PROPOSAL MINI RISET ENZIMOLOGI

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE CAIRAN RUMEN SAPI ASAL RUMAH POTONG HEWAN

Disusun untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah Enzimologi

Dosen pengampu : Dr.Drh. R. Susanti, MP

Dr.Ari Yuniastuti,S.Pt. M.Kes

Anggota Kelompok :

Eva Faradella (4411413008)

Nikmatul Hidayah (4411412054)

Refa Inta Prasetyani. P (4411412026)

Eni Tri Hartanti (4411410027)

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2014

1

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas

limpahan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas penyusunan

proposal mini riset mata kuliah enzimolgi, yaitu tentang Isolasi dan Karakterisasi

Enzim Karbohidrase dari Cairan Rumen Sapi Asal Rumah Potong Hewan.

Penyusunan proposal mini riset ini merupakan tugas yang harus diselesaikan untuk

memenuhi salah satu tugas mata kuliah enzimologi. Dalam proposal ini penulis

membahas tentang bagaimana cara mengisolasi enzim amilase dari cairan rumen sapi,

sekaligus mengkarakterisasinya menggunakan metode yang penulis rujuk dari jurnal.

Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada pihak-pihak yang telah

membantu penulis dalam penyusunan makalah ini, terkhusus kepada:

1. Dra. R. Susanti, M.P dan dr. Ari Yuniastuti, S.Pt, M.Kes selaku dosen

pengampu mata kuliah enzimologi.

2. Dosen-dosen atau pihak yang membantu penulisj dalam penyususan proposal

ini

3. Rekan- rekan Biologi angkatan 2013 dan 2012

4. Orang tua penulis tercinta yang memberikan dukungan penuh kepada penulis

baik dalam segi moral ataupun material dalam perkuliahan.

Dalam proposal ini penulis merasa masih banyak kekurangan dalam hal

teknis maupun teori. Untuk itu kritik dan saran sangat kami harapkan untuk

penyempurnaan proposal ini.Semoga proposal ini bermanfaat bagi penulis dan bagi

pembaca.

Semarang, 5 November 2014

Penulis

2

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL........................................................................................................1

KATA PENGANTAR ........................................................................................................2

DAFTAR ISI.......................................................................................................................3

BAB I : PENDAHULUAN.................................................................................................4

1.1 Latar Belakang.........................................................................................................4

1.2 Rumusan Masalah....................................................................................................6

1.3 Tujuan......................................................................................................................6

BAB II : TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................................7

2.1 Pengertian Isolasi dan Karakterisasi Enzim............................................................7

2.2 Cairan Rumen Sapi..................................................................................................8

2.3 Enzim Amilase........................................................................................................11

BAB III :METODE PENELTIAN......................................................................................12

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian..................................................................................12

3.2 Alat dan Bahan Penelitian.......................................................................................12

3.3 Metode Penelitian....................................................................................................13

BAB 1V : HASIL DAN PEMBAHASAN..........................................................................15

BAB V : PENUTUP............................................................................................................20

DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................................21

3

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isi rumen sapi yang berasal dari limbah rumah potong hewan (RPH)

cukup melimpah. Jika tidak ditangani dengan baik limbah ini berpotensi mencemari

lingkungan. Limbah rumen ini di sisi lain berpotensi sebagai sumber enzim yang

dapat menggantikan sebagian enzim komersial dalam mengatasi kendala pakan

unggas berkualitas rendah. Penambahan enzim cairan rumen pada bahan pakan lokal

atau ransum unggas diharapkan dapat meningkatkan efisiensi penggunaan pakan

(Budiansyah, 2011). Penelitian pemanfaatan isi rumen sapi sebagai pakan unggas

sampai saat ini terbatas hanya pada bagian padatan, sedangkan cairan rumen sapi

(CRS) sebagai pakan tambahan dan pakan suplemen belum dilakukan secara

mendalam. Selama ini isi rumen hanya dibuang percuma dan tidak dimanfaatkan,

hanya sebagian kecil saja yang memanfaatkannya sebagai kompos.

Berdasarkan data Statistik Peternakan (2007), jumlah sapi yang dipotong

setiap tahun tidak kurang dari 1,75 juta ekor, sekitar 1,5 juta ekor berasal dari sapi-

sapi lokal, dan sisanya adalah sapi-sapi impor. Jumlah cairan rumen mencapai 31 liter

per ekor (Priego et al., 1977). Produksi pakan ternak di Indonesia tahun 2008

mencapai 8,156 juta ton dari kapasitas terpasang 12 juta ton. Sekitar 83% dari jumlah

ini diprioritaskan guna pemenuhan kebutuhan ternak unggas (Ditjennak 2010).

Berdasarkan sapi-sapi yang dipotong tersebut potensi cairan rumen sapi mencapai

54,25 juta liter per tahun. Beberapa peneliti melaporkan bahwa cairan rumen sapi

hidup kaya akan selulase, amilase, protease, xilanase dan lain-lain (Lee et al., 2002;

4

Morgavi et al., 2000). Lee et al. (2002) melaporkan cairan rumen sapi hidup yang

diberi makan ransum berbasis hay alfalfa mengandung selulase sebesar 362,7±12,8

IU/ml, xilanase sebesar 528,6±29,03 IU/ml, amilase sebesar 439,0±16,53 IU/ml, dan

protease sebesar 84,8±2,52 IU/ml. Aktivitas enzim-enzim tersebut cukup tinggi.

Meng et al. (2005) melaporkan bahwa penggunaan enzim dengan dosis

94 unit aktivitas selulase, 6360 unit aktivitas xilanase, dan 1090 unit aktivitas

mananase per kg ransum dapat memperbaiki performa ayam broiler. Alam et al.

(2003) melaporkan bahwa penggunaan enzim komersial ”Roxazyme G” dalam

ransum dengan dosis 800 unit aktivitas selulase, 2600 unit aktivitas xilanase dan 1800

unit aktivitas β-glukanase per kilogram juga sudah dapat memperbaiki performa

ayam broiler. Hal tersebut berarti bahwa penggunaan enzim cairan rumen sapi kurang

lebih sebanyak 4-12 ml per kg ransum sudah cukup untuk memperbaiki performa

ayam broiler.

Berbeda dengan sapi hidup, sapi yang akan dipotong umumnya

dipuasakan sehingga jumlah dan kualitas enzim yang dihasilkan akan berbeda.

Berkaitan dengan hal ini, dalam rangka memanfaatkan cairan rumen sapi asal RPH

sebagai sumber enzim untuk meningkatkan kualitas pakan ternak, kondisi optimum

aktivitas enzim perlu diketahui agar penggunaannya dapat disesuaikan dengan

kondisi suhu, pH, dan pengaruh ion-ion logam yang optimum. Kondisi optimum

aktivitas enzim ketika masih di dalam rumen kemungkinan berbeda dengan kondisi

optimum aktivitas enzim bila sudah berada di luar tubuh sapi. Suhu di dalam rumen

sapi dalam keadaan normal rata-rata 38,54 0C dengan kisaran suhu 36,70-39,870C

(AlZahal et al., 2008), dan pH berkisar 5,2–6,7 (Khampa et al., 2006). Oleh karena itu

kajian tentang karakteristik (kondisi optimum) enzim-enzim karbohidrase pada cairan

rumen sapi asal RPH tersebut penting dilakukan.

Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi enzim

karbohidrase dalam cairan rumen sapi asal RPH khususnya enzim amilase,

5

menentukan suhu dan pH optimum enzim serta mengevaluasi pengaruh ion-ion

logam dan bahan kimia terhadap aktivitas enzim dari cairan rumen sapi asal RPH

agar bisa dijadikan sebagai sumber enzim dalam campuran ransum unggas berbahan

baku pakan lokal.

1.2 Rumusan Masalah

Dari uraian di atas, penulis dapat merumuskan masalah sebagai berikut :

1. Apakah terdapat enzim amylase pada cairan rumen sapi asal rumah

potong hewan?

2. Bagaimana cara mengukur aktivitas enzim amilase dari cairan rumen sapi

asal rumah potong hewan?

1.3 Tujuan

Tujuan dari penyusunan makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui adanya nzim amylase dalam cairan rumen sapi aal

rumah potong hewan.

2. Untuk mengetahui tentang cara mengukur aktivitas enzim amilase dari

cairan rumen sapi asal rumah potong hewan

6

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi dan Karakterisasi Enzim

Isolasi merupakan proses memisahkan enzim dari sumbernya dengan

melibatkan beberapa teknik sekaligus. Enzim yang ditemukan di pasaran berasal dari

berbagai macam organisme, dengan berbagai tingkat kemurnian, contoh: α-Amilase,

Glukoamilase, Protease. Berdasarkan fungsi hayatinya, ada dua jenis enzim yaitu ;

enzim intraselluler, enzim ekstraselluler (lebih mudah diisolasi).

Isolasi enzim intraseluler merupakan proses pelepasan enzim dari sel.

Isolasi enzim dari tumbuhan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi, karena dinding

selnya keras, cenderung menimbun zat-zat racun dalam vakuole (misal fenol),

sehingga ketika dinding pecah, racun dan enzim akan bercampur dan berinteraksi.

Cara mengatasi keadaan yang seperti itu bisa dengan menambahkan zat pereduksi,

seperti β- merkaptoetanol, askorbat, atau tioglikolat, dan menggunakan tanaman

muda. Pemurnian enzim sama dengan prinsip pemurnian protein. Metode pemurnian

didasarkan pada sifat enzim yaitu ukuran, muatan, hidrofobisitas, stabilitas, aktivitas,

dan afinitas.

Karakterisasi pada enzim bertujuan untuk menentukan kondisi optimum

kerja enzim agar reaksi enzimatis dapat berjalan dengan optimal. Hal-hal yang perlu

diperhatikan ketika melakukan karakterisasi enzim ialah penentuan suhu, waktu

inkubasi, dan pH optimum.

7

Suhu optimum yaitu suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang

menggunakan enzim tertentu untuk menghasilkan suatu produk

(Wirahadikusumah, 1989). Kenaikan suhu dapat mempercepat reaksi dan

meningkatkan kecepatan molekul karena bertambahnya energi kinetik yang

mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dan substrat sehingga

memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi.Kenaikan suhu melebihi suhu

optimum menyebabkan protein enzim dan substrat mengalami perubahan

konformasi yang bersifat detrimental. Perubahan konformasi substat

mengakibatkan gugus reaktif mengalami hambatan dan tidak dapat lagi memasuki

sisi aktif enzim (Suhartono, 1989).

Waktu inkubasi adalah waktu kontak antara enzim dengan substrat

untuk membentuk kompleks enzim-substrat yang akhirnya terbentuk produk. PH

optimum adalah pH yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim

tertentu untuk menghasilkan produk (Wirahadikusumah, 1989).

Kondisi pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena perubahan

muatan dapat mempengaruhi aktivitasnya akan terganggu, dimana perubahan

tersebut berakibat pada perubahan muatan residu asam amino yang berfungsi

mengikat substrat. Perubahan ion H+ yang ada dalam larutan enzim memberikan efek

pada bagian katalitik dan konformasi enzim.

2.2 Cairan Rumen Sapi

Sumber enzim yang murah dan dapat dimanfaatkan dengan mudah adalah

enzim dari cairan rumen sapi asal rumah potong hewan (RPH). Berdasarkan laporan

Lee et al. (2002) diketahui bahwa cairan rumen mengandung enzim selulase, amilase,

protease, xilanase, mannanase, dan fitase. Enzim-enzim ini dalam rumen

menyebabkan efektivitas pencernaan danefisiensi penggunaan pakan pada ternak

ruminansia lebih tinggi dibanding ternak unggas, terutama penggunaan bahan pakan

berserat kasar tinggi. Penambahan enzim cairan rumen pada bahan pakan lokal atau

8

ransum unggas diharapkan dapat meningkatkan efisiensi penggunaan pakan.

Kemampuan enzim hasil ekstraksi dari cairan rumen sapi asal RPH dalam

mendegradasi pakan perlu dikaji, terutama kemampuannya dalam mendegradasi

karbohidrat agar penggunaan optimum enzim pada pakan ternak, terutama pada

pakan ternak lokal berkualitas rendah yang mengandung serat kasar tinggi dapat

diketahui.

A. Budiansyah, dkk (2011) telah melakukan penelitian terhadap

kandungan cairan rumen sapi impor dan lokal asal rumah potong hewan. Hasilnya

adalah cairan rumen sapi baik sapi lokal maupun sapi impor mengandung enzim

selulase, xilanase, mannanase, amilase, fitase dan protease. Pengendapan optimum

enzim-enzim cairan rumen sapi lokal diperoleh dengan tingkat kejenuhan amonium

sulfat 60 %, sedangan enzim-enzim cairan rumen sapi impor diperoleh pada tingkat

kejenuhan 70 %. Cairan rumen sapi lokal asal rumah potong hewan yang

mengandung enzim selulase, xilanase, mannanase, amilase, protease dan fitase

mampu menghidrolisis karbohidrat bahan pakan lokal. Taraf optimum penambahan

enzim cairan rumen untuk menghasilkan total gula terlarut tertinggi pada ransum

starter dan finisher dicapai pada taraf 1,0 %, pada daun ubi kayu dan bungkil inti

sawit adalah pada taraf 2,0 %, sedangkan pada dedak halus, kacang kedelai

danbungkil kelapa diperoleh pada taraf 2,5 %.

Cairan rumen sapi, selain mengandung mikroba rumen dan enzim-enzim

yang disekresikan oleh mikroba rumen, juga mengandung zat-zat makanan hasil

perombakan mikroba rumen dan enzim, serta vitamin-vitamin dan mineral-mineral

yang larut dalam cairan rumen. Pemisahan cairan rumen dengan sentrifugasi pada

kecepatan 10 000 g selama 10 menit akan menghasilkan bahan padatan yang berasal

dari sel-sel mikroba dan nutrien yang larut di dalam cairan rumen. Bahan tersebut

kaya akan protein, asam amino, vitamin dan mineral. Komposisi asam amino, mineral

dan vitamin dalam endapan cairan rumen seperti halnya enzim-enzim, juga

tergantung dari perlakuan pakan yang diberikan. Komposisi asam-asam amino,

9

mineral dan vitamin pada endapan cairan rumen asal sapi-sapi impor yang dipelihara

dan digemukkan dengan mendapat lebih banyak konsentrat dalam pakannya akan

lebih tinggi karena lebih banyak asam-asam amino, mineral dan vitamin yang larut

dalam cairan rumen dibandingkan dengan sapi-sapi lokal yang lebih banyak

mendapatkan hijauan dan makanan kasar dalam pakannya.

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Agus Budiansyah, Resmi,

dkk (2011) menyatakan bahwa endapan cairan rumen baik asal sapi lokal maupun

sapi impor mengandung mineral-mineral Na, K dan Fe yang tinggi dengan

kandungan Na sebesar 13.47% pada sapi lokal dan 18.40% pada sapi impor, K

sebesar 7.73% pada sapi lokal dan 10.25% pada sapi impor, dan kandungan Fe

sebesar 14.52 gram/kg pada sapi lokal dan 28.18 gram/kg pada sapi impor.

Kandungan vitamin dan asam amino endapan cairan rumen lebih rendah

dari premix. Berdasarkan total kandungan asam amino dibandingkan dengan

kandungan proteinnya, endapan cairan rumen sapi lokal mengandung sebanyak

66.8% protein yang berupa asam amino, sedangkan endapan cairan rumen sapi impor

mengandungsebanyak 73.2% protein yang berupa asam amino. Kualitas asam amino

berdasarkan skor kimia, endapan cairan rumen sapi lokal mempunyai skor 58.7%

sedangkan endapan cairan rumen sapi impor mempunyai skor 59.47%, asam amino

yang menjadi pembatas adalah asam amino lisin.

Endapan cairan rumen baik sapi lokal maupun impor mempunyai pH

yang tinggi yaitu 10.03 ± 0.04 pada endapan cairan rumen sapi lokal dan 10.01 ± 0.04

pada endapan cairan rumen sapi impor, dan tingkat kelarutan bahan kering adalah

39.11 ± 0.28 % pada endapan cairan rumen sapi lokal dan 35.5 ± 47 % pada endapan

cairan rumen sapi impor. Endapan cairan rumen sapi impor mempunyai berat jenis

(1.88 ± 0.0 g/cc), kerapatan tumpukan (0.75 ± 0.01 ton/m3) dankerapatan pemadatan

tumpukan (0.85± 0.01 ton/m3) yang lebih tinggi dari berat jenis (1.54 ± 0.06 g/cc),

kerapatan tumpukan (0.60 ± 0.01 ton/m3) dan kerapatan pemadatan tumpukan (0.65

10

± 0.02 ton/m3), endapan cairan rumen sapi lokal, sedangkan sudut tumpukan relatif

sama (25.71 – 25.96 derajat).

2.3. Enzim Amilase

Salah satu enzim golongan hidrolitik yang memiliki aplikasi yang luas

dalam berbagai bidang industri seperti pangan, kesehatan, dan lingkungan adalah

enzim amilase. Dalam industri pangan, enzim amilase merupakan salah satu enzim

ekstraseluler komersial karena berfungsi menyediakan gula hidrolisis, sehingga

dapat dimanfaatkan untuk produksi sirup glukosa atau sirup fruktosa yang

mempunyai tingkat kemanisan tinggi. Amilase ini banyak digunakan dalam

menghidrolisis molekul pati menjadi maltosa ataupun glukosa dan amilase juga

berfungsi pada pembuatan roti dan makanan bayi (Sebayang, 2005). Oleh karena

enzim golongan tersebut memiliki nilai ekonomi tinggi, maka perlu mendapat

perhatian khusus terutama karena enzim ini sangat berpotensi diaplikasikan dalam

bidang pangan.

Amilase adalah enzim hidrolase glikosida yang mengkatalisis pemecahan

pati menjadi gula. Amilase merupakan salah satu enzim yang paling penting dalam

bioteknologi saat ini. Amilase merupakan enzim yang memecah pati yang diproduksi

oleh berbagai jenis makhluk hidup seperti dari bakteri, jamur, tumbuhan, manusia.

Amilase mewakili sekitar 30% dari produksi enzim industri di seluruh dunia. Amilase

telah diturunkan dari beberapa jamur, ragi, bakteri dan actinomycetes. Jenis-jenis

enzim amilase yaitu α-amilase, β-amilase, dan γ-amilase (glukoamilase) (Henny,

2013).

11

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu pelaksanaan yaitu pada tanggal 14 – 18 November 2014 dan

bertempat di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri

Semarang.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

Alat Bahan

Termos Air berisi 2 L Isi rumen sapi

Beaker Glass Amonium Sulfat bertingkat 60%

Gelas Ukur Buffer fosfat PH 7

12

Botol Flacon Sodium Hipoklorit

Mikropipet Pati / Kanji

Tube DNS

Tip Rochelle Salt

Pengaduk Aquades Steril

Kertas PH NaOH

Inkubator Glukosa

Sentrifuse

Water Bath

Lemari Pendingin

Magnetic stirer

Erlenmeyer

Spektrofotometer

3.3 Metode Penelitian

1. Persiapan Enzim Cairan Rumen

Isi rumen sapi lokal yang diambil dari sapi yang dipotong di

RPH Penggaron Semarang. Cairan rumen diambil dari isi rumen sapi

dengan cara filtrasi dibawah kondisi dingin. Cairan rumen diambil dari isi

rumen sapi dalam keadaan masih hangat kemudian disimpan di dalam

termos yang sebelumnya diisi dengan air panas untuk mempertahankan

suhunya. Cairan rumen sapi sebanyak 100 ml disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4 oC untuk memisahkan

supernatan dari sel-sel dan isi sel mikroba (Lee et al., 2000). Supernatan

kemudian diambil sebagai sumber enzim kasar.

2. Fraksinasi Enzim dengan Amonium Sulfat

Supernatan yang terdiri atas enzim-enzim selanjutnya

direaksikan dengan amonium sulfat pada konsentrasi 60% yang

13

didapatkan dari penelitian sebelumnya memperoleh tingkat kejenuhan

tertinggi untuk enzim amylase dan diaduk menggunakan magnetik stirer

selama kurang lebih 1 jam, dan kemudian didiamkan semalam pada suhu

4 oC.

Supernatan yang dihasilkan kembali disentrifugasi dengan

kecepatan 10.000 g selama 15 menit pada suhu 4 oC. Endapan (enzim)

yang diperoleh diambil kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7,0

dengan perbandingan 10:1 (endapan dari 100 ml supernatan cairan rumen

dilarutkan dalam 10 ml buffer fosfat pH 7,0) tanpa dilakukan pemurnian.

Enzim dalam buffer kemudian disimpan pada lemari pendingin untuk

diukur aktivitasnya.

3. Aktivitas Amilase (Moharrery & Das)

Mengukur laju pelepasan gula pereduksi selama inkubasi dari

enzim dengan substrat pati. Sebanyak 0,25 mL sampel (enzim rumen

sapi), 0,25 mL larutan kanji (1 g pati dalam 100 mL air suling) dan 0,5 mL

buffer fosfat PH 7, dicampur dalam tabung dan diinkubasi selama 15

menit pada 39° C. Setelah itu ditambahkan 3 mL dinitrosalicylic acid (0.3

g DNS dalam 30 mL NaOH (0.5 g NaOH dan 0.84 ml sodium hipoklorit

kemudian ditambahkan air 100 ml) ditambahkan kedalam tube dan direbus

di water bath selama 10 menit pada suhu 39oC. Kemudian tambahkan

Rochelle salt sebanyak 1 ml (10 g Rochelle yang dilarutkan sampai 250

ml) yang di masukkan ke dalam tube. Kemudian larutan dilarutkan sampai

20 ml dengan air distilasi. Kemudian di absorbansi pada 575 nm.

Pembuatan larutan standar glukosa dengan konsentrasi berbeda yaitu 0%,

2%, 4%, 6&, 8%, 10%. Masing masing konsentrasi diambil sebanyak 2.5

ml dan diberi perlakuan sama dengan larutan sampel enzim cairan rumen

sapi kemudian dilakukan absorbansi dengan spektrofotometer pada 575

nm.

14

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Produksi Enzim Kasar

Cairan rumen diambil dari isi rumen sapi dengan cara filtrasi

kemudian disimpan di dalam termos yang sebelumnya diisi dengan air

panas untuk mempertahankan suhunya. Karena Kondisi optimum aktivitas

enzim ketika masih di dalam rumen kemungkinan berbeda dengan kondisi

optimum aktivitas enzim bila sudah berada di luar tubuh sapi. Suhu di

dalam rumen sapi dalam keadaan normal rata-rata 38,54 oC dengan

kisaran suhu 36,70-39,87 oC (Al Zahal et al., 2008), dan pH berkisar 5,2–

6,7 (Khampa et al., 2006). Cairan hasil sebanyak 100 ml disentrifugasi

dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4 oC untuk

memisahkan supernatan dari sel-sel dan isi sel mikroba (Lee et al., 2000).

Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak

berada pada kondisi fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan

struktur dan fungsi protein, maka semua proses isolasi harus dilakukan

15

pada kondisi suhu rendah (0 - 4 C).⁰ Supernatan kemudian diambil sebagai

sumber enzim kasar.

4.2 Pemakaian Amonium Sulfat

Supernatan yang terdiri atas enzim-enzim selanjutnya

direaksikan dengan amonium sulfat. Penggunaan amonium sulfat dalam

pengendapan enzim dilakukan karena amonium sulfat mempunyai

kelarutan yang tinggi, relatif murah, tidak beracun dan dapat menstabilkan

enzim (Chaplin dan Bucke 1990). Pengendapan dengan garam

menggunakan prinsip salting out dimana kelarutan protein akan

berkurang pada konsentrasi garam yang tinggi. Konsentrasi garam

yang meningkat mengakibatkan air akan lepas dari protein yang

menyebabkan terjadinya penempelan ikatan hidrofobik dari satu protein

dengan protein yang lain menghasilkan endapan. Pengendapan dengan

amonium sulfat didasarkan pada persamaan sifat kepolaran dari amonium

sulfat dan air. Penambahan garam amonium sulfat ke dalam larutan

protein akan merusak mantel dan menarik molekul air dari sekitar

permukaan molekul protein, akibatnya protein tidak lagi terlindungi

molekul air melainkan beragregasi dengan sesamanya dan kemudian

mengendap (Scope, 1987). Penambahan garam dilakukan secara

perlahan pada suhu dingin sambil dilakukannya pengadukan,

pengkondisian suhu dingin dilakukan karena terjadi peningkatan suhu

akibat proses pelarutan yang di bantu dengan magnetic stirrer kurang

lebih 1 jam, Supernatan enzim yang bebas sel yang telah di tambahkan

dengan amonium sulfat didiamkan selama semalam pada suhu 4 oC.

Pengendapan optimum cairan rumen sapi (CRS) lokal paling banyak

terjadi pada konsentrasi garam amonium sulfat 60%, yaitu pada enzim

selulase, xilanase, amilase dan fitase (Budiansyah, 2011). Supernatan

kembali disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama 15 menit pada

16

suhu 4 oC. Endapan (enzim) yang diperoleh diambil kemudian dilarutkan

dalam buffer fosfat pH 7,0 dengan perbandingan 10:1 (endapan dari 100

ml supernatan cairan rumen dilarutkan dalam 10 ml buffer fosfat pH 7,0)

tanpa dilakukan pemurnian. Enzim dalam buffer kemudian disimpan pada

lemari pendingin selama 1 x 24 jam untuk diukur aktivitasnya.

4.3 Uji Aktivitas Enzim

Pada pemeriksaan aktivitas enzim dilakukan pengukuran kadar

glukosa untuk pembuatan kurva standar dengan menggunakan soluble

starch sebagai substrat. Unit aktivitas enzim didasarkan perhitungan

pada kurva standar glukosa dengan DNS (3,5-dinitrosalisilat) dengan

berbagai konsentrasi mengikuti metode Moharrery & Das (2002). DNS

merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula reduksi

maupun komponen pereduksi lainnya untuk membentuk 3-amino-5-

nitrosalicylic acid, suatu senyawa yang mampu menyerap dengan kuat

radiasi gelombang elektromagnetik pada 575 nm. Semakin banyak

komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin

banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang terbentuk dan

mengakibatkan serapan semakin tinggi. Dalam pembuatan reagen DNS,

kita perlu menambahkan NaOH ke dalam larutan yang bertujuan untuk

memberikan suasana basa. Karena nantinya reaksi dari reagen DNS ini

bekerja pada suasana basa. Selain menambahkan NaOH, juga

ditambahkan kalium natrium tartrat 40% (Rochelle Salt). Fungsi dari

penambahan ini adalah untuk menstabilkan warna yang terbentuk pada

saat reaksi terjadi yaitu merah bata/kecoklatan. Di samping itu, kadang

juga diperlukan pemanasan untuk membantu mempercepat jalannya

17

reaksi. Karena nantinya yang akan diukur adalah absorbansi dari warna

yang terbentuk tersebut dengan spektrofotometri pada panjang gelombang

575 nm. Reagen DNS mendeteksi adanya gula reduksi dalam sampel

berupa polisakarida dalam bentuk glukosa dari hasil hidrolisis substrat pati

oleh enzim amilase. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada

panjang gelombang 570 nm. Dari pengukuran secara spektrofotometri

diperoleh data sebagai berikut:

Tabel 1. Hasil Absorbansi pada gelombang 575 nm.

KonsentrasiAbsorbansi 1

Absorbansi 2 Absorbansi 3

Rata rata Absorbansi

0 0.007 0.006 0.006 0.006333333

20% 0.006 0.006 0.007 0.006333333

40% 0.011 0.012 0.01 0.011

60% 0.018 0.014 0.018 0.016666667

80% 0.018 0.018 0.019 0.018333333

100% 0.015 0.02 0.019 0.018

Sampel 0.022 0.02 0.021 0.021

18

0 20% 40% 60% 80% 100% Sampel0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

f(x) = 0.00266666666666666 x + 0.00328571428571431

Series1

Linear (Series1)

Grafik 1.

Dari grafik 1. Diperoleh persamaan matematis

y = 0.002x + 0.003

0.021 = 0.002 x + 0.003

0.018 = 0.002 x

9 = x

dimana x adalah aktivitas enzim pada panjang gelombang 575 nm. Dari

persamaan ini, maka diperoleh data sebagai berikut menunjukan bahwa nilai

aktivitas enzim amilase sebesar 9 Unit/ml. Unit aktivitas enzim dalam

penelitian ini didefinisikan sebagai kemampuan α-amilase untuk

menghidrolisis pati menjadi glukosa sebanyak 1 mg/mL.

19

Uji aktivitas amilase secara kuantitatif

Prinsip uji aktivitas enzim amilase didasarkan pada perhitungan

gula pereduksi dari hasil hidrolisis pati dengan metode Nelson-Somogyi.

Kadar glukosa hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase dihitung dengan

menggunakan kurva kalibrasi larutan standar glukosa pada berbagai

konsentrasi, panjang gelombang maksimum dari larutan standar glukosa yaitu

575 nm. Perhitungan aktivitas enzim dilakukan dengan mensubtitusikan

absorbansi larutan yang diperoleh pada pengujian aktivitas enzim ke

dalam persamaan regresi kurva kalibrasi larutan standar glukosa. Diperoleh

aktivitas sampel enzim amilase dari cairan rumen rumen sapi sebesar 9

Unit/ml. Dibandingkan dengan aktivitas enzim amilase pada alang alang yaitu

sebesar 0.119 U/mL, aktivitas enzim amilase dari Saccharomyces cerevisiae

FNCC 3012 adalah sebesar 7,28 Unit/mg protein,dan Aktivitas enzim amilase

dari Aspergillus oryzae FNCC 6004 yaitu sebesar 3,26 Unit/mg protein. Maka

aktivitas enzim amilase pada cairan rumen sapi tergolong tinggi. Hal ini dapat

dimanfaatkan sebagai bahan tambahan pakan atau ransum agar efisien.

BAB V

PENUTUP

A. Simpulan

1. Terdapat enzim amylase pada cairan rumen sapi asal rumah potong hewan

20

2. Uji aktivitas amylase dari cairan rumen sapi menggunakan subtrat pati

yang akan dihidrolisis menjadi glukosa

3. Aktivitas diabsorbansi pada 575 nm dengan larutan standar glukosa dan

didapatkan aktivitas sebesar 9 unit/ml termasuk aktivitas amylase yang

besar dibandingkan dari Saccharomyces cerevisiae FNCC 3012 maupun

Aspergillus oryzae FNCC 6004.

DAFTAR PUSTAKA

A. Budiansyah, dkk. 2011. Hidrolisis Zat Makanan Pakan Oleh Enzim Cairan Rumen

SapiAsal Rumah Potong Hewan. Jurnal. Agrinak :Vol . 01 No. 1

September 2011:17–24. dPusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia : Cibinong.

A. Budiansyah, dkk. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Karbohidrase Cairan

Rumen Sapi Asal Rumah Potong Hewan. Jurnal. Media Peternakan,

21

April 2010, hlm. 36-43 : Vol. 33 No. 1. Pusat Penelitian Bioteknologi

LIPI : Cibinong.

____________. 2011. Karakteristik Endapan Cairan Rumen Sapi asal Rumah Potong

Hewan sebagai Feed Supplement.Jurnal. Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu

Peternakan Mei 2011, Vol. XIV. No.1. Pusat Penelitian Bioteknologi

LIPI : Cibinong.

Endang Purbowati, dkk. 2014. Karakteristik Cairan Rumen, Jenis, Dan Jumlah

Mikrobia Dalam Rumen SapiJawa Dan Peranakan Ongole. Buletin

Peternakan Vol. 38(1): 21-26, Februari 2014. Fakultas Peternakan dan

Pertanian, Universitas Diponegoro, Kampus drh. Soejono

Koesoemowardojo, Tembalang : Semarang.

Moharrery, A. & Tirta. K. Das.2002. Correlation between microbial enzyme

activities in the rumen fluid of sheep under different treatments. Reprod.

Nutr. Dev. 41: 513 - 529.

Sari, Dewi P,. dkk. 2013. Isolasi, Purifikasi Dan Karakterisasi Α-Amilase Dari

Saccharomyces cerevisiae Fncc 3012. Chem Info Vol 1, No 1, Hal 337 –

344 , 2013. Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas

Diponegoro.

Ompusunggu, Henny E. S., dkk. 2013. Kajian Biomedik Enzim Amilase dan

Pemanfaatannya Dalam Industri. Journal. Universitas Sumatra Utara.

22