TeknikTeknik AseptikAseptikBagianBagian IIII

Definisi & Ruang LingkupUsaha untuk membebaskan lingkungandari kontaminasi mikroorganismeSumber Kontaminan :

EksplanMikrobaAlat KulturLingkungan kerjaKecerobohan Pelaksanaan

Apa Saja yang perlu disterilkan ?

Lingkungan KerjaMedia dan Alat KulturBahan Tanam (Eksplan)

TEKNIK ASEPTIK

MACAM BENTUK STERILISASI :MACAM BENTUK STERILISASI :

PANAS BASAHPANAS KERINGKIMIAWIUV

STERILISASI PANAS BASAH

…..DENGAN MENGGUNAKAN UAP AIRAUTOCLAVEHAMPIR SEMUA MIKROBA MATI PADA SUHU 121 derajatWAKTU TERGANTUNG VOLUME

Sterilisasi Media dan Alat

JENIS WAKTU SUHU

20 – 75 ML 15-20 MENIT 121 C

75 – 100 ML 20-25 MENIT 121 C

500 – 5000 ML 25-35 MENIT 121 C

ALAT GELAS/KERTAS 30 MENIT 121 C

STERILISASI PANAS KERING

MENGGUNAKAN OVEN

ALAT YANG TAK MUDAH TERBAKAR(BAHAN GELAS)

(LAMA PEMANASAN 45 MENIT SUHU 160 C)

STERILISASI MEMAKAI NYALA

ALAT DICELUPKAN KE DALAM ALKOHOL 70 % KEMUDIAN DIBAKAR

DIGUNAKAN SELAMA KEGIATAN INOKULASI

BAHAN KIMIA

DIPAKAI UNTUK MENSTERILKAN PERMUKAAN SAJA EX. MATERIAL TANAMAN, INSTRUMEN, TANGAN PEKERJA DAN RUANG ATAU KOTAK TRANSFER

BAHAN KIMIA YANG BIASA DIGUNAKAN ADALAH ALKOHOL, KALSIUM HYPOCHLORIDA, NATRIUM HYPOCHLORIDA, HIDROGEN PEROKSIDA, SUBLIMAT DAN CHLOROX

CAHAYA

DIGUNAKAN PADA RUANG DAN KOTAK TRANSFER

MEMAKAI SINAR ULTRAVIOLET

Sterilisasi Lingkungan Kerja

Ruang PenaburSebelum dimanfaatkan disterilisasi dengan sinar UV selama 1 – 1,5 jam

EntkasDiberi formalin tablet terlebih dulu sebelumdigunakanDilakukan penyemprotan dengan formalin 10 % danalkoho 70 % (perbandingan : 1 : 1) selama 10 menit

Sterilisasi Lingkungan Kerja

R. Laminair air FlowDisemprot dengan alkohol 70 %Disinari lampu UV selama ½ - 1 jam sebelum penggunaan

Sterilisasi Media dan Alat

Dissecting set & Glass Ware :Autoclave (121 C) sekitar 20 – 30 menitDissecting set lalu disimpan di oven dengan suhu106 C selama beberapa menit

Dissecting set (pinset & Gunting)Dicelupkan dalam alkohol 96% lalu dibakar terlebihdulu sebelum digunakan

Sterilisasi Eksplan

Sterilisasi Secara MekanisDigunakan untuk eksplan yang kerasDengan membakar di atas bunsen

Sterilisasi secara KimiawiDigunakan untuk eksplan yang lunak (jar. Muda)Ex : daun, petiole, node, dll

Despatch Oven Company --- genus Bacillus

Rentang suhu yang mematikan : 120 C (40’) hingga 140 C (180’)

Saran : 160 C selama 40 – 60 menit

Respon Kontaminan

Umumnya :Bakteri : 2 x 24 jamFungi : 1 x 24 jam

Kontaminan Internal : hingga 1 bulan

KontaminanBakteri

Jenis kontaminan yang sangat umum dijumpaiUmumnya terbawa melalui eksplan dan mampubertahan pada saat sterilisasi (surface sterilization)Umumnya berada di dalam interior jaringan eksplanSpora bakteri mungkin masih bisa survive meskiberada di permukaan eksplan

Bakteri dapat muncul setelah proses induksiberjalan lama

KontaminanContoh Bakteri :

Agrobacterium, Bacillus, Corynebacterium, Enterobacter, Lactobacillus, Pseudomanas, Staphylococcus, and Xanthomonas

Karakteristik dalam media :Membentuk gumpalan lumpurberwarna di permukaan media, putih, kuning, pink

KontaminanFungi

Umumnya terbawa denganeksplan atau spora yang beterbangan lalu masuk kedalam media saat inokulasiTerbawa dengan eksplan : sebagai patogenPenampakan berupa bulu-bulu halus yang tampakkaburBermacam warna

Jenis KontaminanInitial Contaminant

Terjadi karena proses sterilisasi yang kurang optimalAtau karena material kultur yang terlalu kotorEksplan berasal dari lapang / greenhouseAkan muncul beberapa hari setelah inokulasiBakteri : gumpalan lumpur ; fungi : bulu halus

Latent ContaminationUmumnya dari golongan bakteriTerdeteksi dalam waktu yang lamaKeberadaannya bersifat endogen dalam jaringan eksplan

Introduced ContaminationLingkungan kerja yang tidak steril

Laminair Air FlowHEPA (High Efficiency Particulate Air) :

partikel < 0,3 micrometer

Alat Kultur dari Plastik

Ada yang tidak tahan terhadap panas dan tekanantinggiBahan Plastik tahan sterilisasi :

PolypropilenePolymetilpentanePolyallomerPolycarbonat (selama 20 menit)

Bahan Plastik yg sama sekali tidak tahan :PolystyrenePolyvinyl ChloridaArcilicPolyetilen