Flavonoid dan Biflavonoid

Flavonoid dan BiflavonoidFrans Putra N.SIndah Hapsari K.Muh. Miftahul HudaMatsuko SutandioRika Sofiani

FlavonoidEKSTRAKSIFLAVONOIDFrans Putra N.S

3PendahuluanFaktor utama yang perlu diperhatikan dalam ekstraksi flavonoid :- suhu- pelarut- dan metode yang digunakanFlavonoid dalam simplisia segar/ tidak dikeringkan dapat terdegradasi aktivitas enzimatisoleh karena itu untuk ekstraksi sebaiknya digunakan simplisia yang telah dikeringkan.Pengeringan : pada tempat dengan udara terbuka dan terlindung dari sinar matahari langsung.

4Metode Charaux-Paris

5Secara Maserasi

6Isolasi FlavonoidMuh. Miftahul HudaISOLASISecara umum isolasi flavonoid dan biflavonoid adalah sama tetapi yang membedakan adalah dalam hal struktur kimianya.

I S O L A S I

Identifikasi FlavonoidIndah Hapsari K.1106067330Uji FlavonoidReaksi Warna:Jika tidak ada pigmen yang mengganggu, pada jaringan tumbuhan, (misalnya: daun bunga putih) dapat diidentifikasi adanya flavon dan flavonol dengan pemberian uap ammonia. Reaksi ini menghasilkan warna kuning.Hal ini terjadi karena flavonoid termasuk dari senyawa fenol. Bila fenol direaksikan dengan basa akan terbentuk warna yang disebabkan terjadinya sistem konjugasi dari gugus aromatikUji FlavonoidReduksi menggunakan Magnesium dan Asam klorida pekat Flavonol dan flavononol MerahTerkadang flavon menunjukkan reaksi positif, namun intensitas warna merah yang dihasilkan lebih rendah dari flavonol

Uji FlavonoidReaksi dengan besi (III) klorida dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi belum spesifik membedakan tiap golongan. Adanya warna hitam-biru reaksi positif galokatekin (flavanol).

Pendidihan simplisia dengan HCl 2M untuk mengidentifikasi katekin (flavanol)Reaksi positif coklat kuning

Penambahan air brom dapat digunakan untuk mengidentifikasi katekin (flavanol).Reaksi positif tidak terbentuk endapan. Bandingkan dengan tannin: terbentuk endapan.

Uji Flavonoid

0,5 mL ekstrak sampel + 5 tetes AlCl3 1 % sampel berubah menjadi kuning. Menunjukan uji positif adanya senyawa flavonoid dalam sampel.

Uji Flavonoid 0,5 g sampel ditambahkan dengan metanol sampai terendam lalu dipanaskan. Filtrat ditambahkan dengan 5 tetes H2SO4. Terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 menunjukkan adanya senyawa flavonoid.

Spektrofotometer UV- VisDigunakan untuk menganalisis struktur flavonoidKeuntungan: jumlah flavonoid yang diperlukan untuk analisis lengkap hanya sedikit (sekitar 0,1mg)Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam pelarut methanol atau etanol, namun spectrum dalam etanol kurang memuaskan sehingga digunakan metanol murni. Flavonoid mengandung gugus aromatis terkonjugasi sehingga akan menunjukkan pita serapan yang kuat pada sinar UV dan sinar tampak.

Spektrum khas terdiri dari dua maksima pada rentang 240-285nm (pita II) dan 300-550nm (pita I). Petunjuk mengenai rentang maksima utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoid terdapat dalam table berikut:

KLTFlavonoid akan berfluoresensi kuning, biru, atau hijau di bawah UV 366 nm.

Fase DiamSilika Gel F254 Fase Gerakbutanol asam asetat air (4 : 1 : 5)DeteksiAlCl3 5%Uap amoniaKeteranganDeteksi AlCl3 5%: warna kuningDeteksi uap amonia: warna kuning atau kuning-coklat

Contoh Isolasi Flavonoid dari Daun Katu (Sauropus androgynus (L.) Merr)Matsuko SutandioPendahuluanTumbuhan Katu (Sauropus androgynus (L.) Merr.) telah lama dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia dan beberapa negara tetangga, baik sebagai obat tradisional, sebagai sayuran atau pewarnaDari hasil penelitian dilaporkan bahwa daun katu mengandung protein, vitamin, senyawa sterol, lemak, alkaloid dan mineral. Dari India dan Malaysia dilaporkan bahwa daun katu mengandung papaverin sebesar 580 mg per 100 g daun segar.Dan dari Referensi penelitian yang saya ambil ini di temukan 6 senyawa flavonoid dalan daun katuIdentifikasi pendahuluanSejumlah 1 gram serbuk bahan ditambah 100 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring, filtrat digunakan sebagai larutan percobaan.Ke dalam 5 ml larutan percobaan ditambahkan sedikit serbuk magnesium, 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil-alkohol, dikocok dengan kuat dan dibiarkan memisah. Terbentuknya warna jingga atau merah jingga pada lapisan amil-alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoidSkema Isolasi

Fraksinasi dengan n-butanol dilakukan sebanyak 3 kali dan setiap kalinya dilakukan dengan pelarut n-butanol yang baru sehingga didapatkan 3 fraksi n-butanol : fraksi n-butanol 1, fraksi n-butanol 2, dan fraksi n-butanol 3.Setelah dilakukan pengujian diketahui bahwa yang memiliki kandungan terbanyak flavonoid adalah fraksi n-butanol 1. Kemudian dilakukan isolasi pada fraksi n-butanol 1 dengan kromatografi kertas preparatif. Dan dilakukan identifikasi dengan spektrofotometer ultraviolet dan infra merah.Pengukuran spektrum UV-Vis dilakukan pada panjang gelombang 250-500 nm. Sebanyak 1 mg isolat dilarutkan dalam 100 mL metanol (larutan persediaan), kemudian diukur panjang gelombangnya.

Isolat aktif yang diduga golongan senyawa flavonoid yang telah murni dicampur dengan nujol. Campuran yang terbentuk selanjutnya ditempatkan pada dua buah lempeng kristal NaCl dan dimasukkan ke dalam alat inframerah, kemudian diukur serapannya.

BiflavonoidPendahuluan BiflavonoidMatsuko SutandioBiflavonoidBiflavonoid adalah senyawa dengan 2 buah kerangka dasar flavonoid yang saling berhubungan dengan ikatan C-C.

mempunyai sifat agak polarberperan sebagai antioksidan, anti-inflamasi, antikanker, antialergi, antimikroba, antifungi, antibakteri, anti virus, pelindung terhadap radiasi UV, vasorelaksan, penguat jantung, anti-hipertensi, anti pembekuan darah, dan memepengaruhi metabolism enzim.

Isolasi dan ekstraksiSecara umum isolasi flavonoid dan biflavonoid adalah sama tetapi yang membedakan adalah dalam hal struktur kimianya.

FraksinasiIdentifikasi dgn pereaksi flavonoidK. KolomDipekatkan dgn rotary vacuum evaporatorAtau secara SFE, MAE, dan PLESecara soxlethasi n-heksana lalu etanol, maserasi dan ekstraksi sukksesif / bertingkat menggunakan dikloro metana, lalu amoas dilarutkan dalam alkoholSerbuk kering simplisiaEkstraksiLapisan non-polar (aglikon)Lapisan polar (flavonoid)Ekstrak pekat polar flavonoidFraksi 1Fraksi 3 , dstFraksi 2Fraksi (+) flavonoidSpektro IR, NMR, MS, UV-VisUji kemurnian dgn KLT noda tunggalDengan HPLC, Medium pressure HPLC, Flash chromatography / rekristalisasiPurifikasiFlavonoid murniIdentifikasi strukturFraksi (+) flavonoid

Purifikasi BiflavonoidMuh. Miftahul HudaSecara umumMenggunakan:High Pressure Liquid ChromatographyMedium Pressure Liquid ChromatographyRekristalisasi n-heksana

HPLC

RekristalisasiPrinsip: Perbedaan kelarutan dari komponen-komponen larutan pada pelarut tertentu. Saat suhu semakin tinggi, kelarutan akan semakin tinggiCampuran yang mengandung biflavonoid dilarutkan pada n-heksana pada suhu titik didihnya. Saat larutan didinginkan, kelarutan akan semakin rendah sehingga biflavonoid akan mengkristalMetode Analisis BiflavonoidIndah Hapsari K.1106067330Metode AnalisisPreparasi sampelBertujuan agar komponen yang diinginkan bisa diekstraks dari matriks sampel dengan waktu dan energi yg lebih sedikit namun efisiensi dan reproduksibilitas terjaga. Contoh penyiapan sample dilakukan dengan Solid Phase Extraction (SPE)2. KLTwaktu pemisahan singkat dan bisa digunakan untuk menguji bbrp sampel bersamaan.Analisis pendahuluan sebelum HPLCMenggunakan plat silica gelUntuk biflavonoid digunakan eluen Chloroform MeCOMeHCOOH, 75:16.5:8.5 TolueneHCOOEtHCOOH, 5:4:1

3. KCKTUntuk analisis kualitatif dan kuantitatifBertujuan untuk menentukan konstituen dr ekstrak tanaman, kemurnian dan penyelidikan taksonominyaKolom yang sering dipakai adalah C18 dan RP-18. pelarut yang digunakan asetonitril-air, metanol-air4. HPLC-UV SpektrofotometriMetode deteksi yg sering digunakan untuk HPLC adalah spektrofotometer UV

5. HPLC-MSDigunakan untuk mendeteksi informasi berat molekul dari senyawa yang terindentifikasi dan menghasilkan spektrum massa yang terprotonisasi secara molekular dr molekul senyawanya6. HPLC-NMRIdentifikasi struktur biflavonoid lebih mendalam dapat menggunakan LC-NMR, baik untuk pemisahan dan elusidasi struktur senyawa yang tidak diketahui dalam campuran.Informasi yang diberikan NMR berupa spektrum 1H NMR dan 13C NMR7. Elektroforesis kapiler (CE)Metode analisis berefisiensi tinggi dalam waktu singkat. Jika analisis dengan TLC dan HPLC memberi hasil yang kurang meyakinkan, CE merupakan alternatif yang baik karena dilengkapi detektor diodearray.Jawaban PertanyaanPenetapan kadar yang lain

Spektrofotodensitometri (TLC Scanner)Prinsip dasar pengukuran kadar suatu senyawa secara spektrofotodensitometri adalah mengukur serapan atau fluorosensi dari analit yang menyerap sinar UV.Analisis kuantitatif dari senyawa flavonoid yang telah dipisahkan dengan KLT biasanya dilakukan dengan densitometer langsung pada lempeng KLT (secara in situ), dimana densitometer dapat bekerja secara serapan maupun fluoresensi (Gandjar, 2007).Hasil yang didapatkan berupa luas area serapan yang menunjukkan besarnya konsentrasi flavonoid.Metode penetapan kadar yang lainDilakukan untuk menentukan kadar flavonoid dalam berbagai ekstrak Hibiscus sabdafrida dalam bentuk quercetin.

Yang dipersiapkan:Bahan tumbuhanSampel tumbuhan diperoleh dari University of Medicine and Pharmacy Carol Davila, Fakultas Farmasi, Departemen Farmakognosi, Romania.InstrumenSpektrofotometri UV-VIS Jasco V-530 dengan PC-HP 845X dan kuvet kuarsa 1cmReagen dan larutanBahan analisis:Aseton, Asam Hidroklorida, Hexametilenetetramin, Etil Asetat, Hexahidrat Aluminium Klorida, Natrium Sitrat, Kalium Asetat, Metanol, Etanol, Asam AsetatBahan standar: QuercetinEkstrak tanamanDisiapkan dari tiga jenis pelarut yang berbeda; E1- ektraksi dengan Metanol, E2-ekstraksi dengan air, E3-ekstraksi dengan 40% Etanol dengan 1% HCl. Ekstraksi dilakukan pada bahan serbuk menggunakan alat refluks pada suhu 50C selama 1jam Filtrasi hingga diperoleh 25ml ekstraktan.Metode penetapan kadar dalam ekstrak

Terdapat dua metode untuk penetapan kadar senyawa quercetine dalam ekstrak Hibiscus sabdafrida:Metode Christ-MullerMetode Chang et al.

Metode Christ-MullerDigunakan hanya untuk bagian aglikon dari ekstrak, maka total keselurahan flavonoid yang ada dihitung sesuai dengan quercetin yang ada.

ProsedurDinginkan, filtrasi

A = serapanb = massa dari bahan herbal kering dalam gram

Metode Chang et al.

Prosedur:Hasil dan perhitunganAkan diperoleh persamaan kurva kalibrasi.Contoh y = 0.0007 + 0.0603x, r2=0,9997Konsentrasi menggunakan metode Chang et al. dapat diperoleh dengan rumus:

(R x DF x V x 100) W

R = hasil yang diperoleh dari kurva kalibrasi standarDF = Dillution FactorV = volume larutan; 100 untuk 100gram tanaman keringW = berat tanaman yang digunakan dalam eksperimen (mg)

Bagan KLT- DensitometriPerbedaan kromatografi flash dan kromatografi cair vakumKromatografi FlashKromatografi flash merupakan kromatografi dengan tekanan rendah (pada umumnya