BAB I PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang Sampai saat ini pemanfaatan biota laut di Indonesia masih belum optimal. Terutama di bidang farmasi. Beberapa senyawa yang memiliki aktifitas farmakologik sudah berhasil diisolasi dari spons. Callyspongia sp merupakan salah satu jenis spon yang banyak tumbuh diperairan wilayah Indonesia. Spons ini adalah salah satu biota laut yang banyak mengandung berbagai metabolit sekunder yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat. (1:29) Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat dilaboratorium kimia. Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparatif. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparatif hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran. Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan cara mengotak-atik langsung beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah: (1) Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan), (2) Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorpsi, penjerapan), dan (3) Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian). (2:1)

Teknik KLT dua dimensi (2-D) adalah salah satu metode lebih fleksibel dalam pengembangan TLC. Aplikasi pertama dari 2-D metode kromatografi untuk kromatografi kertas dilaporkan pada tahun 1944 oleh Consden, Gordon, dan Martin. Sejak saat itu, metode ini telah banyak digunakan untuk pemisahan sejumlah besar senyawa yang tidak dapat dipisahkan dalam percobaan satu dimensi (1-D) TLC. Dalam 2-D TLC, pemisahan adalah pada satu permukaan tersebar di sepanjang seluruh area plat. Kekuatan pemecahan 2-D Metode KLT memiliki aplikasi besar, terutama di lingkungan biokimia, biologi, produk alami, farmasi, dan lingkungan analisis. (3:1) I.2 Maksud dan Tujuan I.2.1 Maksud percobaan Mengetahui dan memahami teknik untuk menguji kemurnian hasil isolasi kimia dari komponen bahan alam dengan menggunakan metode KLT dua dimensi dan KLT multi eluen. I.2.2 Tujuan percobaan Melakukan teknik pengujian kemurnian hasil isolasi komponen kimia dari sampel spons Callyspongia sp dengan menggunakan metode KLT multi eluen dan KLT dua dimensi. I.3 Prinsip Percobaan 1. Prinsip dari multi eluen yaitu adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dengan beberapa perbandingan

eluen dengan tingkat kepolaran tertentu untuk mempertegas adanya senyawa tunggal pada sampel Callypongia sp. 2. Prinsip dari KLT dua dimensi adalah adsorpsi dan partisi dengan menggunakan lempeng GF 254 sebagai fase diam dan perbandingan eluen pada profil KLT dimana akan memperpanjang lintasan noda (Rf) yang menunjukkan senyawa tunggal pada sampel Callypongia sp.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Sampel 1. Klasifikasi Kingdom Phylum Kelas Ordo Famili Genus Spesies : Animalia : Porifera : Demospongiae : Haplosclerida : Callyspongiidae : Callyspongia : Callyspongia sp. (4)

2. Kandungan kimia Hasil Identifikasi Metabolit Sekunder Callyspongia sp. Jenis senyawa yang diidentifikasi Alkaloid dan Flavonoid (4) 3. Manfaat Antioksidan, antikanker, anti-mikroba dan antiparasit (5) II.2 Teori Umum Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda. (6:112) Dalam multi eluen, setelah pengembang tunggal menaik,

kromatogram diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 510 menit. Kromatogram tersebut kemudian dielusi lagi dalam eluen segar

dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama. Proses ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusi komponen dengan nilai RF bawah 0,5. Beberapa pengembang dilakukan dengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama, masing-masing yang menjalankan jarak yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap. "Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh fase yang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas lapisan, meninggalkan zat terlarut polar terganggu dari mana dia berasal. Setelah kering, zat terlarut polar dipisahkan oleh pengembang dengan eluen (7:112) Keuntungannya adalah kadang-kadang pelat KLT tampaknya tidak cukup lama untuk memberikan pemisahan yang diperlukan pada komponen sampel. (6:113) KLT dua arah atau dua dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai

karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, dua sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda. (8:364) Kromatografi planar adalah satu-satunya teknik kromatografi dimana kromatografi dua dimensi dapat dilakukan. Ini merupakan alat pemisahan yang baik dan cukup sering dilirik sebagai suatu prosedur untuk dilakukan.

Sayangnya kebanyakan pemisahan dua dimensi dahulunya telah melibatkan pemisahan kurang lebih 20 jenis asam amino pada selulosa atau silika gel, dimana prosedurnya memakan waktu seharian untuk dilakukan dan hanya satu sampel per lempeng yang bisa di analisa dalam satu waktu. Hasilnya adalah suatu kromatogram seperti cetakan jari, mengidentifikasi noda dengan membandingkannya dengan standar sangat memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama. Bagaimanapun juga, suatu metode telah dikembangkan. Dulunya asam amino telah dipisahkan dengan cara ini selama berabadabad. (6:115) Zat identifikasi oleh 2D-TLC juga sering dilakukan dalam

penyelidikan phytopharmaceuticals, yang biasanya memiliki komposisi yang kompleks. Dari sudut pandang logis, 2D-KLT menggunakan pelarut yang sama dalam dua arah harus sistem yang terbaik. Namun, ini tidak biasanya menyebabkan informasi tambahan, karena semua zat akan berbaring pada diagona. Metode 2D-KLT hanya menjadi menarik jika reaksi telah terjadi antara dua eluen, dan penyimpangan dari garis diagonal dapat diamati setelah elusi kedua. (9:108)

Dalam hal untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang sama ini cukup sulit tetapi penting. (6:115) Secara singkat pengerjaan KLT dua dimensi ialah sebagai berikut: Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90, dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua, sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi. (8:365) Keberhasilan pemisahan akan tergantung pada kemampuan untuk memodifikasi selektivitas eluen kedua dibandingkan dengan selektivitas dari eluen pertama. (1:1)

Pemisahan 2-D yang terbaik TLC adalah ketika semua komponen dipisahkan dan didistribusikan pada seluruh permukaan dari pelat kromatografi. Estimasi pemisahan ini dapat dibuat dengan sebuah fungsi

objektif. Umumnya, kesepakatan yang baik antara evaluasi visual dari kromatogram dan evaluasi komputer menggunakan fungsi objektif adalah melihat. Di sisi lain., fungsi yang diperlukan yang dapat memprediksi nilai Rf dari satu komponen fungsi komposisi dari fase gerak . Ada program untuk simulasi kromatogram yang sebanding dengan yang diperoleh dengan percobaan kromatogram. (1:4) Keuntungannya Pemisahan dua-dimensi pada KLT yang mudah dilakukan sangat berguna untuk sampel yang mengandung banyak komponen yang tidak mudah diselesaikan oleh teknik lain. (10:33) Metode ini juga memberikan pemisahan standar di kedua arah, sehingga migrasi dari dua campuran referensi bentuk koordinat grafik yang memungkinkan diketahui untuk ditempatkan di dua dimensi. Menyelesaikan daya persegi yang hamper dicapai dalam satu dimensi TLC. (11:414) Kerugiannya adalah analisis kuantitatif dengan celah-scan

densitometri tidak terlalu berhasil untuk TLC 2D karena standar dapat diterapkan hanya setelah elusi pertama dan tidak akan memiliki konfigurasi zona yang sama dengan zona elusi analit ganda. Atau, standar dan sampel harus dikembangkan dan dipindai diplat yang berbeda dalam kondisi yang harus diasumsikan identik. Hasil terbaik diharapkan akan diperoleh dalam modus fluoresensi, yang telah membentuk efek yang berkurang pada zona area scan, atau dengan

menggunakan tempat terbang (zigzag) scanner yang dapat mewakili kromatogram sebagai peta kontur atau citra tiga dimensi daripada celahpemindaian mekanik, pemindaian elektronik, atau densitometri memiliki potensi untuk menjadi lebih sukses untuk kuantifikasi kromatogram 2D, namun penerimaan dan penggunaan teknik ini belum meluas. (7:111) Seri elutropik (11:409)

Penyerap umum yang digunakan adalah silica gel, aluminium oksida, kieselguhr, selulosa dan turunannya, poliamida, dan lain-lain. Silica gel adalah penyerap yang banyak digunakan karena mempunyai pemisahan yang baik. Zat penyerap dilapiskan secara merata pada penyangga dengan ketebalan lapisan antara 0,1-0,3 mm. Pemisahan suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis

tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap, dan sifat daya serap masingmasing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa fase diam (penyerap) dengan kecepatan bergeraknya komponen terlarut dalam fase gerak (pelarut) adalah dasar untuk mengidentifikasi komponen yang

dipisahkan, perbandingan kecepatan ini dinyatakan dengan Rf (Rate of flow) dengan persamaanJarak yang ditempuh senyawa terlarut Nilai Rf = Jarak yang ditemph pelarut

Contoh perhitungan nilai Rf Rumus:

Nilai Rf noda di eluen nonpolar Jarak yang ditempuh eluen = 5 cm a. ekstrak Hexan Jarak yang ditempuh noda (N)

b. Ekstrak Metanol (ekstrak awal)

Nilai Rf noda di eluen nonpolar Jarak yang ditempuh eluen = 5.3 cm a. Ekstrak Hexan Jarak yang ditempuh noda (N)

b. Ekstrak Metanol (Ekstrak Awal)

BAB III METODE KERJA

III.1

Alat dan Bahan

III.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan adalah chamber, gegep, lampu UV 254 dan 366, oven, pipet skala, pipet tetes, dan vial III.1.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah aluminium foil, eluen hexan, eluen etil asetat, eluen methanol, hasil kerukan KLTP, kertas saring, lempeng KLT GF 254, pereaksi H2SO4 10%, dan pipa kapiler. III.2 Cara Kerja

III.2.1 Multi eluen 1. 2. Disiapkan alat dan bahan Disentrifuse hasil kerukan KLTP dalam tabung dengan

metanol:kloroform (1:1) 3. Diuapkan dan setelah itu disediakan lempeng yang sudah diaktifkan 4. 5. 6. Ditotolkan sampel pada lempeng yang berbeda Disiapkan perbandingan eluen dari yang non-polar hingga polar Dilihat penampakannya di lampu UV.254 nm dan UV 366 nm.

III.2.1 KLT dua dimensi 1. 2. Disiapkan alat dan bahan Dilarutkan ekstrak dengan methanol

3. 4. 5. 6.

Ditotolkan pada lempeng yang telah diaktifkan Dibuat perbandingan eluen hexan:etil = 5:1 Dimasukkan ke dalam chamber, dielusi dan dikeringkan Diputar 90 o setelah mencapai batas atas, lalu dielusi lagi, setelah elusi kedua mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan

7.

Dilihat penampakan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Pengamatan MULTI ELUEN UV 254 UV 3666

Penyemprotan H2SO4 10%

Keterangan Kanan: Heksan:etil (5:1) Kiri: Heksan:etil (3:1)

KLT 2 DIMENSI

Eluen I=Heksan : Etil Asetat = 5 : 1 Eluen II=Heksan : Etil Asetat = 3: 1

IV.2 Pembahasan Kromatografi Lapis Tipis 2 arah biasa disebut juga dengan kromatografi Lapis Tipis 2 dimensi. Merupakan salah satu metode yang dapat memungkinkan pemakaian fase diam yang lebih luas untuk memisahkan campuran yang mengandung banyak komponen. Selain itu, dua system pelarut yang sangat berbeda dapat dipakai secara berurutan pada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan campuran yang mengandung komponen yang kepolarannya sangat berbeda. Cuplikan ditotolkan pada salah satu lapisan yang berbentuk bujur sangkar (20 x 20 cm) dan dikembangkand negan satu system pelarut, sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salahs atu sisi. Pelat diangkat, dikeringkan, diputar 90 derajat, kemudian diletakkan di dalam system pelarut yang kedua. Sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terdapat sepanjang bagian bawah pelat dan dikromatografi lagi. KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solut mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

Keuntungan penggunaan metode KLT 2 dimensi dan multieluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT.

Memfokuskan zona pemisahan. KLT 2 dimensi

memiliki potensi

pemisahan 150-300 komponen senyawa kimia. Sedangkan untuk KLT multi eluen, cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengan nilai Rf di bawah 0.5. Sebelum dilakukan KLT 2 dimensi dan multi eluen, sampel disentrifuge terlebih dahulu dengan menggunakan methanol p.a, sebab untuk menjamin kemurnian senyawa. Sebab, methanol p.a merupakan pelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor. Berbeda dengan methanol teknis yang bisa saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang digunakan untuk menampung pelarut. Lempeng harus diputar 90 derajat pada KLT 2 dimensi, agar seluruh area lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat ter-elusi kembali melalui sisi lempeng yang lain sehingga didapatkan resolusi yang baik dan kapasitas noda yang tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

1.

Satari, RR. (1999). Penelitian Produk Alam Laut Indonesia, Arah dan Prospek. Jakarta.

2. 3.

Meronda, Rahmawati G. Makalah Fito II. Cazes, Jack. (2004). Encyclopedia of Chromatography. New York: Marcell Dekker Inc

4.

Klasifikasi Alkalois. Metabolit Sekunder Callyspongia sp. [Internet]. Tersedia dalam: http://www.artikelkimia.info/kimia/klasifikasi-

alkaloid/page/2 [Diakses 14 November 2011] 5. Hanani, Endang, dkk. (2005). Identifikasi Senyawa Antioksidan dalam Spons Callyspongia sp dari Kepulauan Seribu. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II. Depok: UI Press 6. Wall, Peter E. (2005). Thin-Layer Chromatography, A Modern Practical Approach. UK: RS.C 7. Fried, Bernard & Sherma, Joseph. (1999). Thin Layer

Chromatography. 4th Edition, Revised and Expanded. New York: Marcel Dekker. Inc 8. Gandjar, Ibnu Gholib dan Rohman, Abdul. (2009). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar 9. Hahn-Deinstrop, Elke. (2007). Applied Thin-Layer Chromatography, Best Practice and Avoidance of Mistakes. Second, Revised and Enlarge Edition. Jerman: WILEY-VCH

10.

Striegel, Mary F & Hill, Jo. (1996). Thin Layer Chromatogrphy for Binding Media Analysis. Los Angeles: The Getty Conservation Institute.

11.

Patnaik, Pradyot. Deans Analytical Chemistry Handbook. 2nd Edition. USA: The McGraw-Hill Companies

LAMPIRAN

Skema kerja 1. Multi Eluen Hasil kerukan KLTP

Dilarutkan dengan Metanol

Disiapkan perbandingan eluen Ditotolkan pada lempeng

Dielusi dengan eluen yang telah disiapkan

Dilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm 2. KLT Dua Dimensi Hasil kerukan KLTP

Dilarutkan dalam metanol

Disiapkan eluen hexan:etil = 5:1 Ditotolkan pada lempeng

Dielusi hingga batas atas Diputar 90o

Dielusi lagi hingga batas atas

Dikeluarkan dari chamber

Dikeringkan

Dilihat pada UV 254 nm dan UV 366 nm