sterilisasi dan teknik aseptik

8/10/2019 Sterilisasi Dan Teknik Aseptik

1/12

Sterilisasi dan Teknik Aseptik

1. Sterilisasi

Mikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan

manusia. Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui

substrat yang disebut media.

Alat-alat yang digunakan dalam perkembangbiakan inipun harus disterilisasikan

terlebih dahulu. Hal tersebut dimaksudkan agar tidak ada mikroorganisme lain,

yang tidak diinginkan tumbuh dalam media tersebut, sehingga dapat menghambat

pertumbuhan mikroorganisme yang akan dibiakkan dalam media tersebut.

Agar biakan bakteri dapat dibuat, maka media dan alat-alat yang diperlukan harus

disterilisasi sebelum inokulasi. Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan

semua organisme yang dapat menjadi kontaminan. Metode yang lazim digunakan

untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan. Jika panas

digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan

autaklaf), sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan

oven) (Mila Ermila, 2005).

Dalam proses sterilisasi dikenal beberapa cara atau metode, yaitu dengan

menggunakan uap yang mendidih untuk beberapa menit saja, yang kedua dengan

menggunakan autoklaf, atau yang ketiga dengan penyaringan atau filtrasi. Dalam

proses sterilisasi dan penyiapan media ini, kita harus memperhatikan beberapa

hal, tujuannya adalah agar bahan yang kita siapkan tidak terkontaminasi oleh

mikroba yang tidak kita kehendaki.

Adanya bakteri dalam bahan pangan dapat mengakibatkan pembusukan yang

tidak diinginkan atau dapat menimbulkan penyakit yang ditularkan melalui

makanan atau dapat melangsungkan fermentasi. Pada kenyataanya sedikit sekali

lingkungan yang bersih dari bakteri. Bahan pangan selain merupakan sumber gizi

bagi manusia, juga merupakan sumber makanan bagi perkembangan

mikroorganisme.Tidak hanya bakteri yang menggunakan bahan makanan untuk

hidup dan berkembang tetapi juga jamur dan kapang. Untuk itu diperlukan


2/12

langkah-langkah untuk membuat makanan tetap awet dan bebas dari kontaminasi

mikroba patogen.

Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari

semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha

mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (insitu)

oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehide, etiloksida atau betaprolakton

oleh bermacam-macam larutan kimia. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan

secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Irianto, 2006).

Untuk mensterilkan media dapat dilakukan dengan autoklaf, yaitu alat serupa

tangki minyak yang dapat diisi dengan uap. Media yang akan disterilkan

ditempatkan didalam autoklaf selama 15 sampai 20 menit. Suatu bahan disebut

steril apabila bahan tersebut bebas dari mikroorganisme. Sterilisasi dapat

dilakukan dengan berbagai cara yaitu: cara kimia, mekanik atau fisik.Sterilisasi

cara kimia. Bahan/senyawa kimia yang memiliki sifat membunuh mikroorganisme

dapat digunakan untuk sterilisasi (desinfektan), misalnya dibidang kedokteran.

Contohnya alkohol 70%, detergen, karbon, lisol, merkurokhrom dan lain-

lain.Sterilisasi cara mekanik. Sterilisasi ini dilakukan dengan menggunakan alat

penyaring yang sangat halus, dengan lubang berdiameter 0,02 0,45 mikron,

misalnya Seitz filter, Chamberland filter, milipore, dan lain-lain.Sterilisasi cara

fisik. Umumnya dilakukan dengan cara pemanasan pada suhu tinggi. Salah satu

contohnya adalah menggunakan autoklaf, disterilkan pada suhu 121 C dengan

tekanan 1.5 Kg/cm (15 lbs) dalam jangka waktu tertentu tergantung pada bahan

yang disterilkan. Autoclaf, yaitu alat serupa tangki minyak yang dapat diisi

dengan uap. Medium yang akan disterilkan ditempatkan didalam autoclave selama

15 sampai 20 menit.

Cara sterilisasi yang dipakai tergantung pada macamnya bahan dan sifat bahan

yang disterilkan (ketahanan terhadap panas, bentuk yang disterilkan, padat, cair

ataupun gas). Penyelidikan suatu spesies mikroorganisme selalu didasarkan atas

sifat biakan murni dari spesies mikroorganisme tersebut. Oleh karena itu, untuk

dapat memisahkan kegiatan mikroorganisme yang satu dengan yang lain atau


3/12

untuk memelihara mikroorganisme secara biakan murni, perlu digunakan alat-alat

dan medium yang steril (Muhiddin, 2007).

Sterilisasi dan penyiapan media ini sangat penting dalam sebuah pengamatan

mikroba, karena keberhasilan dalam pengamatan sangat tergantung dari

keberhasilan kita mensterilisasi dan persiapan media. Sterilisasi sangat penting

karena pada saat inilah kita akan membunuh mikroba kontaminan yang akan

menghambat atau mengganggu mikroba yang akan kita amati. Sedangkan

persiapan media sangat penting, sebab media yang tidak baik akan menghambat

pertumbuhan mikroba yang akan kita amati. Konsentrasi media yang akan kita

buat harus kita sesuaikan dengan mikroba yang akan kita tumbuhkan, karena tidak

semua mikroba dapat tumbuh dalam media yang sama. Antara satu mikroba

dengan mikroba yang lain tentu saja membutuhkan media yang berbeda-beda,

kalaupun sama medianya tapi konsentrasi yang dibutuhkan belum tentu juga

sama. Ada beberapa mikroba yang dapat tumbuh dalam satu media dengan

konsentrasi media yang sama, oleh karena itu dalam pengamatan ini, kita berusaha

untuk menumbuhkan beberapa jenis mikroba dalam media yang sama.

Sterilisasi dan penyiapan media adalah salah satu proses yang sangat penting

dalam penelitian tentang mikroorganisme. Sebab kedua faktor ini adalah kunci

utama kesuksesan dalam tahap pengamatan. Kita ketahui bahwa di alam semesta

ini banyak sekali bertebaran mikroorganisme, mereka hampir terdapat disemua

tempat. Tidak heran jika kita bisa terkontaminasi dimana saja, meskipun kita

menganggap tempat tersebut sudah steril.

Keberhasilan dalam pengamatan mikroba ini sangat bergantung pada bagaimana

kita mensterilkan alat, dan bagaimana komposisi media yang kita buat. Sebab

komposisi media juga menentukan tingkat keberhasilan mikroba tersebut tumbuh

dalam media. Sehingga kedua hal ini harus benar-benar diperhatikan ketika kita

akan membiakkan mikroba didalam laboratorium, sebab jika terkontaminasi

sedikit saja, maka kemungkinan gagal akan sangat besar.

Media dan alat-alat yang digunakan dalam inokulasi itu tidak steril. Misalnya kita

tidak memperoleh piaraan bakteri yang kita inginkan. Maka langkah-langkah

pertama yang harus kita ambil sebelum kita mengadakan inokulasi ialah


4/12

mengusahakan sterilnya medium berupa alat-alat perlengkapannya. Lagi pula, kita

harus mengusahakan teknik inokulasi.

Dalam proses praktikum sebelum kita menuju kepersiapan media, maka yang

harus kita lakukan lebih dahulu adalah sterilisasi. Sterilisasi ini berlaku dimana

saja terutama yang berkaitan dengan kesehatan dan mikroorganisme. Dalam

pelaksanaan operasi dalam dunia kedokteran, semua alat yang akan digunakan

disterilisasi terlebih dahulu. Tujuanya agar alat-alat tersebut benar-benar steril dan

bersih dari mikroorganisme yang membahayakan, terutama bagi pasien yang akan

dioperasi.

Sterilisasi yang kita lakukan dalam pengamatan ini ditujukan agar alat-alat

tersebut steril dari mikroorganisme lain yang akan menjadi kontaminan bagi

mikroba yang akan kita tumbuhkan. Sterilisasi yang kita lakukan adalah sterilisasi

panas basah dengan menggunakan autoklaf. Sterilisasi ini selain bertujuan untuk

menjaga mutu kebersihan dan pengamatan di laboratorium juga bertujuan untuk

menjaga agar mikroba yang akan kita amati adalah benar-benar mikroba yang kita

inginkan.

Tujuan utama proses panas adalah untuk merancang kondisi pemanasan sehingga

menghasilkan makanan kaleng yang steril komersial. Berbeda dengan sterilisasi

total, dalam sterilisasi komersial masih terdapat beberapa mikroba yang masih

dapat tumbuh dan hidup setelah pemberian panas (sterilisasi). Pemberian panas

yang tidak mencukupi akan meningkatkan resiko terjadinya kerusakan karena

mikroba yang masih ada dan yang hampir mati akan aktif kembali dan tumbuh di

dalam produk. Proses pemanasan yang diperlukan untuk sterilisasi makanan

kaleng diantaranya tergantung pH produk tergolong makanan bersifat asam, yaitu

yang memiliki pH kurang dari 4,5 seperti misalnya sebagian besar buah-buahan

dan beberapa produk tomat, biasanya disterilkan dengan cara memanaskan coldest

point sampai mencapai 200oF (93,3oC) (Winarno,1994:59-60).

Untuk kebanyakan benda, panas merupakan metode sterilisasi yang paling praktis

dan efisien. Walaupun tidak seorangpun mengetahui dengan tepat bagaimana

panas membunuh mikroorganisme tertentu. Kita benar-benar tahu bahwa

kematian itu terjadi dengan menghentikan satu atau lebih protein penting seperti


5/12

enzim. Jumlah panas yang diperlukan untuk mematikan mikroorganisme berbeda

dari satu organisme ke organisme lain (Wesley, 1993).

Masalah yang sering kita hadapi dalam laboratorium adalah tingkat kesterilan

alat-alat yang akan digunakan, bahkan yang lebih parah lagi adalah alat yang akan

digunakan untuk mensterilkan benda-benda tersebut juga malah tidak berfungsi

dengan baik. Sehingga dalam hal-hal ini akan memacu tingkat kegagalan dalam

pengamatan.

Seperti yang telah dikemukakan diatas tadi bahwa sterilisasi yang dipakai pada

praktikum ini adalah sterilisasi panas basah, dengan menggunakan autoklaf. Alat-

alat yang akan disterilkan dalam autoklaf ini, sebelum dimasukkan ke dalam

autoklaf maka harus dibungkus dengan kertas, tujuannya adalah agar tekanan

yang ditimbulkan tidak sampai memecahkan alat-alat tersebut, sebab yang

dimasukkan ke dalam hampir semuanya adalah alat-alat yang terbuat dari kaca.

Kita ketahui bahwa autoklav memiliki ruangan yang mampu menahan tekanan

diatas 1 atm. Dalam autoklaf inilah berlangsung sterilisasi panas basah. Oleh

karena itu, setelah air dalam tangki mendidih dan mulai terbentuk uap air, maka

uap air ini akan mengalir ke ruang pensteril guna mendesak keluar semua udara

didalamnya. Jika seandainya masih ada udara yang tersisa, maka udara ini akan

menambah tekanan didalam ruang pensteril yang akan mengganggu naiknya suhu

dalam ruangan tersebut.

Alat-alat dan bahan yang akan kita sterilkan sebaiknya ditempatkan dalam

beberapa botol yang lebih kecil daripada dikumpulkan dalam sebuah botol yang

lebih besar. Setelah pintu autoklaf ditutup rapat, barulah kran pipa uap dibuka, dan

temperatur akan terus menerus naik sampai 1210C. Biasanya autoklaf sudah

diatur sedemikian rupa, sehingga pada suhu tersebut, tekanan yang ada 1 atmosfer

per 1 cm2. Perhitungan waktu 15 atau 20 menit dimulai sejak termometer pada

autoklaf menunjuk 1210C. Setelah cukup waktu, maka kran uap ditutup, dan

dengan demikian suhu mulai turun sedikit demi sedikit. Autoklaf tidak boleh

dibuka sekonyong-konyong, hal ini ditujukan untuk sterilisasi yang jika

menggunakan botol dan botol tersebut berisi bahan, maka tidak boleh dibuka

sekonyong-konyong agar isi botol tidak meluap kemana-mana. Sebaiknya kita


6/12

menunggu sampai manometer menunjuk angka 0, barulah autoklaf dibuka.

Pendinginan dilakukan sedikit demi sedikit.

Selain sterilisasi panas basah ada juga sterilisasi panas kering. Sterilisasi dengan

cara ini adalah dengan menggunakan oven atau dengan pembakaran. Alat-alat

yang akan disterilkan ditempatkan dalam oven pada suhu 1601800C. Sterilisasi

panas kering ini caranya adalah alat-alat yang akan kita gunakan dimasukkan

dalam oven, karena tingkat efektifitasnya kurang maka waktu yang dibutuhkan

cukup lama yaitu sekitar 1 2 jam. Hal ini disebabkan daya penetrasi panas

kering tidak sebaik pada panas basah. Sterilisasi panas kering ini cocok untuk alat

gelas atau kaca seperti, cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, dan lain-lain.

Selain dimasukkan dalam oven, ada juga yang dibakar secara langsung. Tetapi

pembakaran secara langsung ini hanya umumnya hanya bisa digunakan pada

jarum ose. Tingkat keberhasilan dari pembakaran secara langsung ini biasanya

mendekati 100%.

Setelah semua alat-alat disterilisasi dan telah dikeluarkan dari autoclaf, maka

tahapan selanjutnya adalah penyiapan media. Media yang akan dibuat ada dua

jenis yaitu media NA (Nutrient Agar), dan PDA (Potato Dextroksa Agar).

Perbedaan kedua jenis media ini adalah terletak pada bahan dasarnya. Jika media

NA menggunakan ekstrak daging dan agar, maka PDA menggunakan ekstrak

kentang. Kedua media ini harus dipanaskan terebih dahulu, selanjutnya disimpan

didalam kulkas. Tujuan dari penyimpanan ini adalah agar medianya tidak rusak.

Tidak semua mikroba dapat tumbuh dalam kedua media ini, ada beberapa jenis

mikroba tertentu yang membutuhkan media lain agar bisa tumbuh dan diamati.

Tetapi kedua media ini adalah media standar yang banyak digunakan di

laboratorium-laboratorium mikrobiologi.

1. Cara Untuk Mensterilkan Media

a) Dalam abad 18 orang mensterilkan media cukup dengan mendidihkan media

tersebut selama beberapa jamdengan jalan ini maka matilah semua benih

kehidupan. Cara yang demikian ini dilakukan oleh Spallanzani (tahun 1729-1799)

untuk membuktikan tidak mungkinnya abiogenesis.


7/12


8/12

masih perlu dipanasi dalam autoklaf, meskipun tidak selama 15 menit dengan

temperatur 1210C. Penyaringan dapat dilakukan juga dengan saringan yang dibuat

dari asbes. Saringan ini lebih murah dan lebih muda penggunaannya dari pada

saringan porselin. Saringan asbes dapat dibuang setelah dipakaidan terlalu sulit

untuk dibersihkan.

Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu secara mekanik,

fisik dan kimiawi (Indra, 2008):

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi) menggunakan suatu saringan yang berpori

sangat kecil (0.22 mikron atau 0.45 mikron) sehingga mikroba tertahan pada

saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk sterilisasi bahan yang peka panas,

misal nya larutan enzim dan antibiotik.

2. Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan & penyinaran.

Pemanasan

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung,

contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

b. Panas kering: sterilisasi dengan oven kira-kira 60-1800C. Sterilisasi panas

kering cocok untuk alat yang terbuat dari kaca misalnya erlenmeyer, tabung reaksi

dll.

c. Uap air panas: konsep ini mirip dengan mengukus. Bahan yang mengandung air

lebih tepat menggungakan metode ini supaya tidak terjadi dehidrasi.

d. Uap air panas bertekanan: menggunakan autoklaf. Adapun cara menggunakan

autoklaf adalah sebagai berikut:

1) Autoklaf Manual

a) Mengisi autoklaf dengan air hingga dekat sarang.

b) Memasukan bahan-bahan (medium) atau peralatan yang akan disterilkan.

c) Membiarkan klep uap terbuka, menyalakan autoklaf.

d) Bila dari klep uap terdapat cairan yang menetes, berarti ruang dalam autoklaf

telah jenuh dengan uap air. Menutup klep uap tersebut.

e) Membiarkan autoklaf menyala hingga tercapai suhu 121C dan tekanan 15

lbs. lalu pertahankan selama 15-20 menit.


9/12

f) Setelah 15-20 menit pada tekanan uap lbs, mematikan autoklaf, menunggu

tekanan menurun selama 5-5-10 menit.

g) Membuka klep berlahan-lahan, mengeluarkan uap hingga tekanan kembali

nol.

2) Autoklaf Otomatis

a) Mengisi autoklaf dengan aquades sampai batas yang ditentukan.

b) Memeriksa juga tempat buangan air diluar autoklaf, jangan sampai isinya

berlebihan atau kurang.

c) Memasukan medium dan alat-alat yang akan disterilkan.

d) Menutup autoklaf rapat-rapat, memeriksa tombol penutupagar benar pada

posisi batas akhir close.

e) Menyalakan autoklaf, mengatur suhu, tekanan dan waktu sterilisasi yang

diinginkan. Sterilisasi yang umum adalah 1000C. tekanan 15 lbs selama 15 menit.

f) Menekan tombol star, membiarkan hingga tanda bunyi kedua yang

menunjukan bahwa kondisi sterilisasi telah tercapai dan tekanan uap dalam

autoklaf telah kembali nol.

g) Membuka autoklaf dan mengambil isinya yang telah steril.

Gambar 1.1 Autoklaf

Penyinaran dengan UV

Sinar Ultra Violet juga dapat digunakan untuk proses sterilisasi, misalnya untuk

membunuh mikroba yang menempel pada permukaan interior Safety Cabinet

dengan disinari lampu UV.

3. Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan senyawa desinfektan antara

lain alkohol.

4. Pensterilan Gelas-gelas

Gelas, botol, pipa, pipet yang sudah bersih tidak disterilkan dalam autoklaf karena

barang-barang tersebut akan tetap basah sehabis sterilisasi. Alat-alat dari gelas


10/12

dimasukan dalam oven kerbing selama 2 3 jam pada temperatur 1600-1700C;

hal ini bergantung pada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan dalam oven.

Kapas masih dapat bertahan dalam oven kering selama waktu dan pada

temperature seperti tersebut diatas. Alat-alat yang belum bersihdan belum kering

tidak boleh dimasukkan dalam oven kering. Pensterilan alat-alat dapat pula

dilakukan dengan gas etilen oksida. Hal ini harus dikerjakan dengan hati-hati,

karena ada bahaya letusan.

Gambar 1.2 Oven

2. Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita

harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi.

Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka

mudah lepas dalam udara dan permukaan. Maka dari itu, kita harus

mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan

mikroorganisme. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan

sampai penanganan berikutnya media kultur harus tetap steril. Materi lain yang

akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983).

Pekerjaan memindahkan bakteri dari media yang lama ke media yang baru minta

banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang

ada sangkut paut dengan media dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril; ini

untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita

inginkan.

Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi

dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan dalam

keberhasilan laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan

pendamping mikrobiologi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah

karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas

mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar

tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah

satu media ke media yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus


11/12

disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur

dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar, dimana

pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel

tunggal(Cappuccino, 1983).

A. Menyiapkan Ruangan

Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang

basah menyebabkan butir-butir debu menempel kepadanya. Pada waktu

mengadakan inokulasi, baik sekali jika meja tempat inokulasi itu didasari dengan

kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan juga didalam suatu kota. Berkaca

(entkas). Dalam laboratorium untuk membuat vaksin, serum dan sebagainya,

udara yang masuk ke dalam itu dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar

ultra-umum.

B. Pemindahan Dengan Kawat Inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung itu boleh

lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3mm. Lebih dahulu ujung

kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api

saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut

tabung tempat pemiaraan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah

pengambilan inokulum (yaitu sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi

ke median di sumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum

tersebut digesekan pada media baru atau pada suatu kaca benda. Kalau tujuannya

membuat suatu sediaan.

Pemindahan Dengan Pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu.

Untuk itu diambillah 1 ml. contoh untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang

steril. Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur adukkan dengan

medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair (suhu antara 42-450C ). Lalu

agar-agar yang masih encer ini dituangkan dicawan petri. Setelah agar-agar

membeku, maka cawan petri yangberisih piaraan baru. Itu di simpan dalam tempat

yang aman, misalnya didalam almari atau di dalam laci. Penyimpanan cawan


12/12

dilakukan dengan meletakkannya secara terbalik, yaitu permukaan medium

menghadap ke bawah; ini untuk menghindari tetesnya air yang mungkin melekat

pada dinding dalam tutup cawan. Piaraan yang diperoleh terkenal sebagai piaraan

adukan. Dengan cara yang demikian ini bakteri yang diinokulasikan dapat

menyebar luas ke seluruh medium. Bakteri yang aerob maupun yang anaerob

dapat tumbuh dan banyaknya koloni dapat dihitung dengan mudah. Pengenceran 1

ml sampel dengan 99 ml air murni itu tidak mutlak, hal ini tergantung kepada

keadaan air atau susu yang akan selidiki.

D. Teknik aseptik Membuka Tabung Reaksi

Teknik aseptikpada Pembuatan Media

sterilisasi dan teknik aseptik

Documents