SIDIK JARI KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DARI DAUN

TIGA JENIS JAMBU BIJI

NUGROHO AJI ANDHIKA

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

ABSTRAK

NUGROHO AJI ANDHIKA Sidik Jari Kromatografi Lapis Tipis dari Daun Tiga

Jenis Jambu Biji Dibimbing oleh LATIFAH K. DARUSMAN dan RUDI

HERYANTO

Daun jambu biji dikenal mengandung senyawa kimia yang memiliki

aktivitas sebagai antioksidan. Metode kendali mutu diperlukan untuk menjaga

mutu bahan baku. Penelitian ini bertujuan mencari sidik jari kromatografi dari

daun jambu biji dengan menggunakan profil kromatografi lapis tipis (KLT) yang

dikembangkan menjadi densitogram. Sidik jari dikembangkan dalam bentuk pola

KLT dan densitogram yang dihasilkan dengan menggunakan perangkat lunak

Image J. Sidik jari tersebut dihasilkan melalui optimasi komposisi fase gerak

dengan simplex centroid design (SCD). Tiga jenis daun jambu biji diekstraksi

dengan 2 komposisi pelarut metanol 96% dan 70%. Ekstrak positif mengandung

flavonoid dan tanin yang diuji secara kualitatif. Hasil evaluasi dengan SCD

menunjukkan bahwa sidik jari terbaik berdasarkan keterpisahan dan jumlah pita

yang berasal dari ekstrak metanol 70% adalah jambu biji putih (JBP) dan jambu

biji merah (JBM) dengan jumlah pita masing-masing 5 dan 6 sedangkan dari

ektrak metanol 96% untuk jambu biji kode7 (JB7) menghasilkan 5 pita. Ketiga

sidik jari tersebut dihasilkan dari nisbah fase gerak kloroform : etil asetat berturut-

turut (0.6:0.4), (0.7:0.3), dan (0.8:0.2) untuk JBP, JBM, dan JB7. Ketiga sidik jari

tersebut memiliki aktivitas antioksidan untuk JBP, JBM, dan JB7 dengan nilai

IC50 berturut-turut 10.73, 9.45, dan 2.63 ppm.

ABSTRACT

NUGROHO AJI ANDHIKA Thin Layer Chromatography Fingerprints of Leaves

of Three Guava Types Supervised by LATIFAH K. DARUSMAN and RUDI

HERYANTO

Guava leaf contains chemical compounds having antioxidant activity.

Quality control methods are needed to maintain the quality of raw materials. The

objective of this research is to find the chromatographic fingerprints from guava

leaves by using the profile of thin layer chromatography (TLC) which is

developed into densitogram. Fingerprint patterns were developed in the form of

TLC and densitogram generated by using the software Image J. Fingerprints were

generated through optimization of mobile phase composition with the simplex

centroid design (SCD). The leaves of three guava types were extracted using two-

solvent composition of 96% and 70% methanol. The extracts contained flavonoids

and tannins which were detected qualitatively. SCD evaluation shown that the

best fingerprints based on its resolution spots from extract methanol 70% were

white guava (JBP) and red guava (JBM) with 5 spots and 6 spots, respectively,

while extract metanol 96% for guava 7 (JB7) resulted 5 spots. All fingerprints

were obtained from chloroform:ethyl acetate as mobile phase with ratio for JBP,

JBM, and JB7 were (0.6:0.4), (0.7:0.3), and (0.8:0.2), respectively. Antioxidant

activities represented by IC50 value for JBP, JBM, and JB7 were 10.73, 9.45 and

2.63ppm respectively.

iii

SIDIK JARI KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS DARI DAUN

TIGA JENIS JAMBU BIJI

NUGROHO AJI ANDHIKA

Skripsi

sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Sains pada

Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2011

iv

Judul Skripsi

Nama

NIM

:

:

:

Sidik Jari Kromatografi Lapis Tipis dari Daun Tiga Jenis

Jambu Biji

Nugroho Aji Andhika

G44070083

Disetujui

Pembimbing I

Prof.Dr.Ir Latifah K. Darusman, MS

NIP. 19530824 197603 2 001

Pembimbing II

Rudi Heryanto, S.Si, M.Si

NIP. 19760428 200501 1 002

Diketahui

Ketua Departemen Kimia

Prof. Dr. Ir. Tun Tedja Irawadi, MS

NIP 19501227 197603 2 002

Tanggal lulus:

v

PRAKATA

Segala puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Allah SWT yang senantiasa

memberikan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan

karya ilmiah berjudul “Sidik Jari Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dari Daun Tiga

Jenis Jambu Biji ”. Penelitian ini bertujuan mengetahui sidik jari daun jambu biji

dengan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis dan juga mengetahui

aktivitas antioksidan dari daun jambu biji. Penelitian dilakukan sejak Maret 2011

sampai Agustus 2011 di Laboratorium Kimia Analitik, Departemen Kimia,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan Laboratorium Uji Pusat

Studi Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor.

Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K

Darusman, MS dan Rudi Heryanto, S.Si, M.Si selaku pembimbing yang selalu

memberi bimbingan, motivasi dan saran selama penelitian dan penyusunan karya

ilmiah ini. Terima kasih kepada Pusat Studi Biofarmaka dan bagian Laboratorium

Kimia Analitik yang telah membantu dalam penelitian dengan tema kendali

kualitas obat bahan alam. Penulis juga ucapkan terima kasih kepada pak Eman,

Bu Nunung, Pak Dede, Pak Kosasih, dan Pak Ridwan, juga kepada Ibu Salina, Ibu

Nunuk, Antonio dan Frengki. Ucapan terima kasih tak terhingga kepada Ayah dan

Ibu atas dukungan materi dan moril.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2011

Nugroho Aji Andhika

vi

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 28 Oktober 1988 dari pasangan

Rachman Utomo dan Satinem. Penulis merupakan anak kedua dari tiga

bersaudara. Penulis lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBo)

pada tahun 2007 dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut

Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru

(SPMB). Penulis memilih Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam.

Selama menjalani perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum

Kimia Analitik Layanan, Kimia Elektroforesis dan Teknik Pemisahan pada tahun

ajaran 2010/2011. Penulis juga berkesempatan mengikuti Pekan Ilmiah

Mahasiswa Nasional (PIMNAS) tahun 2011 dalam rangka mempresentasikan

program kreativitas mahasiswa bidang penelitian. Penulis juga berkesempatan

menjalani kegiatan Praktik Lapang di Laboratorium Pestisida dan Mikrobiologi

Pusat Pengujian Mutu Barang pada tahun 2010.

vii

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ......................................................................................................... vii

DAFTAR TABEL ................................................................................................ viii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix

PENDAHULUAN .................................................................................................. 1

TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................... 1

Senyawa Flavonoid ............................................................................................. 2 Senyawa Antioksidan .......................................................................................... 2 Metode Antioksidan DPPH ................................................................................. 3 Metode Ekstraksi................................................................................................. 3 Kromatografi Lapis Tipis .................................................................................... 4 Kromatografi Lapis Tipis Pemayaran ................................................................. 5 Perangkat Lunak Image J .................................................................................... 5 Analisis Sidik Jari ............................................................................................... 5 Rancangan Campuran ......................................................................................... 5

BAHAN DAN METODE ....................................................................................... 6 Alat dan Bahan .................................................................................................... 6 Metode Penelitian ............................................................................................... 6

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................... 9

SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................. 16 Simpulan ........................................................................................................... 16 Saran.................................................................................................................. 16

viii

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Kekuatan dan klasifikasi pelarut menurut Snyder ............................................. 4

2 Sepuluh titik selektivitas SCD ........................................................................... 8

3 Uji fitokimia serbuk daun jambu biji dengan maserasi metanol 96% ............. 10

4 Uji fitokimia serbuk daun jambu biji dengan maserasi metanol 70 % ............ 10

5 Nilai aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol 96% ...................................... 11

6 Nilai aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol 70% ...................................... 12

7 Komposisi optimum dari fase gerak daun jambu biji putih ............................. 13

8 Komposisi optimum dari fase gerak daun jambu biji merah ........................... 13

9 Komposisi optimum dari fase gerak daun jambu biji 7 ................................... 13

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Daun jambu biji ( Psidi folium) .......................................................................... 2

2 Struktur dasar flavonoid ..................................................................................... 2

3 Struktur dasar kuersetin ..................................................................................... 2

4 Struktur DPPH ................................................................................................... 3

5 Mekanisme kerja DPPH ..................................................................................... 3

6 Mekanisme penjerapan komponen pada silika gel............................................. 4

7 Sepuluh titik selektivitas Simplex Centroid ....................................................... 6

8 Jumlah pita sampel daun jambu biji hasil maserasi metanol 70%. ................. 11

9 Jumlah pita sampel daun jambu biji hasil maserasi metanol 96 % ................. 11

10 Kromatogram JBP 70% daun tua ................................................................... 14

11 Densitogram JBP 70% daun tua ..................................................................... 14

12 Kromatogram JBM 70% daun tua ................................................................. 14

13 Densitogram JBM 70% daun tua ................................................................... 15

14 Kromatogram JB7 96% daun muda ............................................................... 15

15 Densitogram JB7 96% daun muda ................................................................. 15

ix

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1 Bagan kerja penelitian ...................................................................................... 20

2 Kode sampel dan data kadar air daun jambu biji ............................................. 21

3 Hasil maserasi dengan metanol 96% dan 70% ................................................ 22

4 Data dan perhitungan IC50 dari seluruh sampel ................................................ 23

5 Jumlah pita dan nilai Rf berdasarkan rancangan SCD ..................................... 26

6 ANOVA model kuadratik JBP 70% tua.......................................................... 30

7 ANOVA model kubik JBP 70% tua ................................................................ 31

8 ANOVA model linear JBM 70% tua ............................................................... 32

9 ANOVA model kuadratik JBM 70% tua ......................................................... 33

10 ANOVA model kubik JBM 70% tua ............................................................. 34

11 ANOVA model linear JB7 96% muda .......................................................... 35

12 ANOVA model kuadratik JB7 96% muda ..................................................... 36

13 ANOVA model kubik JB7 96% muda ........................................................... 37

14 Nilai Rf dan area puncak dari densitogram .................................................... 38

1

PENDAHULUAN

Latar belakang

Tumbuhan obat telah dimanfaatkan secara

luas oleh masyarakat sebagai solusi alternatif

dalam mengatasi masalah kesehatan yang

dihadapinya. Dewasa ini masyarakat mulai

beralih dari pengobatan modern ke

pengobatan tradisional atau yang dengan

istilah Back to Nature. Pengobatan tradisional

dengan menggunakan tanaman obat sebagai

medianya memiliki beberapa keuntungan

diantaranya lebih aman dan tidak memiliki

resiko yang berarti bagi tubuh

(Wijayakusuma 2000). Masalah yang

berhubungan dengan proses penuaan, kanker,

tumor, hepatitis, dan jantung semua masalah

kesehatan ini dapat disebabkan salah satunya

oleh radikal bebas yang masuk ke dalam

tubuh. Penyakit tersebut dapat dicegah dan

dihindari dengan cara banyak mengkonsumsi

zat antioksidan alami atau buatan. Zat

antioksidan alami banyak terdapat pada

tumbuhan obat, buah, dan sayur-sayuran

(Ghiselli 1998; Shui 2004). Tanaman jambu

biji berpotensi sebagai antioksidan alami

terutama pada bagian buah dan daunnya

karena mengandung vitamin A,C,E, folat, dan

polifenol yang memiliki kemampuan dapat

menangkap radikal bebas (Gill 2002).

Penentuan aktivitas antioksidan dengan

menggunakan metode 1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil (DPPH) merupakan metode uji

aktivitas antioksidan yang dilakukan secara in

vitro untuk menentukan potensi dari suatu zat

aktif sebagai antioksidan yang relatif cepat

dan sederhana dibandingkan dengan uji

aktivitas antioksidan lain (Pokorni 2001).

Analisis sidik jari merupakan salah satu

dari banyak metode yang digunakan sebagai

kendali mutu dalam suatu proses produksi,

metode ini dapat menyajikan informasi yang

spesifik secara menyeluruh dari suatu sampel

(Liang et al. 2009). Analisis sidik jari suatu

sampel dapat dipantau mutunya dari bentuk

profil kromatogram, spektrogram, atau

densitogram. Metode sidik jari telah

dikembangkan oleh beberapa peneliti

sebelumnya diantaranya oleh (Borges et al.

2007) pada Camellia sinensis, (Delaroza &

Scarminio 2008) pada Bauhinia variegate,

dan (Wahyuni 2010) pada Phyllanthus niruri

L.

Metode kromatografi lapis tipis (KLT)

dapat digunakan dalam analisis sidik jari

karena memiliki beberapa keunggulan, yaitu

membutuhkan waktu yang singkat,

membutuhkan sampel dan fase gerak yang

sedikit, lebih sensitif dan selektif (Cie´sla et

al. 2009). Metode kromatografi lapis tipis

(KLT) dan kromatografi lapis tipis kinerja

tinggi (HPTLC) dapat digunakan untuk

menganalisis secara semikuantitatif. Metode

KLT dan HPTLC memiliki kemampuan untuk

mengubah suatu titik atau pita dari profil

kromatogram menjadi bentuk kurva yang

dapat dihitung areanya menggunakan bantuan

teknik deteksinya (Mariswamy 2011).

Metode digitally enhanced thin layer

chromatography (DE-TLC) merupakan

penggabungan metode fotografi dengan KLT

konvensional yang dapat digunakan untuk

menganalisis secara kuantitatif maupun

kualitatif dengan menggunakan bantuan

parangkat lunak pengolah gambar. Metode

DE-TLC ini diharapkan dapat menjadi metode

alternatif pengganti HPTLC yang lebih mahal

(Hess 2007).

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan

sidik jari yang berasal dari tiga jenis daun

jambu biji berdasarkan perbedaan umur

dengan menggunakan analisis sidik jari KLT

yang dikembangkan dari profil digital

kromatogramnya menjadi densitogram yang

kedepannya dapat digunakan sebagai metode

kendali mutu.

TINJAUAN PUSTAKA

Daun Jambu Biji (Psidi folium)

Jambu biji (Psidium guajava L.) memiliki

bagian berupa daun yang dapat dimanfaatkan

untuk mengobati masalah kesehatan. Tanaman

ini berasal dari Amerika Tengah berdasarkan

klasifikasinya termasuk dalam divisi

Spermatophyta, subdivisi Angiospermae,

kelas Dicotyledonae, ordo Myrtales, family

Myrtaceae, genus Psidium, spesies Psidium

guajava (Sudarsono 2001).

Kandungan kimia dari daun jambu biji

terdiri atas senyawa flavonoid, kuinon,

steroid, limonen, kariofilen, seskuiterpen

alkohol, dan senyawa fenolik yang meliputi

kuersetin, avikularin, guajavarin,

leukosianidin, asam elagat, amritosid, dan

piragalol (Indriani 2006).

Daun jambu biji (Gambar 1) memiliki

beberapa manfaat diantaranya dapat sebagai

antidiare, antiradang, antioksidan, antibakteri,

dapat mengobati sariawan, keputihan

penghenti perdarahan (hemostatis), peluruh

haid, dan diabetes melitus. Uji toksisitas

ekstrak daun jambu biji menurut monograf

2

yang dikeluarkan BPOM RI tahun 2004

menyatakan daun jambu biji tidak toksik.

Penelitian aktivitas antioksidan dari daun

jambu biji telah dilakukan oleh sejumlah

peneliti diantaranya oleh Mulyono (1994),

Qian et al. (2004), Indriani (2006) hasil

penelitian menunjukan bahwa daun jambu biji

memiliki efek sebagai antioksidan.

Gambar 1 Daun jambu biji ( Psidi folium) (Sumber: Sudarsono 2001)

Senyawa Flavonoid

Golongan flavonoid dapat digambarkan

sebagai rangkaian gugus karbon C6-C3-C6

(Gambar 2) kerangka karbon terdiri atas dua

gugus C6 yang disambungkan oleh rantai

alifatik tiga karbon. Senyawa flavonoid sering

terdapat sebagai glikosidanya di alam,

golongan terbesar flavonoid berciri

mempunyai cincin piran yang

menghubungkan rantai tiga karbon dengan

salah satu dari cincin benzena (Robinson

1995).

Gambar 2 Struktur dasar flavonoid

(Sumber : Robinson 1995)

Senyawa flavonoid memiliki kemampuan

sebagai antioksidan, karena dapat bertindak

sebagai penampung yang baik radikal hidroksi

dan superoksida sehingga kerusakan sel yang

diakibatkan oleh radikal bebas dapat

dihindari dengan adanya flavonoid (Robinson

1995). Flavonoid termasuk dalam golongan

fenol yang terdapat pada tumbuhan tingkat

tinggi dalam bentuk campuran, salah satu

contohnya adalah flavonol dan flavononol

merupakan senyawa yang banyak terdapat

dalam tumbuhan berpembuluh (Markham

1998).

Senyawa golongan flavonoid yang banyak

terdapat pada daun jambu biji adalah

kuersetin. Kuersetin merupakan senyawa

golongan flavon yang merupakan bagian dari

senyawa golongan flavonoid yang terikat

sebagai glikosida pada jaringan tumbuhan,

kuersetin memiliki aktivitas antioksidan yang

kuat struktur dasar senyawa kuersetin dapat

dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3 Struktur dasar kuersetin (Sumber : Markham 1998)

Senyawa Antioksidan

Antioksidan merupakan senyawa yang

terdapat dalam membran sel maupun ruang

ekstra sel yang mempunyai sifat dapat

menghambat atau mencegah kemunduran,

kerusakan, atau kehancuran sel akibat reaksi

oksidasi. Zat antioksidan mampu mengubah

oksidan menjadi molekul yang tidak dapat

mempengaruhi jaringan penting. Selain itu,

zat antioksidan mampu menangkap berbagai

jenis oksigen yang bersifat reaktif (O2-, H2O2,

·OH, ·HOCl) dengan cara mengubah

pembentukan molekul radikal bebas atau

dengan memperbaiki kerusakan-kerusakan

yang diakibatkannya (Widjaja 1997).

Reaksi antara molekul radikal bebas

dengan molekul non radikal akan

menghasilkan suatu radikal yang baru dan

selanjutnya menimbulkan reaksi oksidasi

berantai. Radikal bebas menjadi sangat

berbahaya bagi makhluk hidup karena apabila

reaksi ini terjadi di dalam tubuh akan

menimbulkan berbagai kerusakan yang

selanjutnya menjadi penyebab berbagai

penyakit.

Sumber antioksidan alami dapat diperoleh

dari buah, sayuran berwarna, dan tumbuhan

obat karena mengandung senyawa yang dapat

menangkap molekul radikal bebas, seperti

senyawa fenolik (flavonoid, asam fenolat, dan

tannin) (Harnly et al. 2006).

3

Aktivitas antioksidan dapat ditentukan

dengan berbagai metode diantaranya,

penangkapan radikal bebas superoksida,

metode pengukuran kapasitas reduksi besi

(FRAP), penangkapan radikal bebas 1,1-

difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), pengukuran

kapasitas reduksi kupri (CUPRAC), dan

pengukuran kapasitas absorbans radikal

oksigen (ORAC).

Metode Antioksidan DPPH

Metode uji antioksidan dengan DPPH

dipilih karena memiliki beberapa keuntungan

diantaranya sederhana dalam proses

pengerjaannya, memerlukan waktu pengerjaan

yang singkat dalam mengevaluasi aktivitas

antioksidan dari senyawa bahan alam.

Senyawa DPPH merupakan senyawa radikal

bebas yang relatif stabil apabila disimpan

dalam kondisi penyimpanan yang baik. Oleh

karena itu, senyawa ini sesuai apabila

digunakan sebagai model radikal bebas untuk

pengujian aktivitas antioksidan dari suatu

senyawa aktif. DPPH memiliki rumus

molekul C18H12N5O6 (Gambar 4), serbuk

berwarna ungu, memiliki bobot molekul

394.33 g/mol, dan larut dalam pelarut etanol.

Metode DPPH dapat digunakan untuk

menentukan nilai IC50 dari suatu senyawa

aktif, yaitu konsentrasi yang efektif untuk

menghambat 50% dari proses oksidasi oleh

radikal bebas (Molyneux 2004). Mekanisme

kerja dengan DPPH, yaitu zat antioksidan

mereduksi radikal bebas DPPH menjadi

senyawa difenil pikrilhidrazin reaksi reduksi

DPPH ini teramati oleh adanya perubahan

warna dari unggu menjadi kuning. DPPH

mempunyai satu atom nitrogen yang

elektronnya tidak berpasangan sehingga bila

senyawa tersebut dilarutkan dalam etanol atau

metanol akan memberikan warna ungu.

Senyawa DPPH apabila bereaksi dengan

senyawa yang mempunyai daya antioksidan

maka akan memudarkan warna ungu dari

larutan DPPH karena terjadi pengikatan satu

elektron atom H oleh atom nitrogen yang

tidak berpasangan membentuk difenil

pikrilhidrazin yang stabil selanjutnya dengan

metode spektrofotometri dapat diamati pada

panjang gelombang 518 nm mekanisme kerja

DPPH dapat dilihat pada Gambar 5 (Rohman

et al. 2009; Molyneux 2004 ).

Gambar 4 Struktur DPPH (Sumber : Molyneux 2004)

Gambar 5 Mekanisme kerja DPPH (Sumber : Molyneux 2004)

Metode Ekstraksi

Ekstraksi merupakan suatu proses secara

selektif mengambil zat terlarut yang

terkandung dalam suatu campuran dengan

bantuan pelarut. Metode pemisahan pada

ekstraksi menggunakan pinsip kelarutan like

dissolves like, yaitu pelarut polar akan

melarutkan zat polar dan sebaliknya. Hal-hal

yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan

pelarut adalah selektivitas pelarut, polaritas

pelarut dengan zat yang diekstrak, kemudahan

larut dari zat yang akan diekstrak, dan

kemudahan untuk diuapkan (Khopkar 2002).

Salah satu prosedur untuk memperoleh

kandungan senyawa organik dari jaringan

tumbuhan ialah maserasi. Metode maserasi

digunakan untuk mengekstrak sampel yang

tidak tahan panas. Metode ini dilakukan

dengan merendam sampel dalam suatu pelarut

dan dilakukan sesekali pengocokan dengan

tanpa pemanasan. Kelebihan metode maserasi,

yaitu sederhana, tidak memerlukan peralatan

yang rumit, dan dapat menghindari kerusakan

komponen yang tidak tahan panas. Kelemahan

dari metode ini dari segi waktu memerlukan

waktu yang lama dan penggunaan pelarut

yang tidak efisien (Harbone 1987; Rohman et

al. 2006).

4

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan

teknik kromatografi yang digunakan untuk

memisahkan campuran komponen

berdasarkan distribusi komponen tersebut

diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase

gerak (Stoenoiu 2006). Prinsip KLT adalah

sampel diaplikasikan pada lapisan tipis

lempeng KLT kemudian dilakukan

pengembangan di dalam wadah chamber yang

berisi fase gerak sehingga sampel tersebut

terpisah menjadi komponen-komponennya.

Setiap komponen akan bergerak dengan laju

tertentu yang dinyatakan dengan faktor retensi

(Rf), yaitu perbandingan antara jarak yang

ditempuh fase gerak dengan jarak komponen.

Komponen yang mempunyai afinitas yang

besar terhadap fase gerak atau afinitas yang

lebih kecil terhadap fase diam akan bergerak

lebih cepat daripada komponen yang

mempunyai sifat sebaliknya (Gritter 1991).

Fase diam yang umum digunakan pada

KLT adalah silika gel, alumunium oksida,

selulosa beserta turunannya, dan poliamida.

KLT merupakan jenis kromatografi adsorpsi

yang memiliki prinsip penjerapan untuk

memisahkan komponen yang ingin

dipisahakan pada permukaan fase diam.

Mekanisme penjerapan antara fase diam

dengan senyawa yang akan dipisahkan dapat

dilihat pada Gambar 6.

Gambar 6 Mekanisme penjerapan komponen

pada silika gel (Sumber: Springer Image)

Proses pengembangan sampel adalah suatu

pemisahan sampel berdasarkan proses

perambatan fase gerak pada lapisan fase diam

(Stahl 1985). Sistem pengembangan yang

digunakan pada KLT didasarkan pada prinsip

like dissolves like, yaitu memisahkan

komponen bersifat nonpolar dengan fase

gerak nonpolar dan komponen polar dengan

fase gerak bersifat polar. Sistem

pengembangan akan lebih baik bila ruangan

pengembang telah jenuh dengan uap fase

gerak. Pemilihan fase gerak yang digunakan

berdasarkan nilai kepolaran fase gerak dapat

dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1 Kekuatan dan klasifikasi pelarut

menurut Snyder

Gol Pelarut Kekuatan

pelarut

I

n-Heksana n-Butil eter

Diidopropil etre

Metil-t-butil eter Dietil eter

0 2.1

2.4

2.7 2.8

II

i-Pentanol n-Butanol

i-Propanol

n-Propanol Etanol

Metanol

3.7 3.9

3.9

4.0 4.3

5.1

III

Tetrahidrofuran

Piridin Metoksietanol

Metilformamida

Dimetilformamida Dimetilsulfoksida

4.0

4.3 5.1

4.0

5.3 5.5

IV Asam asetat Formamida

6.0 6.4

V

Diklorometana

1.1-dikloroetana

Benzilalkohol

7.2 6.0

9.6

3.1

VI

Etil asetat Metil etil keton

Dioksana

Aseton Asetonitril

3.5

5.7

4.4 4.8

5.1

5.8

VII

Toluene

Benzene Nitrobenzene

Nitrometana

2.4

2.7 4.4

6.0

VIII

Kloroform

Dodekaflorohetanol Air

4.1 8.8

10.2

5

Kromatografi Lapis Tipis Pemayaran

Kromatografi lapis tipis pemayaran atau

densitometri merupakan pengembangan dari

KLT konvensional yang digunakan sebagai

metode analisis secara kualitatif maupun

semikuantitatif dari bentuk profil KLT.

Prinsip percobaan dari KLT pemayaran,

yaitu mengukur intensitas pendaran cahaya

yang diteruskan atau yang dipantulkan dari

sumber cahaya ultraviolet (UV) yang

dikenai terhadap pita atau titik pada

lempeng KLT. Metode analisis dengan cara

tersebut memiliki nilai presisi yang tinggi

dengan nilai standar deviasi 1%.

(Braithwaite 1999).

Metode KLT konvensional dapat

digunakan untuk menganalisis secara

kualitatif, mengidentifikasi suatu zat, dan

dapat pula memantau proses reaksi, akan

tetapi metode KLT konvensional masih

memiliki nilai akurasi yang rendah untuk itu

perlu dikembangkan metode KLT yang

dapat memberikan nilai akurasi yang lebih

tinggi. Metode yang digunakan untuk

meningkatkan nilai akurasi dari metode

KLT konvensional, yaitu dengan

menggunakan metode HPTLC. Metode ini

memerlukan biaya operasional yang tinggi

untuk mengatasi hal tersebut perlu

dikembangkanlah suatu teknik yang lebih

efisien dan hasil yang didapatkan memiliki

kualitas yang sama dengan HPTLC metode

tersebut ialah DE-TLC (Hess 2007).

Prinsip dari metode DE-TLC adalah

lempeng KLT yang memiliki sifat dapat

berpendar diterangi dengan cahaya UV

dengan panjang gelombang yang sesuai,

kemudian gambar dari pencahayaan tersebut

diambil dengan kamera khusus selanjutnya

dengan program komputer gambar tersebut

diolah menggunakan piranti lunak pengolah

gambar sehingga dihasilkan dari suatu pita

atau titik pada lempeng KLT menjadi

mulitspektra, densitogram, dan kurva

kalibrasi (Mariswamy 2011).

Perangkat Lunak Image J

Prangkat lunak Image J merupakan

perangkat lunak pengolah gambar

berbasiskan program Java yang dikeluarkan

oleh National Institute of Health, United

States Of America (NIH). Program ini dapat

mengolah gambar dalam bentuk format yang

beragam seperti tagged image format file

(TIFF), grafic interchange format (GIF),

joint photographic experts group (JPEG),

bitmap image (BMP), dan gambar mentah.

Image J dapat menghitung area dan

piksel dari suatu gambar, mengukur jarak,

sudut, membuat profil dari densitogram, dan

garis kurva. Program ini didukung dengan

pengatur gambar seperti pengatur

ketajaman, kehalusan, kecerahan, warna,

sudut, dan penyaring dari gambar yang akan

diolah. Penelitian mengenai sidik jari KLT

dengan piranti lunak semacam ini telah

dilakukan oleh Hess pada 2007 yang

menggunakan piranti lunak pengolah

gambar untuk menggantikan analisis dengan

densitometer.

Analisis Sidik Jari

Analisis sidik jari adalah suatu cara yang

dapat digunakan untuk menunjukan informasi

senyawa kimia dari suatu sampel dalam

bentuk spektrogram, kromatogram, atau grafik

lain yang didapatkan dari teknik analisis

secara menyeluruh (Borges et al. 2007; Liang

et al. 2009).

Metode sidik jari dapat digunakan sebagai

metode kendali mutu, metode validasi dan

dapat digunakan untuk mengklasifikasi dari

suatu sampel tanaman. Metode ini dapat

membantu untuk mengetahui senyawa penciri

dari suatu bahan alam yang ingin diketahui

secara pasti dengan menggunakan bentuk dan

pola kurva atau garfik yang ditunjukkan dari

suatu teknik analisis (Khanpara et al. 2010).

Sidik jari yang optimum dapat diperoleh

dengan memperhatikan beberapa faktor

diantaranya pemilihan pelarut pengekstrak,

pemilihan fase gerak yang sesuai pada proses

elusi KLT, dan pemilihan panjang gelombang

yang sesuai untuk visualisasi KLT.

Rancangan Campuran

Rancangan campuran digunakan saat suatu

sistem terdiri atas campuran beberapa

komponen yang jumlah totalnya konstan,

yaitu 100%. Respons yang diperoleh

merupakan fungsi dari proporsi relatif tiap

komponen dalam sistem. Pada rancangan

campuran dapat digunakan dua komponen

atau lebih. Bertambahnya jumlah komponen

yang terlibat akan menambah jumlah dimensi

ruang yang dipakai untuk menggambarkan

campuran. Saat dua komponen terlibat, maka

profil campuran komponen akan mengikuti

garis lurus, saat tiga komponen akan terbentuk

segitiga, saat empat komponen akan terbentuk

tetrahedron, dan seterusnya.

6

Objek paling sederhana yang

menggambarkan dimensi campuran disebut

sebagai simplex (Brereton 2005). Rancangan

simplex centroid dengan axial design dapat

digambarkan dalam bentuk segitiga pada

Gambar 7 saat digunakan tiga komponen,

rancangan campuran dapat mengikuti

rancangan simplex-lattice, simplex-centroid,

maupun simplex centroid dengan axial design.

Gambar 7 Sepuluh titik selektivitas Simplex

Centroid

Pada rancangan simplex centroid selain

pengaruh sistem tunggal dan biner dipelajari

juga pengaruh kombinasi tiga komponen pada

titik tengah (Brereton 2005). Simplex centroid

design (SCD) diperkenalkan oleh Scheffe

(1963) dengan hasil analisis yang diperoleh

dapat berupa persamaan polinomial yang

menggambarkan respon permukaan.

Persamaan ini mudah didapat dan bagian

optimum dari komponen dapat ditentukan.

Persamaan polinomial yang dapat dibentuk

dengan tiga komponen adalah kuadratik,

spesial kubik, dan kuartik (Anderson &

McLean 1974).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah daun

jambu biji putih (JBP), daun jambu biji merah

(JBM) yang berasal dari daerah Cikabayan

Darmaga, dan daun jambu biji putih asal

Imogiri Jateng dengan kode (JB7). Seluruh

sampel asal Cikabayan berasal dari satu pohon

dan sampel asal Imogiri berasal dari 5 pohon

dari jenis yang sama, metanol 70 dan 96 %, n-

heksana, CHCl3, etil asetat, pekat, serbuk Mg,

HCl pekat, amil alkohol, FeCl3 1 %, serbuk

DPPH.

Peralatan yang digunakan adalah

maserator, oven (Momert), eksikator, neraca

analitik XT 220A (precisa), evaporator putar

R-114 (Buchi), maserator, KLT aplikator

CAMAG®

Linomat 5, CAMAG® Repostar 3,

lempeng silika gel F 254, Piranti lunak Image

J, dan design expert 7, Spektrofotometer UV-

tampak Pharmaspec 1700 Shimidzu.

Metode Penelitian

Tahapan yang dilakukan dalam penelitian

ini terdiri atas pembuatan serbuk daun jambu

biji kemudian dari serbuk tersebut ditentukan

kadar airnya dengan metode gravimetri

evolusi tidak langsung, kemudian serbuk

tersebut diekstrak dengan metode maserasi

menggunakan pelarut yang diragamkan

konsentrasinya, yaitu metanol 70 dan 96%,

ekstrak metanol tersebut dipekatkan sampai

1/10 volume awal kemudian dihidrolisis

dengan HCl 2N selama 30 menit setelah itu

dipartisi dengan etil asetat, fraksi etil asetat

yang berhasil dipisahkan dipekatkan dengan

penguap putar sampai menjadi pasta,

kemudian diuji kandungan senyawa flavonoid

dan tanin didalamnya dengan uji fitokimia,

kemudian setelah itu dilakukan pemilihan fase

gerak untuk memisahkan komponen aktif dari

ekstrak etil asetat sampel pada KLT dengan

rancangan SCD dan setelah itu komposisinya

fase geraknya dioptimasi menggunakan

perangkat lunak Design Expert V.7 (DX 7)

selanjutnya gambar profil KLT diambil pada

panjang gelombang 254 dan 366 nm dengan

kamera khusus kemudian gambar tersebut

diolah dengan perangkat lunak Image J

menjadi bentuk densitogram, setelah itu

dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan

metode DPPH dari masing-masing ekstrak etil

asetat sampel. Bagan alir dari penelitian ini

dapat dilihat pada Lampiran 1.

Persiapan Bahan Baku

Daun jambu biji yang digunakan, yaitu

daun muda yang berasal dari bagian pucuk

batang dan daun tua yang berasal dari bagian

pangkal batang dari seluruh tanaman jambu

biji dengan bobot masing-masing sebanyak ½

kg kemudian daun tersebut dikecilkan

ukurannya dengan pisau pemotong

selanjutnya potongan daun jambu biji

dikeringkan dengan bantuan sinar matahari

sampai hampir kering. Potongan daun jambu

tersebut digiling dengan alat penggiling

sampai didapatkan serbuk daun jambu biji

dengan ukuran 30-40 mesh.

7

Penentuan Kadar Air (AOAC 971.28)

Cawan porselin dibersihkan kemudian

dikeringkan dalam oven bersuhu 105 °C

selama 30 menit, setelah itu didinginkan

dalam eksikator dan ditimbang. Sebanyak 3 g

serbuk daun jambu biji ditimbang ke dalam

cawan yang telah diketahui bobot kosongnya.

Masukkan ke dalam oven bersuhu 105 °C

selama 30 menit setelah itu cawan yang berisi

sampel dikeluarkan dari oven lalu didinginkan

dalam eksikator dan ditimbang hal ini

dilakukan sampai diperoleh bobot tetap, yaitu

apabila perbedaan dua kali penimbangan

berturut-turut setelah dikeringkan selama 1

jam tidak lebih dari 0.25 % atau perbedaan

penimbangan tersebut tidak melebihi 0.5 mg.

Berikut rumus untuk menghitung kadar air.

Kadar air (%) = %100A

BA

Keterangan:

A = bobot contoh sebelum dikeringkan (g) B = bobot contoh setelah dikeringkan (g)

Metode Maserasi

Serbuk daun jambu biji terlebih dahulu

dibebaskan dari komponen lemaknya dengan

menggunakan n-heksana (Harbone 1987).

Sebanyak 150 g serbuk daun jambu biji

dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer 500

mL ditambah 300 mL n-heksana dan

direndam selama 12 jam. Residu dikeringkan

pada suhu kamar selama 24 jam selanjutnya

diekstrak menggunakan metanol 96 dan 70%

sebanyak 500 mL kemudian selama 6 jam

pertama dilakukan pengadukan dengan

maserator proses ekstraksi dilakukan selama

24 jam.

Hasil maserasi (maserat) dipisahkan dan

dipindahkan ke labu Erlenmeyer lain dan

ampasnya diperlakukan seperti maserasi

sebelumnya, proses ini dilakukan sebanyak

dua kali maserasi. Semua maserat

dikumpulkan dan diuapkan dengan penguap

putar tekanan rendah hingga diperoleh ekstrak

metanol 1/10 volume awal.

Isolasi Golongan Flavonoid

Ekstrak metanol 70 dan 96% hasil dari

evaporasi awal ditambahkan asam kuat HCl 2

N dengan perbandingan volume (1:1)

kemudian dihidrolisis dengan kondisi suhu

100 °C selama 30 menit (Harbone 1987).

Setelah dilakukan hidrolisis ekstrak metanol

tersebut dipartisi cair-cair sebanyak tiga kali

dengan etil asetat dengan perbandingan

volume 1:1 (Harbone1987). Fraksi yang larut

etil asetat dikumpulkan kemudian diuapkan

dengan penguap putar tekanan rendah dan

dikeringkan, setelah itu ditentukan rendemen

dari masing-masing konsentrasi metanol 70

dan 96%.

Uji Fitokimia Flavonoid (Harbone 1987)

Sebanyak 0.1 g ekstrak etil asetat daun

jambu biji ditambahkan 10 mL air panas

kemudian dididihkan selama 5 menit dan

disaring. Sebanyak 10 mL filtrat ditambahkan

0.5 g serbuk magnesium (Mg), 1 mL HCl

pekat, dan 1 mL amil alkohol. Campuran

dikocok dengan vorteks. Uji positif ditandai

dengan munculnya warna merah, kuning, atau

jingga pada lapisan amil alkohol.

Uji Fitokimia Tanin (Harbone 1987)

Sebanyak 0.1 g ekstrak etil asetat daun

jambu biji dimasukkan ke dalam 10 mL air

panas dan dididihkan selama 5 menit lalu

disaring. Filtrat ditambahkan 10 mL FeCl3

1%. Uji positif ditandai bila munculnya warna

hijau kehitaman pada hasil filtrat.

Pemilihan Pelarut Sebagai Fase Gerak

(Fernand 2003)

Instrumentasi dan kondisi KLT Sampel

diaplikasikan dalam bentuk pita dengan lebar

8 mm pada silika gel F254 Merck®

menggunakan CAMAG®

Linomat V

dilengkapi dengan perangkat lunak

WinCATS. Sampel diaplikasikan konstan

dengan laju 20 nL/detik dan jarak antar pita

adalah 5 mm. Dokumentasi kromatogram

KLT menggunakan CAMAG®Reprostar 3

(CAMAG®, Muttenz, Swiss). Twin trough

chamber CAMAG® dijenuhkan terlebih

dahulu selama 30 menit dengan fase gerak

yang telah ditentukan. Pelat KLT yang berisi

cuplikan dimasukkan ke dalam bejana

kromatografi. Pengembangan dilakukan

hingga fase gerak mencapai jarak 1 cm dari

tepi atas pelat kemudian diangkat dan

dikeringkan.

1. Penotolan Sampel

Ekstrak daun jambu biji hasil ekstraksi

ditimbang sebanyak 0.1g yang kemudian

dilarutkan masing-masing sampel dengan

metanol 70 dan 96% sampai 10 mL sehingga

didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 10000

ppm. Penotolan ektrak pada KLT dilakukan

8

dengan menggunakan KLT aplikator

CAMAG® Linomat 5.

2. Pemilihan Fase Gerak

Pemilihan fase gerak diawali dengan

menggunakan tiga pelarut tunggal, yaitu

CHCl3, metanol, etil asetat. Sebanyak 5 mL

dari tiga pelarut tersebut dimasukkan ke

dalam bejana kromatografi kemudian

dijenuhkan selama 30 menit. Pelat KLT yang

telah ditotolkan sampel dimasukkan ke dalam

bejana kromatografi dan dielusi dengan fase

gerak sampai fase gerak mencapai jarak ± 0.5

cm dari tepi atas pelat. Pelat KLT diangkat,

dikeringkan, dan dideteksi. Deteksi dilakukan

untuk melihat pita yang muncul pada pelat

KLT dengan cahaya UV 254, 366 nm dengan

CAMAG®

Repostar 3. Setelah itu, dipilih tiga

pelarut yang memberikan penampakan pita

terbanyak dan memiliki pemisahan yang baik.

Ketiga pelarut yang terpilih n-heksana,

metanol, dan etil asetat dikombinasikan

berdasarkan simplex sentroid dengan axial

design kesepuluh perbandingan komposisi

pelarut tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2 Sepuluh titik selektivitas SCD

Fase gerak Perbandingan komposisi fase gerak

(v/v/v)

A B C

1 1 0 0

2 0 0 1

3 0 1 0

4 ½ 0 ½ 5 0 ½ ½

6 ½ ½ 0

7 1/3 1/3 1/3 8 1/6 2/3 1/6

9 1/6 1/6 2/3

10 2/3 1/6 1/6

Selanjutnya dilakukan pemisahan

komponen sampel dengan menggunakan

sepuluh perbandingan komposisi pelarut

tersebut. Kemudian dilakukan pengeringan

pada lempeng KLT, pendeteksian komponen,

dan ditentukan nilai Rf serta jumlah pita yang

dihasilkan untuk menyusun komposisi fase

gerak yang optimum.

Setelah didapatkan jumlah pita yang

dihasilkan dari masing-masing sampel dengan

menggunakan SCD maka dilakukan optimasi

dengan bantuan perangkat lunak DX 7 untuk

mendapatkan komposisi terbaik dari fase

gerak yang berguna untuk menghasilkan

jumlah pita terbanyak yang diharapkan.

Proses Analisis Statistik DX 7

Proses analisis statistik dengan program

DX 7 terlebih dahulu ditentukan rancangan

yang akan digunakan, yaitu Mixture kemudian

pilih Simplex Centroid Design, tentukan

jumlah komponen pada menu Mixture

Component sebanyak 3 kemudian ubah

komponen dengan fase gerak yang digunakan

dengan batas bawah 0 dan batas atas 1.

Pilih order linear tanpa ada pengulangan

(Replicate) dan pilih Augement Design pada

model SCD sehingga didapatkan ada 10

kombinasi campuran. Ubah (R1) respon

dengan variabel yang akan ditentukan dalam

hal ini jumlah spot. Kemudian pada design

actual evaluasi model yang digunakan dengan

cara memilih model mix order menjadi linear.

Respon berupa jumlah pita dianalisis dengan

menu analysis dan terlihat model yang

disarankan dari analisis tersebut dari menu fit

summary. Model yang dipilih adalah model

dengan nilai adjusted R-Sequred, predicted R-

sequred maksimum.

Pada menu f(x) model pilih mix order yang

disarankan (suggested) akan tetapi apabila

dari model yang disarankan tidak mendapat

nilai adjusted R-Sequred, predicted R-sequred

maksimum maka dapat dipilih mix order

dengan model kuadratik atau kubik kemudian

didapat persamaan regresi pada menu

ANOVA.

Hasil dari analisis dioptimasi sehingga

didapatkan ragam rancangan baru. Ubah

variabel pada bagian goal sesuai dengan

tujuan optimasi. Ragam rancangan dapat

terlihat pada bagian solutions. Setelah

didapatkan rancangan fase gerak optimum

dari pengolahan dengan DX 7 kemudian

komposisi fase gerak tersebut digunakan

untuk mengelusi sampel kemudian gambar

hasil elusi tersebut didokumentasikan dengan

CAMAG® Repostar 3 pada panjang

gelombang 254 dan 366 nm. Setelah itu

gambar tersebut diolah dengan perangkat

lunak Image J sehingga didapatkan suatu

bentuk densitogram.

Pengolahan Gambar dengan Image J

Aktifkan program Image J, pilih menu

File lalu pilih Open, kemudian pilih gambar

KLT yang sudah diambil dengan CAMAG®

Repostar 3 format gambar dalam bentuk

JPEG. Pilih krusor menu Rectangular tandai

gambar. Kemudian pilih menu Analyze lalu

pilih Gels, kemudian pilih select first lane.

Atur kontras dengan cara memilih menu

9

0

2

4

6

JBMtua

JB7tua

JBPtua

JBMmuda

JB7muda

JBPmuda

Sampel daun jambu biji

Image pilih Type pilih RGB Color, kemudian

Adjust atur Brigthness dan Contrast sampai

didapat gambar titik yang jelas. Kembali pilih

menu Analyze lalu Gels kemudian plot lane

maka akan tampil kurva yang sesuai dengan

gambar titik pada KLT. Kurva tersebut

dengan menggunakan krusor Rectangular

seluas yang akan diukur. Pilih menu Analyze

kemudian lalu Measure didapatkan area

kurva.

Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958)

Larutan DPPH 1mM dibuat dengan

melarutkan 0.0039 g pada labu takar 10 mL

menggunakan pelarut metanol. Kemudian

sebanyak 0.005 g ekstrak daun jambu biji

ditimbang dan dilarutkan dalam metanol

menggunakan labu takar 10 mL untuk

mendapatkan larutaan stok 500 ppm.

Larutan stok daun jambu biji diencerkan

menjadi konsentrasi 10, 30, 50, 70, ppm.

Kemudian dari tiap konsentrasi dimasukan ke

dalam tabung reaksi. Sebanyak 4.5 mL

ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi

dan ditambahkan 1.5 mL larutan DPPH 0.1

mM dalam metanol dan dihomogenkan

dengan vorteks, kemudian panaskan pada

suhu 37 °C selama 30 menit, selanjutnya

diukur serapannya pada panjang gelombang

518 nm dengan spektrofotometer UV-tampak

serapan larutan yang terbaca adalah serapan

sampel. Larutan DPPH tanpa ekstrak daun

jambu biji diperlakukan sama seperti adanya

ekstrak daun jambu biji kemudian diukur

serapannya pada 518 nm sebagai serapan

kontrol.

Nilai IC50 dari ekstrak daun jambu biji

ditentukan dengan memplotkan hubungan

antara logaritma konsentrasi ekstrak daun

jambu biji sebagai sumbu X dan persen

aktivitas penangkapan radikal DPPH sebagai

sumbu Y. Kemudian dengan perlakuan yang

sama dengan sampel lakukan pengukuran

serapan sampel tanpa penambahan DPPH

sebagai faktor koreksi persen aktivitas

penangkapan DPPH dihitung dengan rumus

sebagai berikut:

HASIL DAN PEMBAHASAN

Persiapan Sampel Daun Jambu Biji

Titik pengambilan setiap sampel diambil

dari bagian muda dan tua batang. Hal ini

bertujuan untuk mengetahui kandungan

senyawa aktif dari bagian yang berbeda pada

satu batang. Sampel daun jambu biji yang

akan dilakukan analisis sidik jari dibuat

serbuk terlebih dahulu agar dapat

memudahkan dalam proses pengekstrakan zat

aktifnya. Serbuk daun jambu biji yang

dihasilkan memiliki ukuran yang sangat halus,

yaitu 30-40 mesh.

Ukuran serbuk yang halus dimungkinkan

pelarut pengekstrak berinteraksi lebih mudah

untuk mengekstrak zat aktif dari daun jambu

biji karena memiliki permukannya yang luas

sehingga kontak antara pelarut pengekstrak

dengan partikel pada jambu biji semakin

intensif. Identitas serbuk daun jambu biji pada

penelitian ini tertera pada Lampiran 2 yang

menunjukkan kode sampel yang dianalisis.

Hasil analisis kadar air dapat dilihat pada

Lampiran 2 dengan rerata kadar air untuk

daun bagian muda dari tiga jenis daun yang

berbeda sebesar 10.40% dan daun bagian tua

dari tiga jenis daun yang berbeda sebesar

9.02%, hal ini tidak seperti data yang

dilaporkan oleh (Inayati 2007) yang

menyatakan bahwa kadar air dari daun jambu

biji sebesar 5,23. Perbedaan ini disebakan

oleh beberapa faktor diantaranya kelembapan

udara, perlakuan terhadap sampel, waktu

pengambilan sampel, dan besaranya

penguapan.

Serbuk adalah sediaan obat tradisional

berupa butiran homogen dengan tingkat

kehalusan yang seragam. Syarat suatu serbuk

untuk bisa menjadi bahan baku obat

tradisional atau jamu menurut Keputusan

Menteri Kesehatan Republik Indonesia

No.661/Menkes/sk/vii/1994 mengenai

persyaratan obat tradisional bahwa kadar air

sediaan serbuk tidak lebih dari 10%. Serbuk

daun jambu biji yang ditentukan kadar airnya

memiliki kadar air yang sesuai dengan

persyaratan yang ditentukan untuk pembuatan

sediaan obat tradisional atau jamu. Kadar air

yang terkandung di dalam suatu sampel

serbuk akan mempengaruhi rendemen yang

dihasilkan hal ini kerena nilai kadar air

termasuk dari faktor koreksi pada perhitungan

persen rendemen.

10

Tahap Ekstraksi dan Partisi Zat Aktif

Daun Jambu Biji

Hasil maserasi yang kemudian dilakukan

proses partisi dengan etil asetat didapatkan

rerata rendemen ekstrak etil asetat yang

sebelumnya dimaserasi dengan metanol 96%

sebesar 2.46% rerata rendemen ekstrak etil

asetat yang sebelumnya dimaserasi dengan

metanol 70% sebesar 0.50%. Berdasarkan

penelitian mengenai daun jambu biji

rendemen ekstrak etil asetat daun jambu biji

yang dihasilkan sebesar 4% (Roy 2010). Data

rendemen ekstrak etil asetat untuk sampel

daun jambu biji yang dimaserasi dengan

metanol 70 dan 96% untuk selengkapnya

dapat dilihat pada Lampiran 3.

Rendemen yang didapatkan antara serbuk

yang dimaserasi dengan metanol 96% dan

70% saling berbeda hal ini dikarenakan

tingkat kepolaran dari metanol 70% lebih

polar dibanding metanol 96%. Jumlah

rendemen yang rendah pada penelitian ini

dikarenakan tidak terbentuk lapisan yang jelas

terpisah antara metanol dengan etil asetat pada

corong pisah, hal ini mengakibatkan ekstrak

metanol terpartisi tidak sempurna sehingga

rendemen fraksi etil asetat yang dihasilkan

tidak optimal. Tahap ekstraksi serbuk daun

jambu biji terlebih dahulu dihilangkan

kandungan lemaknya dengan menggunakan

pelarut yang bersifat nonpolar seperti n-

heksana. Lemak yang terdapat di dalam

sampel dapat mengganggu analisis dengan

cara menghambat proses penguapan pelarut

pada saat pemekatan ekstrak, dan dapat

mengganggu kemurnian dari sampel yang

dianalisis karena dapat terjerap dalam fase

diam kromatografi lapis tipis (Kramer 1985).

Pemilihan metanol sebagai pengekstrak

pada penelitian ini karena metanol dapat

melarutkan semua senyawa organik yang ada

pada contoh baik polar maupun semipolar,

dan bersifat mudah menguap sehingga dapat

dibebaskan dengan mudah dari ekstrak.

Ekstrak yang sudah bebas dari komponen

lemak kemudian dilakukan proses hidrolisis

dengan menggunakan HCl 2 N. Hidrolisis ini

bertujuan untuk memecah ekstrak menjadi

glikosida dan aglikon-aglikon flavonoid.

Aglikon flavonoid dipisahkan dari fraksi

gulanya dengan partisi menggunakan etil

asetat (Markham 1988). Metode ekstraksi

yang dipiih pada percobaan ini adalah

maserasi hal ini karena maserasi merupakan

suatu metode yang cukup mudah dilakukan

memerlukan peralatan yang sederhana.

Maserasi pada penelitian ini dilakukan

sebanyak dua kali ulangan dengan lama

perendaman selama 24 jam.

Pengujian Fitokimia Daun Jambu Biji

Uji fitokimia dilakukan untuk

menunjukkan kandungan metabolit sekunder

yang terekstrak dari sampel secara kualitatif

dan juga untuk mengetahui efektivitas pelarut

dalam mengekstrak senyawa flavonoid dan

tanin. Efektivitas pelarut dapat dilihat dari

intensitas warna. Intensitas warna yang lebih

pekat menunjukkan bahwa suatu ekstrak

positif mengandung senyawa metabolit

sekunder didalamnya.

Tabel 3 Uji fitokimia serbuk daun jambu biji

dengan maserasi metanol 96%

Sampel Flavonoid Tanin

JBM B

JBM A

JBP B

JBP A

JB7 B

JB7 A

+ + + + +

+ + + + +

+ + +

+ + + +

+

++

+ + + + +

+ + + + +

+ + +

+ + + +

+

+ +

Ket: (+) menyatakan hasil uji posistif dan intensitas warnanya

Bagian muda (A)

Bagian tua (B)

Tabel 4 Uji fitokimia serbuk daun jambu biji

dengan maserasi metanol 70 %

Sampel Flavonoid Tanin

JBM B

JBM A

JBP B

JBP A

JB7 B

JB7 A

+ + +

+

+ + +

+ +

+ + +

+ + +

+ + +

+

+ + + + +

+ +

+ + + +

+ + +

Ket: (+) menyatakan hasil uji posistif dan intensitas

warnanya Bagian muda (A)

Bagian tua (B)

Hasil uji fitokimia dapat dilihat pada

Tabel 3 & Tabel 4. Hasil uji kualitatif

menunjukan daun jambu biji pada penelitian

ini memiliki kandungan senyawa flavonoid

dan tanin yang cukup beragam, hal ini terlihat

dari intensitas warna merah jingga untuk

senyawa flavonoid dan hijau kehitaman untuk

tanin yang cukup tinggi.

Daun jambu biji yang dilakukan proses

ekstraksi dengan metanol 96% memiliki hasil

lebih kuat intensitas warnanya untuk senyawa

flavonoid dan tanin dibandingkan dengan

yang dimaserasi dengan metanol 70% hal ini

karena metanol 96% lebih effektif untuk

mengambil senyawa metabolit sekunder

11

seperti flavonoid dan tanin pada daun jambu

biji dibanding dengan metanol 70%.

Penentuan Fase Gerak Komponen Aktif

Daun Jambu Biji

Hasil dari tiga fase gerak tunggal yang

diujikan tampak setiap fase gerak mampu

memisahkan komponen dengan kemampuan

yang berbeda-beda terlihat dari jumlah dan

dan keterpisahan pita yang berbeda-beda

(Gambar 8 & Gambar 9).

Pemilihan fase gerak untuk KLT pada

penelitian ini digunakan tiga macam pelarut

tunggal yang memiliki nilai kepolaran hampir

berdekatan, yaitu metanol dengan nilai

kepolaran 5.1, etil asetat dengan nilai

kepolaran 4.4, dan kloroform dengan nilai

kepolaran 4.1 (Snyder 1979).

Pemilihan ini berdasarkan sifat dari

senyawa flavonoid yang bersifat semipolar

dengan pelarut yang dipilih tersebut bersifat

semipolar diharapkan komponen flavonoid

akan dapat dideteksi pada lempeng KLT.

Keterangan: (metanol), (kloroform)

(etil asetat)

Gambar 8 Jumlah pita sampel daun jambu

biji hasil maserasi metanol 70%.

Keterangan: (metanol), (kloroform)

(etil asetat)

Gambar 9 Jumlah pita sampel daun jambu

biji hasil maserasi metanol 96 %

Penampakan dari semua komponen

dilakukan dengan 2 cara cahaya UV 254, 366

nm berdasarkan cara ini dihasilkan

penampakan dan keterpisahan pita yang

beragam, hal ini disebabkan oleh kedua cara

tersebut spesifik untuk senyawa tertentu.

Penampakan dengan cahaya UV 254 nm

digunakan untuk mendeteksi alkaloid,

flavonoid, dan triterpenoid sedangkan cahaya

UV 366 nm digunakan untuk mendeteksi

senyawa alkaloid, flavonoid, dan lignan

(Fernand 2003).

Aktivitas Antioksidan Daun Jambu Biji

Penentuan aktivitas antioksidan dari

ekstrak kasar metanol yang telah dipartisi

dengan etil asetat dengan metode pengkapan

radikal DPPH didapatkan nilai IC50 semua

ekstrak kasar daun jambu biji yang berbeda

dari setiap sampel ekstrak kasar daun jambu

biji. Nilai IC50 didapat dari persamaan garis

yang dibentuk dari persen penangkapan

radikal bebas dengan ragam konsentrasi yang

dibuat 10, 30, 50, 70 ppm. Hasil IC50 dari

semua sampel ekstrak daun jambu biji dapat

dilihat pada Tabel 5 & Tabel 6.

Tabel 5 Nilai aktivitas antioksidan dari

ekstrak metanol 96%

Sampel IC50 (ppm) R2

JBM A

JBP A

JB7 A

JBM B

JBP B

JB7 B

3.47

6.87

2.63

9.00

15.98

33.86

0.889

0.903

0.858

0.917

0.985

0.928

Ket: Bagian muda (A)

Bagian tua (B)

Data dari Tabel 5 dapat diketahui daun

jambu biji yang diekstrak dengan metanol

96% menujukkan bahwa IC50 terendah diduga

pada daun jambu biji kode 7 bagian muda

sebesar 2.63 ppm dan yang tertinggi diduga

pada daun jambu biji kode 7 bagian tua

sebesar 33.86 ppm.

Jum

lah

Pit

a

Jum

lah P

ita

12

Tabel 6 Nilai aktivitas antioksidan dari

ekstrak metanol 70%

Sampel IC50 (ppm) R2

JBM A

JBP A

JB7 A

JBM B

JBP B

JB7 B

8.78

1.12

9.00

9.45

10.73

22.65

0.905

0.888

0.917

0.895

0.884

0.939

Ket: Bagian muda (A)

Bagian tua (B)

Data dari Tabel 6 dapat diketahui daun

jambu biji yang diekstrak dengan metanol

70% menujukkan bahwa IC50 terendah diduga

pada daun jambu biji putih bagian muda

sebesar 2.63 ppm dan yang tertinggi diduga

pada daun jambu biji kode 7 bagian tua

sebesar 33.86 ppm.

Daun jambu biji yang diekstrak dengan

menggunakan metanol 70% secara

keseluruhan menunjukkan aktivitas

antiokasidan yang lebih tinggi dibanding

dengan yang diekstrak dengan metanol 96%

dan daun bagian muda menunjukkan aktivitas

antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan

daun bagian tua. Secara keseluruhan nilai IC50 dari ekstrak

kasar serbuk daun jambu biji memiliki

aktivitas antioksidan yang cukup kuat terlihat

dari nilai IC50 yang relatif rendah, untuk

dikatakan memiliki tingkat aktivitas

antioksidan cukup kuat maka nilai IC50 kurang

dari 200 ppm (Blois 1958). Penelitian yang

pernah dilakukan oleh (Qian et al. 2004)

menyatakan bahwa ekstrak etanol daun jambu

biji memilki nilai IC50 sebesar 53.00 ppm.

Mengenai data dan contoh perhitungan dari

keseluruhan sampel daun jambu biji ini dapat

dilihat pada Lampiran 4.

Pengoptimuman Fase Gerak dari

Komponen Aktif Daun Jambu Biji

Optimasi fase gerak KLT menggunakan

rancangan SCD dengan fase gerak berupa

kloroform sebagai titik A, etil asetat sebagai

titik B, dan metanol sebagai titik C.

Berdasarkan banyaknya pita dari penampakan

dengan cahaya UV 254 dan 366 nm pada

rancangan SCD komposisi fase gerak yang

paling banyak memunculkan pita dengan

keterpisahannya cukup baik adalah kloroform

berbanding etil asetat (0.5:0.5).

Hasil dari optimasi pelarut dengan DX 7

terlihat bahwa seluruh sampel baik jambu biji

putih, merah, maupun kode 7 memiliki

kesamaan komponen fase gerak, yaitu

kloroform dan etil asetat dengan perbandingan

untuk komposisi kloroform lebih banyak

dibanding etil asetat untuk seluruh sampel.

Hal ini karena kloroform memiliki sifat

mudah membawa komponen aktif dari ekstrak

sampel, oleh karena itu untuk menahan elusi

yang terlalu cepat dari kloroform maka

digunakan etil asetat dalam campuran

tersebut. Hasil selengkapnya mengenai data

jumlah pita dari seluruh sampel daun jambu

biji dapat dilihat dalam Lampiran 5.

Berdasarkan sifat kepolaran dari pelarut

yang dipakai untuk memisahkan komponen

zat aktif dari sampel daun jambu biji

kloroform dan etil asetat memiliki sifat

kepolaran yang hampir sama, yaitu semipolar

sampai polar. Komponen yang terdapat dalam

daun jambu biji memiliki sifat yang hampir

serupa dengan pelarut kloroform dan etil

asetat, yaitu bersifat semipolar sehingga fase

gerak kloroform dan etil asetat dapat

memberikan pemisahan yang cukup baik dan

hal itu didukung dengan percobaan

menggunakan rancangan SCD pada Lampiran

5 terlihat bahwa komponen kloroform dan etil

asetat memberikan pola pemisahan yang baik.

Fase gerak metanol berdasarkan analisis

dengan menggunakan DX 7 terlihat bahwa

metanol tidak memiliki bagian untuk

memisahkan zat aktif hal ini dikarenakan sifat

dari metanol yang lebih bersifat lebih polar

dibanding kloroform dan etil asetat sehingga

sulit untuk bisa memberikan pola pemisahan

yang baik selain itu hal itu didukung dengan

pola pemisahan yang berdasarkan pada

rancangan SCD terlihat bahwa metanol

memiliki jumlah pita yang berhasil

terpisahkan paling sedikit bila dibandingkan

dengan kloroform dan etil asetat.

Hasil optimasi didapatkan model yang

disarankan dari program DX 7 untuk sampel

daun jambu biji putih, yaitu kuadratik dengan

nilai R2 sebesar 0.9674 dan nilai standar

deviasi 0.66 hasil selengkapnya mengenai

analisis ANOVA dari model kuadratik dapat

dilihat pada Lampiran 6, akan tetapi untuk

mendapatkan model yang dapat diterima maka

perlu dicari model lain yang memiliki nilai R2

lebih besar dengan standar deviasi yang kecil

model tersebut adalah model kubik (Aliased)

dengan nilai R2 sebesar 0.9709 dengan standar

deviasi 0.21.

13

Analisis sidik jari yang dilakukan

berdasarkan jumlah pita terbanyak yang

diharapkan dari Tabel 7 adalah JBP 70% tua

dengan rancangan komposisi pelarut fase

gerak kloroform dan etil asetat dengan

perbandingan (0.6:0.4) dan jumlah pita yang

diharapkan terbanyak 8. Persamaan regresi

yang didapat dari JBP 70% tua dengan

menggunakan model kubik adalah y = –

0.015A + 0.990B + 1.99C + 29.94 B +

3.94AC + 1.94BC – 83.65ABC berdasarkan

persamaan tersebut telihat interaksi yang

sinergis antara komponen kloroform (A)

dengan komponen etil asetat (B) yang dapat

terlihat dari nilai koefisien yang terbesar dan

bernilai positif, yaitu 29.94 hasil analisis

statistik ANOVA model kubik selengkapnya

dari model persamaan tersebut dapat dilihat

pada Lampiran 7.

Tabel 7 Komposisi optimum dari fase gerak

daun jambu biji putih

Sampel JBP 70% muda JBP 96% muda

Kloroform 0.7 bagian 0.7 bagian

Etil asetat 0.3 bagian 0.3 bagian Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian

R2 0.9709 0.9994

Pita yang diharapkan

7 5

Sampel JBP 70% tua JBP 96% tua

Kloroform 0.6 bagian 0.7 bagian

Etil asetat 0.4 bagian 0.3 bagian Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian

R2 0.9709 0.9994

Pita yang

diharapkan 8 6

Tabel 8 Komposisi optimum dari fase gerak

daun jambu biji merah

Sampel JBM 70% muda JBM 96%

muda

Kloroform 0.4 bagian 0.6 bagian

Etil asetat 0.6 bagian 0.4 bagian

Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian R2 0.9355 0.9996

Pita yang

diharapkan 4 4

Sampel JBM 70% tua JBM 96% tua

Kloroform 0.7 bagian 0.8 bagian

Etil asetat 0.3 bagian 0.2 bagian

Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian R2 0.9853 1.0000

Pita yang

diharapkan 12 6

Sampel daun jambu biji merah setelah

dilakukan optimasi dengan DX 7 didapatkan

model yang disarankan adalah linier dengan

nilai R2 sebesar 0.5363 dengan nilai standar

deviasi 1.73 hasil selengkapnya mengenai

analisis ANOVA dari model linier dapat

dilihat pada Lampiran 8 akan tetapi, untuk

mendapatkan model yang dapat diterima maka

perlu dicari model lain yang memiliki nilai R2

lebih besar dengan standar deviasi yang kecil,

model yang digunakan untuk mendapatkan

hasil yang optimum diantaranya kuadratik dan

kubik (Aliased). Model kuadratik memiliki

nilai R2

sebesar 0.7534 dengan standar deviasi

sebesar 1,72 (Lampiran 9) dan untuk model

kubik didapatkan nilai R2 sebesar 0.9853

dengan standar deviasi sebesar 0.84

(Lampiran 10). Berdasarkan nilai R2

dan

standar deviasi maka model yang digunakan

pada penelitian ini adalah model kubik

(Aliased).

Analisis sidik jari yang dilakukan

berdasarkan jumlah pita terbanyak yang

diharapkan dari Tabel 8 adalah JBM 70% tua

dengan rancangan komposisi pelarut fase

gerak kloroform dan etil asetat dengan nisbah

(0.7:0.3) dan jumlah pita yang diharapkan

sebanyak 12. Persamaan regresi yang didapat

dari JBM 70% tua dengan menggunakan

model kubik (Aliased) adalah y = 5.94A +

3.94B + 0.94C + 11.76AB –6.29AC + 6.24BC

– 28.59ABC berdasarkan persamaan tersebut

telihat interaksi sinergis antara komponen

kloroform (A) dengan komponen etil asetat

(B) yang dapat terlihat dari nilai koefisien

yang besar dan bernilai positif, yaitu 5.94,

3.94, 11.76.

Tabel 9 Komposisi optimum dari fase gerak

daun jambu biji 7

Sampel JB7 70% muda JB7 96% muda

Kloroform 0.8 bagian 0.8 bagian

Etil asetat 0.2 bagian 0.2 bagian Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian

R2 0.9835 0.9469

pita yang diharapakan

6 8

Sampel JB7 70% tua JB7 96% tua

Kloroform 0.7 bagian 0.8 bagian

Etil asetat 0.3 bagian 0.2 bagian Metanol 0.0 bagian 0.0 bagian

R2 0.9940 0.9871

Pita yang diharapkan

7 5

Sampel daun jambu biji kode 7 setelah

dilakukan optimasi dengan DX 7 didapatkan

model yang disarankan adalah linier dengan

nilai R2 sebesar 0.1194 dan nilai standar

deviasi 1.34 hasil selengkapnya mengenai

analisis ANOVA dari model linier dapat

dilihat pada Lampiran 11 akan tetapi, untuk

mendapatkan model yang dapat diterima maka

perlu dicari model lain yang memiliki nilai R2

lebih besar dengan standar deviasi yang kecil

model yang digunakan untuk mendapatkan

hasil yang dapat diterima diantaranya

14

kuadratik dan kubik (Aliased). Model

kuadratik memiliki nilai R2

sebesar 0.2234

dengan standar deviasi sebesar 1,74

(Lampiran 12) dan untuk model kubik

didapatkan nilai R2 sebesar 0.9469 dengan

standar deviasi sebesar 0.91 (Lampiran 13).

Berdasarkan nilai R2

dan standar deviasi maka

model yang digunakan pada penelitian ini

adalah model kubik (Aliased).

Analisis sidik jari yang dilakukan

berdasarkan pita jumlah terbanyak yang

diharapkan dari (Tabel 9) adalah JB7 96%

muda dengan rancangan komposisi pelarut

fase gerak kloroform dan etil asetat dengan

nisbah (0.8:0.2) dan pita yang diharapkan

sebanyak 8 pita. Persamaan regresi yang

didapat dari JB7 96% muda dengan

menggunakan model kubik adalah y = 2.94A

+ 3.94B + 0.94C + 5.75AB – 0.25AC +

1.75BC – 26.47ABC berdasarkan persamaan

tersebut telihat interaksi sinergis antara

komponen kloroform (A) dengan komponen

etil asetat (B) yang dapat terlihat dari nilai

koefisien yang besar dan bernilai positif, yaitu

2.94, 3.94, 5.75.

Sidik Jari Ekstrak Daun Jambu Biji

Profil sidik jari KLT yang terbentuk dari

sampel JBP 70% tua dengan fase gerak

kloroform dan etil asetat (0.6:0.4) yang

divisualisasi dengan cahaya UV 366 dan 254

nm dari empat kali pengulangan dapat terlihat

pada Gambar 10 menghasilkan jumlah pita

sebanyak 5 pita yang terpisah, hal itu

didukung pula dengan densitogram hasil dari

Image J menghasilkan jumlah kurva sebanyak

5 (Gambar 11).

Gambar 10 Kromatogram JBP 70% daun tua

(a) ulangan ke-1 pada 254 nm (b) ulangan ke-2 pada 254 nm (c) ulangan ke-1pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada

366 nm.

Gambar 11 Densitogram JBP 70% daun tua

(a) ulangan ke-1 pada 366 nm (b) ulangan ke-1 pada 366

nm (c) ulangan ke-1 pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada 366 nm.

Densitogram yang dihasilkan dihitung

nilai Rf dan area dari masing-masing puncak

untuk memberikan informasi yang

menyeluruh mengenai sidik jari dari JBP 70%

tua mengenai informasi tersebut dapat dilihat

pada Lampiran 14.

Profil sidik jari KLT yang terbentuk dari

sampel JBM 70% tua dengan fase gerak

klroroform dan etil asetat (0.7:0.3) dengan

visualisasi cahaya UV 366 dan 254 nm dari

empat kali pengulangan dapat dilihat pada

Gambar 12 menghasilkan jumlah pita

sebanyak 6 pita yang terpisah, hal itu

didukung pula dengan densitogram hasil dari

Image J menghasilkan jumlah kurva sebanyak

6 (Gambar 13).

Gambar 12 Kromatogram JBM 70% daun tua

(a) ulangan ke-1 pada 254 nm (b) ulangan ke-2 pada 254 nm (c) ulangan ke-1 pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada

366 nm.

d c

a b

(a) (b)

254 nm

(c) (d)

366 nm

(a) (b)

254 nm

(a) (b)

366 nm

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Au

300

200

175

150

100

50

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Rf Rf

Au

300

200

175

150

100

50

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Au 300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50 Rf Rf

5

4

3

1

2

4

2

5

3 1

1

2

3

4

5

1

2

3

4 5

15

Gambar 13 Densitogram JBM 70% daun tua

(a) ulangan ke-1 pada 366 nm (b) ulangan ke-1 pada 366 nm (c) ulangan ke-1 pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada

366 nm.

Densitogram yang dihasilkan dihitung

nilai Rf dan area dari masing-masing puncak

untuk memberikan informasi yang

menyeluruh mengenai sidik jari dari JBM

70% tua informasi tersebut dapat dilihat pada

Lampiran 14.

Profil sidik jari KLT yang terbentuk dari

sampel JB7 70% muda dengan fase gerak

kloroform dan etil asetat (0.8:0.2) dengan

visualisasi cahaya UV 254 dan 366 nm dari

empat kali pengulangan dapat dilihat pada

Gambar 14 menghasilkan jumlah pita

sebanyak 5 pita yang terpisah, hal tersebut

didukung pula dengan densitogram hasil dari

Image J menghasilkan jumlah kurva sebanyak

5 (Gambar 15).

Gambar 14 Kromatogram JB7 96% daun

muda

(a) ulangan ke-1 pada 254 nm (b) ulangan ke-2 pada 254

nm (c) ulangan ke-1 pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada

366 nm

Gambar 15 Densitogram JB7 96% daun muda

(a) ulangan ke-1 pada 366 nm (b) ulangan ke-1 pada 366

nm (c) ulangan ke-1 pada 366 nm (d) ulangan ke-2 pada

366 nm.

Densitogram yang dihasilkan dihitung nilai Rf

dan area dari masing-masing puncak untuk

memberikan informasi yang menyeluruh

mengenai sidik jari dari JB7 96% muda

batang informasi tersebut dapat dilihat pada

Lampiran 14. Hasil sidik jari dari pita kromatogram dan

densitogram berbeda dengan yang diharapkan

dari optimasi dengan piranti lunak design

expert 7, hal ini dikarenakan banyak faktor

diantaranya fase gerak yang tidak mengelusi

sempurna KLT, model reancangan yang

digunakan tidak dapat diterima, posisi

penempatan lempeng KLT yang miring, dan

ekstrak dari daun jambu biji yang sudah lama.

d c

b a

d

a b

c

(a) (b)

254 nm

(c) (d)

366 nm

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Rf Rf

Rf Rf

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Au

300

200

175

150

100

50

Rf

Rf

Rf

Rf

5

1

3

4

2

6

1

2

3

4

5

6

1

2

5

3

4 6

1

2 3

4

5

1

4

3 2

5 5

2 3

4

1

1 2 3

4

5

1

2

3

4 5

16

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Berdasarkan aktivitas antioksidan yang

dilihat dari nilai IC50 terendah sampel daun

jambu biji putih memiliki aktivitas

antioksidan terbaik dibanding daun jambu biji

merah dan JB7, daun jambu biji yang

dimaserasi dengan metanol 70% memiliki

aktivitas antioksidan terbaik dibanding yang

dimaserasi dengan metanol 96%, dan daun

jambu biji bagian muda memiliki aktivitas

antioksidan terbaik dibandingkan daun jambu

biji bagian tua.

Berdasarkan pola sidik jari yang dilihat

dari tinggi kurva densitogram dan

keterpisahan pita kromatogram hasil analisis

dengan DE-TLC daun jambu biji bagian tua

memiliki pola sidik jari lebih baik dibanding

daun jambu biji muda, daun jambu biji yang

dimaserasi dengan metanol 70% memiliki

pola sidik jari terbaik dibanding yang

dimaserasi dengan metanol 96%, dan daun

jambu biji putih dengan jambu biji merah

memiliki pola sidik jari lebih baik dari JB7.

Fase gerak optimum untuk semua sampel

adalah klroroform dan etil asetat dengan

berbagai nisbah.

Profil sidik jari untuk JBP, JBM, dan JB7

ditunjukkan dengan jumlah pita yang terpisah

dari KLT dan kurva densitometer secara

berurutan sebanyak 5 pita dan 5 kurva, 6 pita

dan 6 kurva, 5 pita dan 5 kurva.

Saran

Perlu dilakukan proses optimasi terhadap

analisis sidik jari dan proses validasi terhadap

metode DE-TLC untuk mendapatkan hasil

analisis terbaik.

DAFTAR PUSTAKA

Anderson VL, McLean RA. 1974. Design of

Experiments. New York: Marcel Dekker.

[AOAC] Association of Offical Analytical

Chemistry. 1971. Official Methods Of

Analysis of AOAC International 971.28.

Meyrland: AOAC International.

Blois MS. 1958. Antioxidant determinations

by the use of a stable free radical. Nature

181: 1199-1200.

Borges CN, Bruns RE, Almeida AA,

Scarminio IS. 2007. Mixture design for the

Fingerprint optimization of

chromatographic mobile phases and

extraction solutions for Camellia sinensis.

Analytica Chimica Acta 595:28-37.

[BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan.

2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat

Indonesia. Jakarta: BPOM RI.

Braithwaite A, Smith FJ. 1999.

Chromatographic Method. Netherlands:

Kluwer Academic.

Brereton RG. 2005. Chemometrics Data

Analysis for the Laboratory and Chemical

Plant. England: John and Wiley.

Cie´sla L, Hajnos MW. 2009. Two-

dimensional thin-layer chromatography in

the analysis of secondary plant

metabolites. J Chromatogr 1216:1035–

1052.

Delaroza F, Scarminio IS. 2008. Mixture

design optimization of extraction and

mobile phase media for fingerprint

analysis of Bauhinia variegate L. J

Separation Sci 31:034-1041.

Fernand VE. 2003. Initial characterization of

crude extracts from phyllanthus amarus

schum, and Thonn, and Quassia amara L.

using normal phase thin layer

chromatography [tesis]. Lousiana:

Program Pascasarjana, University of

Suriname.

Ghiselli A, Nardini M, Baldi A, Scaccini C.

1998. Antioxidant activity of different

phenolics fractions separated from an

Italian Red Wine. J Agri Food Chem.

(46):367.

17

Gill MI, Tomas FAB, Pierce BH, Kader AA.

2002. Antioxidant capacities, phenolic

compounds, peach, and Plum cultivars from

California. J Agri Food Chem. (50):4976-

82.

Gritter R, Bobbitt JM, Schwating AE. 1991.

Pengantar Kromatografi. Padmawinata K,

penerjemah. Bandung: Penerbit ITB.

Terjemahan dari: Introduction to

Chromatography.

Harbone JB. 1987. Metode fitokimia.

Padmawinata K, Soediro I, penerjemah;

Niksholihin S, editor. Bandung: penerbit

ITB. Terjemahan dari: Phytochemical

Method.

Harnly et al. 2006. Flavonoid content of U.S.

fruits, vegetables, and nuts. J Agri Food

Chem 54: 9966-9977.

Hess AV. 2007. Digitally enhanced thin-layer

chromatography:an inexpensive, new

technique for qualitative and quantitative

analysis. J Chem Edu. (84):842-847.

Indriani S. 2006. Aktivitas antioksidan ekstrak

daun jambu biji (Pisidium guajava L.). J.II.

Pert. Indon. (11) :13-17.

Inayati. 2007. Validasi metode analisis

analisis polifenol pada ekstrak daun jambu

biji secara spektrofotometri. [skripsi].

Departemen Kimia, FMIPA, IPB, Bogor.

Khanpara K et al. 2010. Isolation and

quantification of nirgundoside in vitex

nirgundo Linn. leaf powder by HPTLC

method. Int J Pharma Biomed Reskh 2:90-

95.

Khopkar. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik.

Saptorahadrjo, penerjemah. Jakarta:UI

press. Terjemahan dari: Basic Concept Of

Analytical Chemistry.

Kramer RE. 1985. Antioxidants in clove. J

Am Oil Chemist’s Society 62:111-113.

Li, Chen. 2008. Analysis of Three Flavonoids

in Oxytropis kansuensis Bunge by RP-LC–

DAD Coupled with Weighted Least-

Squares Linear Regression. J Chromatogr

[terhubung berkala]. http://www.springerimages.com/Images/C

hemistry/1-10.1365_s10337-008-0793-1-2

[13 Oct 2011].

Liang XM et al. 2009. Qualitative and

quantitative analysis in quality control of

traditional Chinese medicines. J

Chromatogr A 1216: 2033-2044.

Markham KR. 1988. Cara Mengidentifikasi

Flavonoid Padmawinata K. penerjemah.

Bandung: penerbit ITB. Terjemahan dari:

Techniques of Flavonoid Identification.

Mariswamy Y, Gnaraj W E, M Jhonson.

2011. Chromatographic finger print

analysis of steroids in Aerva lanata L by

HPTLC technique. Asian Pacific J

Tropical Biomed. 428-433.

Molyneux P. 2004. The use of the stable free

radical diphenylpicrilhydrazil (DPPH) for

estimating antioxidant activity. J Sci

Technol 26:211-219

Mulyono MW, Supriyatna, Wiraharja T,

Sumiwi SA. 1994. Studi Fitokimia Fraksi

Antidiare Daun Jambu Biji (Pisidium

guajava L.). Laporan Penelitian Lembaga

Penelitian UNPAD, Bandung.

Pokorni J, Yanishlieva N, Gordon M. 2001.

Antioxidant in food; Practical applications.

New York: CRC Press.

Qian H et al. 2004. Antioxidant power of

phytochemicals from psidium guajava leaf.

J Zhejiang Univ Sci 5: 676-683.

Robinson T. 1995. Kandungan Organik

Tumbuhan Tinggi. K Padmawinata,

penerjemah Bandung: ITB. Terjemahan

dari: The Organic Constituents of Higher

Plants 6th

edition.

Rohman A, Riyanto S, Utari D. 2006.

Aktivitas antioksidan, kandungan fenolik

total dan kandungan flavonoid total

ekstrak etil asetat buah mengkudu serta

fraksi-fraksinya. Majalah Farmasi

Indonesia 17:136-142.

Rohman A, Riyanto S, Dahliyanti R, Pratomo

DB. 2009. Penangkapan radikal 2,2-

difenil-1-pikril hidrazil oleh ekstrak buah

Psidium guajava L dan Averrhoa

carambola L. J Ilmu Kefarmasian

Indonesia 7:1-5.

Roy Ck, Das Ak. 2010. Comparative

evaluation of different extracts of leaves of

Psidium Guajava Linn. For

hepatoprotective activity. J Pharm Sci. 23

15-20.

18

Scheffe H. 1963. Simplex-centroid designs

for experiments with mixtures. J R Statist

Soc B 25: 235-263.

Shui GH, Leong LP. 2004. Analysis of

polyphenolics antioxidants in star fruit

using liquid chromatography and mass

spectrometry. J Chromatogr A. 1022: 67-

75.

[SK MenKes] Surat Keputusan Menteri

Kesehatan Republik Indonesia. 1994.

Keputusan Menteri Kesehatan Republik

Indonesia Nomo 661/Menkes/Sk/VII/1994

Tentang Persyaratan Obat Tradisional.

Jakarta.

Snyder LR, Kirland JJ.1979. Introducing to

Modern Liquid Chromatography. New

York: Wiley.

Sudarsono, Gunawan D, Wahyuono S,

Argodonatus I, Untoro P. 2001. Tanaman

obat II: Hasil penelitian, sifat-sifat, dan

penggunaannya. Yogyakarta: Pusat Studi

Obat Tradisional UGM. Hal. 156-60.

Stahl E. 1985. Analisis Obat Secara

Kromatografi dan Mikroskopi. K

Padmawinata, penerjemah. Bandung: ITB.

Terjemahan dari: Drug Analysis by

Chromatography.

Stoenoiu CE, Bolboaca SD, Jantschi L. 2006.

Mobile phase optimization method for

steroid separation. Applied Medical

Informatics 18 (1,2): 17-24.

Wahyuni WT. 2010. Pengoptimuman dan

validasi sidik jari kromatografi cair kinerja

tinggi ekstrak phyllanthus niruri L. [Tesis].

Departemen Kimia, Pasca Sarjana, IPB,

Bogor.

Widjaja S.1997. antioksidan: Pertahanan

Tubuh Terhadap Efek Oksidan dan

Radikal Bebas. Majalah Ilmu Fakultas

Kedokteran USAKTI. 16: 1659-1672.

Wijayakusuma H. 2000. Potensi tumbuhan

obat asli Indonesia sebagai produk

kesehatan. Prosiding Risalah Pertemuan

Ilmiah Penelilian dan Pengembangan

Teknologi Isotop dan Radiasi, HPTAI.

Jakarta.

19

LAMPIRAN

20

Lampiran 1 Bagan kerja penelitian

Persiapan bahan daun Jambu menjadi serbuk daun jambu biji

Menentukan kadar air dari daun jambu biji

Penghilangan lemak dengan maserasi menggunakan heksana

Maserasi dengan metanol 96 dan 70%

Evaporasi sampai 1/10 volume awal

Hidrolisis ekstrak metanol 96 dan 70% dengan HCl 2N 100°C 30 menit

Partisi dengan etil asetat sebanyak 2 kali

Uji fitokimia golongan flavonoid

Pemilihan eluen terbaik dengan SCD

Penotolan dengan KLT aplikator

Optimasi pelarut dengan bantuan DX 7

Elusi dengan pelarut hasil optimasi

Penampakan hasil KLT pada UV 366, 254 nm dan Diolah dengan Image J

Pengujian aktivitas antioksidan metode DPPH

21

Lampiran 2 Kode sampel dan data kadar air daun jambu biji

Kode sampel daun jambu biji

Kode Sampel Keterangan

JBP 96% muda

JBP 96% tua

JBP 70% muda

JBP 70%% tua

JBM 96%% muda

JBM 96% tua

JBM 70% muda

JBM 70% tua

JB7 96% muda

JB7 96% tua

JB7 70% muda

JB7 70% tua

Daun jambu biji putih bagian muda dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji putih bagian tua dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji putih bagian muda dimaserasi dengan metanol 70%

Daun jambu biji putih bagian tua dimaserasi dengan metanol 70%

Daun jambu biji merah bagian muda dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji merah bagian tua dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji merah bagian muda dimaserasi dengan metanol 70%

Daun jambu biji merah bagian tua dimaserasi dengan metanol 70%

Daun jambu biji 7 bagian muda dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji 7 bagian tua dimaserasi dengan metanol 96%

Daun jambu biji 7 bagian muda dimaserasi dengan metanol70%

Daun jambu biji 7 bagian tua dimaserasi dengan metanol 70%

Data dan perhitungan kadar air

Sampel Bobot awal

(g)

Setelah dikeringkan

(g)

Cawan kosong

(g)

Kadar air

(%)

JBP tua 3,0345 4,6766 1,9192 9,13

JBP muda 3,0500 4,7134 1,9799 10,30

JBM tua 3,0374 4,7332 1,9556 9,40

JBM muda 3,0252 4,6863 1,9742 10,19

JB7 tua 3,2135 4,8047 1,8933 9,40

JB7 muda 3,0975 4,7906 1,8979 10,70

Contoh perhitungan:

Kadar air JBP Tua = Χ100%a

c)(ba

Kadar air JBP Tua = 9.13%x100%3.0345

1.9192)(4.67663.0345

22

% 0.37 100% x 1.103 x 75.0315

0.2550 100% x KoreksiFaktor x

SampelBobot

EkstrakBobot

% 3.30 100% x 1.103 x 75.6052

2.2639 100% x KoreksiFaktor x

SampelBobot

EkstrakBobot

103.1100

30.10100

100

100

kadarair

% 0.37 100% x 1.103 x 75.0315

0.2550 100% x KoreksiFaktor x

SampelBobot

EkstrakBobot

Lampiran 3 Hasil maserasi dengan metanol 96% dan 70%

Bobot awal sampel maserasi metanol 96% dan 70%

Rendemen dari maserasi dengan metanol 96 %

JBP Tua JBM Tua JB7 Tua JBP Muda JBM Muda JB7 Muda Rerata

Vial Kosong ±36.7664 g

Vial Setelah

Rotav 38.8222 g 36.4566 g 39.0594 g 39.0303 g 38.3920 g 38.3734

Ekstrak etil

asetat 2.0558 g 0.3098 g 2.2930 g 2.2639 g 1.6256 g 1.6070 g

Rendemen 2.98% 0.45% 3.33% 3.30% 2.38% 2.36% 2.46%

Contoh Perhitungan

Faktor koreksi =

Rendemen =

Rendemen dari maserasi dengan metanol 70%

JBP B JBM B JB7 B JBP A JBM Muda JB7 Muda Rerata

Vial

Kosong

36.6142 g 37.1634 g 36.8882 g 36.4446 g 37.0968 g 36.3911 g

Vial

Setelah

Rotav

36.9442 g 37.4372 g 37.1850 g 36.6996 g 37.8452 g 36.5592 g

Ekstrak etil

asetat

0.3300 g 0.2738 g 0.2968 g 0.2550 g 0.7484 g 0.1681 g

Rendemen 0.37% 0.40% 0.43% 0.37% 1.09% 0.25% 0.50%

Contoh Perhitungan:

Faktor koreksi =

Rendemen =

Bobot sampel JBP Tua JBM Tua JB7 Tua JBP Muda JBM Muda JB7 Muda

Untuk

maserasi 96% 75.3477 g 75.1620 g 75.2464 g 75.6052 g 75.2239 g 75.3956 g

Untuk

maserasi 70% 75.0909 g 75.2219 g 75.0243 g 75.3025 g 75.6207 g 75.4734 g

23

Lampiran 4 Data dan perhitungan IC50 dari seluruh sampel

Nilai IC50 daun jambu hasil maserasi dengan metanol 96%

sampel Konsentrasi

(ppm)

absorbansi % Inhibisi Persamaan Garis IC50 Sampel+DPPH Tanpa DPPH

JB7 96%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,917

0,493

0,149

0,201

0,220

0,000

0,019

0,048

0,069

0,107

-

75,27

94,73

93,11

94,10

Y=32lnx+77,04 2,63

JBM

96%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,917

0,542

0,127

0,133

0,156

0,000

0,009

0,022

0,039

0,053

-

72,20

94,52

95,10

94,62

Y=39lnx+74,09 3,47

JBP 96%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,917

0,805

0,128

0,135

0,146

0,000

0,010

0,025

0,046

0,068

-

58,52

94,63

95,36

95,93

Y=64lnx+61,43 6,48

JBP 96%

tua

Blanko

10

30

50

70

1,917

1,432

0,449

0,172

0,168

0,000

0,017

0,030

0,056

0,095

-

73,81

78,14

93,95

96,19

Y=119lnx+27,90 15,98

JBM

96% tua

Blanko

10

30

50

70

1,917

0,959

0,147

0,121

0,110

0,000

0,008

0,010

0,021

0,027

-

50,39

92,85

94,78

95,67

Y=77,47lnx+51,94 9,00

JB7 96%

tua

Blanko

10

30

50

70

1,917

1,827

1,279

0,770

0,421

0,000

0,007

0,020

0,019

0,045

-

5,06

34,32

60,82

80,39

Y=116lnx+0,65 33,86

24

Nilai IC50 daun jambu biji hasil maserasi dengan metanol 70%

sampel Konsentrasi

(ppm)

absorbansi % Inhibisi Persamaan Garis IC50 Sampel+DPPH Tanpa DPPH

JB7 70%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,886

0,805

1,131

0,126

0,134

0,000

0,019

0,048

0,069

0,107

-

58,32

95,60

96,98

98,57

Y=78lnx+53,61 9,00

JBM

70%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,886

0,930

0,159

0,132

0,137

0,000

0,009

0,022

0,039

0,053

-

51,17

92,74

95,81

95,55

Y=74lnx+54,30 8,78

JBP 70%

muda

Blanko

10

30

50

70

1,886

0,256

0,125

0,119

0,131

0,000

0,010

0,025

0,046

0,068

-

86,96

94,70

96,13

96,66

Y=12lnx+87,13 1,12

JBP 70%

tua

Blanko

10

30

50

70

1,886

1,083

0,123

0,124

0,130

0,000

0,017

0,030

0,056

0,095

-

43,48

95,07

96,39

96,14

Y=89lnx+47,30 10,73

JBM

70% tua

Blanko

10

30

50

70

1,886

0,975

0,148

0,130

0,133

0,000

0,008

0,010

0,021

0,027

-

48,73

92,68

94,22

94,38

Y=77lnx+51,94 9,45

JB7 70%

tua

Blanko

10

30

50

70

1,886

1,592

0,988

0,337

0,128

0,000

0,007

0,020

0,019

0,045

-

94,38

48,67

83,14

95,60

Y=126lnx+11,57 22,65

25

% 26.19X100%917.1

0.017-1.432-1Tua 96% JBP ppm Inhibisi10Persen

X100%Blanko Abs

DPPH) tanpasampel (Abs -DPPH)dengan sampel (Abs1Tua 96% JBP ppm 10 InhibisiPersen

0.9619Sequare R

27.90 ln x 119 y

Contoh perhitungan untuk JBP 96% tua

Persamaan garis Y=119lnx+27.90

persen penangkapan dibuat menjadi 50%

50 =119lnx+27.90

Ant Ln x = 0.186

X = 1.204

Ant Log 1.204 = 15.98

IC50 = 15.98 ppm

%

inhibisi

Log Konsentrasi

26

Lampiran 5 Jumlah pita dan nilai Rf berdasarkan rancangan SCD

Sampel Pelarut Komposisi Jumlah pita Rf

JBM 70% tua

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10)

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

6

4

1

8

2

4

3

1

3

0,67

0,19;0,31;0,42;0,5;0,6;0,75

0,38;0,54;0,66;0,75

0,69

0,18;0,31;0,41;0,50;0,55;0,61;0,69;0,75

0,60;0,75

0,46;0,56;0,66;0,73

0,50;0,73;0,81

0,69

0,60;0,85;0,91

JB7 70% tua

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10)

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

3

3

1

6

2

4

2

2

2

0,75

0,22;0,35;0,44

0,13;0,53;0,81

0,69

0,13;0,35;0,51;0,69,0,78;0,84

0,54;0,73

0,1;0,43;0,56;0,66

0,12;0,69

0,69;0,63

0,6;0,8

JBP 70% tua

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10)

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

2

-

1

2

8

2

3

2

2

2

0,75;0,88

-

0,74

0,65;0,71

0,21;0,43;0,54;0,61;0,69;0,78;0,83;0,91

0,56;0,74

0,13;0,44;0,66

0,63;0,73

0,72;0,81

0,66;0,79

JBM 96% tua

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

2

4

2

2

5

1

2

3

2

2

0,71;0,81

0,23;0,29;0,53;0,94

0,75;0,84

0,73;0,81

0,31;0,55;0,66;0,79;0,88

0,79

0,5;0,69

0,5;0,73;0,79

0,73;0,81

0,56;0,75

27

JB7 96% tua Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

2

1

1

3

1

3

2

1

2

0,63

0,25;0,94

0,13

0,63

0,53;0,63;0,75

0,7

0,06;0,32;0,63

0,68;0,85

0,75

0,53;0,88

JBP 96% tua

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10 )

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

2

-

2

2

5

1

1

2

1

1

0,75;0,88

-

0,69;0,8

0,73;0,89

0,29;0,53;0,66;0,81;0,9

0,85

0,78

0,83;0,9

0,94

0,86

28

Sampel Pelarut Komposisi Jumlah pita Rf

JBM 70% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

2

3

3

1

4

2

1

2

2

2

0,44;0,56

0,13;0,16

0,58;0,76;081

0,56

0,38;0,41;0,81;0,96

0,54;0,66

0,75

0,63;0,79

0,73;0,85

0,75;0,88

JB7 70% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

5

1

-

4

-

2

3

2

2

0,69

0,06;0,1;0,16;0,25;0,56

0,88

-

0,5;0,65;0,86;0,91

-

0,69;0,88

0,25;0,78;0,84

0,79;0,85

0,58;0,81

JBP 70% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

-

1

3

-

5

3

5

3

2

3

-

0,5

0,56;0,69;0,78

-

0,19;0,39;0,44;0,64;0,88

0,69;0,79;0,88

0,21;0,5;0,66;0,81;0,88

0,25;0,75;0,85

0,69;0,79

0,56;0,69;0,75

JBM 96% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

3

1

1

4

1

1

3

2

2

0,58

0,06;0,13;0,2

0,85

0,84

0,06;0,31;0,75;0,85

0,84

0,66

0,50;0,76;0,88

0,73;0,81

0,48;0,73

29

JB7 96% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10)

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

1

3

4

3

5

2

2

4

1

3

0,63

0,23;0,29;0,55

0,41;0,71;0,8;0,88

0,55;0,73;0,81

0,29;0,5;0,65;0,78;0,88

0,75;0,88

0,59;0,83

0,41;0,66;0,75;0,81

0,69

0,49;0,69;0,81

JBP 96% Muda

Metanol (MET) (1)

Klrofoam (CL) (2)

etil asetat (EA) (3)

EA:MET (4)

CL:EA (5)

CL:MET (6)

CL:EA:MET (7)

CL:EA:MET (8)

CL:EA:MET (9)

CL:EA:MET (10

TUNGGAL

TUNGGAL

TUNGGAL

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(1/2:1/2)

(2/3:1/6:1/6)

(1/6:1/6:2/3)

(1/6:2/3:1/6)

(1/3:1/3:1/3)

2

1

2

1

4

1

2

3

1

2

0,49;0,5

0,25

0,44;0,73

0,66

0,23;0,38;0,81;0,91

0,63

0,69;0,81

0,44;0,68;0,79

0,54

0,66;0,75

30

Lampiran 6 ANOVA model kuadratik JBP 70% tua

Sum of Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 32.28 5 6.46 3.18 0.1424

Kuadratic Mixture 1.44 2 0.72 0.36 0.7206

AB 30.17 1 30.17 14.87 0.0182

AC 0.023 1 0.023 0.011 0.9200

BC 0.59 1 0.59 0.29 0.6193

Residua l 8.12 4 2.03

Cor Total 40.40 9

Std. Dev. 1.42 R-Squared 0.7991

Mean 2.40 Adj R-Squared 0.5480

C.V. % 59.35 Pred R-Squared -1.5757

PRESS 104.06 Adeq Precision 5.820

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-clorofom 0.25 1 1.37 -3.57 4.06 1.96

B-etil asetat 0.88 1 1.37 -2.93 4.70 1.96

C-metanol 2.34 1 1.37 -1.47 6.15 1.96

AB 24.41 1 6.33 6.84 41.99 1.98

AC -0.68 1 6.33 -18.26 16.90 1.98

BC -3.40 1 6.33 -20.98 14.17 1.98

31

Lampiran 7 ANOVA model kubik JBP 70% tua

Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 40.36 8 5.04 114.34 0.0722

Cubic Mixture 1.44 2 0.72 16.37 0.1722

AB 37.48 1 37.48 849.45 0.0218

AC 0.65 1 0.65 14.72 0.1623

BC 0.16 1 0.16 3.57 0.3099

ABC 6.80 1 6.80 154.10 0.0512

AB(A-B) 1.23 1 1.23 27.82 0.1193

AC(A-C) 0.55 1 0.55 12.36 0.1764

BC(B-C) 0.000 0

Residual 0.044 1 0.044

Cor Total 40.40 9

Std. Dev. 0.21 R-Squared 0.9989

Mean 2.40 Adj R-Squared 0.9902

C.V. % 8.75 Pred R-Squared 0.1433

PRESS 34.61 Adeq Precision 40.074

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-clorofom -0.015 1 0.21 -2.68 2.65 2.10

B-etil asetat 0.99 1 0.21 -1.68 3.65 2.10

C-metanol 1.99 1 0.21 -0.68 4.65 2.10

AB 29.94 1 1.03 16.89 42.99 2.40

AC 3.94 1 1.03 -9.11 16.99 2.40

BC 1.94 1 1.03 -11.11 14.99 2.40

ABC -83.65 1 6.74 -169.27 1.97 2.47

AB(A-B) 18.00 1 3.41 -25.36 61.36 1.63

AC(A-C) -12.00 1 3.41 -55.36 31.36 1.63

BC(B-C) ALIASED AB(A-B), AC(A-C)

32

Lampiran 8 ANOVA model linear JBM 70% tua

Sum of Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 27.11 2 13.56 4.52 0.0549

Linear Mixture 27.11 2 13.56 4.52 0.0549

Residual 20.99 7 3.00

Cor Total 48.10 9

Std. Dev. 1.73 R-Squared 0.5636

Mean 3.30 Adj R-Squared 0.4390

C.V. % 52.47 Pred R-Squared 0.2380

PRESS 36.65 Adeq Precision 6.326

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-clorofom 6.19 1 1.28 3.17 9.21 1.15

B-etil asetat 3.52 1 1.28 0.50 6.54 1.15

C-metanol 0.19 1 1.28 -2.83 3.21 1.15

33

Lampiran 9 ANOVA model kuadratik JBM 70% tua

Sum of Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 36.24 5 7.25 2.44 0.2036

Kuadratic Mixture 27.11 2 13.56 4.57 0.0927

AB 3.70 1 3.70 1.25 0.3268

AC 2.29 1 2.29 0.77 0.4291

BC 3.09 1 3.09 1.04 0.3648

Residual 11.86 4 2.97

Cor Total 48.10 9

Std. Dev. 1.72 R-Squared 0.7534

Mean 3.30 Adj R-Squared 0.4450

C.V. % 52.19 Pred R-Squared -3.8583

PRESS 233.68 Adeq Precision 4.634

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-clorofom 5.91 1 1.66 1.30 10.52 1.96

B-etil asetat 3.36 1 1.66 -1.25 7.98 1.96

C-metanol 1.73 1 1.66 -2.88 6.34 1.96

AB 8.55 1 7.66 -12.71 29.80 1.98

AC -6.73 1 7.66 -27.98 14.53 1.98

BC -7.82 1 7.66 -29.07 13.44 1.98

34

Lampiran 10 ANOVA model kubik JBM 70% tua

Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 47.39 8 5.92 8.39 0.2611

Cubic Mixture 27.11 2 13.56 19.20 0.1593

AB 5.79 1 5.79 8.20 0.2139

AC 1.63 1 1.63 2.30 0.3710

BC 1.63 1 1.63 2.30 0.3710

ABC 0.79 1 0.79 1.12 0.4813

AB(A-B) 6.68 1 6.68 9.47 0.2001

AC(A-C) 8.73 1 8.73 12.36 0.1764

BC(B-C) 0.000 0

Residual 0.71 1 0.71

Cor Total 48.10 9

Std. Dev. 0.84 R-Squared 0.9853

Mean 3.30 Adj R-Squared 0.8679

C.V. % 25.46 Pred R-Squared -10.5131

PRESS 553.78 Adeq Precision 8.782

Coefficient Standard 95% CI 95% CI

Component Estimate df Error Low High VIF A-clorofom 5.94 1 0.84 -4.71 16.59 2.10

B-etil asetat 3.94 1 0.84 -6.71 14.59 2.10

C-metanol 0.94 1 0.84 -9.71 11.59 2.10

AB 11.76 1 4.11 -40.45 63.98 2.40

AC -6.24 1 4.11 -58.45 45.98 2.40

BC -6.24 1 4.11 -58.45 45.98 2.40

ABC -28.59 1 26.95 -371.06 313.89 2.47

AB(A-B) 42.00 1 13.65 -131.45 215.45 1.63

AC(A-C) -48.00 1 13.65 -221.45 125.45 1.63

BC(B-C) ALIASED AB(A-B), AC(A-C)

35

Lampiran 11 ANOVA model linear JB7 96% muda

Sum of Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 3.11 2 1.56 0.87 0.4591

Linear Mixture 3.11 2 1.56 0.87 0.4591

Residual 12.49 7 1.78

Cor Total 15.60 9

Std. Dev. 1.34 R-Squared 0.1994

Mean 2.80 Adj R-Squared -0.0293

C.V. % 47.70 Pred R-Squared -0.4032

PRESS 21.89 Adeq Precision 2.734

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-klorofom 3.02 1 0.99 0.69 5.35 1.15

B-etil asetat 3.69 1 0.99 1.36 6.02 1.15

C-metanol 1.69 1 0.99 -0.64 4.02 1.15

36

Lampiran 12 ANOVA model kuadratik JB7 96% muda

Sum of Mean F p-value

Source Squares df Square Value Model 3.48 5 0.70 0.23 0.9306

Cuadratic Mixture 3.11 2 1.56 0.51 0.6331

AB 0.34 1 0.34 0.11 0.7541

AC 0.023 1 0.023 7.654E-003 0.9345

BC 8.681E-003 1 8.681E-003 2.866E-003 0.9599

Residual 12.12 4 3.03

Cor Total 15.60 9

Std. Dev. 1.74 R-Squared 0.2234

Mean 2.80 Adj R-Squared -0.7474

C.V. % 62.16 Pred R-Squared 14.2726

PRESS 238.25 Adeq Precision 1.493

Coefficient Standard

Component Estimate df Error Low High VIF A-klorofom 2.84 1 1.68 -1.82 7.50 1.96

B-etil asetat 3.38 1 1.68 -1.28 8.04 1.96

C-metanol 1.75 1 1.68 -2.91 6.41 1.96

AB2.60 1 7.74 -18.88 24.07 1.98

AC-0.68 1 7.74 -22.15 20.80 1.98

BC0.41 1 7.74 -21.06 21.89 1.98

37

Lampiran 13 ANOVA model kubik JB7 96% muda

Mean F P value

Source Squares df Square Value Model 14.77 8 1.85 2.23 0.4782

Cubic Mixture 3.11 2 1.56 1.88 0.4586

AB 1.38 1 1.38 1.67 0.4197

AC 2.716E-003 1 2.716E-003 3.279E-003 0.9636

BC 0.13 1 0.13 0.15 0.7622

ABC 0.68 1 0.68 0.82 0.5312

AB(A-B) 6.06 1 6.06 7.32 0.2254

AC(A-C) 9.47 1 9.47 11.43 0.1831

BC(B-C) 0.000 0

Residual 0.83 1 0.83

Cor Total 15.60 9

Std. Dev. 0.91 R-Squared 0.9469

Mean 2.80 Adj R-Squared 0.5221

C.V. % 32.51 Pred R-Squared -40.6615

PRESS 649.92 Adeq Precision 4.559

Coefficient Standard 95% CI 95% CI

Component Estimate df Error Low High VIF A-klorofom 2.94 1 0.91 -8.60 14.47 2.10

B-etil asetat 3.94 1 0.91 -7.60 15.47 2.10

C-metanol 0.94 1 0.91 -10.60 12.47 2.10

AB 5.75 1 4.45 -50.82 62.31 2.40

AC -0.25 1 4.45 -56.82 56.31 2.40

BC 1.75 1 4.45 -54.82 58.31 2.40

ABC -26.47 1 29.20 -397.48 344.54 2.47

AB(A-B) 40.00 1 14.79 -147.91 227.91 1.63

AC(A-C) -50.00 1 14.79 -237.91 137.91 1.63

BC(B-C) ALIASED AB(A-B), AC(A-C)

38

Nilai Rf dan area puncak JB7 96% muda

Densitogram Puncak Nilai Rf Area

A

B

C

D

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

0,04

0,15

0,37

0,61

0,76

0,85

0,03

0,12

0,71

0,88

-

0,02

0,12

0,44

0,71

0,88

0,03

0,12

0,43

0,76

0,89

11.066

2.172

12.776

924

1.498

-

350

955

1.802

104

9.187

337

1.265

548

1.901

8.191

867

790

678

2.522

7.747

Lampiran 14 Nilai Rf dan area puncak dari densitogram

Nilai Rf dan area puncak JBP 70% tua

Densitogram Puncak Nilai Rf Area

A

B

C

D

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

1

2

3

4

5

0,07

0,38

0,58

0,72

0,94

0,09

0,38

0,57

0,72

0,94

0,09

0,33

0,57

0,72

0,94

0,06

0,26

0,48

0,67

0,91

1.985

528

2.666

5.554

12.232

1.902

538

2.486

5.559

11.748

1.696

278

2.222

4.702

11.815

6.164

673

892

4.166

10.784

39

Nilai Rf dan area puncak JBM 70% tua

Densitogram Puncak Nilai Rf Area

A

B

C

D

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

0,03

0,18

0,44

0,67

0,85

0,93

0,03

0,25

0,46

0,56

0,69

0,88

0,03

0,23

0,42

0,65

0,80

0,88

0,03

0,23

0,42

0,65

0,76

0,86

2.447

1.160

4.277

11.938

837

7.441

4.479

1.090

3.025

11.817

1.205

4.525

4.297

479

2.720

10.792

1.370

2.901

3.634

729

3.080

11.778

1.766

34.852