polymerase chain reaction - usd repository

i

IDENTIFIKASI GEN CYP2A6 ALEL *9 PADA SUKU TIONGHOA

NONPEROKOK DI INDONESIA DENGAN MENGGUNAKAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Evelyn Angela Sibarani

168114042

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Saya persembahkan karya ini untuk:

Tuhan Yesus

Keluarga tercinta

Almamater Universitas Sanata Dharma


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa karena

atas berkat dan karunia-Nya, skripsi yang berjudul “Identifikasi Gen CYP2A6 Alel

*9 pada Suku Tionghoa Nonperokok di Indonesia dengan Menggunakan Metode

Polymerase Chain Reaction” dapat selesai tanpa adanya halangan yang berarti.

Berkat dukungan dan doa dari berbagai pihak, sehingga karya tulis ini dapat

terselesaikan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm) di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Keberhasilan dalam penulisan naskah skripsi ini tidak terlepas dari dukungan

berbagai pihak. Maka dengan segala kerendahan hati, penulis mengucapkan terima

kasih sebesar-besarnya kepada:

1. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku dosen pembimbing atas segala

ilmu, bimbingan, saran, dan nasihat berharga yang telah diberikan kepada

penulis.

2. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. selaku Dosen Pembimbing Akademik yang

senantiasa memberikan dukungan dan masukan yang membangun kepada

penulis.

4. Ibu Damiana Sapta Candrasari, M.Sc., selaku dosen penguji atas segala ilmu,

bantuan, kritik, dan saran yang membangun kepada penulis.

5. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji atas segala ilmu,

bantuan, kritik, dan saran yang membangun kepada penulis.

6. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

memberikan tidak hanya ilmu pengetahuan melainkan juga nilai-nilai moral

yang berharga selama proses perkuliahan.

7. Bapak Kayat dan seluruh Laboran Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang dengan ketulusan hati selalu membantu dan berkontribusi

dalam hal sarana dan prasarana.


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................. v

LEMBAR PERNYATAAN PUBLIKASI ............................................................. vi

PRAKATA ............................................................................................................ vii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix

DAFTAR TABEL .................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

INTISARI ............................................................................................................. xiii

ABSTRACT ......................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ......................................................................................... 3

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 7

KESIMPULAN ...................................................................................................... 18

SARAN .................................................................................................................. 18

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 19

LAMPIRAN ........................................................................................................... 22

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 37


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil elektroforesis produk PCR .............................................................. 17

Tabel II. Frekuensi alel CYP2A6*9 pada subjek uji suku Tionghoa nonperokok di

Indonesia ................................................................................................................ 33


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA dengan Menggunakan Teknik

Elektroforesis ......................................................................................................... 12

Gambar 2. Situs penempelan primer pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1 .... 14

Gambar 3. Urutan basa nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9

(mutasi Single Nucleotide Polymorphism atau SNP ditunjukan dengan warna

kuning) ................................................................................................................... 14

Gambar 4. Elektrogram produk PCR yang terbentuk pada kondisi optimum dari

berbagai isolat DNA berbeda ................................................................................. 16


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian ............................................................. 23

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis ............................ 24

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix ............................. 25

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladders and Markers ............................ 26

Lampiran 5. Product Data Sheet of Primer Forward and Primer Reverse

CYP2A6*9 .............................................................................................................. 27

Lampiran 6. Usage Information of FavorPrep™ .................................................. 28

Lampiran 7. Hasil Kuisioner Subjek Uji ................................................................ 29

Lampiran 8. Pernyataan Persetujuan (Informed Consent) ..................................... 30

Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden ................................................. 31

Lampiran 10. Permintaan Penggunaan Alat PCR Thermocycler LPPT UGM ...... 32

Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel ............................................................ 33

Lampiran 12. Data Subjek Uji ............................................................................... 34

Lampiran 13. Elektrogram Analisis Kualitatif Isolat DNA ................................... 35

Lampiran 14. Elektrogram Analisis Produk PCR .................................................. 35

Lampiran 15. Frekuensi Alel.................................................................................. 36

Lampiran 16. Biografi Penulis ............................................................................... 37


xiii

INTISARI

Jumlah perokok aktif di Indonesia terus meningkat setiap tahun. Hal tersebut

menyebabkan bertambahnya perokok pasif atau orang yang menghirup asap rokok

dari orang lain. Asap rokok mengandung banyak senyawa prokarsinogenik yang

dapat menginduksi kanker, salah satunya adalah tobacco-specific nitrosamines

(TSNA). TSNA dapat diubah menjadi senyawa aktifnya oleh enzim pemetabolisme

CYP2A6. CYP2A6 dapat mengalami polimorfisme dan salah satu bentuknya

adalah CYP2A6*9. Alel CYP2A6*9 mengalami polimorfisme satu nukleotida pada

TATA BOX (T-48G) di daerah promotor. Adanya alel CYP2A6*9 diketahui dapat

menyebabkan penurunan aktivitas metabolik TSNA sehingga dapat menurunkan

risiko kanker paru akibat paparan asap rokok. Tujuan dari penelitian ini adalah

untuk mengidentifikasi dan mengetahui frekuensi alel CYP2A6*9 pada subjek uji

nonperokok suku Tionghoa di Indonesia dengan menggunakan metode Polymerase

Chain Reaction (PCR). Penelitian ini dilakukan secara deskriptif observasional.

Sebanyak 30 subjek uji yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi diambil sampel

darahnya kemudian diisolasi untuk mendapatkan isolat DNA. Hasil isolat DNA

kemudian dianalisis secara kualitatif dengan amplifikasi menggunakan metode

Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa

sebanyak 4 subjek atau 13,33% dari total subjek uji memiliki alel CYP2A6*9

sehingga dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap

rokok.

Kata kunci: CYP2A6*9, Polimorfisme, Tobacco-Specific Nitrosamines

(TSNA), Suku Tionghoa di Indonesia, Polymerase Chain Reaction (PCR)


xiv

ABSTRACT

The number of active smokers in Indonesia has been increasing up to now. It

leads to the increase of passive smoker or person who inhales cigarette smoke from

the active one. Cigarette smoke contains many procarcinogenic compounds which

can induce cancer. One of them is tobacco-specific nitrosamine (TSNA). TSNA can

be converted into its active compound by CYP2A6 metabolizing enzyme. CYP2A6

has a polymorphism with one of its forms is CYP2A6*9. CYP2A6*9 allele

undergoes one nucleotide polymorphism on the TATA BOX (T-48G) in the

promotor area. The presence of allele CYP2A6*9 is known to slowdown the

metabolic activity of TSNA associated with reducing the risk of lung cancer due to

the cigarette smoke exposure. The purpose of this study was to identify CYP2A6*9

alleles in Chinese non-smoker in Indonesia using the Polymerase Chain Reaction

(PCR) method and calculate its frequency. This research was descriptive

observational study. A total of 30 blood samples were collected from subjects who

met the inclusion and exclusion criteria and then isolated its DNA. Isolated DNA

products were analyzed qualitatively by amplification using Polymerase Chain

Reaction (PCR) method. The results of this study indicate that 4 subjects or 13,33%

of the total subjects have allele CYP2A6*9 which could reduce the risk of lung

cancer caused by cigarette smoke.

Keywords: CYP2A6*9, Polymorphism, Tobacco-Specific Nitrosamines (TSNA),

Chinese in Indonesia, Polymerase Chain Reaction (PCR)


1

PENDAHULUAN

Merokok merupakan salah satu faktor risiko utama terjadinya berbagai

penyakit dan merupakan penyebab kematian utama di dunia (Depkes RI, 2013).

Berdasarkan data WHO (2018), lebih dari 1 miliar orang di dunia mengkonsumsi

rokok dan lebih dari 7 juta orang tiap tahun meninggal akibat rokok. Data tersebut

melaporkan bahwa lebih dari 6 juta orang meninggal sebagai perokok aktif dan

890.000 orang sebagai perokok pasif (WHO, 2018). Indonesia merupakan salah

satu negara dengan prevalensi perokok terbesar di dunia. Jumlah perokok di

Indonesia pada tahun 2013 adalah 24,3% untuk perokok berat dan 5% untuk

perokok ringan (Depkes RI, 2013). Banyaknya jumlah perokok di Indonesia

berhubungan dengan peningkatan risiko beberapa jenis penyakit dan juga masalah

kesehatan.

Rokok mengandung berbagai senyawa toksik yang berbahaya bagi kesehatan

yang tidak hanya berdampak buruk baik bagi perokok aktif tetapi juga perokok

pasif. Perokok pasif adalah orang yang menghirup asap rokok dari perokok aktif.

Semakin sering terpapar asap rokok maka akan semakin tinggi juga risiko gangguan

kesehatan yang mungkin dialami oleh perokok pasif. Dengan demikian, semakin

banyak pengguna rokok di suatu negara maka semakin tinggi pula jumlah perokok

pasif di negara tersebut (Indrajati et al., 2017). Asap rokok mengandung 4000 bahan

kimia beracun dan tidak kurang dari 69 diantaranya bersifat karsinogenik atau dapat

menyebabkan kanker (Nurjanah et al., 2014).

Asap rokok mengandung banyak senyawa yang dapat menginduksi kanker,

seperti polisiklik aromatik hidrokarbon (PAH) dan tobacco-spesific nitrosamines

(TSNA) (Zhang et al., 2003). Beberapa TSNA yang berasal dari nikotin bersifat

prokarsinogenik (Hecth, 1999). TSNA terbagi menjadi beberapa jenis yaitu:

nitrosoanabasin (NAB), nitrosoanatabin (NAT), 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-

1-butanon (NNK), N-nitrosonornikotin (NNN), 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-

1-butanol (NNAL), 4-(metilnitrosamin)-4-(3-piridil)-1-butanol (iso-NNAL), dan 4-

(metilnitrosamin)-4-(3-piridil)-asam butirat (iso-NNAC) (Moldoveanu et al.,

2017). Dari beberapa jenis TSNA tersebut, 4-(metilnitrosamin)-1-(3-piridil)-1-


2

butanon (NNK) dan N-nitrosonornikotin (NNN) dipercaya berhubungan dengan

kanker yang disebabkan oleh penggunaan produk tembakau (Hecth, 1999).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan (Cao et al., 2015), ditemukan bahwa

paparan asap rokok secara signifikan dapat meningkatkan risiko kanker paru.

Kanker paru adalah kanker yang paling umum terjadi di seluruh dunia (1,8 juta

kasus dan 1,6 juta kematian) dan umum dialami baik oleh perokok aktif maupun

pasif (Zhang et al., 2003; Hassan et al., 2018). Peningkatan risiko kanker paru

berhubungan dengan aktivitas enzim CYP2A6 (Hassan et al., 2018). Enzim

CYP2A6 adalah enzim yang dapat mengaktifkan TSNA prokarsinogenik yaitu

NNN dan NNK melalui α-hidroksilasi (Tanner dan Tyndale, 2017).

CYP2A6 memiliki beberapa bentuk polimorfi yang dapat mengakibatkan

terjadinya variasi ekspresi, stabilitas, dan fungsi dari enzim CYP2A6. Penyebab

terjadinya polimorfisme ini bervariasi, seperti Single Nucleotide Polymorphism

(SNP), delesi, duplikasi, konversi dan frameshift (Pharmvar, 2018). Perbedaan

aktivitas enzim CYP2A6 dapat dibagi menjadi tiga kelompok, yaitu: normal

metabolizers, slow metabolizers yang aktivitas metabolismenya 50% lebih lambat

dari normal metabolizers) dan poor metabolizers yang aktivitas metabolismenya

25% lebih lambat dari normal metabolizers) (Ingelman, 2001; Patramurti dan

Fenty, 2017).

CYP2A6*9 merupakan salah satu varian alel akibat polimorfisme gen yang

terjadi pada CYP2A6 dan masuk dalam kelompok slow metabolizers. Individu yang

memiliki alel CYP2A6*9 akan mengalami penurunan aktivitas enzim CYP2A6 dan

berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Fujieda et al. (2004), terjadi penurunan

risiko kanker paru pada individu yang memiliki alel CYP2A6*9 (Rossini et al.,

2008). Hal ini dikarenakan berkurangnya aktivasi senyawa prokarsinogenik seperti

nitrosamin yang terdapat dalam asap rokok (Hassan et al., 2018). Karena perannya

dalam memetabolisme senyawa prokarsinogenik tertentu, identifikasi alel ini dapat

bermanfaat bagi peningkatan kesehatan masyarakat dengan mengurangi efek

berbahaya terkait dengan rokok berdasarkan genotip tiap individu (Liu et al., 2011;

Dempsey et al., 2004).


3

Frekuensi CYP2A6*9 pada tiap populasi bervariasi. Populasi Asia

menunjukkan frekuensi tertinggi terhadap CYP2A6*9 yaitu mencapai 21% ( Luis

et al., 2017; Hassan et al., 2018). Berdasarkan penelitian yang dilakukan

sebelumnya terhadap populasi Asia Timur, ditemukan bahwa 15,7% populasi Cina

memiliki alel tersebut (Pitarque et al., 2001; Rossini et al., 2008). Suku Tionghoa

merupakan suku yang berasal dari Cina namun tinggal dan menetap di Indonesia

(BPS, 2011). Oleh karena itu, diperkirakan bahwa suku Tionghoa di Indonesia juga

memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi yang tinggi. Indonesia merupakan

Negara Asia dengan populasi suku Tionghoa mencapai 2,83 juta jiwa dari total

penduduk Indonesia yang berjumlah 236,73 juta jiwa menurut hasil sensus

penduduk tahun 2010 (Anonim, 2018).

Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan mengetahui frekuensi alel

CYP2A6*9 pada subjek uji nonperokok suku Tionghoa di Indonesia sehingga dapat

diketahui risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok pada populasi yang

diteliti tersebut. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Polymerase

Chain Reaction (PCR). PCR adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA

dengan cara in vitro (Fatchiyah et al., 2012). Produk hasil PCR yang didapatkan

kemudian akan dianalisis dengan metode elektroforesis.

METODE PENELITIAN

Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif observasional. Pada penelitian

ini dilakukan penggambaran hasil polimorfisme gen CYP2A6 pada isolat DNA dari

populasi suku Tionghoa nonperokok di Indonesia tanpa adanya pemberian

perlakuan.

Bahan Penelitian

Primer forward: (5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’) dan primer reverse:

(5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’) (Macrogen) (Yoshida, et al., 2003),

sampel darah 30 subjek uji nonperokok suku Tionghoa di Indonesia, promega Go

Taq Green Master Mix (taq DNA polymerase, dNTP, MgC12 dan buffer), kit DNA

isolasi (FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell)) yang terdiri dari


4

proteinase-K; FABG buffer; etanol; W1 buffer; wash buffer; dan elution buffer, 10X

Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer pH 8,3 Ultra Pure Grade (Vivantis), gel agarosa

(Vivantis), FluoroVue™ Nucleic Acid Gel Stain (Smobio), 1 Kb (0,25-10 kb) DNA

Ladder (Smobio), loading dye (bromophenol blue 25 mg; gliserol 3,3 mL; aqua pro

injection 6,7 mL), etanol absolut (Sigma Chemical Co., St. Louis), aqua pro

injection (Ikapharmindo).

Alat Penelitian

Thermal cycler (Perkin Elmer 2400), satu set elektroforesis horizontal (Sigma

Aldrich), UV Transilluminator (Fisher Scientific), microtubes 1,5 mL (Biologix),

disposable gloves, blue tip, yellow tip, white tip, mikropipet (Soccorex Swiss), hot

plate (Cimarec™ Thermo Scientific), neraca analitik digital dengan ketelitian

0,0001 g (Mattler Toledo), microsentrifuge (Fisher Scientific), spuit injeksi 3 mL

(Terumo), vacutainer K2 dengan kandungan EDTA 5,4 mg, PCR® Tubes

(Axygen), vortex (Fisher Scientific), peralatan gelas, kamera DSLR Canon.

Penentuan Kriteria Subjek Uji dalam Penelitian

Pada penelitian ini, kriteria subjek uji adalah suku Tionghoa asli minimal

sampai third degree relatives (kakek dan nenek orang Tionghoa asli) berjenis

kelamin laki-laki dan perempuan yang tidak merokok. Subjek uji yang dipilih tidak

menderita penyakit-penyakit yang dapat disebabkan oleh virus atau bakteri.

Pemilihan subjek uji dilakukan melalui wawancara secara langsung disertai

pengisian kuisioner oleh subjek uji yang sesuai dengan kriteria pada penelitian ini.

Subjek uji secara sadar dan tanpa paksaan menandatangani informed consent.

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Sanata

Dharma Yogyakarta dengan memenuhi kode etik yang telah disetujui oleh Komisi

Etik Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Duta Wacana.

Pengambilan Sampel Darah pada Subjek Uji

Pengambilan sampel darah pada 30 subjek uji dilakukan oleh perawat

professional. Sampel darah diambil dari pembuluh vena tiap subjek uji kemudian

ditampung dalam vacutainer K2 dengan kandungan EDTA 5,4 mg. Darah segar

yang diperoleh kemudian disimpan pada suhu ± 4oC sebelum dianalisis untuk


5

mencegah kerusakan sampel. Darah tersebut kemudian digunakan untuk

mengidentifikasi alel CYP2A6*9 pada subjek uji.

Isolasi DNA

Sampel darah berupa whole blood berjumlah 30 sampel yang diambil dari 30

subjek uji berbeda. Sebanyak 200 µL sampel darah disiapkan pada tabung

microcentrifuge tube 1,5 mL. Ditambahkan 20 µl Proteinase K dan 200 µl FABG

buffer ke dalam sampel kemudian dilakukan pencampuran dengan cara divorteks

sebentar. Setelah itu tube diinkubasi pada suhu 60°C selama 15 menit untuk

melisiskan sampel sambil dihomogenkan setiap 3 menit selama 30 detik. Kemudian

tahap selanjutnya adalah melakukan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm

selama 3 menit. Setelah itu dilakukan penambahan 200 µL etanol absolut dan

divorteks selama 30 detik. Setelah etanol absolut ditambahkan maka tahap

selanjtnya adalah melakukan sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30

detik. Dipasangkan kolom FABG pada collection tube dan pindahkan sampel dari

microcentrifuge tube 1,5 mL ke dalamnya kemudian lakukan sentrifugasi dengan

kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat dalam collection tube

kemudian dibuang. Kolom FABG kemudian dipasangkan pada collection tube baru

dan dilakukan pencucian kolom FABG dengan menambahkan 500 µL W1 Buffer

kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1,5 menit.

Sisa cairan dalam kolom FABG kemudian dibuang. Kolom FABG kemudian dicuci

dengan menggunakan 750 µL wash buffer lalu disentrifugasi pada kecepatan

13.000 rpm selama 1,5 menit. Sisa cairan kemudian dibuang dan dilakukan

sentrifugasi 13.000 rpm selama 4 menit untuk mengeringkan kolom. Kolom FABG

kemudian dipasangkan pada elution tube dan ditambahkan 200 µL elution buffer ke

dalamnya. Diamkan selama 3 menit pada suhu ruang kemudian lakukan sentrifugasi

dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit untuk mengelusi DNA. Isolat DNA

kemudian disimpan pada suhu -20°C.

Analisis kemurnian isolat DNA

Elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,0% dilakukan dengan melarutkan

250 mg agarosa dalam larutan 1x TBE sebanyak 25 mL lalu dipanaskan dengan hot

plate sampai mendidih sambil diaduk dengan magnetic stirrer hingga larut.


6

Selanjutnya ditambahkan 2,5 µL nucleic acid gel stain dan diaduk hingga homogen.

Sebanyak 25 mL larutan kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel yang telah

diberi sisiran pada tepi gel dan biarkan mengeras. Sisiran lalu dicabut setelah gel

mengeras sehingga akan terbentuk sumur-sumur. Gel kemudian ditempatkan ke

dalam gel tray elektroforesis yang telah berisi larutan buffer 1x TBE. Sebanyak 4,0

µL isolat DNA ditambahkan dengan 1,0 µL aquabidest kemudian dicampur dengan

loading dye sebanyak 1,0 µL. Campuran tersebut kemudian diambil sebanyak 6,0

µL dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur pada gel dengan menggunakan

mikropipet. Salah satu sumur gel diisi dengan 100 bp DNA ladder sebanyak 3,0 µL

sebagai marker. Elektroforesis kemudian dilakukan dengan tegangan 100 Volt

selama 30 menit. Hasil elektroforesis kemudian dideteksi dibawah UV

transilluminator dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera DSLR

Canon. Panjang pita DNA dapat diketahui dengan cara menarik garis lurus pada

masing-masing pita sampel DNA dengan posisi pita DNA ladder.

Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR

Dilakukan amplifikasi dengan menggunakan primer yang diadopsi dari

Yoshida et al. (2003) untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9.

Primer yang digunakan berupa primer forward: 5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-

3’ dan primer reverse: 5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’ dengan

konsentrasi masing-masing sebesar 100 pmol/µL. Amplifikasi DNA dengan

metode PCR dilakukan dengan menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix.

Volume akhir campuran adalah 25 µL yang terdiri dari Promega Go Taq Green

Master Mix 12,5 µL, primer forward 1,25 µL, primer reverse 1,25 µL, isolat DNA

5,0 µL, dan nuclease-free water 5 µL. Penentuan rentang suhu annealing dan

jumlah siklus amplifikasi berdasarkan pada hasil optimasi yang dilakukan oleh

Cindy (2017). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan mesin PCR (Thermal

cycler Perkin Elmer 2400). Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut:

initial denaturasi pada suhu 94oC (3’); dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu

94oC (30”); annealing pada suhu 60oC (30”); dan ekstensi pada suhu 70oC (25”).

Siklus amplifikasi tersebut dilakukan sebanyak 35 kali dan kemudian diakhiri

dengan final extension pada suhu 72oC (5’).


7

Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis

Elektroforesis dilakukan untuk melihat hasil produk PCR dengan

menggunakan fase diam agarosa 1,5% yang telah ditambahkan dengan nucleic acid

gel stain 2,5 µL. Gel dicetak di dalam cetakan kemudian diberi sumuran dan

ditunggu hingga mengeras. Sumuran kemudian dilepaskan dan gel agarosa 1,5%

yang sudah mengeras diletakkan ke dalam gel tray elektroforesis. TBE 1x

dituangkan ke dalam gel tray elektroforesis hingga permukaan gel agarosa 1,5%

terendam. Setelah itu diambil sebanyak 5,0 µL produk PCR dan 1,0 µL loading dye

kemudian dihomogenkan dan diambil dengan menggunakan mikropipet sehingga

didapatkan volume akhir 6,0 µL. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam

sumuran gel agarosa 1,5%. Pada salah satu sumuran diisi DNA ladder sebanyak 3,0

µL. Kemudian dilakukan elektroforesis dengan kondisi tegangan 100 Volt/cm dan

running dijalankan selama 30 menit. Hasil elektroforesis produk PCR kemudian

dilihat dengan menggunakan UV Transilluminator.

Analisis Hasil

Produk PCR yang terbentuk pada penelitian ini berada pada panjang pita 368

bp (Yoshida et al., 2003) dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera

DSLR Canon. Terbentuknya hasil produk PCR berupa pita dengan panjang 368 bp

menunjukkan bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*1.

Sedangkan apabila pada panjang 368 bp tidak ditemukan produk PCR, maka dapat

dinyatakan bahwa isolat DNA yang dianalisis memiliki alel CYP2A6*9. Frekuensi

dari subjek uji yang memiliki alel CYP2A6*9 dapat diperoleh melalui perhitungan

dengan menggunakan rumus:

Frekuensi CYP2A6 *1 =jumlah subjek uji dengan alel CYP2A6∗1

jumlah seluruh subjek uji x 100%


jumlah seluruh subjek uji x 100%

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tobacco-specific nitrosamines (TSNA) merupakan senyawa pemicu kanker

yang dapat didetoksifikasi oleh enzim pemetabolisme. TSNA dapat dikonversi

menjadi produk yang lebih larut dalam air untuk dikeluarkan dari tubuh manusia.


8

Namun selama proses ini, senyawa reaktif nitrosamin dapat terbentuk menjadi zat

antara yang secara kovalen berikatan dengan sisi nukleofilik dalam DNA. Beberapa

TSNA seperti NNN dan NNK yang terdapat dalam asap rokok diaktivasi melalui

proses metabolik oleh enzim CYP2A6 yang kadarnya bervariasi di antara berbagai

jaringan dan jenis sel pada manusia (Zhang et al., 2003). NNK dan NNN yang

diaktifkan secara metabolik dapat menginduksi mutasi yang bersifat merusak pada

onkogen dan gen penekan tumor (Xue et al., 2014). Aktivasi metabolik NNK dan

NNN akan berakibat pada modifikasi DNA yang selanjutnya akan memicu kanker.

Tahap metabolisme penting yang terlibat dalam modifikasi DNA oleh senyawa-

senyawa prokarsinogen tersebut adalah α-Hidroksilasi (Hecht dan Hoffmann,

1988).

Gambar (1) Metabolit utama NNN hasil reaksi metabolisme CYP2A6 (Rossini, et al., 2008)

Gambar (2) Metabolit utama NNK hasil reaksi metabolisme CYP2A6 (Rossini, et al., 2008)

α-hidroxymethyl-NNK

α-methylenehidroxy-NNK

2’-hydroxy-NNN

5’-hydroxy-NNN

NNK

NNN

CYP2A6


9

Enzim CYP2A6 diketahui memiliki bentuk polimorfi yang tinggi dan

memiliki efek berupa penurunan, penghilangan atau justru peningkatan aktivitas

enzim. Saat ini terdapat 80 jenis alel CYP2A6 yang sudah berhasil diidentifikasi

dan salah satu diantaranya adalah alel CYP2A6*9 yang memiliki frekuensi tinggi

di populasi Asia khususnya Cina (Zhang et al., 2003). Pada penelitian ini dilakukan

analisis polimorfisme gen CYP2A6 yaitu dengan mengidentifikasi adanya alel

CYP2A6*9 pada subjek yang diuji. Dasar pemilihan alel CYP2A6*9 adalah karena

efeknya yang dapat menurunkan aktivitas metabolik dari enzim CYP2A6 sehingga

akan mempengaruhi risiko kanker paru yang disebabkan oleh asap rokok.

Karena perannya dalam memetabolisme senyawa karsinogenik tertentu,

identifikasi alel ini dapat bermanfaat bagi peningkatan kesehatan masyarakat

dengan memberikan informasi terkait efek berbahaya dari merokok yang

dipersonalisasi sesuai dengan genotip individu mereka (Liu et al., 2011; Dempsey

et al., 2004). Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi terkait strategi

pencegahan penyakit kanker paru dan penyakit lain yang ditimbulkan oleh

nitrosamin dalam asap rokok yang jalur metabolismenya diperantarai oleh enzim

CYP2A6.

Penentuan Subjek Uji

Pada penelitian ini digunakan subjek uji suku Tionghoa asli minimal sampai

third degree relatives (kakek dan nenek merupakan suku Tionghoa asli) berjenis

kelamin laki-laki dan perempuan yang tidak merokok dan berdomisili di

Yogyakarta. Subjek uji yang digunakan adalah manusia dewasa yang bersedia,

mengerti manfaat penelitian, serta secara sadar menandatangani informed consent.

Subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 30 orang dan menurut B-

Rao (2001), jumlah tersebut telah mencapai ukuran sampel minimum untuk

penelitian terkait studi polimorfisme genetik dengan dua alel yang terdeteksi.

Sehingga dengan jumlah 30 subjek uji yang digunakan dalam penelitian ini akan

mampu mendeteksi dua alel yaitu CYP2A6*1 dan CYP2A6*9 dengan probabilitas

yang tinggi. Subjek uji yang dipilih tidak menderita penyakit-penyakit yang

disebabkan oleh virus atau bakteri. Hal tersebut dilakukan agar saat uji dilakukan

bukan DNA virus atau bakteri yang terdapat dalam tubuh subjek uji yang terbaca.


10

Isolasi DNA

Gen tersusun oleh suatu substansi yang disebut dengan deoxyribonucleic acid

atau yang biasa disingkat DNA. DNA merupakan material genetik yang diturunkan

dari generasi ke generasi berikutnya (Siswanto et al., 2016). Isolasi DNA dari

materi biologi merupakan tahapan utama dalam analisis molekular genomik. Proses

isolasi DNA memegang peran penting dalam amplifikasi dengan metode PCR.

Efisiensi PCR bergantung dari kemurnian dan konsentrasi dari hasil DNA yang

telah diisolasi (Florczak et al., 2017).

Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan sampel darah, karena darah

merupakan sumber DNA genomik manusia yang ideal (Gong dan Li, 2014). Sampel

darah yang diambil berupa whole blood yang mengandung baik sel-sel berinti (sel

darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah) (Siswanto et al., 2016).

Tujuan dilakukannya isolasi DNA adalah untuk memurnikan dan memisahkan

DNA dari komponen lain dalam darah seperti sel darah merah, lemak, protein, dan

karbohidrat (Fatchiyah et al., 2012).

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti protein, serta pemurnian

DNA (Fatchiyah et al., 2012). Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan kit

DNA isolasi FavorPrep Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell). Untuk

memperoleh isolat DNA dari sampel darah, ada beberapa hal yang perlu dilakukan.

Tahapan pertama yaitu melisiskan atau menghancurkan sel darah merah yang tidak

mengandung DNA agar dapat dipisahkan dari sel darah putih. Penghancuran sel

darah merah tersebut dilakukan dengan menambahkan RBC lysis. Kemudian

dilakukan penambahan FABG buffer dan dilanjutkan dengan penambahan

Proteinase K untuk mendapatkan DNA yang murni dari kontaminan protein

(Fatchiyah et al., 2012).

Setelah pemurnian isolat DNA dari kontaminasi protein, maka dapat

dilanjutkan dengan penambahan etanol absolut yang bertujuan untuk memicu

dehidrasi DNA sehingga terjadi presipitasi karena sifatnya yang higroskopis. Isolat

DNA yang telah mengalami presipitasi kemudian ditambahkan dengan wash buffer

dan W1 buffer untuk menghilangkan sisa etanol yang terdapat dalam isolat DNA.


11

Tahapan selanjutnya adalah melakukan penambahan elution buffer yang bertujuan

untuk mengelusikan DNA dan menjaga agar DNA tidak rusak (Asris, 2010). Isolat

DNA yang didapatkan kemudian disimpan pada suhu -20°C untuk mencegah

kerusakan DNA akibat pengaruh suhu. Isolat DNA yang diperoleh dapat dikatakan

baik apabila bersifat murni, belum mengalami degradasi, dan bebas dari

kontaminan (Patramurti et al., 2014). Kualitas isolat DNA dapat dilihat dan diuji

secara kualitatif dengan menggunakan teknik elektroforesis.

Analisis Kualitatif Isolat DNA

Hasil isolasi DNA dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan

utuh. Penentuan kemurnian DNA merupakan suatu tahapan yang sangat diperlukan

dari serangkaian proses isolasi DNA. Hal ini dilakukan untuk melihat kontaminan

yang mungkin masih terdapat pada isolat DNA yang diperoleh. Analisis kualitatif

isolat DNA dilakukan dengan menggunakan loading dye yang bertujuan untuk

menambah densitas sampel sehingga dapat meresap ke dalam gel; memberikan

warna; memudahkan proses loading; serta memungkinkan estimasi jarak fragmen

DNA yang dimigrasi (Lee et al., 2012).

Analisis juga dilakukan menggunakan baku pembanding berupa DNA ladder

yang dimasukkan ke dalam salah satu sumuran dan berfungsi sebagai marker.

Analisis kualitatif isolat DNA dilakukan dengan menggunakan teknik

elektroforesis yang dijalankan pada kondisi kecepatan 100 Volt/cm selama 30

menit. Dalam proses ini, molekul DNA yang bermuatan negatif di bagian fosfat

pada pH netral akan bergerak ke arah positif dengan bantuan arus listrik (Patramurti

dan Fenty, 2017). Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh

faktor ukuran, konformasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan

temperatur (Fatchiyah et al., 2012).

Hasil elektroforesis yang didapatkan ditunjukan pada Gambar 1 dan

menunjukkan bahwa isolat DNA yang didapatkan memiliki pita tunggal (single

band) dengan intensitas pita bervariasi yaitu tebal dan tipis. Isolat DNA dengan pita

yang tebal menunjukan kadar DNA yang lebih besar, sedangkan pita yang tipis

menunjukan kadar yang lebih rendah (Lee et al., 2012). Panjang pita DNA dapat

diketahui dengan cara menarik garis lurus masing-masing pita sampel DNA dengan


12

posisi pita DNA marker (Patramurti dan Fenty, 2017). Panjang pita dari isolat DNA

yang dianalisis memiliki ukuran lebih dari 3000 bp. Isolat DNA yang diperoleh

kemudian disimpulkan bersifat murni, belum mengalami degradasi, bebas dari

kontaminan, namun memiliki konsentrasi yang rendah. Isolat DNA yang dianalisis

kemudian digunakan untuk proses amplifikasi dengan menggunakan metode PCR.

Gambar 1. Hasil Analisis Kualitatif Isolat DNA dengan Menggunakan Teknik Elektroforesis

Keterangan:

L : DNA Ladder

1-5 : Isolat DNA subjek uji

Kondisi elektroforesis : Fase diam menggunakan agarosa 1%; Fase gerak menggunakan larutan

TBE 0,1%; Kecepatan 100 Volt/cm selama 30 menit; Volume injeksi 6 µL

Amplifikasi Isolat DNA dengan Metode PCR

Amplifikasi isolat DNA dilakukan dengan metode Polymerase Chain

Reaction (PCR) yang merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk

mengamplifikasi nukleotida secara in vitro. Dasar siklus PCR yang utama adalah

siklus berulang 30-35 siklus meliputi: denaturation (denaturasi dua untai DNA

template menjadi untai tunggal); annealing (pengenalan/penempelan primer pada

DNA template); dan extension (proses polimerasi untuk pembentukan untai DNA

baru) (Fatchiyah et al., 2012).

Amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (Thermal cycler Perkin Elmer

2400) menggunakan Promega Go Taq Green Master Mix dengan kadar genomik

DNA masing-masing larutan kira-kira 50 ng dengan volume akhir 25 μL. Kondisi

Isolat DNA

3000 bp

L 1 2 3 4 5

250 bp

1000 bp


13

PCR yang digunakan mengadopsi dari penelitian yang dilakukan oleh Cindy (2017)

yaitu initial denaturation pada suhu 94oC (3’); kemudian dilanjutkan dengan

denaturation pada suhu 94oC (30”); annealing pada suhu 60oC (30”); extension

pada suhu 70oC (25”); dan final extension pada suhu 72oC (5’).

Suhu yang tinggi pada tahap denaturasi bertujuan agar terjadi pemisahan untai

ganda DNA menjadi untai tunggal (single strand). Kemudian pada tahap annealing

akan terjadi penurunan suhu yang bertujuan agar primer dapat menempel pada

DNA template yang akan digunakan untuk membuat salinan yang bersifat identik

dengan DNA template yang diinginkan. Tahap annealing merupakan tahap yang

sangat penting dan kritis karena apabila primer tidak menempel pada DNA template

target maka salinan DNA yang diinginkan tidak akan terbentuk. Pada tahap

ekstensi, enzim DNA polymerase akan memanjangkan DNA template target dan

membentuk salinan untai DNA yang komplementer (Joshi et al., 2011).

Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer yang diadopsi dari

Yoshida et al. (2003) untuk mendapatkan fragmen DNA dari alel CYP2A6*9.

Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi isolat DNA pada penelitian ini

berupa primer forward: 5’-GATTCCTCTCCCCTGGAAC-3’ dan primer reverse:

5’-GGCTGGGGTGGTTTGCCTTTA-3’. Primer forward akan mengamplifikasi

ekson 395 sampai dengan 376, sedangkan primer reverse akan mengamplifikasi

ekson 48 sampai 28. Primer tersebut nantinya akan menempel pada target pasang

basa nukleotida isolat DNA. Namun apabila subjek yang diuji memiliki alel

CYP2A6*9 maka tidak akan terjadi penempelan primer (Yoshida et al., 2003).

Alel CYP2A6*9 tidak akan menghasilkan produk PCR karena adanya

polimorfisme di TATA BOX yaitu perbedaan basa nukleotida antara CYP2A6*9

dengan CYP2A6*1. Perbedaan basa nukleotida tersebut mengakibatkan produk

dengan alel CYP2A6*9 tidak dapat diamplifikasikan (Yoshida et al., 2003). Situs

penempelan primer forward dan primer reverse pada sekuen urutan basa nukleotida

potongan gen CYP2A6*1 pada bagian yang diamplifikasi diilustrasikan pada

Gambar 2.


14

Gambar 2. Situs penempelan primer forward dan reverse pada urutan basa nukleotida CYP2A6*1

Keterangan:

: arah penempelan primer forward

: arah penempelan primer reverse

Pada identifikasi alel CYP2A6*9 digunakan primer yang mengamplifikasi

dari alel CYP2A6*1 karena kedua alel ini hanya memiliki satu perbedaan basa

nukleotida yaitu akibat adanya SNP di T-48G (Yoshida et al., 2003). Perbedaan

basa ini dapat dilihat dengan mengurutkan urutan basa nukleotida dari kedua alel

dan ditunjukan pada Gambar 3.

*1 : GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

*9 : GGATTCCTCTCCCCTGGAACCCCCAGATCCACAACTTTGGGGTGC

*1 : ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

*9 : ATTCTCACTCTCAGACCCCAAATCCAAAGCCCAAGTGCTCCCCTA

*1 : TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

*9 : TGCAAATATTCCAAACTCCTCAGTTCTACAGCTTATCTGTTGCCC

*1 : CCTCCTAAATCCCACGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

*9 : CCTCCTAAATCCCACGCCCTGCGGCACCCCTCCTGAAGTACCACA

*1 : GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

*9 : GATTTAGTCTGGAGGCCCCCTCTCTGTTCAGCTGCCCTGGGGTCC

*1 : CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

*9 : CCTTATCCTCCCTTGCTGGCTGTGTCCCAAGCTAGGCAGGATTCA

*1 : TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

*9 : TGGTGGGGCATGTAGTTGGGAGGTGAAATGAGGTAATTATGTAAT

*1 : CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTATAAAGGCAAACC

*9 : CAGCCAAAGTCCATCCCTCTTTTTCAGGCAGTAGAAAGGCAAACC

*1 : ACCCCAGCCG

*9 : ACCCCAGCCG

Gambar 3. Urutan basa nukleotida produk PCR gen CYP2A6*1 dan CYP2A6*9

(mutasi Single Nucleotide Polymorphism ditunjukan dengan warna kuning)

Keterangan:

*1 : Potongan urutan basa CYP2A6*1 (Gen Bank)

*9 : Potongan urutan basa CYP2A6*9 (Yoshida et al., 2003)

SNP

5’ 3’

GATT CCTC TCCC CTGG AAC TAAA GGCA AACC ACCC CAGCC

CTAA GGAG AGGG GACC TTG ATTT CCGT TTGG TGGG GTCGG

5’ 3’

Primer forward

Primer reverse


15

Alel CYP2A6*9 terbentuk akibat adanya Single Nucleotide Polymorphism

(SNP) di dalam TATA BOX di wilayah promotor CYP2A6 pada titik -48T> G dan

menghasilkan penurunan lebih dari 50% aktivitas enzimatik (Pitarque et al., 2001;

Yoshida et al., 2003). Ekspresi mRNA CYP2A6 akan menurun sehingga aktivitas

enzim akan menjadi lebih rendah (Tanner dan Tyndale, 2017). Hal tersebut

dikarenakan fungsi promotor yaitu sebagai pengatur ekspresi gen, tempat RNA

polimerase dan faktor transkripsi dapat berikatan (Hassan et al., 2018). Berdasarkan

penelitian yang dilakukan oleh Fujieda et al., (2004), terjadi penurunan risiko

kanker paru pada individu yang memiliki alel CYP2A6*9 (Rossini et al., 2008).

Analisis Produk PCR dengan Elektroforesis

Analisis produk PCR dilakukan dengan teknik elektroforesis dan

menggunakan alat UV Transilluminator. Produk PCR dari isolat DNA yang

memiliki alel CYP2A6*9 ditandai dengan tidak terekspresi atau tidak terbentuknya

pita pada hasil pembacaan produk PCR dengan menggunakan teknik elektroforesis.

Sebaliknya, produk PCR dari isolat DNA yang tidak memiliki alel CYP2A6*9 atau

yang memiliki alel CYP2A6*1 ditandai dengan terbentuknya pita tunggal dan tebal

pada posisi 368 bp. Terbentuk dan tidaknya produk ditentukan oleh spesifisitas

primer yang digunakan.

Pada Gambar 4 dapat dilihat bahwa terdapat pita yang terbentuk pada panjang

368 bp yang menunjukkan bahwa sampel DNA yang diuji memiliki alel CYP2A6*1

(wild type). Pada elektrogram juga ditunjukkan bahwa terdapat pita yang kosong

yang menunjukkan bahwa sampel tersebut mengalami polimorfisme dan dikatakan

memiliki alel CYP2A6*9. Hal tersebut dapat terjadi karena untaian DNA tidak

dapat diamplifikasi akibat adanya perbedaan basa nukleotida antara CYP2A6*1 dan

CYP2A6*9. Primer spesifik yang digunakan akan menempel pada DNA target dan

menghasilkan produk yang sesuai. Sedangkan primer yang mengamplifikasi

CYP2A6*1 tidak dapat melakukan annealing pada alel CYP2A6*9 karena

perbedaan basa yang terjadi.


16

Gambar 4. Elektogram produk PCR yang terbentuk pada kondisi optimum

Keterangan:

L : DNA Ladder sebagai marker

22-28 : Produk PCR dari berbagai sampel isolat DNA yang berbeda

Kondisi elektroforesis : Fase diam menggunakan agarosa 1,5%; Fase gerak menggunakan

larutan TBE 0,1%; Kecepatan 100 Volt/cm selama 30 menit; Volume injeksi 6 µL

Polimorfisme gen CYP2A6 berhubungan dengan risiko kanker paru yang

diakibatkan oleh asap rokok karena fungsinya yang secara metabolik dapat

mengaktifkan NNN dan NNK (Rossini et al., 2008). Individu yang memiliki alel

CYP2A6*9 dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang disebabkan oleh

asap rokok (Fujieda et al., 2002; Xu et al., 2002). Hal tersebut dikarenakan

terjadinya penurunan aktivasi dari senyawa prokarsinogenik NNN dan NNK

melalui jalur metabolik yang dapat menginduksi kanker.

Penelitian ini mengamplifikasi isolat DNA dari 30 subjek uji dan data

menunjukkan bahwa sebanyak 26 subjek uji memiliki alel normal CYP2A6*1. Data

juga menunjukkan bahwa 4 subjek uji mengalami polimorfisme dan memiliki alel

CYP2A6*9. Berdasarkan perhitungan yang dilakukan, didapatkan data bahwa total

subjek yang diuji memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi yang tinggi yaitu

sebesar 13,33%. Dengan demikian maka dapat disimpulkan sebanyak 4 orang dari

total subjek yang diuji dapat mengalami penurunan risiko kanker paru yang

L 15 16 17 18 19 20 21

Produk PCR

368 bp

Tidak

terbentuk pita

250 bp

1000 bp

3000 bp


17

disebabkan oleh asap rokok. Data elektroforesis produk PCR yang dianalisis

disajikan dalam Tabel 1.

Tabel 1. Hasil elektroforesis produk PCR

Alel Subjek Uji Jumlah Subjek

CYP2A6*1/ CYP2A6*9 4

CYP2A6*1/ CYP2A6*1 26

Selain berperan dalam metabolisme nikotin dan senyawa prokarsinogenik,

enzim CYP2A6 juga berperan dalam metabolisme sekitar 3% senyawa obat seperti

letrozole, tegafur, coumarin, valproic acid, methoxyflurane, artesunate, disulfiram,

halothane dan fadrozole (Gurusamy dan Shewade, 2014). Salah satu contoh dari

pengaruh polimorfisme CYP2A6 terhadap metabolisme obat adalah terjadinya

peningkatan konsentrasi metabolit hepatotoksik dari asam valproat yaitu 4-ene-

VPA dan 2,4-diene-VPA. Kedua metabolit tersebut secara signifikan dapat

meningkatkan risiko kerusakan hati pada individu dengan alel yang termasuk dalam

golongan slow metabolizers (Zhao et al., 2017).

Karena perannya tersebut, maka polimorfisme yang terjadi pada CYP2A6

juga akan berdampak pada perbedaan metabolisme dan efek obat untuk tiap

individu. Walaupun penderita dengan penyakit yang sama diberikan obat dan dosis

yang serupa, namun efek yang diterima dapat berbeda untuk tiap individunya.

Perbedaan respon tersebut bahkan justru dapat menimbulkan efek samping atau

efek toksik pada individu tertentu. Dengan kata lain, suatu obat dapat bersifat

manjur dan aman pada seseorang, tetapi untuk orang lain obat itu bisa saja tidak

memberikan efek terapi atau malah akan menimbulkan efek yang tidak diinginkan.

Tujuan terapi pada dasarnya adalah untuk mendapatkan efek menguntungkan

sebesar mungkin dan efek merugikan sekecil mungkin (Alsanosi et al., 2014). Oleh

karena itu dibutuhkan paradigma baru dalam terapi obat untuk meningkatkan

keberhasilan terapi dan menghindari efek samping maupun efek toksik dari obat

berdasarkan profil genetik penderita. Dalam dunia pengobatan, penggabungan

ranah penelitian mengenai genom dan farmakologi telah menciptakan studi baru

yaitu farmakogenomik (Kurth, 2000).


18

Farmakogenomik memiliki manfaat yang luar biasa dalam bidang

pengembangan obat dan terapeutik karena dapat memberikan informasi terkait

perbedaan respon tiap individu terhadap obat. Tujuan penerapan farmakogenomik

dalam terapi obat adalah untuk memberikan pengobatan secara prediktif, preventif,

dan personal dengan aplikasi data genomik dalam praktik klinis. Hal tersebut dapat

membantu para peneliti dalam memahami keadaan genetik kausatif untuk efek

farmakokinetik dan farmakodinamik yang berubah dari suatu obat melalui penilaian

profil genetik individu dalam hubungannya dengan kovariat klinis dan lingkungan

(Gurusamy dan Shewade, 2014).

KESIMPULAN

Hasil amplifikasi isolat DNA subjek uji suku Tionghoa nonperokok yang

dianalisis dengan metode elektroforesis menunjukkan bahwa terdapat 4 subjek uji

yang memiliki alel CYP2A6*9 dengan frekuensi sebesar 13,33%. Subjek uji yang

memiliki gen CYP2A6*9 tersebut dapat mengalami penurunan aktivitas metabolik

terhadap TSNA sehingga berdampak pada penurunan risiko kanker paru yang

disebabkan oleh asap rokok.

SARAN

1. Peneliti menyarankan agar selanjutnya dilakukan penelitian dengan subjek uji

berbeda yaitu pada suku lain di Indonesia dengan jumlah yang lebih besar dan

tipe alel yang berbeda.

2. Peneliti menyarankan agar ilmu farmakogenomik khususnya bagi farmasis

dapat terus dikembangkan mengingat peran pentingnya dalam pengembangan

obat dan peningkatan kualitas hidup pasien.


19

DAFTAR PUSTAKA

Alsanosi, S., Skiffington, C., Padmanabhan, S., 2014. Pharmacokinetic

Pharmacogenomics. Handbook of Pharmacogenomics and Stratified

Medicine. University of Glasgow UK, 341-344.

Anonim, 2018. Suku Bangsa di Indonesia.

https://id.wikipedia.org/wiki/Suku_bangsa_di_Indonesia, diakses pada

tanggal 14 April 2019 pukul 20.28 WIB.

Asris, 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.

http://asris07.student.ipb.ac.id, diakses pada tanggal 1 September 2019 pukul

21.19 WIB.

Badan Pusat Statistik, 2011. Kewarganegaraan, Suku Bangsa, Agama dan Bahasa

Sehari-hari Penduduk Indonesia. Indonesia: Jakarta.

B-Rao, C., 2001. Sample Size Considerations in Genetic Polymorphism Studies.

Human Heredity, 52, 191-200.

Cao, S., Yang, C., Gan, Y., Lu, Z., 2015. The Health Effects of Passive Smoking:

An Overview of Systematic Reviews Based on Observational

Epidemiological Evidence. PLOS ONE, 10(10), 1–12.

Cindy, 2017. Optimasi dan Validasi Kondisi Polymerase Chain Reaction pada

Identifikasi CYP2A6*9. Skripsi. Universitas Sanata Dharma, 3-10.

Dempsey, D., Tutka, P., Jacob, P., Allen, F., Schoedel, K., Tyndale, R. F., 2004.

Nicotine metabolite ratio as an index of cytochrome P450 2A6 metabolic

activity. Clin Pharmacol Ther, 64–72.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2013. Riset Kesehatan Dasar 2013,

http://www.litbang.depkes.go.id/sites/download/rkd2013/Laporan_Riskesda

s2013.PDF, diakses pada tanggal 14 April 2019 pukul 22.38 WIB.

Fatchiyah, Widyarti, S., Arumningtyas, E. L., Permana, S., 2012. Buku Praktikum

Teknik Analisis Biologi Molekuler, 1–49.

Florczak, S., et al., 2017. Review Article: DNA Isolation Method from Human

Blood with MasterPure DNA Purification Kit™, World Scientific News, 69-

76.

Fujieda, M., Yamazaki, H., Dosaka-Akita, H., et al., 2002. Genetic polymorphism

of CYP2A6 and lung cancer risk in Japanese smokers, Drug Metabolism

Reviews, Vol. 11, 890-894.

Gong, R., dan Li, S., 2014. Extraction of Human Genomic DNA from Whole Blood

Using a Magnetic Microsphere Method, International Journal of

Nanomedicine, 3781-3789.

Gurusamy, U., Shewade, D., 2014. Pharmacogenomics in India. Handbook of

Pharmacogenomics and Stratified Medicine, 1037-1046.

Hassan, M.M., Darwish, A., Abd Elaziz, S. H. , Ezzeldin, N., El-Lebedy, D., Saad-

Hussein, A., El Bastawisy, A., 2018. Association of Genetic Polymorphisms

CYP2A6*2 rs1801272 and CYP2A6*9 rs28399433 with Tobacco-Induced

lung Cancer: Case-Control Study in an Egyptian Population. BMC Cancer,

18(1), 1–9.

Hecht, S., 1999. Tobacco Smoke Carcinogens and Lung Cancer. JNCI: Journal of

the National Cancer Institute, Vol. 91, No. 14, 1194-1210.


https://id.wikipedia.org/wiki/Suku_bangsa_di_Indonesia

http://asris07.student.ipb.ac.id/

http://www.litbang.depkes.go.id/sites/download/rkd2013/Laporan_Riskesdas2013.PDF

http://www.litbang.depkes.go.id/sites/download/rkd2013/Laporan_Riskesdas2013.PDF

20

Indrajati, T.B., Istiarti, T., Kusumawati, A., 2017. Faktor-faktor Yang Berhubungan

Dengan Praktik Ibu Dalam Mencegah Paparan Asap Rokok Pada Balita

Perokok Pasif. Jurnal Kesehatan Masyarakat, 5, 1123–1132.

Ingelman, S. M., Oscarson, M., Dalya, K., Garte, S., Nebert, D. W., 2001. Human

Cytochrome P-450 (CYP) Genes: a Web Page for the Nomenclature of

Alleles. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 10(12), 1307–8.

Kurth, Janice, H., 2000. Pharmacogenomics: Future Promise of a Tool for

Identifying Patient at Risk. Drugs Information Journal. Vol. 3. 223-227.

Liu, T., David, S. P., Tyndale, R. F., Wang, H., Zhou, Q., Ding, P., et al., 2011.

Associations of CYP2A6 genotype with smoking behaviors in southern

China. Addiction. 85–94.

Luis, A., Flores, L., Rubio, G. P., Valencia, R. F., 2017. Review Article:

Distribution of Polymorphic Variants of CYP2A6 and Their Involvement in

Nicotine Addiction. EXCLI Journal, 174–196.

McDonagh, E. M., Wassenaar, C., David, S. P., Tyndale, R. F., Altman, R. B.,

Whirl-Carrillo, M., Klein, T. E., 2012. Pharm GKB Summary.

Pharmacogenetics and Genomics, 22(9), 695–708. Moldoveanu, S. C., Zhu. J., Qian, N., 2017. Analysis of Traces of Tobacco-Specific

Nitrosamines (TSNAs) in USP Grade Nicotine, E-Liquids, and Particulate

Phase Generated by the Electronic Smoking Devices. Contributions to

Tobacco Research, Vol. 7, No. 6.

Nurjanah, Kresnowati, L., Mufid, A., 2014. Gangguan Fungsi Paru Dan Kadar

Cotinine Pada Urin Karyawan Yang Terpapar Asap Rokok Orang Lain.

Jurnal Kesehatan Masyarakat, 10(5), 43–52.

Patramurti, C., Fenty, 2017. Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel CYP2A6 * 4

dan CYP2A6 * 9 pada Subyek Uji Perokok Suku Jawa Indonesia (Genotyping

Study of Cytochrome P450 2A6 Alel CYP2A6 * 1 and CYP2A6 * 9 among

Javanese Indonesian Smokers). Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 15(1),

50–56.

Patramurti, C., Nurrochmad, A., Martono, S., 2014. Polymorphism of Cytochrome

P450 2A6 (CYP2A6*1 and CYP2A6*4) Among Javanese Indonesian

Smoker and Non Smoker. Indonesian Journal of Pharmacy, 26(1), 11.

Pharmvar, 2018. https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6 diakses pada tanggal 14

April 2019, pukul 20.30 WIB.

Pitarque, M., Richter, O., Oke, B., Berkkan, H., Oscarson, M., Ingelman-Sundberg,

M., 2001. Identification of a single nucleotide polymorphism in the TATA

box of the CYP2A6 gene: Impairment of Promoter Activity. Biochem

Biophys Res Commun, 55–60.

Rossini, A., Mattos, R., Felipe, L., Pinto, R., 2008. Review: CYP2A6

Polymorphisms and Risk for Tobacco-Related Cancers. Pharmacogenomics,

1737–1752.

Siswanto, J., Tiara, B., Putricahya, E., Panggalo, L., dan Yuniani, L., 2016. Isolasi

DNA pada Sampel Darah Tepi dan Swab Buccal pada Bayi Penderita ROP:

Perbandingan Hasil Uji Konsentrasi dan Indeks Kemurnian. Sari Pediatri,

18(4), 270-278.


https://www.pharmvar.org/gene/CYP2A6

21

Tanner, J. A., Tyndale, R. F., 2017. Variation in CYP2A6 activity and personalized

medicine. Journal of Personalized Medicine, 7(4), 1–29.

WHO, 2018. Tobacco. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en/,

diakses pada tangggal 19 April 2019 pukul 21.50 WIB.

Xu et al., 2001. An In Vivo Pilot Study Characterizing the New CYP2A6*7, *8,

and *10 alleles. Biochemical and Biophysical Research Communications.

Vol. 290.

Xue, J., Yang, S., Seng, S., 2014. Mechanisms of cancer induction by tobacco-

specific NNK and NNN. Cancers, 6(2), 1138–1156.

Yoshida, R., Nakajima, M., Watanabe, Y., Kwon, J. T., Yokoi, T., 2003. Genetic

Polymorphisms in Human CYP2A6 Gene Causing Impaired Nicotine

Metabolism. Br J Clin Pharmacol, 54(5), 511–7.

Zhang, et al., 2003. Inhibition of Human Liver Microsomal (S)-Nicotine Oxidation

by (−) Menthol and Analogues. Chemical Research in Toxicology, 16(8),

988–993.

Zhao, M., Zhang, T., Li, G., Qiu, F., Sun, Y., Gao, L., 2017. Associations of

CYP2C9 and CYP2A6 Polymorphisms with the Concentrations of Valproate

and its Hepatotoxin Metabolites and Valproate-Induced Hepatotoxicity.

Basic Clin Pharmacol Toxicol, 121(2), 138-143.


http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs339/en/

22

LAMPIRAN


23

Lampiran 1. Ethical Clearance Penelitian


24

Lampiran 2. Go Taq Green Master Mix Certificate of Analysis


25

Lampiran 3. Usage Information of Go Taq Green Master Mix


26

Lampiran 4. Product Datasheet of DNA Ladders and Markers


27

Lampiran 5. Product Datasheet of primer forward and primer reverse CYP2A6*9


28

Lampiran 6. Usage Information of FavorPrep™


29

Lampiran 7. Hasil Kuisioner Subjek Uji


30

Lampiran 8. Pernyataan Persetujuan (Informed Consent)


31

Lampiran 9. Lembar Informasi untuk Responden


32

Lampiran 10. Permintaan Penggunaan Alat PCR Thermocycler LPPT UGM


33

Lampiran 11. Perhitungan Jumlah Sampel

Persamaan untuk menentukan jumlah sampel minimal pada penelitian ini diacu dari

penelitian yang dilakukan oleh B-Rao (2001), sebagai berikut:

Nmin ≥ log (1 - π) / 2 log (1 - fmin)

Keterangan:

Nmin : jumlah sampel minimal

π : probabilitas alel utama

fmin : probabilitas alel minor

Penelitian ini akan mendeteksi dua bentuk polimorfisme gen CYP2A6 yaitu alel

CYP2A6*1 sebagai alel utama dan alel CYP2A6*9 sebagai alel minor. Sehingga

dengan demikian, nilai π dan fmin untuk kedua alel tersebut adalah π = 0,95 dan fmin

= 0,05 (B-Rao, 2001). Sehingga dapat disimpulkan bahwa jumlah sampel minimal

yang diperlukan untuk penelitian ini berdasarkan persamaan tersebut adalah:

Nmin = log (1 - π) / 2 log (1 - fmin)

= log (1 – 0,95) / 2 log (1 – 0,05)

= 28,89 29 orang

Penelitian ini menggunakan subjek uji sebanyak 30 orang dan dengan demikian

telah memenuhi persyaratan jumlah sampel minimal untuk penelitian polimorfisme

genetik.


34

Lampiran 12. Data Subjek Uji

Subjek Uji Genotip

1T CYP2A6*1/*1

2T CYP2A6*1/*1

3T CYP2A6*1/*1

4T CYP2A6*1/*1

5T CYP2A6*1/*1

6T CYP2A6*1/*1

7T CYP2A6*1/*1

8T CYP2A6*1/*1

9T CYP2A6*1/*1

10T CYP2A6*1/*9

11T CYP2A6*1/*1

12T CYP2A6*1/*1

13T CYP2A6*1/*1

14T CYP2A6*1/*1

15T CYP2A6*1/*1

16T CYP2A6*1/*1

17T CYP2A6*1/*9

18T CYP2A6*1/*1

19T CYP2A6*1/*9

20T CYP2A6*1/*1

21T CYP2A6*1/*1

22T CYP2A6*1/*1

23T CYP2A6*1/*1

24T CYP2A6*1/*1

25T CYP2A6*1/*1

26T CYP2A6*1/*1

27T CYP2A6*1/*9

28T CYP2A6*1/*1

29T CYP2A6*1/*1

30T CYP2A6*1/*1


35

Lampiran 13. Elektrogram Analisis Kualitatif Isolat DNA

Lampiran 14. Elektrogram Analisis Produk PCR

L 1 2 3 4 5 6 7 L 8 9 10 11 12 13 14

L 1 2 3 4 5


36

Lampiran 15. Frekuensi Alel


jumlah seluruh subjek uji x 100 %

= 26

30 x 100 %

= 86,67 %


jumlah seluruh subjek uji x 100 %

= 4

30 x 100 %

= 13,33 %

L 15 16 17 18 19 20 21

21

L 22 23 24 25 26 27 28

L 29 30


37

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama lengkap Evelyn Angela Sibarani lahir

di Nabire pada tanggal 1 September 1998. Penulis

merupakan anak kedua dari pasangan Lamhotman

Sibarani dan Nona Mallisa. Penulis menempuh

pendidikan di TK Pertiwi VIII Nabire (2002-2003), SD

YPPK St. Petrus Nabire (2010-2013), SMA Negeri 1

Nabire (2013-2016), kemudian melanjutkan pendidikan

Sarjana S1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Penulis pernah

menjabat sebagai Ketua UKF DNA Dance Crew USD (2017-2018). Selama masa

kuliah, penulis turut berpartisipasi dalam beberapa unit kegiatan kampus seperti

UKF DNA Dance Crew USD (2016-2019), UKF PSF Veronika (2016), UKF

Herbal Garden Team (2016), UKF Badminton USD (2016), UKF Basket USD

(2016), dan UKF PCC (2016). Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan seperti

menjadi CO divisi Acara Osteo Day (2017), CO divisi Teater Titrasi (2018),

anggota divisi Perkap dalam acara Pharmacy Performance (2017-2018), anggota

divisi Acara dalam acara CBIA (2017), dan berbagai kegiatan kampus lainnya.

Penulis juga turut mengambil peran sebagai asisten dosen praktikum Kimia Dasar

(2018-2019), Biokimia (2018), Kimia Organik (2017), dan Farmasi Fisika (2017-

2018). Penulis juga diberikan kepercayaan menjadi ketua kelas FSM A 2016 dan

telah menjabat sejak tahun 2016 hingga 2019.


polymerase chain reaction - usd repository

Documents