Teknik Aseptik (sterilisasi)Teknik Aseptik (sterilisasi)

Sterilisasi adalah salah satu prosedur yang digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme Kondisi steril

menentukan keberhasilan dalam prosedur Kultur Jaringan

Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman,(inokulasi), media kultur, dan eksplan yang akan dikulturkan

• Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari :

1. Eksplan, baik eksternal maupun internal.

2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang paling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.

3.  Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril.

4.  Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara).

5.  Kecerobohan dalam pelaksanaan.

Berdasarkan perbedaan benda yang akan disterilkan, umumnya prosedur sterilisasi dapat dikelompokan dalam tiga kategori, yakni:

a.  Sterilisasi lingkungan kerja.b.  Sterilisasi alat-alat dan media.c.  Sterilisasi bahan tanaman

(eksplan).

Sterilisasi lingkungan Sterilisasi lingkungan kerjakerja

Ruang tabur atau ruang inokulasi

Ruang persiapan

• Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma, subkultur dilakukan dalam kotak pindah steril atau dikenal dengan Laminar Air Flow cabinet.(LAFC)

• LAFC disempurnakan dengan adanya aliran udara halus yang dihembuskan dari blower kira-kira 100 hembusan per menit, melalui suatu filter yang sangat halus sehingga mikrobia dapat tersaring oleh adanya filter tersebut

LAMINAR AIR FLOW CABINET (LAFC)

- Aliran udara melalui suatu filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan pori 0,3 µm

- Lampu Ultra Violet

ENTKASMerupakan tempat inokulasi sederhana dan terbuat

dari bahan kaca dan bingkai kayu atau bingkai aluminium.

ALAT TEMPAT INOKLASI (PENABUR)

PROSEDUR STERILASI LAFC• Sebelum mulai bekerja, permukaan

tempat kerja dari laminar air flow cabinet dilap dengan kapas/tissue yang telah disemprot dengan alcohol 70% atau dalam larutan kaporit atau dapat juga disemprot menggunakan spiritus (untuk menghemat biaya).

• LAFC biasanya dilengkapi dengan lampu ultra violet. Sebelum mulai bekerja, lampu ultra violet dinyalakan selama 30 menit dengan tujuan untuk mematikan kontaminan di permukaan tempat kerja.

Saat Melakukan kegiatan inokulasi maupun subkultur, Lampu di LAFC dan blower dinyalakan.

Kondisi LAFC saat bekerja

Sebelum digunakan, entkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandingan 1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit, baru kemudian boleh digunakan. Atau menggunakan formalin tablet

Sterilisasi Media dan Alat-Sterilisasi Media dan Alat-alatalat• Alat sterilisasi, baik media maupun peralatan

yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf

AUTOCLAVE yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram).

• Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor. Dengan autoklaf sederhana ini, tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.

KELEMAHAN autoklaf ini adalah bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual, selama masa sterilisasi dilakukan. Tetapi autoklaf ini mempunyai KEUNTUNGAN sederhana, harga relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat dari autoklaf listrik yang seukuran dan setaraf.

• Sterilisasi PERALATAN TANAM; seperti glasware (petridish, botol kultur, testube), alat diseksi (pinset, gunting, handscalpel), tissue, aluminium foil dsb disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121 °C pada tekanan 16.5 psi (pounds per square inch) selama 15 – 20 menit

• Untuk MEDIA TANAM dan aquades, suhu dan tekanan sama, waktu 10 – 15 menit.

• Menggunakan oven : untuk alat-alat tanam dan botol pada suhu 180ºC selama 3 (tiga) jam

• Untuk bahan heat labile dalam bentuk larutan disterilisasi dengan penyaringan dg kertas saring; ukuran pori 0,20 – 0,22 µm

Autoclave

Ruang Kultur

Sterilisasi ruang kultur, dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 70%, dapat dilakukan setiap saat. Dengan menyemprotkan formalin 0.04% secara berkala dan diinkubasi selama satu minggu

Sterilisasi Bahan Sterilisasi Bahan TanamanTanamanProblem terbesar yang dihadapi

para tissue culturist adalah kontaminasi mikroba pada kultur (baik bakteri maupun jamur).  Dua cara dapat dilakukan untuk mengurangi kontaminasi kultur

1.  Metode fisik2.  Metode Kimia

METODA FISIK (sterilisasi METODA FISIK (sterilisasi bahan tanaman)bahan tanaman)• Tanaman induk dikondisikan dalam kekeringan

selama 3 – 4 minggu sebelum mulai dikulturkan.  Tanaman diberi air yang cukup, dipupuk, dan diberi pestisida atau fungisida jika perlu.  Kelebihan pengairan mesti dihindari. 

• Pada saat pelaksanaan kultur, tanaman dicuci bersih. Pembersihan meliputi pencucian, penggosokan yang merata untuk membuang semua partikel tanah dan daun mati.  Termasuk juga membuang bagian tidak digunakan dalam kultur.

• Bahan tanaman kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 20 menit, sampai beberapa jam, tergantung sumber bahan tanaman.  Ini sama artinya dengan membuang jutaan mikroba ke aliran drainase.

Sterilisasi eksplan secara mekanis

Cara ini dilakukan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan cara membakar eksplan di atas Bunsen sebanyak 3 kali.

Eksplan yang disterilisasi dengan cara ini antara lain tebu, biji salak, bung, buah anggrek, kapulaga dan sebagainya. Sedangkan eksplan yang berdaging diantaranya wortel, umbi bawang putih dan sebagainya.

METODE KIMIA (Sterilisasi Bahan Tanaman)Prinsip dasar sterilisasi eksplan adalah

mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi eksplannya tidak ikut mati.

Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus, sehingga sebelum mengkulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi.

Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda, tergantung :

1.Jenis tanaman2.Bagian tanaman yang digunakan3.Morfologi tanaman4.Lingkungan tumbuh5.Musim waktu megambil6.Umur tanaman

Beberapa jenis bahan kimia yang digunakan dalam sterilisasi permukaan :

Setelah penggunaan dibilas dg aquades steril 3X

Bahan Kimia Konsentrasi Lama Perendaman

Kalsium hipokhlorit

1 – 10% 5 – 30 menit

Natrium hipokhlorit

1 – 2% 7 – 10 menit

Hidrogen Peroksida

3 – 10% 5 – 15 menit

Perak Nitrat 1% 5 - 10 menit

Merkuri Khlorit 0,1 – 0,2% 10 – 20 menit

Gas Khlorin - 1 – 4 jam

Betadine 10% 5 – 10 menit

Benlate 2 g/l 20 – 30 menit

Antibiotik 50 mg/l ½ - 1 jam

Alkohol 70% ½ - 1 menit

Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, dapat dilakukan hal berikut :1. Membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi, berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah banyak.

2. Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi.

Tujuannya supaya tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan sebagai berikut:Sterilisasi Ringan, Eksplan kuljar direndam dalam bayclin atau Clorox 20% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam larutan bayclin atau Clorox 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam larutan bayclin atau Clorox 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.Sterilisasi Sedang, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit, lalu dibilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam larutan bayclin, clorox 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam larutan bayclin atau clorox 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.Sterilisasi Keras, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam larutan bayclin atau clorox 20% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali

Kontaminan pada bahan tanaman dikelompokkan atas :a. Kontaminan eksternal (bagian luar bahan tanaman), biasa

dapat diatasi dengan proses sterilisasi permukaan, seperti prosedur di atas

b. Kontaminan internal (bagian dalam bahan tanaman), Dalam kasus kontaminasi internal, langkah yang dapat diambil

adalah perendaman bahan tanaman yang sudah dicuci bersih, didalam larutan antibiotik selama 4 – 5 jam, atau menambahkan antibiotik ke dalam media yang difiltrasi dengan micro-filter dengan pori-pori 0.2 um.

Tindakan ini menolong keadaan tanaman dengan kontaminan internal yang berupa bakteri

Kemudian prosedur selanjutnya, sama dengan sterilisasi permukaan bahan tanaman yang lain.

Menyembuhkan kultur yang terkontaminasiKultur yang telah terkontaminasi dapat diselamatkan dengan metode berikut:1.Buka wadah yang berisi kultur terkontaminasi dan isi penuh dengan larutan 0.5 – 1% w/v sodium hypochlorite (bayclin atau clorox)2.Biarkan selama 1-50 menit tergantung pada keganasan kontaminasi atau sensitivitas bahan tanaman 3.Keluarkan kultur dari larutan kloring, potong bagian dasar dan membuang daun –daun yang berlebihan 4.Transfer ke media kultur yang baru