ASAM NUKLEAT

Struktur Molekul Asam Nukleat

Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang memegang peranan

sangat penting dalam kehidupan organisme karena di dalamnya tersimpan informasi

genetik. Asam nukleat sering dinamakan juga polinukleotida karena tersusun dari

sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai

struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentosa, dan basa nitrogen atau basa

nukleotida (basa N). Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat

atau deoxyribonucleic acid (DNA) dan asam ribonukleat atau ribonucleic acid

(RNA). Dilihat dari strukturnya, perbedaan di antara kedua macam asam nukleat ini

terutama terletak pada komponen gula pentosanya.

Pada RNA gula pentosanya adalah ribosa, sedangkan pada DNA gula

pentosanya mengalami kehilangan satu atom O pada posisi C nomor 2’ sehingga

dinamakan gula 2’-deoksiribosa (Gambar 1.1.b). Perbedaan struktur lainnya antara

DNA dan RNA adalah pada basa N-nya. Basa N, baik pada DNA maupun pada RNA,

mempunyai struktur berupa cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) dan

dapat dikelompokkan menjadi dua golongan, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin

mempunyai dua buah cincin (bisiklik), sedangkan basa pirimidin hanya mempunyai

satu cincin (monosiklik).

Pada DNA, dan juga RNA, purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G).

Akan tetapi, untuk pirimidin ada perbedaan antara DNA dan RNA. Kalau pada DNA

basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T), pada RNA tidak ada timin dan

sebagai gantinya terdapat urasil (U). Timin berbeda dengan urasil hanya karena

adanya gugus metil pada posisi nomor 5 sehingga timin dapat juga dikatakan sebagai

5-metilurasil.

Gambar 1.1. Komponen-komponen asam nukleat

a) gugus fosfat

b) gula pentosa

c) basa N

Di antara ketiga komponen monomer asam nukleat tersebut di atas, hanya

basa N lah yang memungkinkan terjadinya variasi. Pada kenyataannya memang

urutan (sekuens) basa N pada suatu molekul asam nukleat merupakan penentu bagi

spesifisitasnya. Dengan perkataan lain, identifikasi asam nukleat dilakukan

berdasarkan atas urutan basa N-nya sehingga secara skema kita bisa menggambarkan

suatu molekul asam nukleat hanya dengan menuliskan urutan basanya saja.

Nukleosida dan nukleotida

Penomoran posisi atom C pada cincin gula dilakukan menggunakan tanda

aksen (1’, 2’, dan seterusnya), sekedar untuk membedakannya dengan penomoran

posisi pada cincin basa. Posisi 1’ pada gula akan berikatan dengan posisi 9 (N-9) pada

basa purin atau posisi 1 (N-1) pada basa pirimidin melalui ikatan glikosidik atau

glikosilik (Gambar 1.2). Kompleks gula-basa ini dinamakan nukleosida. Di atas

telah disinggung bahwa asam nukleat tersusun dari monomer-monomer berupa

nukleotida, yang masing-masing terdiri atas sebuah gugus fosfat, sebuah gula

pentosa, dan sebuah basa N. Dengan demikian, setiap nukleotida pada asam nukleat

dapat dilihat sebagai nukleosida monofosfat. Namun, pengertian nukleotida secara

umum sebenarnya adalah nukleosida dengan sebuah atau lebih gugus fosfat. Sebagai

contoh, molekul ATP (adenosin trifosfat) adalah nukleotida yang merupakan

nukleosida dengan tiga gugus fosfat. Jika gula pentosanya adalah ribosa seperti

halnya pada RNA, maka nukleosidanya dapat berupa adenosin, guanosin, sitidin, dan

uridin. Begitu pula, nukleotidanya akan ada empat macam, yaitu adenosin

monofosfat, guanosin monofosfat, sitidin monofosfat, dan uridin monofosfat.

Sementara itu, jika gula pentosanya adalah deoksiribosa seperti halnya pada DNA,

maka (2’-deoksiribo)nukleosidanya terdiri atas deoksiadenosin, deoksiguanosin,

deoksisitidin, dan deoksitimidin.

Ikatan fosfodiester

Selain ikatan glikosidik yang menghubungkan gula pentosa dengan basa N,

pada asam nukleat terdapat pula ikatan kovalen melalui gugus fosfat yang

menghubungkan antara gugus hidroksil (OH) pada posisi 5’ gula pentosa dan gugus

hidroksil pada posisi 3’ gula pentosa nukleotida berikutnya. Ikatan ini dinamakan

ikatan fosfodiester karena secara kimia gugus fosfat berada dalam bentuk diester

(Gambar 1.2).

Gambar 1.2. Ikatan fosfodiester dan ikatan glikosidik pada asam nukleat

Oleh karena ikatan fosfodiester menghubungkan gula pada suatu nukleotida

dengan gula pada nukleotida berikutnya, maka ikatan ini sekaligus menghubungkan

kedua nukleotida yang berurutan tersebut. Dengan demikian, akan terbentuk suatu

rantai polinukleotida yang masing-masing nukleotidanya satu sama lain dihubungkan

oleh ikatan fosfodiester. Kecuali yang berbentuk sirkuler, seperti halnya pada

kromosom dan plasmid bakteri, rantai polinukleotida memiliki dua ujung. Salah satu

ujungnya berupa gugus fosfat yang terikat pada posisi 5’ gula pentosa. Oleh karena

itu, ujung ini dinamakan ujung P atau ujung 5’. Ujung yang lainnya berupa gugus

hidroksil yang terikat pada posisi 3’ gula pentosa sehingga ujung ini dinamakan

ujung OH atau ujung 3’. Adanya ujung-ujung tersebut menjadikan rantai

polinukleotida linier mempunyai arah tertentu. Pada pH netral adanya gugus fosfat

akan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif. Inilah alasan pemberian nama

’asam’ kepada molekul polinukleotida meskipun di dalamnya juga terdapat banyak

basa N. Kenyataannya, asam nukleat memang merupakan anion asam kuat atau

merupakan polimer yang sangat bermuatan negatif.

Sekuens asam nukleat

Telah dikatakan di atas bahwa urutan basa N akan menentukan spesifisitas

suatu molekul asam nukleat sehingga biasanya kita menggambarkan suatu molekul

asam nukleat cukup dengan menuliskan urutan basa (sekuens)-nya saja. Selanjutnya,

dalam penulisan sekuens asam nukleat ada kebiasaan untuk menempatkan ujung 5’ di

sebelah kiri atau ujung 3’ di sebelah kanan. Sebagai contoh, suatu sekuens DNA

dapat dituliskan 5’-ATGACCTGAAAC-3’ atau suatu sekuens RNA dituliskan 5’-

GGUCUGAAUG-3’. Jadi, spesifisitas suatu asam nukleat selain ditentukan oleh

sekuens basanya, juga harus dilihat dari arah pembacaannya. Dua asam nukleat yang

memiliki sekuens sama tidak berarti keduanya sama jika pembacaan sekuens tersebut

dilakukan dari arah yang berlawanan (yang satu 5’→3’,sedangkan yang lain 3’→ 5’).

Struktur tangga berpilin (double helix) DNA

Dua orang ilmuwan, J.D.Watson dan F.H.C.Crick, mengajukan model

struktur molekul DNA yang hingga kini sangat diyakini kebenarannya dan dijadikan

dasar dalam berbagai teknik yang berkaitan dengan manipulasi DNA. Model tersebut

dikenal sebagai tangga berplilin (double helix). Secara alami DNA pada umumnya

mempunyai struktur molekul tangga berpilin ini. Model tangga berpilin

menggambarkan struktur molekul DNA sebagai dua rantai polinukleotida yang saling

memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Fosfat dan gula pada

masing-masing rantai menghadap ke arah luar sumbu pilinan, sedangkan basa N

menghadap ke arah dalam sumbu pilinan dengan susunan yang sangat khas sebagai

pasangan - pasangan basa antara kedua rantai. Dalam hal ini, basa A pada satu rantai

akan berpasangan dengan basa T pada rantai lainnya, sedangkan basa G berpasangan

dengan basa C. Pasangan-pasangan basa ini dihubungkan oleh ikatan hidrogen yang

lemah (nonkovalen). Basa A dan T dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap dua,

sedangkan basa G dan C dihubungkan oleh ikatan hidrogen rangkap tiga. Adanya

ikatan hidrogen tersebut menjadikan kedua rantai polinukleotida terikat satu sama

lain dan saling komplementer. Artinya, begitu sekuens basa pada salah satu rantai

diketahui, maka sekuens pada rantai yang lainnya dapat ditentukan. Oleh karena basa

bisiklik selalu berpasangan dengan basa monosiklik, maka jarak antara kedua rantai

polinukleotida di sepanjang molekul DNA akan selalu tetap. Dengan perkataan lain,

kedua rantai tersebut sejajar. Akan tetapi, jika rantai yang satu dibaca dari arah 5’ ke

3’, maka rantai pasangannya dibaca dari arah 3’ ke 5’. Jadi, kedua rantai tersebut

sejajar tetapi berlawanan arah (antiparalel).

Gambar 1.3. Model struktur tangga berpilin DNA

P = fosfat S =gula

A = adenin, G = guanin, C = sitosin, T =timin

Jarak antara dua pasangan basa yang berurutan adalah 0,34 nm. Sementara itu,

didalam setiap putaran spiral terdapat 10 pasangan basa sehingga jarak antara dua

basa yang tegak lurus di dalam masing-masing rantai menjadi 3,4 nm. Namun,

kondisi semacam ini hanya dijumpai apabila DNA berada dalam medium larutan

fisiologis dengan kadar garam rendah seperti halnya yang terdapat di dalam

protoplasma sel hidup.

DNA semacam ini dikatakan berada dalam bentuk B atau bentuk yang sesuai

dengan model asli Watson-Crick. Bentuk yang lain, misalnya bentuk A, akan

dijumpai jika DNA berada dalam medium dengan kadar garam tinggi. Pada bentuk A

terdapat 11 pasangan basa dalam setiap putaran spiral. Selain itu, ada pula bentuk Z,

yaitu bentuk molekul DNA yang mempunyai arah pilinan spiral ke kiri. Bermacam-

macam bentuk DNA ini sifatnya fleksibel, artinya dapat berubah dari yang satu ke

yang lain bergantung kepada kondisi lingkungannya.

Modifikasi struktur molekul RNA

Tidak seperti DNA, molekul RNA pada umumnya berupa untai tunggal

sehingga tidak memiliki struktur tangga berpilin. Namun, modifikasi struktur juga

terjadi akibat terbentuknya ikatan hidrogen di dalam untai tunggal itu sendiri

(intramolekuler). Dengan adanya modifikasi struktur molekul RNA, kita mengenal

tiga macam RNA, yaitu RNA duta atau messenger RNA (mRNA), RNA pemindah

atau transfer RNA (tRNA), dan RNA ribosomal (rRNA). Struktur mRNA dikatakan

sebagai struktur primer, sedangkan struktur tRNA dan rRNA dikatakan sebagai

struktur sekunder. Perbedaan di antara ketiga struktur molekul RNA tersebut

berkaitan dengan perbedaan fungsinya masing-masing.

Sifat-sifat Fisika-Kimia Asam Nukleat

Di bawah ini akan dibicarakan sekilas beberapa sifat fisika-kimia asam

nukleat. Sifat-sifat tersebut adalah stabilitas asam nukleat, pengaruh asam, pengaruh

alkali, denaturasi kimia, viskositas, dan kerapatan apung.

Stabilitas asam nukleat

Ketika kita melihat struktur tangga berpilin molekul DNA atau pun struktur

sekunder RNA, sepintas akan nampak bahwa struktur tersebut menjadi stabil akibat

adanya ikatan hidrogen di antara basa-basa yang berpasangan. Padahal, sebenarnya

tidaklah demikian. Ikatan hidrogen di antara pasangan-pasangan basa hanya akan

sama kuatnya dengan ikatan hidrogen antara basa dan molekul air apabila DNA

berada dalam bentuk rantai tunggal. Jadi, ikatan hidrogen jelas tidak berpengaruh

terhadap stabilitas struktur asam nukleat, tetapi sekedar menentukan spesifitas

perpasangan basa. Penentu stabilitas struktur asam nukleat terletak pada interaksi

penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan

basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air dikeluarkan dari

sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat.

Pengaruh asam

Di dalam asam pekat dan suhu tinggi, misalnya HClO4 dengan suhu lebih dari

100ºC, asam nukleat akan mengalami hidrolisis sempurna menjadi komponen

komponennya. Namun, di dalam asam mineral yang lebih encer, hanya ikatan

glikosidik antara gula dan basa purin saja yang putus sehingga asam nukleat

dikatakan bersifat apurinik.

Pengaruh alkali

Pengaruh alkali terhadap asam nukleat mengakibatkan terjadinya perubahan

status tautomerik basa. Sebagai contoh, peningkatan pH akan menyebabkan

perubahan struktur guanin dari bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul

tersebut kehilangan sebuah proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan

terputusnya sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA

mengalami denaturasi. Hal yang sama terjadi pula pada RNA. Bahkan pada pH netral

sekalipun, RNA jauh lebih rentan terhadap hidrolisis bila dibadingkan dengan DNA

karena adanya gugus OH pada atom C nomor 2 di dalam gula ribosanya.

Denaturasi kimia

Sejumlah bahan kimia diketahui dapat menyebabkan denaturasi asam nukleat

pada pH netral. Contoh yang paling dikenal adalah urea (CO(NH2)2) dan formamid

(COHNH2). Pada konsentrasi yang relatif tinggi, senyawa-senyawa tersebut dapat

merusak ikatan hidrogen. Artinya, stabilitas struktur sekunder asam nukleat menjadi

berkurang dan rantai ganda mengalami denaturasi.

Viskositas

DNA kromosom dikatakan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi

karena diameternya hanya sekitar 2 nm, tetapi panjangnya dapat mencapai beberapa

sentimeter. Dengan demikian, DNA tersebut berbentuk tipis memanjang. Selain itu,

DNA merupakan molekul yang relatif kaku sehingga larutan DNA akan mempunyai

viskositas yang tinggi. Karena sifatnya itulah molekul DNA menjadi sangat rentan

terhadap fragmentasi fisik. Hal ini menimbulkan masalah tersendiri ketika kita

hendak melakukan isolasi DNA yang utuh.

Kerapatan apung

Analisis dan pemurnian DNA dapat dilakukan sesuai dengan kerapatan apung

(bouyant density)-nya. Di dalam larutan yang mengandung garam pekat dengan berat

molekul tinggi, misalnya sesium klorid (CsCl) 8M, DNA mempunyai kerapatan yang

sama dengan larutan tersebut, yakni sekitar 1,7 g/cm3. Jika larutan ini disentrifugasi

dengan kecepatan yang sangat tinggi, maka garam CsCl yang pekat akan bermigrasi

ke dasar tabung dengan membentuk gradien kerapatan. Begitu juga, sampel DNA

akan bermigrasi menuju posisi gradien yang sesuai dengan kerapatannya. Teknik ini

dikenal sebagai sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan (equilibrium

density gradient centrifugation) atau sentrifugasi isopiknik. Oleh karena dengan

teknik sentrifugasi tersebut pelet RNA akan berada di dasar tabung dan protein akan

mengapung, maka DNA dapat dimurnikan baik dari RNA maupun dari protein.

Selain itu, teknik tersebut juga berguna untuk keperluan analisis DNA karena

kerapatan apung DNA (ρ) merupakan fungsi linier bagi kandungan GCnya. Dalam

hal ini, ρ = 1,66 + 0,098% (G + C).

Gambar 1.4. Sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan

Sifat-sifat Spektroskopik-Termal Asam Nukleat

Sifat spektroskopik-termal asam nukleat meliputi kemampuan absorpsi sinar

UV, hipokromisitas, penghitungan konsentrasi asam nukleat, penentuan kemurnian

DNA, serta denaturasi termal dan renaturasi asam nukleat. Masing-masing akan

dibicarakan sekilas berikut ini.

Absorpsi UV

Asam nukleat dapat mengabsorpsi sinar UV karena adanya basa nitrogen yang

bersifat aromatik; fosfat dan gula tidak memberikan kontribusi dalam absorpsi UV.

Panjang gelombang untuk absorpsi maksimum baik oleh DNA maupun RNA adalah

260 nm atau dikatakan λmaks = 260 nm. Nilai ini jelas sangat berbeda dengan nilai

untuk protein yang mempunyai λmaks = 280 nm. Sifat-sifat absorpsi asam nukleat

dapat digunakan untuk deteksi, kuantifikasi, dan perkiraan kemurniannya.

Hipokromisitas

Meskipun λmaks untuk DNA dan RNA konstan, ternyata ada perbedaan nilai

yang bergantung kepada lingkungan di sekitar basa berada. Dalam hal ini, absorbansi

pada λ 260 nm (A260) memperlihatkan variasi di antara basa-basa pada kondisi yang

berbeda. Nilai tertinggi terlihat pada nukleotida yang diisolasi, nilai sedang diperoleh

pada molekul DNA rantai tunggal (ssDNA) atau RNA, dan nilai terendah dijumpai

pada DNA rantai ganda (dsDNA). Efek ini disebabkan oleh pengikatan basa di dalam

lingkungan hidrofobik. Istilah klasik untuk menyatakan perbedaan nilai absorbansi

tersebut adalah hipokromisitas. Molekul dsDNA dikatakan relatif hipokromik

(kurang berwarna) bila dibandingkan dengan ssDNA. Sebaliknya, ssDNA dikatakan

hiperkromik terhadap dsDNA.

Penghitungan konsentrasi asam nukleat

Konsentrasi DNA dihitung atas dasar nilai A260-nya. Molekul dsDNA dengan

konsentrasi 1mg/ml mempunyai A260 sebesar 20, sedangkan konsentrasi yang sama

untuk molekul ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Nilai

A260 untuk ssDNA dan RNA hanya merupakan perkiraan karena kandungan basa

purin dan pirimidin pada kedua molekul tersebut tidak selalu sama, dan nilai A260

purin tidak sama dengan nilai A260 pirimidin. Pada dsDNA, yang selalu mempunyai

kandungan purin dan pirimidin sama, nilai A260 -nya sudah pasti.

Kemurnian asam nukleat

Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah

A260 terhadap A280. Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar

1,8. Sementara itu, RNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Protein,

dengan λmaks = 280 nm, tentu saja mempunyai nisbah A260 /A280 kurang dari 1,0.

Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari

1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang

memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh

protein.

Denaturasi termal dan renaturasi

Di atas telah disinggung bahwa beberapa senyawa kimia tertentu dapat

menyebabkan terjadinya denaturasi asam nukleat. Ternyata, panas juga dapat

menyebabkan denaturasi asam nukleat. Proses denaturasi ini dapat diikuti melalui

pengamatan nilai absorbansi yang meningkat karena molekul rantai ganda (pada

dsDNA dan sebagian daerah pada RNA) akan berubah menjadi molekul rantai

tunggal. Denaturasi termal pada DNA dan RNA ternyata sangat berbeda. Pada RNA

denaturasi berlangsung perlahan dan bersifat acak karena bagian rantai ganda yang

pendek akan terdenaturasi lebih dahulu daripada bagian rantai ganda yang panjang.

Tidaklah demikian halnya pada DNA. Denaturasi terjadi sangat cepat dan bersifat

koperatif karena denaturasi pada kedua ujung molekul dan pada daerah kaya AT akan

mendestabilisasi daerah-daerah di sekitarnya.

Suhu ketika molekul asam nukleat mulai mengalami denaturasi dinamakan titik leleh

atau melting temperature (Tm). Nilai Tm merupakan fungsi kandungan GC sampel

DNA, dan berkisar dari 80 ºC hingga 100ºC untuk molekul-molekul DNA yang

panjang. DNA yang mengalami denaturasi termal dapat dipulihkan (direnaturasi)

dengan cara didinginkan. Laju pendinginan berpengaruh terhadap hasil renaturasi

yang diperoleh. Pendinginan yang berlangsung cepat hanya memungkinkan

renaturasi pada beberapa bagian/daerah tertentu. Sebaliknya, pendinginan yang

dilakukan perlahanlahan dapat mengembalikan seluruh molekul DNA ke bentuk

rantai ganda seperti semula. Renaturasi yang terjadi antara daerah komplementer dari

dua rantai asam nukleat yang berbeda dinamakan hibridisasi.

Superkoiling DNA

Banyak molekul dsDNA berada dalam bentuk sirkuler tertutup atau

closedcircular (CC), misalnya DNA plasmid dan kromosom bakteri serta DNA

berbagai virus. Artinya, kedua rantai membentuk lingkaran dan satu sama lain

dihubungkan sesuai dengan banyaknya putaran heliks (Lk) di dalam molekul DNA

tersebut. Sejumlah sifat muncul dari kondisi sirkuler DNA. Cara yang baik untuk

membayangkannya adalah menganggap struktur tangga berpilin DNA seperti gelang

karet dengan suatu garis yang ditarik di sepanjang gelang tersebut. Jika kita

membayangkan suatu pilinan pada gelang, maka deformasi yang terbentuk akan

terkunci ke dalam sistem pilinan tersebut. Deformasi inilah yang disebut sebagai

superkoiling.

Interkalator

Geometri suatu molekul yang mengalami superkoiling dapat berubah akibat

beberapa faktor yang mempengaruhi pilinan internalnya. Sebagai contoh,

peningkatan suhu dapat menurunkan jumlah pilinan, atau sebaliknya, peningkatan

kekuatan ionik dapat menambah jumlah pilinan. Salah satu faktor yang penting

adalah keberadaan interkalator seperti etidium bromid (EtBr). Molekul ini

merupakan senyawa aromatik polisiklik bermuatan positif yang menyisip di antara

pasangan-pasangan basa. Dengan adanya EtBr molekul DNA dapat divisualisasikan

menggunakan paparan sinar UV.