presentasi real time pcr dasar&teknis lc nano

1Teknis Pemeriksaan Biomolekular

dengan Metode Real Time PCR

2012

PT Roche Indonesia

2Teknis Pemeriksaan Biomolekular


Prinsip Metode PCR & Real-Time PCR

Desain Laboratorium PCR

Quality Assurance

Aplikasi Real-Time PCR

3Prinsip Metode PCR & Real-Time PC2009

4Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR adalah paten teknologi yang dapat membuat tiruan berlipat ganda dari sekuen nukleotida spesifik dari organisme target.

Metoda PCR menyediakan suatu mekanisme untuk mendeteksi target organisme dengan konsentrasi yang sangat kecil dengan spesifitas yang tinggi.

Teknologi PCR ditemukan oleh Kary Mullis pada tahun 1985.

5PRINSIP METODE PCR & REAL-TIME PCR

Apakah Metoda PCR ?

Metoda PCR dapat digunakan untuk berbagai aplikasi

penting seperti bidang penelitian biologi, genetika,

arkeologi, forensik, tes paterniti dan diagnostik klinik.

Didalam bidang diagnostik klinik, hanya dibutuhkan

jumlah sampel yang sangat sedikit dan dibuat tiruannya

berlipat ganda sehingga ada atau tidak adanya virus dan

bakteri spesifik serta mutasi materi genetik dapat

dideteksi

6Tahapan Proses PCR

Pre PCR :

Preparasi reagensia

Preparasi spesimen : isolasi/ purifikasi DNA/ RNA

PCR : proses amplifikasi

Denaturasi (pemisahan rantai DNA)

Annealing (penempelan primer)

Extension (pemanjangan oleh enzim)

Post PCR :

Deteksi/ Analisa Hasil PCR

7PRE-PCR

Preparasi spesimen :

isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat

Isolasi/ ekstraksi/ purifikasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekular biologi.

Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik (manusia, hewan, tumbuhan) dilakukan melalui proses :

Penghancuran dinding sel

Penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid dan karbohidrat dari sampel

Pengendapan DNA/RNA

Pemanenan

8Preparasi spesimen :


dengan Metode Phenol

Isolasi DNA Isolasi RNA

9 Berikatan dengan glass fleece

Garam kaotropik

Wash and spin

Pelarutan asam nukleat

Analisa selanjutnya



dengan Metode Kolom

10



dengan Metode Magnetik Glass Particle

DNA

or

RNA

1. Lysis,

Stabilization and

Deproteinization

2. Capture

Virus or Cell

3. Wash 4. Elute

Incubation Temperature: 37C

Incubation

Temperature: 80CRoom Temperature

11

Sekuen Target

Target Sequence

DNA Strand

Double Helix

DNA StrandSupercoiled

DNA Strand

Chromosome

DNA/ RNA diperoleh dari

hasil isolasi/ purifikasi

target organisme

12

DNA Double Helix

13

Sekuen NukleotidaHydrogen Bonds

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

Deoxyribose

(Sugar molecule)

Phosphoric Acid

(Phosphate molecule)

Cytosine (C)

Adenine (A)

Thymine (T)

Guanine (G)

14

Target Denaturation

Primer Annealing

Primers

ExtensionPolymerase & dNTPs

PCR Review

Reverse Transcription

and

Polymerase Chain Reaction

RNA Virus cDNA

Target Amplification

cDNA

Reverse

Transcription

15

Deteksi/ Analisa Hasil PCR

Elektroforesis gel agarosa (horizontal)

Eleftroforesis gel poliakrilamid (vertikal)

Enzym labelling oligonucleotide

Biotin-labelled oligonucleotide

Digoxigenin-labelled oligonucleotide

Selanjutnya : RFLP, Sequencing dll.

16

Deteksi Produk PCR:

Elektroforesis Gel agarosa

17

Deteksi Produk PCR:

Elisa : Microwell Plate

18

PRINSIP METODE PCR & REAL-TIME PCR

Apakah Real-Time PCR ?

Real Time PCR dapat dikatakan sebagai mengoleksi dan menganalisa data yang terjadi selama proses reaksi

Real Time PCR berarti amplifikasi dan analisa terjadi bersamaan Dikenal sebagai Rapid Cycle PCR dengan siklus temperatur antara 20-60

detik Produk PCR dapat dianalisa selama proses amplifikasi Menggunakan pewarna DNA dan probe fluoresensi Data dikoleksi dari tabung yang sama didalam instrumen yang sama Tidak ada transfer sampel, penambahan reagensia atau gel separasi

19

Apakah Real-Time PCR ?

Format deteksi :SYBR Green IHybridization Probes (HybProbe Probes)Hydrolysis probes / Taqman ProbesSimpleProbe Probes

Dapat melakukan real-time quantitative PCR Real Time PCR adalah metode yang powerful, sederhana dan cepat

20Roche Applied Science

Persiapan Proses Real-Time PCR

H2OReaction Buffer

Primer:

ForwardReverse

dNTPs

Taq DNAPolymerase

RNA/DNA template

- Campur dengan baik, naik turun - Spin down dengan hati2- Di Aliquote kedalam beberapa tabung PCR- Tambahkam sampel kedalam setiap tabung- Spin down dengan hati2- Masukkan kedalam LigthCycler

Reaction capillaryOn LightCycler

MWP

21

-1.00

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

0 10 20 30 40 50 60

Cycles

No

rm F

luo

rescen

ce

Ct = 33.2

AFL

Real Time-PCR vs. PCR:

Apa perbedaannya?

Real-Time PCR Agarose Gel Electrophoresis

22

Format Deteksi Real-Timedengan Pewarna Fluoresensi

2009

23

Format SYBR Green I

Ketika SYBR Green I berikatan dengan primer dsDNA, akan terjadipeningkatan fluoresensi

Selama tahapan PCR yang berbeda, intensitas dari sinyal fluoresensiakan berbeda, tergantung dari jumlah dsDNA yang ada

24

Format Hybridization Probe / HybProbe

Hybridization probe merubah fluoresensi pada saat hibridisasi denganfluorescene resonance energy transfer (FRET)

2 probe oligonukleotida sekuen spesifik dilabel dengan pewarna yang berbeda (donor & aseptor) dan ditambahkan kedalam master mix

Dalam analisa HybProbe adanya produk amplifikasi spesifik dapat dibacasecara kuantitatif berdasarkan peningkatan fluoresensi

Fluorescein LC Red

25

Format Hybridization Probe / HybProbe

Spesifik karena 2 probe dihibridisasi dengan target dengan cara yang sangat sekuen spesifik

Primer-dimer tidak terdeteksi karena probe sekuen spesifik tidakmengenalinya

Dapat untuk aplikasi deteksi mutasi, analisis SNP, genotyping SNP , qPCRdan multiplex tes

26

Format Hydrolysis Probes

Dikenal juga dengan nama Taqman Probe

Menggunakan aktivitas exonuclease 5 dari DNA Polymerase

Sebuah probe terdiri dari 2 label, fluorescence reporter dan fluorescenequencher, yang sangat dekat satu sama lain. Ketika probe masih utuh, quencher menahan sinyal fluoresensi reporter

reporter quencher

27

Format Hydrolysis Probes

Pada proses extention, aktivitas exonuclease 5 dari DNA Pol memotonghidrolisis probe dan memisahkan reporter dan quencher

Sinyal fluoresensi reporter tidak lagi tertahan dan dapat memancarkansinyal fluoresensi

Peningkatan sinyal fluoresensi dari reporter berbanding langsung denganakumulasi produk PCR

28

Format Simple Probes

Simple Probe adalah bentuk sederhana dari hybridization probe danhanya menggunakan 1 probe saja

Ketika terjadi hibridisasi akan memancarkan sinyal fluoresensi yang lebihbesar

29

Format Simple Probes

Perubahan sinyal fluoresensi tergantung dari status hibridasi dari probe, semakin stabil hibridisasinya semakin tinggi temperatur melting

Untuk aplikasi SNP genotyping dan deteksi mutasi

30

Teknis Pemeriksaan Biomolekular




Quality Assurance


31

Laboratory Set-up

35

Potential PCR Contamination

36

Tips Mencegah Kontaminasi

Area Pre dan Post-PCR harus ruang yang terpisah.

Peralatan pendukung seperti pipet, jaslab danreagensia harus disediakan di area Pre dan Post-PCR.

Sarung tangan disposibel harus selalu dipakai dansering diganti.

Reaksi harus dikerjakan di dalam kotak laminar flow atau UV dead air box/ entkas yang berlampu UV.

37

Tips Mencegah Kontaminasi

Cegah kontaminasi silang antar spesimen

Gunakan tip pipet berfilter

Sering ganti sarung tangan

Buat kertas kerja spesimen (work form)

Lakukan preparasi reagen dengan hati untuk menghindarikontaminasi DNA & nuklease

Tempat kerja PCR harus disinar UV

Bersihkan meja kerja dan alat dengan alkohol 70% dan/ataularutan bleach 10%

GOOD LAB PRACTICE!

38





Quality Assurance


39

Quality Assurance

Koleksi & proses spesimen

Kualifikasi Reagen pada pergantian no batch/lot

Monitoring data pasien secara sistematik

Rutin quality control

Kalibrasi & perawatan Alat2

Analisa periodik competency assessment

Proficiency Testing

40

Quality Assurance

Evaluasi awal dan validasi dari kit

Evaluasi internal quality control berkelanjutanyang sesuai prosedur

Monitoring hasil melalui quality assesment atauprogram pelatihan

41

Validasi Klinis

Evaluasi menggunakan sampel yang diketahui positif & negatif

Dibandingkan dengan standar panel

Dibandingkan dengan metode tervalidasi atau gold standard

Validasi semua jenis spesimen dan kondisi yang akan dipakai dilab diagnostik

Bila dilakukan modifikasi yang signifikan, harus dibandingkanlagi dengan prosedur aslinya dengan sampel/ jenis sampel yang sama

Reprodusibilitas harus dilakukan dengan analisa berulang kali menggunakan sampel yang sama

42

Parameter Evaluasi

Performance characteristics Accuracy Precision Sensitivity Specificity Genetic variability genotype/subtypes

43

QUALITY CONTROL

Kit Controls

Kontrol Positif

Menunjukkan bahwa semua reagensia dan alat berfungsi baik, semua tahapsudah sesuai prosedur

Kontrol Negatif

Menunjukkan bahwa reagensia tidak terkontaminasi atau tidak adamalfungsi alat yang menyebabkan hasil positif

Kedua kontrol harus dijalankan dalam setiappemeriksaan

Kontrol Internal

Menunjukkan bahwa tidak ada inhibisi PCR atau tidak ada malfungsi alatpada hasil sampel yang negatif

44

Proficiency Testing Programmes

Royal College of Pathologists, Australia (RCPA)

www.rcpaqap.com.au

Quality Control Molecular Diagnostics, UK (QCMD)

www.qcmd.org

National Reference Laboratory, Australia (NRL)

www.nrl.gov.au

Accutest, USA (Digital PT)

www.digitalpt.com

45





Quality Assurance


46

Aplikasi PCR di Bidang Riset / Penelitian

47


Gene Detection

Detection of specific DNA/RNA (e.g. oncology research)

Identification of a specific species (e.g. bacteria, virus)

Pathogen detection (e.g. legionella, white spot virus,

herpes virus, IHHNV)

Antibiotic resistance screening (e.g. MRSA, VRE)

Water quality monitoring

Gene Expression

Studies on minimal residual diseases (MRD)

Determination of mRNA expression levels (e.g. cytokines, chemokines)

Gene dosis quantification (e.g. chromosomal aberrations)

Staph. aureus

48


Genotyping

Mutation in detection in cancer

Pharmacogenetics

Genetic fingerprint

Evolutional studies

Food Safety Analysis

GMO detection

Pathogene in food (e.g. Salmonella, E. coli)

Screening for beer spoilage

Gene Knockdown

Silencing of genes with siRNA

Zea mays

49

Riset / Penelitian

Penyakit Infeksi - Contoh

HIV RNA genotyping HBV DNA - cccDNA HCV RNA micro RNA MTB DNA CMV DNA HPV DNA genotipe 16 & 18 Herpes Virus Toxoplasmosis Fecal Microbiota

Sepsis (gram +/ garm -/ Candida)

EBV

Dengue

Salmonella thyposa

Enterovirus

Rotavirus

H5N1

H1N1

Legionella

Polio Virus

Helicobacter pylori

Dll.

50

Riset / Penelitian

Penyakit Non-Infeksi - Contoh

Colorectal cancer : k-ras

Anti-EGFR

Leukemia: Bcr-abl

Thalasemia : Alfa & beta-globin

Breast cancer : P53

Brca1 & brca2

PTEN

Progesteron reseptor

Estrogen reseptor

Cardiovascular disease :

Apo(a)

Apo B

Apo E polimorfisme

Thrombophilia :

Factor II G20210A & Factor V

Metabolisme obat :

2C9

2D6

2C19

CYP 450

Dll.

51

Applied Science / In-House / HomebrewContoh

52

Terapi Anti-EGFR (contoh : panitumumab & cetuximab) berikatandengan EGFR

Prolifearsi sel2 tumor berhenti

Sel2 tumor dengan mutasi K-RAS :

KRAS tetap On(aktif proliferasi)

Sel2 tumor terus berkembang, walau ada ikatan dengan anti-EGFR.

Efikasi terapi Anti-EGFR :

WT: efikasi lebih tinggi

Mutant: tidak ada efikasi

Aplikasi Bidang Patologi Molekular

Status Mutasi K-RAS & Terapi anti-EGFR

53

Mutation Exon Base Change Cosmic ID

12 Asp 1 Gly12Asp (GGT>GAT) 521

12 Ala 1 Gly12Ala (GGT>GCT) 522

12 Arg 1 Gly12Arg (GGT>CGT) 518

12 Cys 1 Gly12Cys (GGT>TGT) 516

12 Ser 1 Gly12Ser (GGT>AGT) 517

12 Val 1 Gly12Val (GGT>GTT) 520

13 Asp 1 Gly13Asp (GGC>GAC) 532

Mutation Coverage

98.5% of mutations reported in CRC

54

Step 1 - Biopsi sel tumor.

Jaringan dibuat preparat

Step 2 - Ekstraksi DNA (jar.parafin)........

Step 3 - Target sampel + master mix PCR..........

Step 4 - Sinyal fluoresensi menunjukan adanya mutasi

Pemeriksaan K-RAS

Tahapan

55

Real Time PCR with the LightCycler System

LightCycler 2.0

LightCycler Nano

LightCycler 480

56

LightCycler Real-Time PCR Platform

Over a Decade of Real-Time PCR Evolution

57

High Precision and Reproducibility

High Dynamic Range and Sensitivity

High Temperature Accuracy

Powerful Performance

58





59

Powerful


Excellent resolutionof 2-fold concentrations

TaqMan

Experimental setup: UPL 137 (Parvo) 200 nM, primers 200 nM Taq Man format: FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 2-fold dilution series (1E6 7.81E3 copies) 4 replicates each

60

Powerful


Excellent intra-run homogeneity

TaqMan

Experimental setup: 400 nM primers, FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 10 replicates each (wt / het / mut) 2 NTCs Target: add1

61





62

Powerful


SYBR Green TaqMan

Experimental setup: UPL 137 (Parvo) 200 nM, primers 200 nM FastStart Essential DNA Probes Master or FastStart SYBR Green Master 20 l reaction 10-fold dilution series (1E0 1E9 copies) 3 replicates each

Reliable detection over a broad range from 10E9 down to a

single copy

63





64

Powerful


Experimental setup: 400 nM primers LightCycler 480 High Resolution Melting Master 20 l reaction 10 replicates each (wt / het / mut) 2 NTCs Target: Cyp2C9 / SNP Class I (= C T) / 144 bp / plasmid DNA)

Excellent temperature accuracy and resolution for clear HRM results

65

Powerful


Excellent intra-run homogeneity

TaqMan

Experimental setup: UPL (-Globin) 200 nM, primers 200 nM Taq Man format: FastStart Essential DNA Probes Master 20 l reaction 32 replicates of Concentration: 1E4

MW 26.77

SD 0.02

Min 26.73

Max 26.81

Max-Min 0.08

66

Fast Protocols

Flexible Reaction Vessels

4 Channels

Optimized Workflow

Powerful Design

67

Fast Protocols


4 Channels

Optimized Workflow

Powerful Design

68

Powerful DesignSilver Block

2.42.62.833.23.43.6380

385

390

395

400

405

410

415

420

425

Volumetric heat capacity (J/cc-oC)

The

rma

l co

nd

uctivity

(W/m

-K)

Copper (A)

Silver (Nano)

69

Powerful DesignFast Protocols

Silver mount and long-life Peltierelements for

qPCR runs down to 25 min

Heating rate: + 5 C/sec

Cooling rate: + 4 C/sec

High temperature uniformity

+ 0.1 C

71

Fast Protocols


4 Channels

Optimized Workflow

Powerful Design

72

Powerful DesignFlexible Reaction Vessels

8-well strips or single tubes and reaction volumes of 10-100l for

maximum convenience

73

Fast Protocols


Robust and Versatile Optics

Optimized Workflow

Powerful Design

74

Powerful DesignSolid State Optics

Long life and high reliability

Clear results over the full spectrum

No light lost with narrowband filters

High power, stabilized, excitation source

Less noise from condensation and bubbles

No noise introduced by moving parts

75

Powerful DesignFast and Easy Set-up

9 pre-calibrated dyes for

Fast set-up

Easy dual color multiplexing

Factory Calibrated Dyes Virtual Channels / nm

SYBR Green I / ResoLight / FAM 2 / 530 548

VIC / HEX / Yellow555 3 / 550 560

LightCycler 610, Texas Red 6 / 610 628

Cy 5 8 / 650 668

76

Fast Protocols


4 Channels

Optimized Workflow

Powerful Design

77

Powerful Design

LightCycler Nano Workflow

Design your assay in 1 min.

Lyse cells in

5 min.

Reverse transcribe in

30 min.

Results ready to publish

(MIQE-compl.)

Universal Probe Library

RealTime ready Assays

Rapid Lysis Kit

Transcriptor Universal cDNA Master

FastStart Essential Masters

LightCycler 8-tube Strips

Amplify in

40 min.

78

Absolute Quantification

Relative Quantification

Endpoint Genotyping

High Resolution Melting

Tm Calling

Powerful Applications

79

FunEasy Programming

80

FunEasy Programming

Visual

81

FunEasy Programming

FlexibleVisual

82

FunEasy Programming

IntuitiveFlexible

Visual

83

FunEasy Analysis

Zoom

Drag to select curves

Export

Vector, or CSV, or bitmap

84

Fun5 Colors Showing You the Status of the Run

Not loaded

Ready to run, loaded

Heating

Cooling

Run completed

85

Fun

Take an easy step into qPCR:

More than 10 years experience in real-time PCR

Excellent quality and reliability of the market leader in Molecular Diagnostics

Application specialists for on-site training and support

Service Engineer in branches

86

Terima Kasih

presentasi real time pcr dasar&teknis lc nano

Documents