plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · (spe) untuk mendukung penetapan kadar kuersetin...

i

OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU

DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION

(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN

DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Adi Wirasaputra

NIM : 088114059

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

Persetujuan Pembimbing





TINGGI

Skripsi yang diajukan oleh:

Adi Wirasaputra

NIM : 088114059

telah disetujui oleh :

Pembimbing Utama

Prof. Dr. Sri Noegrohati Apt. tanggal...................................................


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul





TINGGI

oleh:

Adi Wirasaputra

NIM : 088114059

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal:............................

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Ipang Djunarko, M. Sc., Apt.

Panitia Penguji Tanda tangan :

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ...............

2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. ...............

3. Jeffry Julianus, M. Si. ..............


iv

“Ketika jiwaku letih lesu di dalam aku, teringatlah aku

kepada TUHAN, dan sampailah doaku kepada-Mu, ke

dalam bait-Mu yang kudus.”

(Yunus 2:7)

“Usaha yang sedang – sedang saja membuahkan hasil yang sedang

– sedang saja. Tetapi usaha yang luar biasa membuahkan hasil

yang luar biasa pula.”

(Toyotomi Hideyoshi)

“Terbayangkan berarti terjangkau.”

(Toyotomi Hideyoshi)

Skripsi ini aku persembahkan kepada :

Bapak, Mama, Bagus, dan Candra,

yang selalu mendukungku dan menerimaku apa adanya

semua sahabat, teman, dan almamaterku


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 8 Juli 2012

Penulis


vi

(Adi Wirasaputra)

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK

KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertandatangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata

Dharma:

Nama : Adi Wirasaputra

No Mahasiswa : 088114059

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:





TINGGI

Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di Internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.


vii

PRAKATA

Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya

dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi Clean

Up Ekstrak Metanol Air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid

Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin

dalam Teh Hijau dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Skripsi ini

disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata

Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).

Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan

berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap staf serta

karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam

proses penyusunan skripsi ini.

3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Bapak Jeffry Julianus, M. Si. selaku

Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan demi

kesempurnaan skripsi ini.

4. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

: Mas Bimo, Mas Kunto, Pak Parlan, dan Pak Kethul yang telah banyak

membantu selama penelitian di laboratorium.


viii

5. Pak Sanjaya dan Pak Acang atas bantuan selama menghadapi masalah dalam

penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan selama kuliah.

6. Keluarga Wirasaputra tercinta Bapak, Mama, Bagus, dan Candra terima kasih

atas dukungan doa yang selalu membanjir tulus untukku yang membuatku

berani bangkit lagi di kala terpuruk.

7. Keluarga Mbah Putri yang selalu mendoakan segala perjuanganku Mbah

Putri, Bulik Etik, Mas Hagai, Heraldi, Kezia, dan Brian.

8. Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga, Paulus Setya Dharma dan Anastasia

Filipa Veritas da Silva teman seperjuangkanku yang telah dengan sabar

menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan menyemangati aku selama

masa-masa terpuruk di lab.

9. Kawan-kawan seperjuangan di lab dan grup antistress: Eka Riusinta Wati,

Melisa Dharmawan, Vinsensia Vica, M.G. Rosita Secoadi, Dhimas B.K.,

Novi Imoliana, Meiske Munda, Wilfrida Maria Dua, Margaretha Efa Putri,

Yuni Rogan, dan Elisa atas kerja sama dan kebersamaan, dukungan dan

keceriaan di lab selama penelitian ini.

10. Monica Satya Resmi Yunita untuk momen – momen kebersamaan kita dulu

dan terima kasih atas dukungan doa selama ini.

11. Teman – teman FST 2008 yang selalu memberi bantuan, dukungan, dan

berbagi keceriaan : Theresia Wijayanti, Anastasia Mardilla, Helena Angelina

Kurniawan, Margareth Henrika Silow, Elya Findawati, Laurensius Widi

Andhika Putra, Sari Tambunan, Aldo Sahala, Valentinus Widyawan, Edward

Wijaya Setyawan, dan Fajar Dwi Riyanto.


ix

12. Antonius Pandu W., Albertus Djanu Rombang, Alexius Ario P.W., dan Yosef

Himawan Yudha terima kasih atas keluangan waktu untuk bersama pergi

sejenak dari penatnya skripsi.

13. Teman – teman FKK 2008 yang mau membantu dan selalu memberi

dukungan untuk selesainya skripsi ini : Adityawarman, Perthy Melati Kasih,

Ellen Sinaga, Paulina Marcellina, Pratiwi Setyaningsih, Gina Vinrensia,

Marsyani, dan Tia.

14. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang

tidak dapat disebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan

dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu

penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir

kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.

Penulis


x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .......................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................. v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... vi

PRAKATA ......................................................................................... vii

DAFTAR ISI ...................................................................................... x

DAFTAR TABEL .............................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................... xvi

INTISARI ........................................................................................... xvii

ABSTRACT ......................................................................................... xviii

BAB I PENGANTAR ......................................................................... 1

A. Latar Belakang .............................................................................. 1

1. Permasalahan .......................................................................... 3

2. Keaslian penelitian .................................................................. 4

3. Manfaat penelitian ................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian .......................................................................... 4

BAB II PENELAHAAN PUSTAKA .................................................. 5

A. Kandungan daun teh hijau (Camelia sinensis L.) .......................... 5


xi

B. Flavonoid ..................................................................................... 5

C. Kuersetin ..................................................................................... 6

D. Ekstraksi ...................................................................................... 7

E. Soxhlet.............................................................................................. 7

F. Solid Phase Extraction (SPE) ....................................................... 7

1. Prosedur SPE ........................................................................... 7

2. Fase SPE...................................................................................... 9

G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .................................. 10

1. Definisi dan instrumentasi KCKT................................................ 10

2. Kromatografi partisi fase terbalik................................................. 12

H. Landasan Teori ............................................................................ 12

I. Hipotesis.......................................................................................... 13

BAB III METODE PENELITIAN ...................................................... 14

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................... 14

B. Variabel Penelitian............................................................................ 14

C. Definisi Operasional.......................................................................... 15

D. Bahan Penelitian .......................................................................... 15

E. Alat Penelitian ............................................................................. 16

F. Tata Cara Penelitian ..................................................................... 17

1. Pembuatan serbuk daun teh ..................................................... 17

2. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis 17

3. Skrining metode clean up ........................................................ 17

4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE ........................... 18


xii

5. Optimasi volume fase gerak (eluen) ......................................... 20

6. Penentuan kapasitas kolom SPE .............................................. 21

G. Analisis Hasil Optimasi ................................................................ 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 24

A. Pembuatan Serbuk Daun Teh ....................................................... 24

B. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis 24

C. Skrining metode clean up ............................................................. 27

D. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE................................ 29

E. Optimasi volume fase gerak (eluen) ............................................. 44

F. Penentuan kapasitas kolom SPE ................................................... 46

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................... 49

A. Kesimpulan .................................................................................. 49

B. Saran ............................................................................................ 49

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 50

LAMPIRAN ....................................................................................... 52

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................ 72


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia .................................... ..... 10

Tabel II. SPE – KLT densitometri.................................................... 28

Tabel III. Ekstraksi cair – cair............................................................ 28

Tabel IV. Rata – rata resolusi............................................................. 42

Tabel V. Optimasi volume eluen........................................................ 44


xiv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kuersetin ........................................................................ 1

Gambar 2. Sisi aktif kuersetin .......................................................... 6

Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut

metanol-air(90:10) .......................................................... 26

Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon .................. 27

Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm ............................. 32

Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)........... 32

Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)........... 33

Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol......................... 33

Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol) ........... 36

Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol) ............ 36

Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol) .............. 37

Gambar 12. Kromatogram baku kuersetin 14 ppm (C18) ................... 39

Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N (C18) ...... 39

Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol ....................... 40

Gambar 15. Kromatogram baku kuersetin 10 ppm ............................. 41

Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol .......................................... 41

Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE ................................ 43

Gambar 18. Kurva volume eluen vs AUC .......................................... 45

Gambar 19. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,05 ml

sampel ............................................................................ 46


xv


sampel.................................................... .......................... 47


sampel ............................................................................ 47


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam

C18 .............................................................................. 53


diol............................................................................... 55


silika ............................................................................ 58

Lampiran 4. Kromatogram optimasi volume .................................... 61

Lampiran 5. Kromatogram kapsitas .................................................. 64

Lampiran 6. Contoh cara perhitungan resolusi .................................. 70

Lampiran 7. Contoh cara perhitungan efisiensi clean up ................... 70

Lampiran 8 Contoh cara perhitungan t-test ...................................... 70


xvii

INTISARI

Kuersetin merupakan senyawa berkhasiat yang terdapat dalam daun teh

(Camelia sinensis). Senyawa flavonoid golongan flavonol ini dikenal memilki

khasiat sebagai antioksidan kuat. Di dalam daun teh terdapat bermacam – macam

senyawa dari golongan fenolik, tanin, pektin, katekin, dan vitamin. Tentunya

ekstrak metanol air dari teh hijau mengandung senyawa – senyawa lain yang bisa

mengganggu determinasi kuersetin dalam teh hijau. Oleh karena itu dalam

penelitian ini digunakan metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk mengurangi

berbagai senyawa yang ikut terekstraksi agar kuersetin dapat dideterminasi tanpa

adanya gangguan dari senyawa – senyawa tersebut.

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan sistem SPE optimal yang

bisa mengurangi berbagai senyawa yang ikut terekstraksi sehingga dapat

digunakan untuk determinasi kuersetin dalam ekstrak teh hijau. Optimasi

dilakukan dengan pemilihan jenis fase diam (diol, silika, dan C18) dan fase gerak

(aquabidest, metanol, etil asetat, n-heksana) serta volume fase gerak untuk

mengelusi kuersetin.

Sistem SPE terpilih adalah SPE kolom C18 dengan larutan pencuci 6 ml

HCl 0,002 N dan larutan pengelusi 5 – 10 ml metanol. Kondisi tersebut cukup

efisien dalam memisahkan kuersetin dari koekstraktan dengan nilai resolusi 2,994

dan nilai efisiensi clean up 37,5 – 43,75%.

Kata kunci : kuersetin, teh hijau, clean up, SPE


xviii

ABSTRACT

Quercetin is a pharmacologic component in green tea (Camelia sinensis).

This flavonol flavonoid has a potential antioxidant effect. There are many

components in green tea leaves such as phenolic components, tannin, pectin,

cathecin, and vitamin. Aqueous methanolic green tea extract has many other

components which can disturb the determination of quercetin in green tea sampel.

Therefore Solid Phase Extraction is used in this study to reduce the number of co-

extractants so it can support the determination of quercetin.

This study is to determine the optimum conditions of Solid Phase

Extraction system that fit for purpose. Optimation could be done by choosing the

type of stationary phase (diol, silica, and C18) and the mobile phase (aquabidest,

methanol, aethyl acetic, n-hexane) and the volume of mobile phase to eluting

quercetin.

The chosen SPE system is SPE C18 coloumn with 6 ml HCl 0,002 N as

the washing solvent and 5 – 10 ml methanol as the eluting solvent. That condition

is enough efficient to separate quercetin from co-extractants which resolution

value 2,994 and clean up efficiency value 37,5 – 43,75%.

Keywords : quercetin, green tea, clean up, SPE


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Teh sudah tak asing lagi bagi masyarakat Indonesia. Menikmati teh bisa

dengan dijadikan teh seduh, teh celup, hingga teh siap saji dalam kemasan. Teh

hijau memiliki banyak kandungan di dalamnya, di antaranya adalah pektin, tanin,

vitamin, dan termasuk di dalamnya adalah flavonoid.

OHO

OH O

OH

OH

OH

Gambar 1. Kuersetin

Kuersetin merupakan salah satu turunan flavonoid golongan flavonol.

Kuersetin memiliki khasiat sebagai antioksidan yang poten (Phani, Vinaykumar,

Rao, and Sindhuja, 2010). Kuersetin sebagai senyawa antioksidan diperlukan oleh

tubuh untuk menetralkan radikal bebas dan mencegah kerusakan sel normal oleh

adanya radikal bebas. Senyawa antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan

mendonorkan protonnya untuk berpasangan dengan elektron yang dimiliki radikal

bebas sehingga reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas dapat dihambat.

Kandungan flavonoid golongan lain dalam daun teh hijau (Camellia

sinensis L.) adalah katekin. Katekin tidak berwarna, larut dalam air, dan memberi

rasa pahit pada teh. Katekin utama dalam daun teh hijau (Camellia sinensis L.)


2

adalah epigalokatekin galat (log P = 2,38), epigalokatekin (log P = 1,2), epikatein

galat, epikatekin (log P = 1,02), dan katekin (log P = 1,02). Epigalokatekin galat

juga mempunyai aktivitas antioksidan (Kodama, Goncalves, Lajolo, and

Genovese, 2010).

Upaya mendapatkan fraksi analit yang bersih dari senyawa lain (clean

up) bisa ditempuh dengan cara Liquid – Liquid Extraction (LLE) maupun Solid

Phase Extraction (SPE). LLE berdasarkan pada koefisien distribusi analit pada

suatu pelarut dengan prinsip partisi. Pelarut yang digunakan untuk menghilangkan

senyawa lain selain analit tidak boleh bercampur. SPE merupakan kromatografi

kolom, dimana senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan fase diam atau

dapat berinteraksi dengan fase diam akan tertahan sedangkan senyawa yang lain

akan ikut terelusi. Dengan mempertimbangkan log P dari senyawa – senyawa

selain kuersetin dan log P kuersetin sendiri (log P = 1,82), maka fase gerak SPE

yang dipilih juga diharapkan mampu mengelusi kuersetin dengan sedikit

mengelusi senyawa – senyawa lain.

Adapun langkah dalam metode SPE adalah dengan pemilihan pelarut

yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan,

sementara senyawa – senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang

tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut

organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Langkah lain adalah

dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara

senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Rohman, 2009). Selanjutnya analit


3

diinjeksikan pada alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik

yang metodenya telah dioptimasi oleh Dwiyoga (2012).

Pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) dan komposisi pelarut dalam

metode SPE perlu dioptimasi untuk mendapatkan hasil yang optimum. Kondisi

metode SPE dikatakan optimum jika memenuhi parameter – parameter berikut

yaitu berkurangnya jumlah peak senyawa – senyawa lain yang terikut dalam

ekstraksi yang dinyatakan dengan nilai efisiensi clean up, Area Under Curve

(AUC) kuersetin terbesar dan didapatkan nilai Rs ≥ 1,5.

Telah dilakukan penelitian tentang pemisahan kuersetin menggunakan

metode SPE fase terbalik dalam tablet Ginkgo biloba (Mokgadi, Mmualefe, and

Torto, 2009), namun bukan dalam teh hijau. Dengan tetap mengacu pada

penelitian tersebut, optimasi dilakukan dengan mengubah – ubah komposisi atau

jenis pelarut dan pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) serta menentukan

volume pengelusi. Ketiga faktor tersebut dapat mempengaruhi parameter –

parameter clean up yang optimum.

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan yang dapat diuraikan

sebagai berikut: bagaimanakah jenis fase diam dan fase gerak serta volume eluen

yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang baik, nilai resolusi ≥ 1,5 dan

Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar untuk mendukung penetapan kadar

kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau?


4

2. Keaslian penelitian

Penelitian terhadap kuersetin dengan metode SPE telah dilakukan dalam

suatu sediaan obat. Penelitian dengan judul “SampliQ OPT Solid Phase

Extraction Sorbent in the Cleanup of Flavonoids in Ginkgo Biloba by HPLC-

DAD” dilakukan dengan menggunakan fase diam C18 dan larutan pengelusi

metanol:air (5:95 v/v) serta metanol:amonium asetat (30:70 v/v) untuk

memisahkan kuersetin dalam tablet Ginkgo Biloba (Mokgadi, Mmualefe, and

Torto, 2009). Demikian, maka dapat dipastikan bahwa optimasi metode SPE

kuersetin dalam teh hijau ini belum pernah dilakukan sebelumnya.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi mengenai penggunaan metode SPE pada proses ekstraksi kuersetin

untuk penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi terkait dengan pemilihan jenis fase diam, jenis fase gerak, dan volume

eluen SPE yang terbaik untuk proses ekstraksi kuersetin untuk penetapan kadar

kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan jenis fase diam dan fase

gerak serta volume eluen yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang

baik, nilai resolusi ≥ 1,5 dan Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar untuk

penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.


5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kandungan Daun Teh Hijau (Camellia sinensis L.)

Daun teh hijau (Camellia sinensis L.) mengandung substansi fenol dan

substansi bukan fenol. Substansi fenol terdiri dari katekin yang punya empat

turunan, yaitu epikatekin (EC), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC) dan

epigalokatekin galat (EGCG) serta flavonol terdiri dari kaempferol, kuersetin, dan

mirisetin. Subtansi bukan fenol terdiri dari pektin, alkaloid, karbohidrat, klorofil,

mineral, protein, dan asam amino (Soraya, 2007).

Flavonol utama yang ada di dalam daun teh adalah kuersetin, kaempferol

dan myrycetin. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya

(berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo,

2003).

B. Flavonoid

Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia

senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi

bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak

yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih,

atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka umunya flavonoid

cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil

sulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain – lain (Markham, 1988).


6

Adanya gula yang terikat pada flavonoid, cenderung menyebabkan

falvonoid mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas

dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya,

aglikon yang kurang polar seperti flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih

mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).

C. Kuersetin

Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhidrat

pada suhu 95 - 97° C. Kelarutan : larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan

aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989).

Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat

membentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).

Kuersetin memiliki aktivitas antioksidan yang kuat karena memiliki tiga

ciri pada strukturnya, yaitu 3’,4’-dihidroksi pada cincin B; 2,3-ikatan rangkap

pada cincin C dan sebuah gugus 5-hidroksil pada cincin A. Ketiga ciri ini secara

umum ditunjukkan pada gambar di bawah ini (Sibuea, 2006).

O

OOH

OH

HO

OH

OH

OH

A

B

C

2

3

456

7

8

2

3

4

5

Gambar 2. Sisi aktif kuersetin yang potensial sebagai antioksidan


7

D. Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat

aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(DirJen POM, 1995).

Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu

campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent

(Harborne, 1987). Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat

dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung

simplisia (DirJen POM, 1986).

E. Soxhlet

Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang

dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah

pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan alat

soxhlet menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif

yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (DirJen POM, 2010).

F. Solid-Phase Extraction (SPE)

1. Prosedur SPE

Ada dua strategi untuk melakukan penyiapan sampel menggunakan SPE

ini. Strategi pertama adalah dengan pemilihan pelarut yang mampu menahan


8

semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara senyawa –

senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang tertahan pada penjerap

ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik yang akan

mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini beramanfaat jika analit yang dituju

berkadar rendah. Strategi lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang

tertuju keluar (terelusi), sementara senyawa penganggu tertahan pada penjerap

(Rohman, 2009).

Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan

penjerap dengan pelarut yang sesuai. Penjerapa nonpolar seperti C18 dan penjerap

penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol lalu dengan

akuades. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi recovery analit.

Penjerap – penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika harus dibilas

dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida (Rohman, 2009).

Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:

a. Pengkondisian

Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi

permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga

perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan

dapat dihindari.

b. Retensi (tertahannya) sampel

Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang

dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang

tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi.


9

c. Pembilasan

Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak

tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi

Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju

jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

2. Fase SPE

Suatu penjerap SPE harus dipilih sedemikian rupa sehingga mampu

menahan analit secara kuat selama pemasukan sampel ke dalam cartridge. Untuk

sampel – sampel yang bersifat ionik atau yang dapat terionisasi, digunakan

penjerap penukar ion. Fraksi analit yang keluar dari SPE dapat langsung

diinjeksikan ke sistem kromatografi atau dilakukan pengaturan pH untuk

meminimalkan ionisasi sehingga dapat dipisahkan dengan kolom fase terbalik

pada KCKT (Rohman, 2009).


10

Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia (Snyder, 1978)

Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa

pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu lapisan berpori karena ada

gaya kapiler (Stahl, 1985).

G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Definisi dan instrumentasi KCKT

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan

campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase diam di bawah aliran fase

gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara

cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai (Hendayana, 2006). Ada dua fase

dalam kromatografi, yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal apabila fase

diam lebih polar dari fase gerak, sedangkan fase terbalik, yaitu apabila fase diam

lebih non polar dari fase geraknya (Munson, 1991).


11

Kromatografi merupakan teknik yang mana solut terpisah oleh

perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut – solut ini melewati suatu kolom

kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2009).

a. Fase diam

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yan paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa – senyawa dengan kepolaran

yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi

lebih sesuai untuk solut yang polar (Gandjar dan Rohman, 2009).

b. Fase gerak

Kemampuan KCKT dalam memisahkan banyak senyawa terutama

tergantung pada jenis fase gerak. Fase gerak dapat mempengaruhi pemisahan

komponen dalam campuran (Munson, 1991).

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase

terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril (Gandjar dan Rohman, 2009).

c. Detektor

Detektor UV-Vis didasarkan pada adanya penyerapan ultraviolet (UV)

dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190 – 800 nm oleh

spesies oleh spesies solut yang mempunyai struktur – struktur atau gugus – gugus

kromoforik (Gandjar dan Rohman, 2009).

Detektor spektrofotometri UV dapat berupa detektor dengan panjang

gelombang tetap (merupakan detektor yang paling sederhana) serta detektor

dengan panjang gelombang bervariasi (Gandjar dan Rohman, 2009).


12

2. Kromatografi partisi fase terbalik

Konsep dasar kromatografi partisi, yaitu perlakuan sampel dalam kondisi

cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat (Gritter

et al., 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak saling campur, karena

adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa (Munson,

1991).

H. Landasan Teori

Kuersetin merupakan turunan flavonoid golongan flavonol. Kuersetin

adalah aglikon yang terlepas dari gugus glikosidanya sehingga kepolarannya

menurun namun larut dalam pelarut metanol.

Salah satu kandungan ekstrak teh hijau adalah flavonoid. Kandungan

flavonoid dalam ekstrak teh hijau tidak hanya kuersetin, namun masih ada turunan

flavonoid golongan lain ataupun polifenol lain yang larut dalam pelarut ekstrak

yang sama. Oleh karena itu, diperlukan Solid Phase Extraction (SPE) dengan

harapan didapatkan ekstrak teh hijau yang bersih dari turunan flavonoid lain

ataupun polifenol lain.

Solid Phase Extraction merupakan teknik pemisahan analit dari

koekstraktan. Proses pemisahannya, yaitu kuersetin diikatkan pada fase diam C18

dan pengotornya dipisahkan dengan dialiri larutan pengelusi yang lebih polar dari

fase diam. Lalu hasilnya dibandingkan dengan langkah yang berbeda yaitu

koekstrakstan diikatkan pada fase diam diol dan kuersetin dipisahkan dengan

dialiri larutan pengelusi yang lebih nonpolar dari fase diam. Optimasi clean up


13

dengan SPE dilakukan untuk memperoleh ekstrak yang bersih dari senyawa

lainnya (selain kuersetin) dan didaptkan kandungan kuersetin terbanyak. Hasil

ekstraksi diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dan

dilihat kromatogramnya. Parameter pemisahan dengan SPE yang menunjukkan

hasil optimum yaitu berkurangnya puncak – puncak senyawa selain kuersetin,

Area Under Curve (AUC) kuersetin yang terbesar, dan resolusi tercapai ≥ 1,5

pada kromatogram.

I. Hipotesis

Dengan menggunakan jenis fase diam C18 dan fase gerak HCl 0,002 N

dan metanol serta menggunakan jenis fase diam diol dan silika dan fase gerak n-

heksana, etil asetat, dan metanol akan menghasilkan kromatogram yang baik,

yakni efisiensi clean up yang baik dengan berkurangnya puncak – puncak

senyawa selain kuersetin, Area Under Curve (AUC) yang terbesar, dan nilai

resolusi tercapai ≥ 1,5.


14

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis dan rancangan penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat

perlakuan terhadap subjek uji.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah :

a. Fase diam C18 dengan fase gerak HCl 0,002 N dan metanol.

b. Fase diam diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

c. Fase diam silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

d. Volume eluen yang digunakan

2. Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah nilai efisiensi clean up,

nilai resolusi, dan AUC kuersetin.

3. Variabel pengacau terkendali

Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan menggunakan

pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.


15

C. Definisi Operasional

1. Kuersetin yang dianalisis merupakan senyawa aktif yang berada dalam sampel

ekstrak teh hijau.

2. Sistem SPE yang digunakan adalah seperangkat alat SPE menggunakan fase

diam C18 dengan fase gerak aquabidest HCl 0,002 N, dan metanol; fase diam

diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol; serta fase diam

silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.

3. Optimasi jenis fase diam dan fesa gerak dilakukan dengan menggunakan fase

diam yang berbeda dan fase gerak yang berbeda pada tiap fase diam, optimasi

volume fase gerak dilakukan dengan mengubah volume fase gerak, dan

optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan mengubah volume sampel yang

masuk pada kolom SPE.

4. Parameter pemisahan komponen dengan metode SPE dilanjutkan dengan

KCKT fase terbalik adalah kromatogram dengan jumlah impurities yang

sedikit dan AUC kuersetin terbesar.

D. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah baku kuersetin

(Pcode:100910390), metanol p.a. (E, Merck), aquabidest, etil asetat p.a. (E,

Merck), n-heksana p.a. (E, Merck), akuades yang disaring yang diperoleh dari

Laboratorium Farmasi USD, metanol teknis (PT.Brataco), BHT (PT.Brataco),

asam klorida yang telah dibakukan dengan natrium karbonat dan diperoleh


16

konsentrasinya adalah 11,32 M, teh hijau dengan merk ”Sigma” yang diperoleh

dari PT. Pagilaran Samigaluh, Kulon Progo.

E. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat soxhlet

100 ml dan refluks, waterbath (merk “Marius” dan “Hedolph), termometer,

kantong sokhlet, rotary evaporator, neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ

1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d = 0,01/0,1 mg, e = 1 mg), densitometer

(CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602), autosampler

(Linomat 5 No. 170610), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), bejana

kromatografi, seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan sistem gradien dan

isokratik dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18 merek

KNAUER C-18 (No. 25EE181KS (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm),

seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant Sistem RD01-D850 A03-

0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625730), alat

ultrasonikasi (Retsch tipe T640 No.935922013), kertas saring Whatman 0,45 μm,

alat vacuum, hair dryer “Q2 External Beauty”, milipore, seperangkat cartridge

Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam C18, diol, silika merek E-Merck,

dan alat-alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium.


17

F. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan serbuk daun teh

Sejumlah tujuh bungkus kemasan teh hijau yang diambil dari PT

Pagilaran dengan nomor batch yang sama dicampur menjadi satu kemudian

dihomogenkan, lalu diserbuk dan disaring. Hasil serbuk kemudian disimpan

dalam wadah yang kering, kemudian diberi silika gel.

2. Ekstraksi dengan menggunakan metode Soxhlet sekaligus hidrolisis

Serbuk daun teh ditimbang 8 gram kemudian dimasukkan ke dalam tea

bag. Tea bag dimasukkan ke dalam tabung soxhlet kemudian disoxhlet dengan

240 ml larutan metanol : aquabidest (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M dan

Butyl Hidroxy Toluene (BHT) 0,1% b/v pada suhu 90OC. Proses soxhletasi

dihentikan setelah mencapai 18 kali sirkulasi larutan penyari. Hasil soxhlet atau

ekstrak didiamkan selama beberapa saat pada suhu kamar hingga suhunya kurang

lebih sama dengan suhu kamar. Ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml

lalu diencerkan dengan ditambahkan larutan metanol : aquabides (90:10) hingga

tanda. Sejumlah 25 ml ekstrak diuapkan dengan rotary evaporator hingga 5 ml.

3. Skrining metode clean up

Dilakukan skrining metode clean up dengan SPE cartridge diol, silika,

dan C18 dengan fase gerak metanol, etil asetat, toluen, n-heksana, kloroform,

etanol, aseton. Kemudian fraksi – fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-

densitometri yang telah dioptimasi oleh Dharma (2012).


18

Dilakukan metode clean up dengan cara partisi, yaitu ekstraksi cair – cair

antara larutan metanol:air (90:10) dengan n-heksana, air dengan etil asetat. Fraksi

– fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-densitometri yang telah dioptimasi.

4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE

a. Pembuatan HCl 0,002 N. Sejumlah 2,21 ml HCl 32% dimikropipet

dan dipindahkan pada labu takar 25 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga

batas tanda menjadi HCl 1 N. Sejumlah 200 µl larutan HCl 1 N dimikropipet dan

dipindahkan ke labu takar 100 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas

tanda menjadi HCl 0,002 N.

b. Fase diam diol

1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a.

dialirkan pada kolom SPE diol kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.

Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a.

ke dalam kolom SPE diol.

2) Pengisian (loading) sampel. Sejumlah 0,3 ml sampel pekat

dimasukkan ke dalam kolom SPE diol.

3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a.

dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –

turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen

ditampung pada tabung reaksi.

4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol

diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah

tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke


19

dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut

di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.

c. Fase diam silika

1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a.

dialirkan pada kolom SPE silika kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.

Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a.

ke dalam kolom SPE silika.

2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,3 ml sampel pekat

dimasukkan ke dalam kolom SPE.

3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a.

dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –

turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen


4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol

diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah

tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke

dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut

di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.

d. Fase diam C18

1) Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml

metanol p.a. dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian

tetesan ditampung pada tabung reaksi.


20

2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,2 ml sampel pekat

dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.

3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan

melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 5 ml

metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.

4) Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan

rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar

5 ml dan ditmbahkan metanol hingga batas tanda. Sejumlah 5 ml fraksi metanol

diencerkan dengan labu takar 10 ml hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut di-

milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.

5. Optimasi volume fase gerak (eluen)

a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a.

dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan


b. Pengisian (loading). Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke

dalam kolom SPE C18.

c. Pencucian (washing). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan

melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi.

d. Pengelusian (eluting).

1) Sejumlah 5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan

eluen ditampung pada tabung reaksi.

2) Sejumlah 7,5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan



21

3) Sejumlah 10 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan


e. Preparasi sampel. Fraksi metanol sejumlah 7,5 ml dan 10 ml

diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan diencerkan dengan

metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu di-milipore dan di-

ultrasonikasi selama 10 menit.

6. Penentuan kapasitas kolom SPE

a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a.

dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan


b. Pengisian (loading).

1) Sejumlah 0,05 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam

kolom SPE C18.

2) Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom

SPE C18.

3) Sejumlah 0,2 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom

SPE C18.

c. Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan

melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 6 ml

metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.

d. Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan rotary

evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar 5 ml

dan ditambahkan metanol hingga batas tanda. Fraksi metanol sejumlah 6 ml


22

diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan, diencerkan dengan

metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu di-milipore dan di-

ultrasonikasi selama 10 menit.

7. Identifikasi kuersetin

Analit yang diperoleh dari hasil SPE kemudian diinjeksikan pada sistem

KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dengan kolom C18 detektor UV pada

panjang gelombang 370 nm, flow rate 1 mL, komposisi fase gerak aquabidest-

metanol-asam fosfat 1% (55:45:1).

G. Analisis Hasil Optimasi

Data kromatogram yang diperoleh pada baku diamati sehingga dapat

diketahui sistem SPE yang memberikan hasil optimal, yaitu dengan menghitung

nilai resolusi dan menghitung nilai efisiensi clean up.

1. Analisis kualitatif

Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi

antara kromatogram baku kuersetin dengan kromatogram fraksi hasil elusi SPE.

2. Nilai resolusi

Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan

rumus: Rs = 𝑡𝑅1 − 𝑡𝑅2

(𝑤2+𝑤1)/2

Keterangan : tR1 dan tR2 = waktu retensi komponen

W1 dan W2 = lebar alas puncak

Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs > 1,5 (Pescok et al., 1976).


23

3. Nilai efisiensi clean up

Nilai efisiensi clean up dihitung dengan membandingkan jumlah peak

sebelum SPE dengan jumlah peak sesudah SPE dengan rumus:

Efisiensi clean up= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎 𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100%


24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Serbuk Daun Teh

Sebelum dilakukan ekstraksi dengan metode sokhletasi, sampel daun teh

kering yang diperoleh dari PT. Pagilaran diserbuk dahulu. Tujuan dari proses

penyerbukan ini adalah untuk memperluas area kontak antara pelarut dengan

sampel sehingga ketika proses ekstraksi, pelarut akan lebih banyak berinteraksi

dengan sel tanaman. Dengan proses penyerbukan sampel ini diharapkan proses

ekstraksi bisa berlangsung maksimal.

Setelah diperoleh serbuk daun teh, dilakukan penyaringan dan

pencampuran serbuk daun teh. Dalam proses penyaringan ini serbuk akan terpisah

berdasarkan ukuran partikelnya. Ukuran partikel serbuk yang diambil adalah

serbuk yang berukuran partikel kecil karena memiliki luas area kontak dengan

pelarut yang lebih besar. Tujuan pencampuran serbuk daun teh adalah untuk

menghomogenkan sampel.

B. Ekstraksi dengan Menggunakan Metode Soxhlet Sekaligus Hidrolisis

Proses ekstraksi ini berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh

Dharma (2012) dimana diperoleh kondisi ekstraksi optimal yaitu proses sokhletasi

disertai dengan hidrolisis menggunakan larutan penyari metanol-air (90:10) yang

mengandung HCl 1,85 M pada suhu 90°C. Proses soxhletasi ini dilakukan hingga

tercapai 18 sirkulasi.


25

Metode ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi. Soxhletasi adalah

ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan dengan alat

khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik (DirJen POM, 2010). Dikatakan “pelarut

selalu baru” karena pelarut yang berada di dalam labu akan menguap dan

terkondensasi oleh adanya pendingin balik sehingga menetes mengisi tabung sifon

dan membasahi tea bag di dalamnya. Pelarut yang membawa ekstrak, akan

memenuhi tabung sifon dan kembali ke dalam labu yang nantinya akan menguap

dan terkondensasi lagi sehingga bisa dikatakan terjadi ekstaksi secara kontinyu

(berkesinamungan).

Kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang umumnya

terdapat di alam dalam bentuk glikosida. Adanya glikosida menyebabkan

flavonoid memiliki kelarutan di dalam air. Bentuk glikosida kuersetin salah

satunya adalah rutin (kuersetin-3-rutinoside). Dalam penelitian ini kuersetin yang

akan dianalisis adalah kuersetin dalam bentuk aglikon, oleh karena itu diperlukan

proses hidrolisis untuk mengubah kuersetin glikon menjadi kuersetin aglikon.

O

OH

OH

O

OH

HO

OH

Gambar 1. Kuersetin


26

Pada proses ekstraksi yang disertai hidrolisis ini digunakan larutan

penyari metanol:air (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M. Pelarut yang dipilih

adalah metanol:air (90:10) karena adanya gugus - gugus hidroksil pada kuersetin

menyebabkan larutan metanol-air mampu berinteraksi secara hidrogen bonding

sehingga kuersetin dapat larut dalam pelarut tersebut.

OO

O

O

O

O

O

H

H

HH

H

H

H

H

O

O

O

O

CH3

H

H3C H

CH3

H

O

O

O

HO

H3C

H

H

OH

H

metanol

air

air

metanol

metanol

metanol

Keterangan : merupakan ikatan hidrogen

H3C

H

H3C

H

O H

H

air

metanol

Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut metanol-air(90:10).

Adanya HCL 1,85 M digunakan untuk memberikan suasana asam dan

sebagai katalisator proses hidrolisis. Suasana asam dapat mempercepat proses

hidrolisis dan tetap menjaga kuersetin dalam bentuk molekul. Adapun reaksi

hidrolisis yang terjadi :


27

Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon

Suhu yang digunakan dalam proses sokhletasi sekaligus hidrolisis ini

adalah 90°C. Pada suhu tersebut metanol akan menguap dan mengalami

kondensasi sehingga menetes dan membasahi tea bag mengisi ruang sifon.

C. Skrining Metode Clean Up

Tujuan dilakukan clean up yaitu untuk mengurangi senyawa – senyawa

selain analit yang ikut terekstraksi (ko-ekstraktan) selama proses ekstraksi

berlangsung. Alasan pentingnya dilakukan clean up karena ko-ekstraktan bisa

mengganggu proses determinasi analit, dalam hal ini adalah kuersetin. Gangguan

tersebut bisa menyebabkan tidak tercapainya parameter optimal yang salah

satunya adalah resolusi. Jika parameter resolusi tidak tercapai maka metode tidak

akan valid untuk dapat dilakukan determinasi.


28

Tabel II. SPE – KLT densitometri

SPE pengelusi hasil keterangan

diol &

silika

toluen tidak ada kuersetin

toluen:metanol (2:1)

ada kuersetin

karena terelusi oleh metanol

metanol ada

kuersetin

mengelusi hampir semua senyawa selain kuersetin, masih ada kuersetin yang terjerap kuat pada diol

aseton ada

kuersetin

etanol ada

kuersetin

etil asetat ada

kuersetin

kloroform tidak ada kuersetin

n-heksana tidak ada kuersetin

C18

campuran air &

metanol

ada kuersetin

karena terelusi oleh metanol

metanol ada

kuersetin

Tabel III. Ekstraksi cair – cair

Ekstraksi Cair – Cair Hasil

Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) diuapkan metanolnya dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat analit larut dalam etil

asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.

Beberapa senyawa yang polar (larut dalam air)

berkurang

Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) dipartisi dengan n-heksana analit berada dalam fraksi metanol-

aquabidest(90:10). Metanol diuapkan dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat

analit larut dalam etil asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.

Diperoleh fraksi dengan profil kromatogram terdiri

dari 3 puncak

Namun langkah ini tidak reprodusibel

Banyak kuersetin yang

hilang


29

Optimasi metode SPE dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi (KCKT) akhirnya dipilih karena KCKT lebih sensitif dalam mendeteksi

analit dibadingkan dengan Kromatografi Lapid Tipis Densitometri (KLT-

Densitometri). Selain itu, ekstraksi cair – cair secara partisi tidak lagi dipilih

karena tidak efektif dan tidak efisien dalam mendapatkan analit. Hal ini terkait

dengan banyaknya pelarut yang digunakan dan koefisien distribusi kuersetin pada

dua pelarut yang digunakan saat proses partisi.

Metode KLT Densitometri yang digunakan untuk skrining metode clean

up berdasarkan penelitian Dharma (2012) dimana menggunakan fase diam silika,

fase gerak toluen-etil asetat-asam format (14:5:1). Sedangkan metode KCKT yang

digunakan untuk optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE yang akan dibahas

pada subbab selanjutnya adalah metode KCKT optimal dari penelitian Dwiyoga

(2012), yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase gerak aquabidest-metanol

(52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2 ml/menit.

D. Optimasi Jenis Fase Diam dan Fase Gerak SPE

Pemilihan jenis fase diam dan fase gerak SPE dilakukan untuk

mendapatkan sistem SPE yang mampu memenuhi parameter resolusi, selektivitas,

dan efisiensi clean up. Fase diam (cartridge) SPE yang digunakan adalah diol,

silika, dan C18, sedangkan fase gerak yang digunakan juga berbeda karena

perbedaan fase diamnya. Diol dan silika merupakan sistem kromatografi dengan

fase normal, sedangkan C18 merupakan sistem kromatografi fase terbalik.


30

Adapun tahap – tahap yang dilakukan dalam SPE adalah sebagai berikut :

a. Pengkondisian

Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi

permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga

perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan

dapat dihindari.

b. Retensi (tertahannya) sampel

Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang

dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang

tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi.

c. Pembilasan

Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak

tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.

d. Elusi

Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju

jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).

1. Fase diam (cartridge) silika. Fase diam silika merupakan sistem

kromatografi fase normal. Dikatakan demikian karena fase diam yang digunakan

lebih polar daripada fase geraknya.

Pada langkah awal dilakukan aktivasi fase diam silika dengan metanol.

Langkah ini bertujuan untuk menghilangkan sisa – sisa air yang mungkin

tertinggal di fase diam silika sehingga nantinya analit mampu berinteraksi dengan

fase diam secara maksimal karena sudah tidak ada lagi halangan oleh molekul air.


31

Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-

heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana

karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama

karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya

perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).

Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang tingkat kepolarannya menengah yang

mampu berinteraksi dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki

nilai indeks polaritas 4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang

tertinggal di cartridge saat dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil

asetat.

Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika

kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml

metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-

heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-

heksana. Fraksi – fraksi tersebut kemudian diinjeksikan pada KCKT yang telah

dioptimasi oleh Dwiyoga (2012) yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase

gerak aquabidest-metanol (52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2

ml/menit.

Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu

retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi

etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.

Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan suatu senyawa untuk terelusi keluar


32

dari kolom hingga sampai ke detektor. Adapun kromatogram yang didapatkan

sebagai berikut.

Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm

Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)

Berdasarkan hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa fraksi hasil

elusi dengan n-heksana tidak menunjukkan adanya kuersetin. Hal ini ditunjukkan

dengan tidak munculnya puncak kuersetin pada sekitar menit 10. N-heksana tidak

melarutkan kuersetin sehingga n-heksana tidak mampu mengelusi kuersetin dari

fase diam, kuersetin lebih teradsorpsi pada fase diam silika.

Kuersetin


33

Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)

Pada kromatogram fraksi etil asetat terdapat puncak dengan tR 10,428

menit. Puncak tersebut adalah puncak kuersetin karena memiliki tR yang mirip

dengan tR baku kuersetin. Etil asetat mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin

larut dalam etil asetat dan juga etil asetat mampu berinteraksi dengan kuersetin.

Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol

Pada kromatogram fraksi metanol terdapat puncak dengan tR 10,429

menit yang merupakan puncak kuersetin karena kemiripan tR-nya dengan baku

Kuersetin

Kuersetin


34

kuersetin. Metanol mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin larut dalam

metanol dan metanol mampu berinteraksi dengan kuersetin.

Dari kromatogram di atas tampak bahwa etil asetat dan metanol mampu

mengelusi kuersetin. Area Under Curve kuersetin pada fraksi metanol lebih kecil

daripada AUC kuersertin pada fraksi etil asetat karena kuersetin yang tersisa

dalam cartridge tinggal sedikit, sebagian besar terlusi oleh etil asetat. Jumlah

puncak yang ada dalam kromatogram fraksi etil asetat dan metanol sama, yaitu 14

puncak.

Etil asetat mampu mengelusi kuersetin dengan jumlah besar, namun

demikian juga koekstraktan yang terikut juga banyak. Nilai resolusi kuersetin

dengan puncak di sebelah kirinya sebesar 0,5666 dan nilai resolusi kuersetin

dengan puncak di sebelah kanannya sebesar 1,3716. Hal ini menunjukkan bahwa

etil asetat tetap mengelusi koekstraktan yang memiliki kepolaran yang mirip

dengan kuersetin. Dengan sistem SPE ini nilai resolusi yang baik tidak tercapai,

nilai resolusi yang baik adalah RS ≥ 1,5.

2. Fase diam (cartridge) diol. Fase diam diol yang dipakai dalam

sistem ini merupakan sistem kromatografi fase normal. Dikatakan demikian

karena fase diam yang digunakan lebih polar daripada fase geraknya.

Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-

heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana

karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama

karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya

perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).


35

Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang semi polar yang mampu berinteraksi

dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki nilai indeks polaritas

4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang tertinggal di cartridge saat

dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil asetat.

Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika

kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml

metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-

heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-

heksana.

Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu

retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi

etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.

Adapun kromatogram yang didapatkan sebagai berikut.


Kuersetin


36

Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol)

Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol)

Kuersetin


37

Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol)

Dilihat dari kromatogram fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol

memiliki kemiripan profil kromatogram dengan kromatogram hasil SPE

menggunakan cartridge silika. Hal ini karena diol memiliki sistem kromatogrfi

fase normal seperti pada penggunaan cartridge silika.

Nilai resolusi puncak kuersetin yang didapatkan pada kromatogram

fraksi etil asetat juga tidak memenuhi parameter resolusi yang baik. Nilai resolusi

puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kirinya adalah 0,4796, sedangkan nilai

resolusi puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kanannya adalah 1,4549. Hal

ini menunjukkan bahwa etil asetat mengelusi senyawa lain yang memiliki

kepolaran yang mirip dengan kuersetin, yaitu senyawa yang memiliki tR yang

berdekatan dengan kuersetin.

3. Fase diam (cartridge) C18. Fase diam kolom SPE C18 merupakan

sistem kromatografi fase terbalik. Hal ini karena fase gerak yang digunakan lebih

polar daripada fase diamnya.

Kuersetin


38

Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol kemudian

dialirkan HCl 0,002 N. Digunakan metanol karena metanol memiliki viskositas

yang rendah sehingga bisa membasahi seluruh partikel C18 pada kolom.

Kemudian HCl 0,002 N dialirkan agar suasana kolom menjadi asam. Digunakan

HCl 0,002 N karena pH-nya 3 sehingga masih masuk dalam range pH yang aman

untuk fase diam C18. Karena suasana asam maka kuersetin yang berada dalam

kolom akan berubah menjadi bentuk molekul sehingga kuersetin akan mengalami

retensi pada kolom C18.

Setelah dilakukan pengkondisian, sejumlah 0,2 ml sampel dimasukkan ke

dalam kolom SPE lalu dielusi menggunakan HCl 0,002 N. Pengelusian

menggunakan HCl 0,002 N berfungsi sebagai langkah washing (pembilasan)

untuk mengelusi koekstraktan yang larut dalam air. Kemudian dialirkan metanol

untuk mengelusi analit (kuersetin) beserta senyawa lain yang tidak larut dalam air

namun larut dalam metanol. Interaksi yang terjadi antara kuersetin dengan fase

diam C18 adalah interaksi van der Waals, sedangkan interaksi yang terjadi antara

kuersetin dengan metanol adalah interaksi hidrogen.


39


Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N

Pada kromatogram di atas tampak bahwa senyawa kuersetin masih ada

yang ikut terelusi oleh fase gerak HCl 0,002 N. Hal ini karena kuersetin memang

memiliki kelarutan pada aquabidest. Jumlah kuersetin yang terelusi tidak

sebanyak pada fase gerak metanol.

Kuersetin


40

Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol

Pada fraksi ini tampak bahwa terdapat puncak kuersetin dilihat dari tR

puncak yang muncul pada menit 10,418. Kuersetin larut dalam metanol sehingga

kuersetin bisa terelusi oleh metanol. Nilai resolusi puncak kuersetin dengan

puncak di sebelah kirinya adalah 1,6773. Dengan demikian parameter resolusi

tercapai yaitu nilai resolusi lebih besar dari 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa

kolom SPE C18 mampu menahan senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan

kuersetin yang ditunjukkan dengan tidak munculnya puncak dengan tR dekat

dengan kuersetin.

Metode SPE dengan larutan pembilas (washing) 0,002 N HCl dan

pengelusi metanol juga diaplikasikan pada sistem KCKT optimum yang

didapatkan oleh Dwiyoga (2012). Sistem KCKT tersebut menggunakan fase diam

oktildesilsilan (C18), campuran fase gerak metanol-aquabidest-asam fosfat 5%

(54:45:1), kecepatan alir 1,0 mL/menit, suhu oven 30° C dengan sistem gradien.

Adapun kromatogram yang didapatkan adalah sebagai berikut.

Kuersetin


41


Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol

Kromatogram di atas merupakan hasil dari sistem KCKT elusi gradien.

Konsentrasi fase gerak metanol meningkat mulai menit ke-20 sehinga baseline

berubah menjadi naik. Tujuan memakai sistem elusi gradien agar puncak terakhir

cepat terelusi sehingga tidak memakan waktu lama untuk menunggu waktu

retensinya.

Dari kromatogram di atas didapatkan tR baku kuersetin pada menit

15,963 sehingga puncak yang memiliki tR 15,557 pada kromatogram fraksi

Kuersetin

Kuersetin


42

metanol dipastikan menjadi puncak kuersetin. Dengan demikian puncak kuersetin

muncul di sekitar menit ke-15.

Resolusi yang didapatkan dari fraksi metanol dengan cartridge SPE C18

sejumlah 3x replikasi yaitu :

Tabel IV. Rata – rata resolusi

replikasi kiri puncak kuersetin

Rs puncak kuersetin

w (menit) tR (menit) w (menit) tR (menit)

1 9,333 7,242 7,824 2,695 16,688 13,801 14,532

2 9,959 7,301 7,948 2,227 17,32 13,91 14,706

3 10,815 10,098 10,261 4,061 16,851 14,96 15,557

rata - rata Rs 2,994

Rata – rata resolusi yang didapatkan dari 3x replikasi adalah 2,994. Dengan

demikian metode SPE cartridge C18 dengan larutan pengelusi metanol memenuhi

parameter resolusi. Dengan tertahannya senyawa yang memiliki tR dekat dengan

kuersetin pada cartridge SPE C18, maka proses clean up ini menunjang

tercapainya resolusi yang baik pada sistem KCKT tersebut.

Efisiensi clean up merupakan kemampuan suatu metode SPE dalam

mengurangi jumlah senyawa selain analit yang ikut terekstraksi. Senyawa –

senyawa selain analit yang ikut terekstraksi tersebut disebut koekstraktan.

Koekstraktan bisa menganggu proses determinasi suatu analit, oleh karena itu

sebisa mungkin jumlah koekstraktan dikurangi.

Cara menghitung efisiensi clean up adalah dengan membandingkan

jumlah senyawa sebelum SPE dan sesudah SPE. Adapun kromatogram sampel

yang sebelum sebagai berikut :


43

Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE

Pada kromatogram fraksi metanol SPE C18 dari kromatogram –

kromatogram sebelumnya didapatkan 9 – 10 puncak dan dari kromatogram

sampel sebelum SPE di atas terdapat 16 puncak. Hal ini menunjukkan bahwa

metode SPE mampu mengurangi jumlah koekstraktan. Adapun perhitungannya

adalah (𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸)

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100% =

(16−9)

16 𝑥 100% = 43,75%. Karena ada puncak kromatogram berjumlah 10

Kuersetin


44

puncak maka didapatkan juga hasil perhitungan efisiensi clean up sebesar 37,5%.

Dengan demikian nilai efisiensi clean up metode ini adalah 37,5 – 43,75%. Angka

tersebut menunjukkan bahwa metode ini kurang efisien.

E. Optimasi Volume Fase Gerak (Eluen)

Tujuan dilakukannya optimasi volume fase gerak pengelusi adalah untuk

mendapatkan berapa volume fase gerak pengelusi (metanol) yang dibutuhkan agar

semua analit terelusi dari kolom SPE. Dengan mendapatkan kepastian seberapa

jumlah volume metanol yang dibutuhkan maka diharapkan mampu

mengefisienkan penggunaan sejumlah metanol sebagai eluen. Jika penggunaan

fase gerak efisien maka tidak akan membuang – buang metanol berlebih atau pun

sebaliknya yaitu volume eluen tidak kurang untuk menarik analit.

Tabel V. Optimasi volume eluen

volume eluen (ml) AUC (dalam 100000)

replikasi 1 replikasi 2 rata - rata

5 2,51277 2,4758 2,494285

7,5 2,92801 2,87266 2,900335

10 2,60228 2,62976 2,61602

Volume sampel yang dimasukkan ke dalam kolom SPE C18 adalah 0,1

ml. Kemudian dibilas (washing) menggunakan HCl 0,002 N sejumlah 6 ml yang

selanjutnya dielusi dengan metanol sejumlah 5 ml; 7,5 ml; dan 10 ml. Respon

Area Under Curve (AUC) pada masing – masing volume berbeda – beda dengan

rata – rata 2494285 mV untuk volume metanol 5 ml, 2900335 mV untuk volume

metanol 7,5 ml, dan 2616020 mV untuk volume metanol 10 ml. Peningkatan


45

AUC pada volume 7,5 ml disebabkan karena kesalahan pada saat pengisian

sampel yang tidak pas 0,1 ml sehingga terjadi kenaikan AUC.

Gambar 18. Kurva volume eluen vs AUC

Volume eluen dan respon AUC yang didapatkan kemudian diplotkan

untuk mengetahui hubungan antara penambahan volume eluen dengan respon

AUC dan didapatkan persamaan y = 0,024x + 2,487. Dengan menggunakan one

sample t-test, nilai slope 0,024 dibandingkan dengan nilai 0 untuk mengetahui ada

atau tidaknya perbedaan yang bermakna antara kedua nilai tersebut. Didapatkan

bahwa t hitung = 1,0496 < t tabel = 4,30. Dengan demikian tidak ada perbedaan

signifikan antara antara nilai slope dengan 0. Hal ini menunjukkan penambahan

volume eluen tidak akan memberikan perbedaan berarti pada nilai AUC. Oleh

karena itu volume metanol pengelusi yang dipakai adalah 5 – 10 ml. Namun lebih

dipilih volume pengelusi tidak lebih dari 10 ml agar koekstraktan yang terjerap

pada fase diam C18 tidak ikut terelusi.

y = 0,024x + 2,487R² = 0,085

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 2 4 6 8 10 12

AU

C

volume metanol (ml)

kurva volume eluen vs AUC


46

F. Penentuan Kapasitas Kolom SPE C18

Penentuan kapasitas kolom SPE bertujuan untuk mengetahui kemampuan

cartridge SPE dalam menahan (retensi) sampel dalam jumlah tertentu. Dalam hal

ini bertujuan untuk mencari batasan volume sampel yang boleh dimasukkan ke

dalam kolom SPE agar mampu tertahan di kolom.

Penentuan kapasitas kolom ini dilakukan dengan mengubah volume

sampel yang dimasukkan ke dalam kolom SPE dari 0,05 ml; 0,1 ml; dan 0,2 ml.

Kemudian sampel dielusi pertama dengan HCl 0,002 N lalu dielusi dengan

metanol. Jika ada kuersetin yang terelusi oleh HCl 0,002 N maka hal itu

menunjukkan bahwa cartridge SPE tidak bisa menahan sampel.

Gambar 19. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,05 ml sampel


47



Dari 3 kromatogram fraksi HCl 0,002 N di atas menunjukkan tidak

adanya puncak yang terdeteksi pada tR 15 menit dimana pada menit tersebut

muncul puncak kuersetin. Hal ini menunjukkan pada pengisian sampel sejumlah


48

0,005 – 0,2 ml pada cartridge SPE C18, kuersetin masih bisa ditahan. Batas

sampai dimana analit tidak tertahan lagi di cartridge SPE tidak diketahui, karena

hanya dilakukan pengisian sampel hingga volume 0,2 ml.

Kinerja proses clean up pada fase diam C18 adalah dengan menjerapkan

analit pada fase diam kemudian dielusi dengan metanol. Adanya HCl 0,002 N

menyebabkan suasana asam sehingga analit berada dalam bentuk molekul dan

terjerap ke fase diam. Koekstraktan yang tidak terjerap pada fase diam akan

terelusi oleh HCl 0,002 N. Kemudian dialiri metanol untuk mengelusi analit

(kuersetin). Namun ada juga koekstraktan yang terjerap pada fase diam, dan tidak

terelusi oleh metanol. Di sinilah peran fase diam C18 dalam proses clean up ini,

yaitu ada koekstraktan yang terelusi oleh HCl 0,002 N dan ada juga yang terjerap

pada fase diam C18 namun tidak terelusi.


49

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa metode

SPE kolom C18 dapat digunakan untuk mengurangi jumlah senyawa – senyawa

lain (koekstraktan) pada ekstrak teh hijau dengan menggunakan larutan pencuci 6

ml HCl 0,002 N dan larutan pengelusi 5 - 10 ml metanol pada volume pengisian

sampel 0,1 ml dengan parameter optimum resolusi 2,994 namun didapatkan

efisiensi clean up yang kurang baik, yaitu 37,5 – 43,75%.

B. Saran

Perlu dilakukan optimasi clean up kuersetin dengan menggunakan

cartridge SPE lain, yaitu C4 dan C8 untuk fase terbalik, serta NH2 untuk fase

normal dengan jenis dan komposisi fase gerak yang menghasilkan efisiensi clean

up yang lebih baik.


50

DAFTAR PUSTAKA

Dharma, P.S., 2012, Optimasi Proses Ekstraksi Kuersetin Total pada Teh Hijau

dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri, Skripsi,

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope

Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,

299, 1009-1010.

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan

Herbal, volume kelima, edisi I, Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta, 299, 64-65.

Dwiyoga, A.R.H., 2012, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Kuersetin

Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase Terbalik

dalam Teh Hijau (Camelia sinensis O.K.), Skripsi, Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2009, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,

Yogyakarta, pp. 379.

Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis

Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung, 21-25.

Kodama, D.H., Goncalves, A.E.d.S.S., Lajolo, F.M., and Genovese, M.I., 2010, Flavonoids, Total Phenolics and Antioxidant Capacity: Comparison

between Commercial Green Tea Preparations, Ciencia e Technologia de

Alimentos, 1077.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh

Kosasih Padmawinata, hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.

Mokgadi, J., Mmualefe, L.C., and Torto, N., 2009, SampliQ OPT Solid Phase

Extraction Sorbent in the Cleanup of Flavonoids in Ginkgo Biloba by

HPLC-DAD, Agilent Technologies, 1 – 8.

Munson, J. W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan

oleh Harjana, Parwa B., Volume II, hal. 13-5, 8Airlangga University

Press, Surabaya.

Paulsen, S., 2003, Quercetin Monograph, diakses tanggal 19 Februari 2012


51

Pescok, R. L., Shields, L. D., and Cains, T., 1976, Modern Methods of Chemical

Analysis, 2nd

ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 51.

Phani, Ch. R. S., Vinaykumar, Ch., Rao, K.U., and Sindhuja, G., 2010,

Quantitative Analysis of Quercetin in Natural Sources by RP-HPLC,

IJRPBS, 19.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi 1, Graha Ilmu,

Yogyakarta, pp. 36 – 38.

Sibuea, P., 2006, Makan Sehat Hidup Sehat, hal 162-165, diakses tanggal 3 april

2011.

Silva, A. F. V. D., 2012, Validasi Metode dalam Penetapan Kadar Kuersetin Total

dalam Daun Teh Segar (Camellia sinensis O.K.), Teh Hijau, dan Teh

Hitam Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Fase Terbalik, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method

Development, 2nd Edition, JohnWiley & Sons, Inc., New York, pp. 690.

Soraya, N., 2007, Sehat dan Cantik Berkat Teh Hijau, diakses tanggal 3 April

2011.

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, Penerbit

ITB, Bandung, pp. 1-8.

The Merck Index, 1989, The Merck Index An Encyclopedia Of Chemicals Drugs

and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.1278.


52

LAMPIRAN


53

Lampiran 1. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam C18

1. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak 0,002 N HCl replikasi 1

2. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak metanol replikasi 1


54

3. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak 0,002 N HCl replikasi 2

4. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak metanol replikasi 2


55

Lampiran 2. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam diol

1. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak n-heksan replikasi 1

2. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak etil asetat replikasi 1


56

3. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak metanol replikasi 1

4. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak n-heksan replikasi 2


57

5. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak etil asetat replikasi 2

6. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak metanol replikasi 2


58

Lampiran 3. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam silika

1. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak n-heksan replikasi 1

2. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak etil asetat replikasi 1


59

3. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak metanol replikasi 1

4. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak n-heksan replikasi 2


60

5. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak etil asetat replikasi 2

6. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak metanol replikasi 2


61

Lampiran 4. Kromatogram optimasi volume

1. Volume eluen 5 ml metanol replikasi 1



62

3. Volume eluen 7,5 ml metanol replikasi 1

4. Volume eluen 7,5 ml metanol replikasi 2


63




64

Lampiran 5. Kromatogram kapsitas

1. Fraksi air pada 0,05 ml sampel replikasi 1

2. Fraksi metanol pada 0,05 ml sampel replikasi 1


65




66




67




68




69




70

Lampiran 6. Contoh cara perhitungan resolusi

Rumus: Rs = 2 ( 𝑡𝑅2−𝑡𝑅1 )

( 𝑊2+ 𝑊1 )

Rs = 2 ( 10,422−9,544 )

( 12,603−9,814 + (9,82−8,948))

= 0,479650369

Rs = 2 ( 10,363−8,856 )

( 13,033−9,741 + (9,637−8,637))

= 0,702236719

Lampiran 7. Contoh cara perhitungan efisiensi clean up

Rumus :

efisiensi clean up = (𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸)

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100%

efisiensi clean up = (16−9)

16 𝑥 100%

= 43,75%

efisiensi clean up = (16−10)

16 𝑥 100%

= 37,5%

Lampiran 8. Contoh cara perhitungan t-test

Rumus : t = (rata – rata – nilai yang diketahui) x √jumlah sampel/standar deviasi

Diketahui persamaan : y = 0,02435x + 2,48761

Standar deviasi yang didapatkan = 0,0401822

t = (0,02435 – 0) x √3/0,0401822 = 1,0496

t hitung = 1,0496


71

derajat kebebasan = n-1 = 3-1 = 2 t tabel untuk tingkat kepercayaan 95% =

4,30

t hitung < t tabel tidak berbeda signifikan


72

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Optimasi Clean Up Ekstrak

Metanol Air The Hijau dengan Menggunakan Metode Solid

Phase Extraction (SPE) Untuk Determinasi Kuersetin dalam

Teh Hijau” bernama lengkap Adi Wirasaputra. Penulis lahir

di Klaten pada tanggal 20 Oktober 1989 sebagai anak

pertama dari pasangan Tri Setiyo Widiyanto dan Yuniati

Dewi Dyah Kuswandari. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di SD Maria

Assumpta Klaten (2002), di SMP Pangudi Luhur 1 Klaten (2005), SMA Kolese

De Britto Yogyakarta (2008). Penulis melanjutkan pendidikannya di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008. Selama

menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta, penulis aktif dalam kegiatan seperti menjadi panitia Pharmacy

Performances and Event Cup 2008, panitia TITRASI 2009, menjadi panitia

Pharmacy Performances and Event Cup 2010, kegiatan donor darah, dan panitia

pelepasan wisuda.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · (spe) untuk mendukung penetapan kadar kuersetin...

Documents