PROPOSAL MINI RISET ENZIMOLOGI
ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ENZIM AMILASE CAIRAN RUMEN SAPI ASAL RUMAH POTONG HEWAN
Disusun untuk memenuhi tugas akhir mata kuliah Enzimologi
Dosen pengampu : Dr.Drh. R. Susanti, MP
Dr.Ari Yuniastuti,S.Pt. M.Kes
Anggota Kelompok :
Eva Faradella (4411413008)
Nikmatul Hidayah (4411412054)
Refa Inta Prasetyani. P (4411412026)
Eni Tri Hartanti (4411410027)
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
2014
1
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
limpahan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas penyusunan
proposal mini riset mata kuliah enzimolgi, yaitu tentang Isolasi dan Karakterisasi
Enzim Karbohidrase dari Cairan Rumen Sapi Asal Rumah Potong Hewan.
Penyusunan proposal mini riset ini merupakan tugas yang harus diselesaikan untuk
memenuhi salah satu tugas mata kuliah enzimologi. Dalam proposal ini penulis
membahas tentang bagaimana cara mengisolasi enzim amilase dari cairan rumen sapi,
sekaligus mengkarakterisasinya menggunakan metode yang penulis rujuk dari jurnal.
Ucapan terimakasih penulis haturkan kepada pihak-pihak yang telah
membantu penulis dalam penyusunan makalah ini, terkhusus kepada:
1. Dra. R. Susanti, M.P dan dr. Ari Yuniastuti, S.Pt, M.Kes selaku dosen
pengampu mata kuliah enzimologi.
2. Dosen-dosen atau pihak yang membantu penulisj dalam penyususan proposal
ini
3. Rekan- rekan Biologi angkatan 2013 dan 2012
4. Orang tua penulis tercinta yang memberikan dukungan penuh kepada penulis
baik dalam segi moral ataupun material dalam perkuliahan.
Dalam proposal ini penulis merasa masih banyak kekurangan dalam hal
teknis maupun teori. Untuk itu kritik dan saran sangat kami harapkan untuk
penyempurnaan proposal ini.Semoga proposal ini bermanfaat bagi penulis dan bagi
pembaca.
Semarang, 5 November 2014
Penulis
2
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL........................................................................................................1
KATA PENGANTAR ........................................................................................................2
DAFTAR ISI.......................................................................................................................3
BAB I : PENDAHULUAN.................................................................................................4
1.1 Latar Belakang.........................................................................................................4
1.2 Rumusan Masalah....................................................................................................6
1.3 Tujuan......................................................................................................................6
BAB II : TINJAUAN PUSTAKA.......................................................................................7
2.1 Pengertian Isolasi dan Karakterisasi Enzim............................................................7
2.2 Cairan Rumen Sapi..................................................................................................8
2.3 Enzim Amilase........................................................................................................11
BAB III :METODE PENELTIAN......................................................................................12
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian..................................................................................12
3.2 Alat dan Bahan Penelitian.......................................................................................12
3.3 Metode Penelitian....................................................................................................13
BAB 1V : HASIL DAN PEMBAHASAN..........................................................................15
BAB V : PENUTUP............................................................................................................20
DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................................21
3
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Isi rumen sapi yang berasal dari limbah rumah potong hewan (RPH)
cukup melimpah. Jika tidak ditangani dengan baik limbah ini berpotensi mencemari
lingkungan. Limbah rumen ini di sisi lain berpotensi sebagai sumber enzim yang
dapat menggantikan sebagian enzim komersial dalam mengatasi kendala pakan
unggas berkualitas rendah. Penambahan enzim cairan rumen pada bahan pakan lokal
atau ransum unggas diharapkan dapat meningkatkan efisiensi penggunaan pakan
(Budiansyah, 2011). Penelitian pemanfaatan isi rumen sapi sebagai pakan unggas
sampai saat ini terbatas hanya pada bagian padatan, sedangkan cairan rumen sapi
(CRS) sebagai pakan tambahan dan pakan suplemen belum dilakukan secara
mendalam. Selama ini isi rumen hanya dibuang percuma dan tidak dimanfaatkan,
hanya sebagian kecil saja yang memanfaatkannya sebagai kompos.
Berdasarkan data Statistik Peternakan (2007), jumlah sapi yang dipotong
setiap tahun tidak kurang dari 1,75 juta ekor, sekitar 1,5 juta ekor berasal dari sapi-
sapi lokal, dan sisanya adalah sapi-sapi impor. Jumlah cairan rumen mencapai 31 liter
per ekor (Priego et al., 1977). Produksi pakan ternak di Indonesia tahun 2008
mencapai 8,156 juta ton dari kapasitas terpasang 12 juta ton. Sekitar 83% dari jumlah
ini diprioritaskan guna pemenuhan kebutuhan ternak unggas (Ditjennak 2010).
Berdasarkan sapi-sapi yang dipotong tersebut potensi cairan rumen sapi mencapai
54,25 juta liter per tahun. Beberapa peneliti melaporkan bahwa cairan rumen sapi
hidup kaya akan selulase, amilase, protease, xilanase dan lain-lain (Lee et al., 2002;
4
Morgavi et al., 2000). Lee et al. (2002) melaporkan cairan rumen sapi hidup yang
diberi makan ransum berbasis hay alfalfa mengandung selulase sebesar 362,7±12,8
IU/ml, xilanase sebesar 528,6±29,03 IU/ml, amilase sebesar 439,0±16,53 IU/ml, dan
protease sebesar 84,8±2,52 IU/ml. Aktivitas enzim-enzim tersebut cukup tinggi.
Meng et al. (2005) melaporkan bahwa penggunaan enzim dengan dosis
94 unit aktivitas selulase, 6360 unit aktivitas xilanase, dan 1090 unit aktivitas
mananase per kg ransum dapat memperbaiki performa ayam broiler. Alam et al.
(2003) melaporkan bahwa penggunaan enzim komersial ”Roxazyme G” dalam
ransum dengan dosis 800 unit aktivitas selulase, 2600 unit aktivitas xilanase dan 1800
unit aktivitas β-glukanase per kilogram juga sudah dapat memperbaiki performa
ayam broiler. Hal tersebut berarti bahwa penggunaan enzim cairan rumen sapi kurang
lebih sebanyak 4-12 ml per kg ransum sudah cukup untuk memperbaiki performa
ayam broiler.
Berbeda dengan sapi hidup, sapi yang akan dipotong umumnya
dipuasakan sehingga jumlah dan kualitas enzim yang dihasilkan akan berbeda.
Berkaitan dengan hal ini, dalam rangka memanfaatkan cairan rumen sapi asal RPH
sebagai sumber enzim untuk meningkatkan kualitas pakan ternak, kondisi optimum
aktivitas enzim perlu diketahui agar penggunaannya dapat disesuaikan dengan
kondisi suhu, pH, dan pengaruh ion-ion logam yang optimum. Kondisi optimum
aktivitas enzim ketika masih di dalam rumen kemungkinan berbeda dengan kondisi
optimum aktivitas enzim bila sudah berada di luar tubuh sapi. Suhu di dalam rumen
sapi dalam keadaan normal rata-rata 38,54 0C dengan kisaran suhu 36,70-39,870C
(AlZahal et al., 2008), dan pH berkisar 5,2–6,7 (Khampa et al., 2006). Oleh karena itu
kajian tentang karakteristik (kondisi optimum) enzim-enzim karbohidrase pada cairan
rumen sapi asal RPH tersebut penting dilakukan.
Penelitian ini dilakukan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi enzim
karbohidrase dalam cairan rumen sapi asal RPH khususnya enzim amilase,
5
menentukan suhu dan pH optimum enzim serta mengevaluasi pengaruh ion-ion
logam dan bahan kimia terhadap aktivitas enzim dari cairan rumen sapi asal RPH
agar bisa dijadikan sebagai sumber enzim dalam campuran ransum unggas berbahan
baku pakan lokal.
1.2 Rumusan Masalah
Dari uraian di atas, penulis dapat merumuskan masalah sebagai berikut :
1. Apakah terdapat enzim amylase pada cairan rumen sapi asal rumah
potong hewan?
2. Bagaimana cara mengukur aktivitas enzim amilase dari cairan rumen sapi
asal rumah potong hewan?
1.3 Tujuan
Tujuan dari penyusunan makalah ini adalah sebagai berikut :
1. Untuk mengetahui adanya nzim amylase dalam cairan rumen sapi aal
rumah potong hewan.
2. Untuk mengetahui tentang cara mengukur aktivitas enzim amilase dari
cairan rumen sapi asal rumah potong hewan
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Pengertian Isolasi dan Karakterisasi Enzim
Isolasi merupakan proses memisahkan enzim dari sumbernya dengan
melibatkan beberapa teknik sekaligus. Enzim yang ditemukan di pasaran berasal dari
berbagai macam organisme, dengan berbagai tingkat kemurnian, contoh: α-Amilase,
Glukoamilase, Protease. Berdasarkan fungsi hayatinya, ada dua jenis enzim yaitu ;
enzim intraselluler, enzim ekstraselluler (lebih mudah diisolasi).
Isolasi enzim intraseluler merupakan proses pelepasan enzim dari sel.
Isolasi enzim dari tumbuhan memiliki tingkat kesulitan yang tinggi, karena dinding
selnya keras, cenderung menimbun zat-zat racun dalam vakuole (misal fenol),
sehingga ketika dinding pecah, racun dan enzim akan bercampur dan berinteraksi.
Cara mengatasi keadaan yang seperti itu bisa dengan menambahkan zat pereduksi,
seperti β- merkaptoetanol, askorbat, atau tioglikolat, dan menggunakan tanaman
muda. Pemurnian enzim sama dengan prinsip pemurnian protein. Metode pemurnian
didasarkan pada sifat enzim yaitu ukuran, muatan, hidrofobisitas, stabilitas, aktivitas,
dan afinitas.
Karakterisasi pada enzim bertujuan untuk menentukan kondisi optimum
kerja enzim agar reaksi enzimatis dapat berjalan dengan optimal. Hal-hal yang perlu
diperhatikan ketika melakukan karakterisasi enzim ialah penentuan suhu, waktu
inkubasi, dan pH optimum.
7
Suhu optimum yaitu suhu yang paling tepat bagi suatu reaksi yang
menggunakan enzim tertentu untuk menghasilkan suatu produk
(Wirahadikusumah, 1989). Kenaikan suhu dapat mempercepat reaksi dan
meningkatkan kecepatan molekul karena bertambahnya energi kinetik yang
mempercepat gerak vibrasi, translasi, dan rotasi enzim dan substrat sehingga
memperbesar peluang keduanya untuk bereaksi.Kenaikan suhu melebihi suhu
optimum menyebabkan protein enzim dan substrat mengalami perubahan
konformasi yang bersifat detrimental. Perubahan konformasi substat
mengakibatkan gugus reaktif mengalami hambatan dan tidak dapat lagi memasuki
sisi aktif enzim (Suhartono, 1989).
Waktu inkubasi adalah waktu kontak antara enzim dengan substrat
untuk membentuk kompleks enzim-substrat yang akhirnya terbentuk produk. PH
optimum adalah pH yang paling tepat bagi suatu reaksi yang menggunakan enzim
tertentu untuk menghasilkan produk (Wirahadikusumah, 1989).
Kondisi pH berpengaruh terhadap aktivitas enzim, karena perubahan
muatan dapat mempengaruhi aktivitasnya akan terganggu, dimana perubahan
tersebut berakibat pada perubahan muatan residu asam amino yang berfungsi
mengikat substrat. Perubahan ion H+ yang ada dalam larutan enzim memberikan efek
pada bagian katalitik dan konformasi enzim.
2.2 Cairan Rumen Sapi
Sumber enzim yang murah dan dapat dimanfaatkan dengan mudah adalah
enzim dari cairan rumen sapi asal rumah potong hewan (RPH). Berdasarkan laporan
Lee et al. (2002) diketahui bahwa cairan rumen mengandung enzim selulase, amilase,
protease, xilanase, mannanase, dan fitase. Enzim-enzim ini dalam rumen
menyebabkan efektivitas pencernaan danefisiensi penggunaan pakan pada ternak
ruminansia lebih tinggi dibanding ternak unggas, terutama penggunaan bahan pakan
berserat kasar tinggi. Penambahan enzim cairan rumen pada bahan pakan lokal atau
8
ransum unggas diharapkan dapat meningkatkan efisiensi penggunaan pakan.
Kemampuan enzim hasil ekstraksi dari cairan rumen sapi asal RPH dalam
mendegradasi pakan perlu dikaji, terutama kemampuannya dalam mendegradasi
karbohidrat agar penggunaan optimum enzim pada pakan ternak, terutama pada
pakan ternak lokal berkualitas rendah yang mengandung serat kasar tinggi dapat
diketahui.
A. Budiansyah, dkk (2011) telah melakukan penelitian terhadap
kandungan cairan rumen sapi impor dan lokal asal rumah potong hewan. Hasilnya
adalah cairan rumen sapi baik sapi lokal maupun sapi impor mengandung enzim
selulase, xilanase, mannanase, amilase, fitase dan protease. Pengendapan optimum
enzim-enzim cairan rumen sapi lokal diperoleh dengan tingkat kejenuhan amonium
sulfat 60 %, sedangan enzim-enzim cairan rumen sapi impor diperoleh pada tingkat
kejenuhan 70 %. Cairan rumen sapi lokal asal rumah potong hewan yang
mengandung enzim selulase, xilanase, mannanase, amilase, protease dan fitase
mampu menghidrolisis karbohidrat bahan pakan lokal. Taraf optimum penambahan
enzim cairan rumen untuk menghasilkan total gula terlarut tertinggi pada ransum
starter dan finisher dicapai pada taraf 1,0 %, pada daun ubi kayu dan bungkil inti
sawit adalah pada taraf 2,0 %, sedangkan pada dedak halus, kacang kedelai
danbungkil kelapa diperoleh pada taraf 2,5 %.
Cairan rumen sapi, selain mengandung mikroba rumen dan enzim-enzim
yang disekresikan oleh mikroba rumen, juga mengandung zat-zat makanan hasil
perombakan mikroba rumen dan enzim, serta vitamin-vitamin dan mineral-mineral
yang larut dalam cairan rumen. Pemisahan cairan rumen dengan sentrifugasi pada
kecepatan 10 000 g selama 10 menit akan menghasilkan bahan padatan yang berasal
dari sel-sel mikroba dan nutrien yang larut di dalam cairan rumen. Bahan tersebut
kaya akan protein, asam amino, vitamin dan mineral. Komposisi asam amino, mineral
dan vitamin dalam endapan cairan rumen seperti halnya enzim-enzim, juga
tergantung dari perlakuan pakan yang diberikan. Komposisi asam-asam amino,
9
mineral dan vitamin pada endapan cairan rumen asal sapi-sapi impor yang dipelihara
dan digemukkan dengan mendapat lebih banyak konsentrat dalam pakannya akan
lebih tinggi karena lebih banyak asam-asam amino, mineral dan vitamin yang larut
dalam cairan rumen dibandingkan dengan sapi-sapi lokal yang lebih banyak
mendapatkan hijauan dan makanan kasar dalam pakannya.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Agus Budiansyah, Resmi,
dkk (2011) menyatakan bahwa endapan cairan rumen baik asal sapi lokal maupun
sapi impor mengandung mineral-mineral Na, K dan Fe yang tinggi dengan
kandungan Na sebesar 13.47% pada sapi lokal dan 18.40% pada sapi impor, K
sebesar 7.73% pada sapi lokal dan 10.25% pada sapi impor, dan kandungan Fe
sebesar 14.52 gram/kg pada sapi lokal dan 28.18 gram/kg pada sapi impor.
Kandungan vitamin dan asam amino endapan cairan rumen lebih rendah
dari premix. Berdasarkan total kandungan asam amino dibandingkan dengan
kandungan proteinnya, endapan cairan rumen sapi lokal mengandung sebanyak
66.8% protein yang berupa asam amino, sedangkan endapan cairan rumen sapi impor
mengandungsebanyak 73.2% protein yang berupa asam amino. Kualitas asam amino
berdasarkan skor kimia, endapan cairan rumen sapi lokal mempunyai skor 58.7%
sedangkan endapan cairan rumen sapi impor mempunyai skor 59.47%, asam amino
yang menjadi pembatas adalah asam amino lisin.
Endapan cairan rumen baik sapi lokal maupun impor mempunyai pH
yang tinggi yaitu 10.03 ± 0.04 pada endapan cairan rumen sapi lokal dan 10.01 ± 0.04
pada endapan cairan rumen sapi impor, dan tingkat kelarutan bahan kering adalah
39.11 ± 0.28 % pada endapan cairan rumen sapi lokal dan 35.5 ± 47 % pada endapan
cairan rumen sapi impor. Endapan cairan rumen sapi impor mempunyai berat jenis
(1.88 ± 0.0 g/cc), kerapatan tumpukan (0.75 ± 0.01 ton/m3) dankerapatan pemadatan
tumpukan (0.85± 0.01 ton/m3) yang lebih tinggi dari berat jenis (1.54 ± 0.06 g/cc),
kerapatan tumpukan (0.60 ± 0.01 ton/m3) dan kerapatan pemadatan tumpukan (0.65
10
± 0.02 ton/m3), endapan cairan rumen sapi lokal, sedangkan sudut tumpukan relatif
sama (25.71 – 25.96 derajat).
2.3. Enzim Amilase
Salah satu enzim golongan hidrolitik yang memiliki aplikasi yang luas
dalam berbagai bidang industri seperti pangan, kesehatan, dan lingkungan adalah
enzim amilase. Dalam industri pangan, enzim amilase merupakan salah satu enzim
ekstraseluler komersial karena berfungsi menyediakan gula hidrolisis, sehingga
dapat dimanfaatkan untuk produksi sirup glukosa atau sirup fruktosa yang
mempunyai tingkat kemanisan tinggi. Amilase ini banyak digunakan dalam
menghidrolisis molekul pati menjadi maltosa ataupun glukosa dan amilase juga
berfungsi pada pembuatan roti dan makanan bayi (Sebayang, 2005). Oleh karena
enzim golongan tersebut memiliki nilai ekonomi tinggi, maka perlu mendapat
perhatian khusus terutama karena enzim ini sangat berpotensi diaplikasikan dalam
bidang pangan.
Amilase adalah enzim hidrolase glikosida yang mengkatalisis pemecahan
pati menjadi gula. Amilase merupakan salah satu enzim yang paling penting dalam
bioteknologi saat ini. Amilase merupakan enzim yang memecah pati yang diproduksi
oleh berbagai jenis makhluk hidup seperti dari bakteri, jamur, tumbuhan, manusia.
Amilase mewakili sekitar 30% dari produksi enzim industri di seluruh dunia. Amilase
telah diturunkan dari beberapa jamur, ragi, bakteri dan actinomycetes. Jenis-jenis
enzim amilase yaitu α-amilase, β-amilase, dan γ-amilase (glukoamilase) (Henny,
2013).
11
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Waktu pelaksanaan yaitu pada tanggal 14 – 18 November 2014 dan
bertempat di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan
Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri
Semarang.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat Bahan
Termos Air berisi 2 L Isi rumen sapi
Beaker Glass Amonium Sulfat bertingkat 60%
Gelas Ukur Buffer fosfat PH 7
12
Botol Flacon Sodium Hipoklorit
Mikropipet Pati / Kanji
Tube DNS
Tip Rochelle Salt
Pengaduk Aquades Steril
Kertas PH NaOH
Inkubator Glukosa
Sentrifuse
Water Bath
Lemari Pendingin
Magnetic stirer
Erlenmeyer
Spektrofotometer
3.3 Metode Penelitian
1. Persiapan Enzim Cairan Rumen
Isi rumen sapi lokal yang diambil dari sapi yang dipotong di
RPH Penggaron Semarang. Cairan rumen diambil dari isi rumen sapi
dengan cara filtrasi dibawah kondisi dingin. Cairan rumen diambil dari isi
rumen sapi dalam keadaan masih hangat kemudian disimpan di dalam
termos yang sebelumnya diisi dengan air panas untuk mempertahankan
suhunya. Cairan rumen sapi sebanyak 100 ml disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4 oC untuk memisahkan
supernatan dari sel-sel dan isi sel mikroba (Lee et al., 2000). Supernatan
kemudian diambil sebagai sumber enzim kasar.
2. Fraksinasi Enzim dengan Amonium Sulfat
Supernatan yang terdiri atas enzim-enzim selanjutnya
direaksikan dengan amonium sulfat pada konsentrasi 60% yang
13
didapatkan dari penelitian sebelumnya memperoleh tingkat kejenuhan
tertinggi untuk enzim amylase dan diaduk menggunakan magnetik stirer
selama kurang lebih 1 jam, dan kemudian didiamkan semalam pada suhu
4 oC.
Supernatan yang dihasilkan kembali disentrifugasi dengan
kecepatan 10.000 g selama 15 menit pada suhu 4 oC. Endapan (enzim)
yang diperoleh diambil kemudian dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7,0
dengan perbandingan 10:1 (endapan dari 100 ml supernatan cairan rumen
dilarutkan dalam 10 ml buffer fosfat pH 7,0) tanpa dilakukan pemurnian.
Enzim dalam buffer kemudian disimpan pada lemari pendingin untuk
diukur aktivitasnya.
3. Aktivitas Amilase (Moharrery & Das)
Mengukur laju pelepasan gula pereduksi selama inkubasi dari
enzim dengan substrat pati. Sebanyak 0,25 mL sampel (enzim rumen
sapi), 0,25 mL larutan kanji (1 g pati dalam 100 mL air suling) dan 0,5 mL
buffer fosfat PH 7, dicampur dalam tabung dan diinkubasi selama 15
menit pada 39° C. Setelah itu ditambahkan 3 mL dinitrosalicylic acid (0.3
g DNS dalam 30 mL NaOH (0.5 g NaOH dan 0.84 ml sodium hipoklorit
kemudian ditambahkan air 100 ml) ditambahkan kedalam tube dan direbus
di water bath selama 10 menit pada suhu 39oC. Kemudian tambahkan
Rochelle salt sebanyak 1 ml (10 g Rochelle yang dilarutkan sampai 250
ml) yang di masukkan ke dalam tube. Kemudian larutan dilarutkan sampai
20 ml dengan air distilasi. Kemudian di absorbansi pada 575 nm.
Pembuatan larutan standar glukosa dengan konsentrasi berbeda yaitu 0%,
2%, 4%, 6&, 8%, 10%. Masing masing konsentrasi diambil sebanyak 2.5
ml dan diberi perlakuan sama dengan larutan sampel enzim cairan rumen
sapi kemudian dilakukan absorbansi dengan spektrofotometer pada 575
nm.
14
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Produksi Enzim Kasar
Cairan rumen diambil dari isi rumen sapi dengan cara filtrasi
kemudian disimpan di dalam termos yang sebelumnya diisi dengan air
panas untuk mempertahankan suhunya. Karena Kondisi optimum aktivitas
enzim ketika masih di dalam rumen kemungkinan berbeda dengan kondisi
optimum aktivitas enzim bila sudah berada di luar tubuh sapi. Suhu di
dalam rumen sapi dalam keadaan normal rata-rata 38,54 oC dengan
kisaran suhu 36,70-39,87 oC (Al Zahal et al., 2008), dan pH berkisar 5,2–
6,7 (Khampa et al., 2006). Cairan hasil sebanyak 100 ml disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 g selama 10 menit pada suhu 4 oC untuk
memisahkan supernatan dari sel-sel dan isi sel mikroba (Lee et al., 2000).
Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak
berada pada kondisi fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan
struktur dan fungsi protein, maka semua proses isolasi harus dilakukan
15
pada kondisi suhu rendah (0 - 4 C).⁰ Supernatan kemudian diambil sebagai
sumber enzim kasar.
4.2 Pemakaian Amonium Sulfat
Supernatan yang terdiri atas enzim-enzim selanjutnya
direaksikan dengan amonium sulfat. Penggunaan amonium sulfat dalam
pengendapan enzim dilakukan karena amonium sulfat mempunyai
kelarutan yang tinggi, relatif murah, tidak beracun dan dapat menstabilkan
enzim (Chaplin dan Bucke 1990). Pengendapan dengan garam
menggunakan prinsip salting out dimana kelarutan protein akan
berkurang pada konsentrasi garam yang tinggi. Konsentrasi garam
yang meningkat mengakibatkan air akan lepas dari protein yang
menyebabkan terjadinya penempelan ikatan hidrofobik dari satu protein
dengan protein yang lain menghasilkan endapan. Pengendapan dengan
amonium sulfat didasarkan pada persamaan sifat kepolaran dari amonium
sulfat dan air. Penambahan garam amonium sulfat ke dalam larutan
protein akan merusak mantel dan menarik molekul air dari sekitar
permukaan molekul protein, akibatnya protein tidak lagi terlindungi
molekul air melainkan beragregasi dengan sesamanya dan kemudian
mengendap (Scope, 1987). Penambahan garam dilakukan secara
perlahan pada suhu dingin sambil dilakukannya pengadukan,
pengkondisian suhu dingin dilakukan karena terjadi peningkatan suhu
akibat proses pelarutan yang di bantu dengan magnetic stirrer kurang
lebih 1 jam, Supernatan enzim yang bebas sel yang telah di tambahkan
dengan amonium sulfat didiamkan selama semalam pada suhu 4 oC.
Pengendapan optimum cairan rumen sapi (CRS) lokal paling banyak
terjadi pada konsentrasi garam amonium sulfat 60%, yaitu pada enzim
selulase, xilanase, amilase dan fitase (Budiansyah, 2011). Supernatan
kembali disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 g selama 15 menit pada
16
suhu 4 oC. Endapan (enzim) yang diperoleh diambil kemudian dilarutkan
dalam buffer fosfat pH 7,0 dengan perbandingan 10:1 (endapan dari 100
ml supernatan cairan rumen dilarutkan dalam 10 ml buffer fosfat pH 7,0)
tanpa dilakukan pemurnian. Enzim dalam buffer kemudian disimpan pada
lemari pendingin selama 1 x 24 jam untuk diukur aktivitasnya.
4.3 Uji Aktivitas Enzim
Pada pemeriksaan aktivitas enzim dilakukan pengukuran kadar
glukosa untuk pembuatan kurva standar dengan menggunakan soluble
starch sebagai substrat. Unit aktivitas enzim didasarkan perhitungan
pada kurva standar glukosa dengan DNS (3,5-dinitrosalisilat) dengan
berbagai konsentrasi mengikuti metode Moharrery & Das (2002). DNS
merupakan senyawa aromatis yang akan bereaksi dengan gula reduksi
maupun komponen pereduksi lainnya untuk membentuk 3-amino-5-
nitrosalicylic acid, suatu senyawa yang mampu menyerap dengan kuat
radiasi gelombang elektromagnetik pada 575 nm. Semakin banyak
komponen pereduksi yang terdapat dalam sampel, maka akan semakin
banyak pula molekul 3-amino-5-nitrosalicylic acid yang terbentuk dan
mengakibatkan serapan semakin tinggi. Dalam pembuatan reagen DNS,
kita perlu menambahkan NaOH ke dalam larutan yang bertujuan untuk
memberikan suasana basa. Karena nantinya reaksi dari reagen DNS ini
bekerja pada suasana basa. Selain menambahkan NaOH, juga
ditambahkan kalium natrium tartrat 40% (Rochelle Salt). Fungsi dari
penambahan ini adalah untuk menstabilkan warna yang terbentuk pada
saat reaksi terjadi yaitu merah bata/kecoklatan. Di samping itu, kadang
juga diperlukan pemanasan untuk membantu mempercepat jalannya
17
reaksi. Karena nantinya yang akan diukur adalah absorbansi dari warna
yang terbentuk tersebut dengan spektrofotometri pada panjang gelombang
575 nm. Reagen DNS mendeteksi adanya gula reduksi dalam sampel
berupa polisakarida dalam bentuk glukosa dari hasil hidrolisis substrat pati
oleh enzim amilase. Serapan diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 570 nm. Dari pengukuran secara spektrofotometri
diperoleh data sebagai berikut:
Tabel 1. Hasil Absorbansi pada gelombang 575 nm.
KonsentrasiAbsorbansi 1
Absorbansi 2 Absorbansi 3
Rata rata Absorbansi
0 0.007 0.006 0.006 0.006333333
20% 0.006 0.006 0.007 0.006333333
40% 0.011 0.012 0.01 0.011
60% 0.018 0.014 0.018 0.016666667
80% 0.018 0.018 0.019 0.018333333
100% 0.015 0.02 0.019 0.018
Sampel 0.022 0.02 0.021 0.021
18
0 20% 40% 60% 80% 100% Sampel0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
f(x) = 0.00266666666666666 x + 0.00328571428571431
Series1
Linear (Series1)
Grafik 1.
Dari grafik 1. Diperoleh persamaan matematis
y = 0.002x + 0.003
0.021 = 0.002 x + 0.003
0.018 = 0.002 x
9 = x
dimana x adalah aktivitas enzim pada panjang gelombang 575 nm. Dari
persamaan ini, maka diperoleh data sebagai berikut menunjukan bahwa nilai
aktivitas enzim amilase sebesar 9 Unit/ml. Unit aktivitas enzim dalam
penelitian ini didefinisikan sebagai kemampuan α-amilase untuk
menghidrolisis pati menjadi glukosa sebanyak 1 mg/mL.
19
Uji aktivitas amilase secara kuantitatif
Prinsip uji aktivitas enzim amilase didasarkan pada perhitungan
gula pereduksi dari hasil hidrolisis pati dengan metode Nelson-Somogyi.
Kadar glukosa hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase dihitung dengan
menggunakan kurva kalibrasi larutan standar glukosa pada berbagai
konsentrasi, panjang gelombang maksimum dari larutan standar glukosa yaitu
575 nm. Perhitungan aktivitas enzim dilakukan dengan mensubtitusikan
absorbansi larutan yang diperoleh pada pengujian aktivitas enzim ke
dalam persamaan regresi kurva kalibrasi larutan standar glukosa. Diperoleh
aktivitas sampel enzim amilase dari cairan rumen rumen sapi sebesar 9
Unit/ml. Dibandingkan dengan aktivitas enzim amilase pada alang alang yaitu
sebesar 0.119 U/mL, aktivitas enzim amilase dari Saccharomyces cerevisiae
FNCC 3012 adalah sebesar 7,28 Unit/mg protein,dan Aktivitas enzim amilase
dari Aspergillus oryzae FNCC 6004 yaitu sebesar 3,26 Unit/mg protein. Maka
aktivitas enzim amilase pada cairan rumen sapi tergolong tinggi. Hal ini dapat
dimanfaatkan sebagai bahan tambahan pakan atau ransum agar efisien.
BAB V
PENUTUP
A. Simpulan
1. Terdapat enzim amylase pada cairan rumen sapi asal rumah potong hewan
20
2. Uji aktivitas amylase dari cairan rumen sapi menggunakan subtrat pati
yang akan dihidrolisis menjadi glukosa
3. Aktivitas diabsorbansi pada 575 nm dengan larutan standar glukosa dan
didapatkan aktivitas sebesar 9 unit/ml termasuk aktivitas amylase yang
besar dibandingkan dari Saccharomyces cerevisiae FNCC 3012 maupun
Aspergillus oryzae FNCC 6004.
DAFTAR PUSTAKA
A. Budiansyah, dkk. 2011. Hidrolisis Zat Makanan Pakan Oleh Enzim Cairan Rumen
SapiAsal Rumah Potong Hewan. Jurnal. Agrinak :Vol . 01 No. 1
September 2011:17–24. dPusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu
Pengetahuan Indonesia : Cibinong.
A. Budiansyah, dkk. 2010. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Karbohidrase Cairan
Rumen Sapi Asal Rumah Potong Hewan. Jurnal. Media Peternakan,
21
April 2010, hlm. 36-43 : Vol. 33 No. 1. Pusat Penelitian Bioteknologi
LIPI : Cibinong.
____________. 2011. Karakteristik Endapan Cairan Rumen Sapi asal Rumah Potong
Hewan sebagai Feed Supplement.Jurnal. Jurnal Ilmiah Ilmu-Ilmu
Peternakan Mei 2011, Vol. XIV. No.1. Pusat Penelitian Bioteknologi
LIPI : Cibinong.
Endang Purbowati, dkk. 2014. Karakteristik Cairan Rumen, Jenis, Dan Jumlah
Mikrobia Dalam Rumen SapiJawa Dan Peranakan Ongole. Buletin
Peternakan Vol. 38(1): 21-26, Februari 2014. Fakultas Peternakan dan
Pertanian, Universitas Diponegoro, Kampus drh. Soejono
Koesoemowardojo, Tembalang : Semarang.
Moharrery, A. & Tirta. K. Das.2002. Correlation between microbial enzyme
activities in the rumen fluid of sheep under different treatments. Reprod.
Nutr. Dev. 41: 513 - 529.
Sari, Dewi P,. dkk. 2013. Isolasi, Purifikasi Dan Karakterisasi Α-Amilase Dari
Saccharomyces cerevisiae Fncc 3012. Chem Info Vol 1, No 1, Hal 337 –
344 , 2013. Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas
Diponegoro.
Ompusunggu, Henny E. S., dkk. 2013. Kajian Biomedik Enzim Amilase dan
Pemanfaatannya Dalam Industri. Journal. Universitas Sumatra Utara.
22