menggunakan kromatografi permeasi gel method.15 Singkatnya, kolom (20 cm x 1 cm) diisi dengan Sephadex G-25 gel dielusi dengan 200 uL liposom kosong untuk jenuh kolom dan meningkatkan pemulihan kolom. Selanjutnya, liposom tacrolimus-loaded dipasang dan dielusi dengan air pada laju alir 1 mL per menit untuk memisahkan tacrolimus bebas dari liposom. Elusi dipantau dengan pengukuran kekeruhan pada panjang gelombang 500 nm menggunakan spektrofotometer (UV-2401, Shimadzu, Tokyo, Jepang). Eluen yang mengandung liposom dilarutkan dalam metanol dan dianalisis untuk tacrolimus dengan kromatografi cair kinerja tinggi ultraviolet. Efisiensi jebakan (EE%) dihitung sebagai: EE% = Wliposome / Wtotal, di mana Wlipsome dan Wtotal menunjukkan berat tacrolimus dalam liposom dan jumlah tacrolimus berat dalam dispersi liposom.Pelepasan In VitroDalam profil pelepasan in vitro untuk liposom tacrolimus-loaded diselidiki menggunakan dialisis dinamis. Media rilis baru disiapkan, simulasi cairan air mata dengan komposisi NaCl (0,67 g), NaHCO3 (0,20 g), dan CaCl2 2H2O (0,008 g) dilarutkan dalam 100 mL air⋅ deionisasi. Media rilis mengandung 0,1% sodium dodesil sulfat untuk mencapai kondisi tenggelam. Awalnya, 1 mL liposom (tacrolimus 3 mg / mL) dipindahkan ke dalam tabung dialisis (Float-A-alat analisa ® G2, Spectrum Laboratories, Torrance, CA, USA) dengan 100 kDa berat molekul membran cutoff, yang kemudian ditempatkan ke dalam 100 mL media rilis diaduk pada 100 rpm pada 34 ° C ± 0,5 ° C. Pada interval waktu yang telah ditetapkan, 1 mL medium rilis ditarik dan volume yang sama dari media rilis baru ditambahkan untuk mempertahankan volume konstan. Isi tacrolimus ditentukan oleh ultraviolet-kromatografi cair kinerja tinggi setelah sentrifugasi (10.000 × g selama lima menit).Uji sitotoksisitas menggunakan SDHCECsbudidaya sel

SDHCECs 40-60 bagian ditanam sebagai monolayer pada 37 ° C dalam suasana udara 5 % CO2/95 % , dan sel-sel yang menunjukkan lebih dari 97 % viabilitas digunakan untuk percobaan . Budaya yang digunakan adalah media Dulbecco dimodifikasi Eagle , ditambah dengan 10% panas dilemahkan serum janin sapi , 10 ng / mL faktor pertumbuhan epidermal manusia , 5 mg / mL insulin manusia transferin - Se , 0,4 mg / mL hidrokortison , 2 mM L - glutamin , 100 U / mL penisilin , dan 100 mg / mL streptomisin (semua dari Gibco , Grand Island , NY , USA ) .sitotoksisitasKelangsungan hidup SDHCECs diukur dengan MTT untuk mengevaluasi sitotoksisitas liposom yang mengandung garam empedu . Sekitar 1 × 104 sel ( 200 uL media kultur sel , 5 × 104 sel / mL ) yang diunggulkan di 96- piring kultur jaringan . Sel-sel kemudian dikultur dalam kondisi yang sama seperti yang dijelaskan untuk budidaya sel selama 24 jam . Media telah dihapus sebelum eksperimen dan 200 uL liposom dalam suplemen bebas medium kultur yang ditambahkan ke masing-masing serta kontrol negatif . Setelah 10 jam , 20 uL dari 5 mg / mL larutan MTT ditambahkan ke setiap sumur , dan menengah telah dihapus setelah dua jam . Kristal yang dihasilkan formazan kemudian dilarutkan dalam 150 uL dimetil sulfoksida , dan absorbansi diukur pada 570 nm .Penyerapan oleh selSDHCECs yang diunggulkan dalam piring 24 - baik dengan kepadatan 3 × 104 sel / sumur dan diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan mereka untuk mematuhi . Untuk mengukur serapan dari liposom tacrolimus -loaded oleh sel, SDHCECs diinkubasi dengan liposom tacrolimus -loaded dalam suplemen bebas medium kultur selama periode waktu yang berbeda ( 2 , 4 , 8 dan 12 jam ) . Setelah mencuci sel tiga kali dengan fosfat - buffered saline ( pH 7,4 ) , 200 uL phosphate-buffered saline ditambahkan , dan suspensi sel adalah beku- dicairkan . Freeze - dicairkan suspensi sel ( 100 uL ) adalah vortexed dengan 100 uL metanol selama lima menit , dan disentrifugasi pada 10.000 xg selama 10 menit . Konsentrasi obat dalam supernatan diukur dengan kinerja tinggi kromatografi cair tandem spektrometri massa , dan kandungan protein dalam suspensi sel diukur dengan menggunakan asam bicinchoninic assay kit ( Xitang Perusahaan Bioteknologi , Shanghai , Republik Rakyat Cina) . Penyerapan seluler tacrolimus dihitung sebagai : serapan obat ( ng / mg protein ) = CTLM / Cprotein , di mana CTLM adalah konsentrasi intraselular tacrolimus dan Cprotein adalah konsentrasi protein selular .Transportasi ex vivo di kelinci kornea

Ex vivo penetrasi kornea dilakukan dengan menggunakan sel difusi Valia - Chien dengan luas difusi 0,825 cm2 . Albino Baru kelinci Selandia berat 2,0-2,5 kg diperoleh dari Laboratorium Hewan Pusat Layanan dari Fudan University. Semua perawatan hewan yang sesuai dengan peraturan untuk administrasi urusan mengenai hewan percobaan dan disetujui oleh etika hewan komite Fudan University. Kelinci eutanasia dengan suntikan overdosis udara ke telinga vena marjinal setelah dibius dengan overdosis intramuskular campuran anestesi xylazine 20 mg / kg ketamin dan 200 mg / kg . Kornea yang dipotong dari bola dan dipasang ke cincin aparat perfusi . Kornea yang lembut dibilas dengan garam , dan sangat hati-hati diambil tidak menghasilkan kerutan atau lipatan pada membran sebelum pemasangan . Cairan air mata Simulasi ( 3 mL ) , prewarmed sampai suhu 34 ° C , ditempatkan ke dalam ruang reseptor aparatur, dengan pengadukan magnetik di seluruh

percobaan . Tiga mililiter liposom ( mengandung 1 mg / mL tacrolimus ) ditempatkan di ruang donor , yang kemudian disegel untuk menghindari penguapan . Campuran O2 : CO2 ( 95:5 ) digelembungkan melalui ruang . Tingkat hidrasi kornea , yang menunjukkan kondisi kornea , diukur menurut metode yang dilaporkan previously. Selanjutnya, 500 sampel uL diambil pada 30 , 60 , 90 , 120 , 180 dan 240 menit dan diganti dengan segar simulasi tearfluid . Jumlah obat menyerap seluruh kornea diuji dengan kinerja tinggi kromatografi cair tandem spektrometri massa .

Jumlah obat yang meresap melalui epitel kornea diplot terhadap waktu untuk setiap liposom dan kemiringan bagian linear dari grafik dihitung . The jelas Koefisien permeabilitas kornea ( cm / s ) ditentukan menurut persamaan : PQ app = Δ / At C A 0 60 , di mana ΔQ⋅ ⋅ ⋅ / At adalah bagian linear dari lereng ( ug per menit ) , 60 adalah konversi konstan dari menit ke detik , A adalah luas permukaan kornea , dan C0 adalah konsentrasi obat awal ( μg/cm3 ) .Dalam penyerapan kornea vivoIn vivo serapan kornea liposom dievaluasi menggunakan fluoresensi - berlabel bagian beku . Formulasi liposom diberi label dengan menambahkan jumlah tertentu Dii perklorat dan kemudian diproses melalui prosedur yang sama seperti yang digunakan untuk pembuatan liposom mengandung tacrolimus . kelinci secara acak dibagi menjadi empat kelompok tiga binatang masing-masing, dan masing-masing menerima 40 uL liposom mengandung Dii perklorat 50 mg / mL pada kedua mata . Pada 10 , 30 , dan 60 menit setelah berangsur-angsur , satu kelinci dari masing-masing kelompok adalah eutanasia , dan kornea yang dipotong dari bola dan lembut dibilas dengan saline . Satu kelinci tidak diobati sebagai negatif kontrol . Kornea difiksasi dengan pencelupan ke Davidson solusi selama empat jam dan kemudian pada 30 % sukrosa dehidrasi semalam. Kornea yang selanjutnya tertanam dalam optimum Senyawa suhu pemotongan ( Tissue - Tek ® , Sakura , Torrance , CA , USA) , dibekukan pada -22 ° C , potong menjadi 5 pM iris , dan diamati di bawah mikroskop scanning confocal laser yang ( LSM 510 Meta , Zeiss , Oberkochen , Jerman ) .

Dalam uji toleransi vivo korneaIn vivo toleransi kornea dievaluasi di bagian parafin mengikuti hematoxylin dan eosin untuk patologi . Kelinci secara acak dibagi menjadi lima kelompok tiga hewan masing-masing, dan setiap kelinci menerima 40 uL liposom mengandung tacrolimus 1 mg / mL pada mata kanan di 30 menit interval selama enam jam . Mata lain yang digunakan sebagai kontrol dan tidak menerima pengobatan. Yang keenam belas hewan adalah diobati dan menjabat sebagai kontrol palsu . Enam jam setelah berangsur-angsur pertama, kelinci eutanasia , dan kornea yang dipotong dari bola dan lembut dibilas dengan saline . Kornea direndam ke dalam larutan Davidson untuk satu jam dan tetap dengan 10 % netral formalin . Selanjutnya, mereka adalah dehidrasi dalam gradien alkohol , ditempatkan dalam meleleh parafin , dan dipadatkan ke dalam bentuk blok . Salib – bagian dipotong , diwarnai dengan hematoxylin dan eosin , dan diamati mikroskopis untuk modifikasi patologis .Penentuan tacrolimus

Tacrolimus ditentukan menggunakan LC-10 atvp reversedphase ultraviolet kromatografi cair tekanan tinggi (Shimadzu, Kyoto, Jepang) metode seperti yang dilaporkan sebelumnya. Sistem ini terdiri dari pompa biner, detektor ultraviolet merdu, pemanas kolom,

dan manual injektor. Fase gerak adalah campuran acetonitrile/0.1% larutan asam fosfat (65/35, v / v) dipompa dengan laju alir 1,0 mL per menit. Para tacrolimus dipisahkan pada kolom C18 (Eclipse XDB, 4.6 × 50 mm, 5 m, Agilent Teknologi Inc, Santa Clara, CA, USA), dijaga dengan isi ulang precolumn (C18, 2,0 mm × 20 mm, Alltech, Nicholasville, KY, USA). Suhu kolom dipertahankan pada 60 ° C. Deteksi panjang gelombang adalah 220 nm.

Kromatografi cair kinerja tinggi spektrometri massa tandem digunakan untuk mengukur sampel tacrolimus untuk serapan seluler dan studi transportasi kornea vitro. Pemisahan kromatografi dilakukan pada 1200 sistem Agilent penyusunan pompa kuaterner, degasser, sebuah autosampler, dan pemanas kolom (Agilent Technologies Inc). Kolom kromatografi cair kinerja tinggi adalah XDB-C18 (2.1 × 50 mm, 5 m) kolom Zorbax dari Agilent. Fase gerak terdiri 30% dari fase air (0,1% asam formiat) dan 70% dari fase organik (metanol dengan asam format 0,1%). Laju aliran yang ditetapkan sebesar 0,5 mL per menit. Kolom dijaga pada 50 ° C dalam oven kolom. Deteksi spektrometri massa dilakukan pada 4000 Q-TRAP kolom kromatografi cair ditambah dengan sistem spektrometri massa tandem menggunakan sumber ion ESI (Turbo Ionspray) dari AB SCIEX Perusahaan (Framingham, MA, USA) dan dioperasikan dalam mode ionisasi negatif. Ion tegangan semprot dan suhu sumber ditetapkan sebesar -4.500 V dan 450 ° C, masing-masing. Transisi ion dipantau dari m / z 802,5 → 560,5 untuk tacrolimus dan 790,5 → 548,3 untuk ascomycin (standar internal).Analisis statistikAnalisis satu arah varians dilakukan pada semua data eksperimen, dan sarana dibandingkan dengan menggunakan Student t-test pada tingkat 5% dengan Paket Statistik untuk Ilmu Sosial versi software 13.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA).Hasil dan diskusiPersiapan liposom tacrolimus - loaded yang mengandung garam empeduLiposom yang mengandung garam empedu berhasil dibuat dengan metode film tipis dispersi / sonication seperti yang dijelaskan dalam laporan kami sebelumnya enkapsulasi siklosporin A dalam liposom yang mengandung natrium deoxycholate.15 hasil penelitian ini kami menunjukkan bahwa liposom yang mengandung tiga garam empedu yang berbeda tidak signifikan berbeda dalam ukuran partikel atau efisiensi jebakan ( P . 0.05 , Gambar 1A dan B). Namun, rasio fosfatidilkolin kedelai terhadap garam empedu dapat mempengaruhi ukuran partikel dan efisiensi penjeratan liposom . Ukuran partikel dari liposom yang mengandung 4 /1 fosfatidilkolin kedelai terhadap garam empedu secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan dua kelompok lain , dan liposom mengandung 5 /1 fosfatidilkolin kedelai terhadap garam empedu menunjukkan efisiensi penjeratan tertinggi . Kecenderungan yang sama diamati untuk masing-masing dari tiga jenis liposom (yaitu , yang mengandung natrium taurocholate , natrium deoxycholate , atau natrium glycocholate ) . Dengan peningkatan kadar garam empedu , permukaan peregangan sistem liposomal harus menurun dan menyebabkan penurunan ukuran partikel . Namun , kandungan sangat tinggi garam empedu meningkatkan kelarutan tacrolimus dalam fase dispersi , yang dikompromikan efisiensi jebakan . Rendahnya efisiensi penjeratan terlihat untuk liposom yang mengandung 6/1 fosfatidilkolin kedelai terhadap garam empedu mungkin adalah hasil dari stabilitas miskin liposom pada rasio ini . Oleh karena itu, kami memilih 5/1 dari fosfatidilkolin kedelai terhadap garam empedu untuk mempersiapkan liposom ( yang mengandung natrium

taurocholate , natrium deoxycholate , atau garam empedu glycocholate natrium ) untuk evaluasi lebih lanjut .Ultrasonication sering digunakan untuk mengurangi ukuran nanopartikel . Gambar 1C menunjukkan pengaruh waktu ultrasonication pada ukuran partikel dan efisiensi jebakan . Ada penurunan yang signifikan dalam ukuran dari sekitar 800 nm sampai 90 nm setelah ultrasonication selama dua menit , dengan masukan energi 380 W. Untuk durasi diselidiki , tampaknya waktu tidak mempengaruhi ukuran partikel . Namun , ultrasonication menunjukkan sedikit efek pada efisiensi penjeratan untuk tacrolimus dalam liposom , yang dapat dikaitkan dengan lipophilicity tacrolimus dan afinitas tinggi untuk bilayers lipid .Tabel 1 menunjukkan ukuran partikel , potensial zeta , dan efisiensi penjeratan liposom tacrolimus disiapkan dalam kondisi optimal . Karena ukuran partikel memberikan pengaruh yang signifikan terhadap kinerja liposom baik in vitro dan in vivo , maka perlu untuk memastikan konsistensi ukuran partikel antara semua batch liposom . Berkenaan dengan liposom konvensional , kurang kolesterol didirikan untuk menghasilkan liposom dengan ukuran partikel yang lebih kecil karena peningkatan kolesterol dalam bilayers lipid meningkatkan kekakuan liposom , yang akibatnya meningkatkan ukuran partikel keseluruhan vesikel . Dari catatan, garam empedu bermuatan negatif merangsang potensi zeta dari liposom yang mengandung tiga jenis garam empedu bila dibandingkan dengan liposom yang mengandung kolesterol .morfologiGambar 2 menunjukkan mikrograf elektron transmisi untuk liposom . Semua liposom yang dekat dengan berbentuk bulat , dengan ukuran partikel rata-rata sekitar 100 nm , yang berkorelasi dengan baik dengan hasil yang diperoleh oleh hamburan cahaya dinamis . Vesikel liposom yang mengandung kolesterol memiliki kecenderungan menggumpal , tapi bukan mereka yang mengandung garam empedu . Fenomena ini dapat segera dikaitkan dengan nilai potensial zeta tinggi, yang menghambat agregasi partikel .Dalam rilis vitroGambar 3 menunjukkan dalam profil pelepasan in vitro untuk formulasi liposomal tacrolimus . Keseluruhan pelepasan tacrolimus dari empat jenis liposom tacrolimus -loaded sangat lambat , tidak lebih dari 5 % pada 24 jam , yang mirip dengan temuan kami sebelumnya dengan siklosporin liposom A - loaded mengandung natrium deoxycholate . Karena kelarutan tacrolimus dalam 0,1 % larutan natrium sulfat dodesil bertekad untuk menjadi lebih dari 0,5 mg / mL , kondisi wastafel yang baik dapat dipertahankan selama pengujian rilis . Tacrolimus dalam larutan benar-benar bisa menyebar di seluruh tabung dialisis dalam waktu satu jam , menunjukkan efek yang dapat diabaikan dari tabung dialisis pada rilis tacrolimus . The slow release tacrolimus dari liposom dapat dikaitkan dengan afinitas tinggi tacrolimus untuk bahan hidrofobik dalam formulasi .sitotoksisitasViabilitas SDHCECs setelah terpapar liposom tacrolimus -loaded pada konsentrasi yang berbeda dievaluasi langsung oleh MTT assay ( Gambar 4 ) . Viabilitas sel lebih dari 85 % untuk semua empat jenis formulasi liposom setelah 12 jam inkubasi , dengan konsentrasi fosfolipid kurang dari 4,0 mg / mL . Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kelangsungan hidup sel diamati antara liposom yang mengandung berbagai konsentrasi natrium taurocholate , natrium glycocholate , atau kolesterol . Namun, ketika konsentrasi

lipid lebih dari 6 mg / mL , liposom mengandung natrium deoxycholate menunjukkan toksisitas lebih SDHCECs dari 2 mg / mL konsentrasi ( P , 0,01 ) , menunjukkan bahwa sitotoksisitas liposom mengandung natrium deoxycholate lebih besar dari itu liposom yang mengandung garam-garam empedu lainnya , yaitu natrium taurocholate dan natrium glycocholate .Garam empedu adalah kelas surfaktan yang menyebabkan iritasi dan toksisitas pada sel membrane.25 Meskipun beberapa laporan menunjukkan bahwa fosfolipid dapat melemahkan toksisitas garam empedu , 26,27 toksisitas liposom yang mengandung garam empedu belum dievaluasi secara rinci untuk sistem pengiriman obat tetes mata. Liposom yang mengandung natrium deoxycholate menunjukkan toksisitas yang lebih besar dalam SDHCECs dibandingkan liposom lainnya . Toksisitas dan aktivitas permukaan garam empedu bervariasi sesuai dengan struktur mereka . Sodium deoxycholate tergabung dalam liposom terutama racun bagi sel-sel kornea , menunjukkan bahwa ini garam empedu bukan penambah cocok untuk pengiriman obat mata .Penyerapan oleh selSerapan liposom tacrolimus -loaded dengan SDHCECs ditunjukkan pada Gambar 5 . Serapan meningkat dengan meningkatnya waktu inkubasi selama empat jenis formulasi liposom . Selama periode 2-8 jam , penyerapan seluler liposom mengandung natrium glycocholate dan mereka kolesterol mengandung tidak berbeda secara signifikan, namun serapan liposom mengandung natrium deoxycholate adalah kurang dari yang mengandung kolesterol selama periode waktu penelitian. Namun, dengan 12 jam , penyerapan liposom yang mengandung kolesterol secara signifikan lebih besar dibandingkan dengan liposom yang mengandung garam empedu , yang mungkin akibat dari zeta potensi negatif mereka .Nanopartikel meningkatkan penetrasi molekul obat oleh berbagai jalur , termasuk meningkatkan serapan seluler , meningkatkan fluiditas membran , dan membuka persimpangan ketat sementara. Oleh karena itu, pertama-tama kita mempelajari penyerapan liposom untuk memahami mekanisme peningkatan penyerapan oleh sel . Liposom yang diambil oleh sel dalam serangkaian langkah-langkah , termasuk adsorpsi , fusi, dan endositosis . Serapan seluler berkorelasi dengan muatan permukaan dan meningkat dengan meningkatnya charge.Therefore positif, bermuatan negatif nanopartikel teradsorpsi buruk ke membran sel , sehingga mengurangi serapan SDHCEC liposom yang mengandung garam empedu dibandingkan dengan mereka kolesterol mengandung . Namun , serapan seluler liposom mengandung natrium glycocholate dan mereka kolesterol yang mengandung mirip . Hasil ini setuju dengan temuan kami sebelumnya untuk liposom insulin - loaded yang mengandung garam empedu yang berbeda .In vitro transportasi transcorneal Gambar 6 menunjukkan in vitro hasil penetrasi kornea untuk liposom mengandung natrium taurocholate, natrium deoxycholate, natrium glycocholate, atau kolesterol. Sebuah hubungan yang hampir linier diamati antara jumlah tacrolimus yang meresap melalui kornea dan waktu. Koefisien permeabilitas nyata (Papp) ditunjukkan pada Tabel 2. Bila dibandingkan dengan liposom yang mengandung kolesterol, yang mengandung natrium taurocholate, natrium deoxycholate, atau natrium glycocholate menunjukkan 4,5 kali lipat, 3,7 kali lipat, dan meningkatkan 3,7 kali lipat pada Papp, masing-masing, menyoroti peningkatan penetrasi dicapai oleh liposom yang mengandung garam empedu, namun, tidak ada perbedaan yang

signifikan antara liposom yang mengandung tiga jenis garam empedu (P. 0,05). Meskipun liposom yang mengandung garam empedu memiliki afinitas kurang untuk membran sel, mereka lebih fleksibel dibandingkan kolesterol mengandung, yang mendukung penetrasi mereka melalui biomembranes. Selain itu, garam empedu transiently dapat membuka persimpangan ketat untuk meningkatkan permeabilitas molekul obat atau nanopartikel. Hati-hati dg kornea terisolasi dan pemeliharaan aktivitas fisiologis di seluruh percobaan sangat penting bagi kemampuan untuk memproduksi hasil. Tingkat hidrasi merupakan parameter yang sering digunakan untuk mengevaluasi kerusakan kornea. Kornea normal memiliki tingkat hidrasi sekitar 76% -80%, sedangkan tingkat hidrasi 83% -92% menunjukkan kerusakan epitel dan / atau endotelium. Dalam studi ini, tingkat hidrasi kornea berkisar antara 78,23% ± 0,94% (untuk liposom mengandung natrium taurocholate) ke 81,59% ± 2,31% (untuk liposom mengandung natrium deoxycholate) dan tidak melebihi 83%, mengkonfirmasikan integritas kornea seluruh eksperimen.In vivo serapan kornea dan transportasiGambar 7 menunjukkan gambar bagian kornea ditangkap oleh confocal scanning laser microscopy setelah dalam administrasi vivo dari berbagai jenis formulasi liposom ketika dimuat dengan Dii perklorat . Dii perklorat adalah probe neon untuk membran sel , memiliki kelarutan air yang sangat rendah , dan umumnya digunakan untuk label membran liposomal . Tidak ada fluoresensi diamati di bagian kornea kontrol. Kornea dari mata diobati dengan liposom yang mengandung kolesterol dipancarkan sinyal fluoresensi lebih intens dalam epitel daripada kelompok lain pada 10 menit setelah berangsur-angsur . Pada 10 menit , kornea dari mata diobati dengan liposom yang mengandung natrium deoxycholate atau natrium taurocholate menunjukkan sinyal fluoresensi jelas dalam endotelium , menunjukkan penetrasi yang cepat dari kendaraan . Namun , sinyal fluoresensi lebih intens diamati dalam stroma kornea dari mata diobati dengan liposom mengandung natrium glycocholate . Setelah pengobatan dengan liposom selama 30 menit , fluoresensi diamati pada semua spesimen endotel kornea , dengan urutan sebagai berikut intensitas : liposom mengandung natrium deoxycholate . natrium taurocholate . kolesterol ≈ glycocholate natrium . Stroma akumulasi lebih dari liposom yang mengandung natrium glycocholate . Selain itu , 60 menit setelah pemberian , sinyal fluoresensi sangat lemah diamati pada kornea dari mata diobati dengan liposom yang mengandung kolesterol . Namun , kornea diobati dengan liposom yang mengandung garam empedu menunjukkan sinyal fluoresensi berturut-turut dari epitel ke endotelium , menunjukkan bahwa liposom yang mengandung garam empedu memiliki kemampuan penetrasi transcorneal kuat dari yang mengandung kolesterol .Hasil dari eksperimen in vivo serapan kornea yang konsisten dengan hasil kami untuk penyerapan sel dan ex vivo transportasi kornea . Dii perklorat adalah probe fluoresensi umum digunakan , yang hidrofobik dan memiliki afinitas tinggi untuk membran fosfolipid . Liposom mengandung kolesterol bisa menyerap ke epitel kornea setelah berangsur-angsur . Namun demikian , liposom yang mengandung garam empedu tiba di endotelium melalui stroma sangat cepat , yang dapat dikaitkan dengan permeabilitas transmembran baik mereka. Liposom Lebih mengandung taurocholate atau natrium glycocholate didistribusikan dalam stroma dan endotelium pada 30 dan 60 menit setelah berangsur-angsur . Dalam penyerapan dan transportasi hasil kornea vivo juga menunjukkan peningkatan kemampuan liposom yang mengandung garam empedu untuk menyerap seluruh kornea .

Toleransi Kornea in vivo Gambar 8 menunjukkan struktur kornea mata yang tidak diobati (kontrol negatif) dan mata diobati dengan liposom atau dengan 0,1% larutan natrium sulfat dodesil (kontrol positif). Mata kelinci diobati dengan liposom yang mengandung natrium taurocholate, natrium glycocholate, atau kolesterol, serta mata kontrol negatif tidak menunjukkan tanda-tanda ketidaknyamanan selama uji enam jam. Tidak ada perbedaan dalam struktur kornea yang diamati antara mata diobati dengan liposom yang mengandung natrium taurocholate, natrium glycocholate, atau kolesterol dan kontrol negatif. Namun, ketika epitel kornea terkena 0,1% natrium sulfat dodesil, sel-sel epitel superfisial yang rusak dan beberapa kesenjangan pada permukaan kornea yang diamati, menunjukkan bahwa natrium dodesil sulfat berbahaya bagi kornea kelinci. Selain itu, mata diobati dengan liposom yang mengandung natrium deoxycholate menunjukkan kesenjangan pada permukaan kornea, mirip dengan yang terlihat pada kelompok kontrol positif. Meskipun hasil penelitian kami menunjukkan bahwa sitotoksisitas liposom mengandung natrium deoxycholate lebih sitotoksik daripada liposom lain, situasi yang sebenarnya dalam jaringan mungkin berbeda. Oleh karena itu, kami mempelajari toleransi kornea lebih lanjut setelah dalam administrasi vivo dari liposom. Sodium dodesil sulfat terpilih sebagai kontrol positif karena dapat merusak sebagian besar biomembrane karena aktivitas permukaan yang kuat. Kami mengamati bahwa liposom yang mengandung natrium deoxycholate, tetapi tidak liposom lainnya, menunjukkan toksisitas sedikit pada kornea kelinci, lanjut menunjukkan bahwa natrium deoxycholate tidak cocok untuk digunakan dalam sistem pengiriman obat mata.KesimpulanLiposom mengandung kolesterol atau garam empedu , termasuk sodium taurocholate , natrium dan natrium deoxycholate glycocholate , disusun menggunakan metode dispersi tipis membran dan menunjukkan ukuran yang sama partikel dan efisiensi penjeratan . Pelepasan tacrolimus dari liposom ini adalah kurang dari 5 % dalam waktu 24 jam . Ex vivo transportasi kornea dan in vivo percobaan serapan kornea menunjukkan bahwa liposom yang mengandung garam empedu memiliki kemampuan permeasi transmembran lebih baik daripada mereka kolesterol yang mengandung dan dapat meningkatkan pengangkutan tacrolimus di kornea oleh 3-4 - kali lipat . Sitotoksisitas dan dalam studi toleransi kornea vivo menunjukkan bahwa liposom yang mengandung natrium taurocholate atau natrium glycocholate ditoleransi dengan baik , sedangkan yang mengandung natrium deoxycholate yang beracun bagi kedua SDHCECs dan kelinci kornea . Sodium taurocholate dan natrium glycocholate dimasukkan ke dalam liposom mungkin pembawa potensial untuk pengiriman okular obat tidak larut seperti tacrolimus .