plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · c. solid phase extraction (spe) ... e. alat...

VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM

BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Florentina Silviana Devi

NIM: 118114149

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta

2015

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM

BUAH MELON (Cucumis melo L.)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Florentina Silviana Devi

NIM: 118114149

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta

2015


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“ Hidup untuk bermimpi, Hidup untuk berusaha, Hidup untuk bersyukur dan

kembalilah pada sebuah mimpi, usaha dan syukur”

Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga, teman-teman dan

almamaterku Universitas Sanata Dharma.


v


vi


vii

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan atas berkat karunia yang telah dilimpahkan

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “VALIDASI METODE

ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo

L.)” sebagai tugas akhir untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.).

Selama pelaksanaan penelitian penulis mendapatkan banyak dukungan

motivasi, bantuan arahan, bimbingan, kritik, saran dan doa dari berbagai pihak. Maka

dari itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih, terutama kepada:

1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku pembimbing utama skripsi yang telah

memberikan bimbingan, arahan, kritik, saran, doa, semangat motivasi, dan

bantuan lainnya sejak awal hingga akhir penelitian.

2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta

3. Jeffry Julianus, M.Si dan F. Dika Octa riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji

yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini.

4. Sanjayadi M.Si., yang telah banyak memberikan arahan, bimbingan, kritik,

saran, doa, membantu dalam optimasi kesesuaian sistem GC-ECD yang

digunakan serta memberi semangat motivasi dan dukungan sejak awal hingga

akhir penelitian.

5. Nina setiawati, M.Sc., Apt. selaku kepala laboratorium Universitas Sanata

Dharma yang memberikan perijinan untuk menggunakan laboratorium.


viii

6. Seluruh dosen dan karyawan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma atas

bantuan selama proses pembelajaran menempuh jenjang S1 Farmasi.

7. Bapak Lukas Sumari dan mamak Katarina Katrin selaku orang tua yang selalu

mendoakan, mendukung, dan memberi motivasi sehingga penulis dapat

menyelesaikan program studi S1 farmasi.

8. Agnes Reka Wati, Stevanus midut, mamak Sri, Biyung, Pakpoh, selaku

keluarga penulis yang selalu mendoakan dan memberi motivasi hingga

penulis menyelesaikan studi S1 Farmasi.

9. Serlika Rostiana, Rizki Seviana, Rushadi Jatmiko, selaku tim skripsi yang

selalu memberikan pengertian, kerja sama, motivasi, dukungan, bantuan doa,

dalam proses penyelesaian skripsi.

10. Mas Bimo, Pak Kethul, Pak Mus, Pak Parlan, Pak Kunto, seluruh staf

laboratorium Universitas Sanata Dharma dan staf keamanan serta kebersihan

Universitas Santa Dharma.

11. Teman-teman FSM-D dan FST-B 2011 selaku teman-teman kelas yang telah

memberikan banyak kesan kenangan dan pengalaman selama empat tahun ini.

12. Seluruh pihak yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah

membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi.

13. Mas bebek, Mas Enggal, dan pak Bantul selaku pemilik ladang melon yang

membantu mengurus melon sebagai subjek uji dalam penelitian hingga panen.


ix


x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................... v

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................... vi

PRAKATA ...................................................................................................... vii

DAFTAR ISI ..................................................................................................... x

DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xvii

INTISARI ..................................................................................................... xviii

ABSTRACT ..................................................................................................... .xix

BAB I PENGANTAR ....................................................................................... 1


xi

A. Latar Belakang ........................................................................................... 1

1. Permasalahan ........................................................................................ 4

2. Keaslian Penelitian ................................................................................ 4

3. Manfaat Penelitian ................................................................................ 4

B. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 5

Bab II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................. 6

A. Difenokonazol ............................................................................................. 6

1. Sifat Fisika Kimia ................................................................................. 7

2. Toksisitas ............................................................................................. 8

B. Kandungan Buah Melon ........................................................................... 10

C. Solid Phase Extraction (SPE) ................................................................... 12

D. Ekstraksi .................................................................................................... 14

E. Gas Chromatography (GC) ...................................................................... 17

1. Pengertian ............................................................................................ 17

2. Prinsip pemisahan ............................................................................... 19

3. Kinerja GC .......................................................................................... 20

4. Instrumentasi ...................................................................................... 22

F. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 29

1. Akurasi ............................................................................................... 30

2. Presisi ................................................................................................. 30

3. Linearitas dan rentang ......................................................................... 31


xii

4. Limit of Quantitation (LOQ) ............................................................... 31

G. Metode Kuantifikasi .................................................................................. 31

1. Metode standar eksternal..................................................................... 32

2. Metode standar internal ....................................................................... 32

3. Metode standar adisi ........................................................................... 33

H. Landasan Teori .......................................................................................... 34

I. Hipotesis .................................................................................................... 35

BAB III METODE PENELITIAN.................................................................. 38

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 38

B. Variabel Penelitian .................................................................................... 38

1. Variabel bebas ..................................................................................... 38

2. Variabel tergantung ............................................................................. 38

3. Variabel pengacau terkendali .............................................................. 39

C. Definisi Operasional.................................................................................. 39

D. Bahan Penelitian........................................................................................ 40

E. Alat Penelitian ........................................................................................... 41

F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 41

1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD .......................................................... 41

2. Preparasi sampel dengan metode QUeChERS .................................... 42

3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol....................................... 42

4. Optimasi clean-up SPE C18 ................................................................. 43


xiii

5. Validasi metode analisis ...................................................................... 47

G. Analisis Hasil ............................................................................................ 50

H. Rancangan Penelitian ................................................................................ 55

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 65

A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD ............................................................... 66

1. Optimasi instrument GC-ECD ............................................................ 66

2. Kinerja instrument GC-ECD ............................................................... 67

B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS ........................................ 77

C. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 87

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 100

A. Kesimpulan ............................................................................................ 100

B. Saran ........................................................................................................ 101

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 102

LAMPIRAN .................................................................................................. 106

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 120


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon Tiap 100 gram ........... 10

Tabel II. Kriteria Validasi ................................................................................. 30

Tabel III. Hasil Optimasi Kondisi GC ............................................................ 67

Tabel IV. Nilai Rata-rata N, Rs, danTF Puncak Difenokonazol Kurva Baku Solven

.......................................................................................................... 69

Tabel V.Nilai %RSD Kurva Baku Solven ....................................................... 71

Tabel VI. Uji Sensitivitas .................................................................................. 74

Tabel VII. Nilai Response Factor ..................................................................... 75

Tabel VIII. Nilai %D......................................................................................... 77

Tabel IX. Kadar Air Buah dalam Melon ........................................................... 78

Tabel X. Hasil Optimasi Lama Sentrifugasi ..................................................... 80

Tabel XI. Penentuan Kapasitas SPE (Sigmaaldrich) ....................................... 83

Tabel XII. Optimasi Penentuan Kapasitas SPE C18 .......................................... 83

Tabel XIII. Nilai % Recovery Hasil Optimasi Kelayakan Penggunaan SPE Berulang

.......................................................................................................... 86

Tabel XIV. Hasil Optimasi Clean-up SPE C18 ................................................. 87


xv

Tabel XV. Nilai %Recovery Metode Adisi C .................................................. 89

Tabel XVI. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi C .......................................... 90

Tabel XVII. Nilai %Recovery Metode Adisi B ............................................... 90

Tabel XVIII. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi B ....................................... 90

Tabel XIX. Nilai %Recovery, SD,Dan %RSD Metode Adisi A ...................... 91

Tabel XX. Nilai N, Rs, TF Dan Tr Dari Kurva Adisi ....................................... 95

Tabel XXI. Hasil % Recovery pada Kisaran 0,263-0,789 ng............................ 95

Tabel XXII. Hasil %RSD sebagai Presisi Kurva Adisi .................................... 96


xvi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Difenokonazol ..................................................................... 7

Gambar 2. Proses Skematik Prosedur Spe ........................................................ 12

Gambar 3. Diagram Skematik Kromatografi Gas ............................................. 22

Gambar 4. Struktur Difenokonazol ................................................................... 66

Gambar 5. Kromatogram Difenokonazol dalam Pelarut Heksan...................... 68

Gambar 6. Kurva Baku Solvent antara Luas Puncak Difenokonazol/DCB vs Kadar

Difenokonazol ................................................................................. 73

Gambar 7. Luas Puncak Difenokonazol yang Diperoleh dari Hasil Fraksinasi setelah

Washing dengan 5% Meoh Vs 100% UPW .................................. 84

Gambar 8. Luas Puncak Difenokonazol Hasil Elusi Difenokonazol dalam SPE C18 per

mL metanol ......................................................................................... 85

Gambar 9.Linearitas Kurva Adisi ..................................................................... 93

Gambar 10. Kromatogram Kurva Adisi ............................................................ 94


xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs) .............................................................. 105

Lampiran 2. Perhitungan IDL & IQL ................................................................ 106

Lampiran 3. Certificate Of Analysis DCB .......................................................... 109

Lampiran 4. Certificate Of Analysis Asetonitril ................................................. 110

Lampiran 5. Certificate Of Analysis Heksan....................................................... 111

Lampiran 6. Certificate Of Analysis Metanol ..................................................... 112

Lampiran 7. Certificate Of Analysis MgSO4 ................................................................................. 114

Lampiran 8. Certificate Of Analysis Na2Hsitrat .................................................. 115

Lampiran 9. Certificate Of Analysis Na3Sitrat .................................................... 116

Lampiran 10. Certificate Of Analysis NaCl ........................................................ 117

Lampiran 11. Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari

PT.Syngenta ................................................................................ 118


xviii

INTISARI

Kondisi iklim tropis Indonesia yang panas dan lembab memicu perkembangan

dan penyebaran jamur antaknosa (Colletotrichum gloesporioides) menyebakan

kerusakan pada buah melon (Cucumis melo L.). Untuk mengontrol jamur antraknosa,

para petani menggunakan difenokonazol. Oleh karena itu, untuk menjamin

konsumen, tingkat residue difenokonazol yang tertinggal dalam melon diawasi.

Tujuan dari studi ini adalah menvalidasi metode analisis untuk residu difenokonazol

dalam buah melon, agar metode ini dapat diterapkan untuk analisis residu pestisida di

laboratorium Indonesia.

Proses ektraksi pada pengembangan metode ini dibantu dnegan metode LLE

dari QuEChERS, dimana proses cleanup menggunakan SPE C18 dan determinasi

menggunakan GC-ECD serta kuantifikasi standar internal menggunakan

dekaklorobifenil (DCB). Performa kerja GC-ECD menunjukan presisi dari rasio area,

waktu retensi <20%, ketika integritas standar menujukan RSD dari response factor

dan %difference <20%. Range linearitaspada konsentrasi 0,053-0,526 ng dengan r

0,890 - 0,999, Instrumental Detection Limit (IDL) 0,01-0,07 ng/ml dan Instrumental

Quantitation Limit (IQL) 1,06 ng/g . Recovery fortifikasi sampel ekstrak blank pada

konsentrasi 0,158-0,684 ng sebesar 86-91 % dan tidak ada efek matrik secara

signifikan. Kesalahan pada tahap ekstraksi, cleanup dan determinasi secara berturut-

turut 0,133%, 8,753%, dan 8,670%. Recovery fortifikasi sampel pada 0,158-0,684ng

sebesar 71-115% . LOQ sebesar 0,002 g/g dan LLMV 7,364 ng/g, oleh karena itu

metode ini sesuai untuk mengawasi kadar residu difenokonazol dalam buah melon,

yang memiliki Batas Maksimum Residu (BMR) sebesar 0,7 mg/kg.

Kata kunci : Difenokonazol, Residu pestisida, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase

Extraxtion, GC-ECD , Validasi Metode.


xix

ABSTRACT

Indonesian tropical climate which is warm and humid promote the

development and spread antrachnose (Colletotrichum gloesporioides) causing

significant damage in melon (Cucumis melo L.). To control the antracmose, farmers

used difenoconazole. For that reason, to assure the safety of the consumer, the level

of difenoconazole residue in melon should be monitored. The purpose of this study is

to develop a valid analytical method for difenoconazole residue in melon can be done

in common pesticide residue laboratory in Indonesia.

The extraction process of the development method was done following the

assisted LLE method of the QuEChERS, while the clean-up process was done using

C18 SPE catridge and determinate by GC-ECD and quantified by internal

standardization using decachlorobiphenyl (DCB) as internal standard. The

performance of the GC-ECD shows precision of ratio area, retention time less than

20%, while the standard integrity shows RSD of the response factor and %difference

<20%. Linearity range was 0,053-0,526 ng with r 0,890-0,999,. Instrumental

detection Limit (IDL) was 0,01-0,07 ng/ml and Instrumental Quantitation Limit

(IQL) was 1,06 ng/g, Recovery of fortified blank extract at 0,158-0,684 ng was 86-

91% and no matrix effect was observed. The error at extraction step, cleanup step and

determination step were 0,133%, 8,753%, and 8,670 % respectively. The recovery of

Fortified sample at 0,158–0,684 ng was 71-115%. The LOQ was 0,002 g/g and the

LLMV 7,364 ng/g, therefore this method is fit for monitoring difenoconazole residue

in melon, which has Maximum Residue Limit (MRL) of 0.7 mg/kg.

Key words: Difenokonazol, Pesticide residue, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase

Extraxtion, GC-ECD, method validation


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Indonesia merupakan negara agraris, Sebagian besar penduduk Indonesia

bermata pencaharian sebagai petani. Budidaya tanaman hortikultura yang meliputi

sayuran dan buah-buahan semakin banyak diminati petani, karena komoditas ini

mampu memberikan keuntungan lebih tinggi dibandingkan padi dan palawija dalam

luas area tanam yang sama. Salah satu komoditas hortikultura yang dimaksud adalah

tanaman melon (Samadi,2007).

Melon merupakan salah satu buah yang ekslusif, yang telah memasyarakat.

Melon banyak dibudidayakan di Bogor, Lampung, Jakarta, Jawa Barat, Yogyakarta,

Jawa Tengah (seperti Sukoharjo, Surakarta, Sragen, Karanganyar dan Klaten), dan

Jawa Timur (Malang, Ngawi, Walikukun, Kedung Galar, Ngrambe, Pacitan,

Madiun). Buah ini sangat digemari, terutama apabila dihidangkan sebagai buah segar.

Di dalam perusahaan makanan dan minuman, melon sering kali dimanfaatkan sebagai

bahan penyedap rasa untuk memberikan aroma segar yang khas dari buah melon.

Selain itu saat ini sedang gencar mengenai ekspor buah tropis. Pasar ekspor dunia

menuntut pengadaan buah-buah tropis untuk memenuhi kebutuhan konsumen. Salah

satu buah tropis yang dimaksud adalah melon. Namun ekspor ini terganggu dengan


2

pengadaan buah melon, karena adanya kendala-kendala dalam budidaya buah melon.

Saat ini Indonesia hanya mampu mengekspor buah melon satu bulan sekali.

Iklim tropis di Indonesia menyebabkan budidaya melon tidak terlepas dari

adanya kendala serangan hama penyakit terutama karena jamur antraknosa. Adanya

serangan hama penyakit yang berat dapat menurunkan produktivitas tanaman, bahkan

menyebabkan gagal panen. Oleh karena itu, perlu dilakukan usaha pengendalian

pemberantasan hama dan penyakit. Pengendalian dan pemberantasan fungi umumnya

menggunakan fungisida yang berlebihan sehingga dapat membahayakan kesehatan

konsumen. Sehingga untuk melindungi kesehatan konsumen nasional dan

internasional perlu diadakan pengawasan terhadap kadar fungisida agar tidak

melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan (Sudarmo,1999).

Fungisida adalah bahan kimia yang dipergunakan untuk membunuh dan

menghentikan perkembangan jamur. Fungisida yang popular digunakan oleh petani

saat ini adalah AMISTARTOP Azoxystrobin 200 g/L dan Difenokonazol 125 g/L.

Penggunaannya menurut INDOGAP sesuai label adalah maksimum tiga kali aplikasi

dengan konsentrasi 0,5 mL/L. Komposisi fungisida terdiri dari dua bahan zat atau

senyawa kimia yaitu difenokonazol dan azoxystrobin. Difenokonazol merupakan

bahan aktif fungisida golongan tiga yang menghambat pertumbuhan mycelia, dimana

pertumbuhan jamur/fungi menjadi lambat atau berhenti dan efektif untuk mencegah

infeksi selanjutnya atau invasi dari jaringan-jaringan host. Penggunaan dan aplikasi

fungisida pada tanaman akan meninggalkan sisa-sisa fungsida yang disebut dengan


3

residu pestisida. Residu fungisida difenokonazol dengan kadar tertentu pada tanaman

dapat membahayakan kesehatan dan lingkungan sekitar. Oleh karena itu untuk

menjamin bahwa melon asal Indonesia layak konsumsi tanpa adanya dampak negatif

dari residu pestisida perlu dilakukan analisis dengan metode analisis yang valid.

Analisis penetapan kadar residu pestisida dengan kadar yang kecil pada buah

melon, diperlukan suatu pengembangan metode yang selektif dan sensitif. Dalam

beberapa tahun terakhir ini, salah satu metode analisis baku yang sering digunakan

untuk menganalisis residu pestisida adalah metode baku AOAC 2007.01 yaitu

analisis multiresidu dengan dasar QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,

Rugged, and Safe) yang dalam ekstraksinya menggunakan asetonitril, clean-up

sampel cukup dilakukan dengan dispersive Solid Phase Extraction (d-SPE) kemudian

dideterminasi dengan LC/MS/MS. Analisis dengan LC/MS/MS menjadi kendala bagi

para analisis residu pestisida di Indonesia. Pada umumnya laboratorium analisisis di

Indonesia tidak memiliki instrumen tersebut, begitu juga metode residu

difenokonazol pada matriks buah melon belum tersedia. Oleh karena itu untuk

mengatasi masalah tersebut diperlukan suatu modifikasi metode dengan instrumen

yang mudah ditemui tanpa mengurangi selektifitas dan sensitifitas. Pada penelitian

ini modifikasi QuEChERS dilakukan dengan kromatografi Gas (GC) yang dilengkapi

detektor penangkap elektron (ECD) yang kurang spesifik jika dibandingkan dengan

LC MS/MS. Perlu adanya penyesuaian terutama pada tahap clean-up yang

dilanjutkan dengan validasi penuh menggunakan matriks buah melon.


4

1. Permasalahan

Dari uraian masalah di atas, dapat disampaikan perumusan masalah :

a. Apakah instrumen GC-ECD (electron Capture Detector/ECD) sesuai untuk

penetapan kadar residu difenokonazol dalam matriks buah melon?

b. Bagaimana proses validasi metode analisis modifikasi QuEChERS untuk

analisis residu difenokonazol dalam matriks buah melon?

c. Bagaimana optimasi proses ekstraksi dan clean-up residu difenokonazol

dalam matriks buah melon dengan SPE?

2. Keaslian penelitian

Sampai saat ini belum ada penelitian mengenai “Validasi Metode Analisis

Residu Difenokonazol dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)”.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat metodologis.Penelitian ini dapat memberikan pengetahuan tambahan

terhadap perkembangan metode QuEChERS dalam analisis residu fungisida

difenokonazol dengan menggunakan Gas Chromatography (GC) pada sampel

buah melon.

b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat digunakan sebagai prosedur analisis

penetapan kadar residu fungisida difenokonazol dalam buah melon dengan

hasil yang akurat dengan menggunakan Gas Chromatography Electron

Capture Detector (GC-ECD).


5

B. Tujuan Penelitian

Tujuan umum dari penelitian ini adalah

1. Mengembangkan metode QuEChERS dalam analisis penetapan kadar residu

fungisida difenokonazol dalam buah melon hingga didapatkan hasil yang

valid.

2. Mampu melakukan validasi metode analisis residu difenokonazol pada buah

melon (Cucumis melo L.) dengan instrumen Gas Chromatography Electron

Capture Detector (GC-ECD).

Tujuan khusus penelitian ini adalah :

1. Mengetahui proses ekstraksi QuEChERS serta pelarut yang cocok untuk

mencari difenokonazol dari buah melon ( Cucumis melo L.).

2. Mendapatkan komposisi fase diam dan fase gerak optimum pada proses

clean-up menggunakan SPE C18.

3. Mampu menetapkan kadar residu pestisida difenokonazol dengan kondisi

Gas Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD) yang optimal.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Difenokonazol

Difenokonazol merupakan fungisida spektrum luas yang digunakan untuk

berbagai penyakit pada berbagai buah, sayur, sereal dan tanaman lainnya. Fungisida

difenokonazol termasuk golongan fungisida triazol yang bekerja secara sistemik dan

memiliki daya preventif dan kuratif. Difenokonazol bekerja menghambat demetilasi

selama sintesis ergosterol sehingga menghentikan perkembangan jamur.

Difenokonazol merupakan molekul yang berpotensi dapat bergerak, tidak mudah

untuk dicuci karena kelarutan dalam air rendah. Difenokonazol tidak volatil, persisten

di dalam tanah dan pada lingkungan akuatik (Anonim1, 2015).

Nama umum : difenokonazol

Sinonim : CGA 169374

Nama IUPAC :1-[2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-4-

methyl[1,3]dioxolan-2-ylmethyl]-1H-1,2,4-triazole

Rumus molekul : C19H17Cl2N3O3

Massa molekul :406,3


7

Rumus struktur (terdapat dua cincin karbon kiral pada struktur difenokonazol yang

menghasilkan diastereoisomer pasangan cis-trans) :

Gambar 1. Struktur Difenokonazol (EFSA, 2011).

1. Sifat Fisika Kimia

Bentuk fisik : putih, tidak berbau, bubuk Kristal halus

Titik lebur : 82-83 ºC

Titik didih : 100,8 ºC pada 3,7 mPa

Suhu dekomposisi : 337 ºC

Kepadatan relatif : 1,39 pada 22 ºC

Tekanan uap : 3,32 × 10-8

Pa pada 25 ºC

Kelarutan di dalam air : 15 mg/L pada 25 ºC

Log Pow (koefisien partisi) : 4,4 pada 25 ºC

Konstanta disosiasi dalam pKa : 1,1 pada 20 ºC

Konstanta Henry‟s law : 9,0 × 10-7

Pa m3 mol

-1 pada 25 ºC

Kelarutan dalam pelarut organic : Aseton > 500 g/L

Diklorometan > 500 g/L

Etil asetat > 500 g/L


8

Hexan 3,0 g/L

Metanol > 500 g/L

Oktanol 110 g/L

Toluen > 500 g/L

(EFSA, 2011).

2. Toksisitas

Toksisitas Akut

LD50 oral pada tikus : 1453 mg/kg bb

LD50 oral pada mencit : > 2000 mg/kg bb

LD50 dermal pada kelinci : > 2010 mg/kg bb

LD50 inhalasi pada tikus : > 3,3 mg/L (4 jam paparan)

Iritasi kulit : tidak iritasi

Iritasi mata : tidak iritasi

Toksisitas Jangka Pendek

Target/Efek : Tikus : penurunan berat badan dan jantung, penurunan

nafsu makan dan minum, liver (pada dosis tinggi

setelah paparan secara oral), liver dan tiroid setalah

paparan secara dermal

Mencit : penurunan berat badan, penurunan berat

indung telur, liver (pembesaran dan peningkatan berat,

vakuolisasi dan koagulasi nekrosis)


9

Anjing : penurunan berat badan, liver (berat meningkat

dan perubahan secara klinis), pembentukan katarak

(pada dosis tinggi)

NOAEL oral : Rat : 20 mg/kgbb/d (90 hari)

Mouse : 34 mg/kgbb/d (90 hari)

Anjing : 31 mg/kgbb/d (28 minggu)

NOAEL dermal : Rat : 100 mg/kgbb/d (28 hari)

Genotoksisitas : difenokonazol mungkin menjadi genotoksik secara in

vivo

Toksisitas Jangka Panjang dan Karsinogenisitas

Target/Efek : Rat : penurunan berat badan, liver (berat relative

meningkat, hepatosit hipertropi)

Tikus : penurunan berat badan, liver (berat meningkat,

perubahan histopatologi termasuk nekrosis, hipertropi,

perubahan lemak dan stasis empedu)

NOAEL : Rat : 1,0 mg/kgbb/d (2 tahun)

Tikus : 4,7 mg/kgbb/d (18 bulan)

Karsinogenisitas : adenoma/karsinoma liver pada mice, hanya pada dosis

tinggi, difenokonazol dianggap tidak menimbulkan

resiko karsinogenik pada manusia.


10

Toksisitas Reproduksi

Target/Efek : Parental : menurunkan berat badan

Keturunan : menurunkan berat badan melalui laktasi

Reproduksi : tidak ada efek samping

NOAEL parental : 16,8 mg/kgbb/d

NOAEL reproduksi : 189 mg/kgbb/d

NOAEL keturunan : 16,8 mg/kgbb/d

Toksisitas Perkembangan

Target/Efek : Perkembangan : variasi skeletal (rat), peningkatan

jumlah resorpsi (rat, rabbit)

Maternal : penurunan berat badan dan nafsu makan

(rat, kelinci), aborsi dan kematian

NOAEL maternal : Rat : 15,6 mg/kg bb/d

Kelinci : 25 mg/kgbb/d

NOAEL perkembangan : Rat : 15,6 mg/kg bb/d

Kelinci : 25 mg/kgbb/d

Neurotoksisitas

Neurotoksisitas akut : data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik

pada studi toksisitas akut

Neurotoksisitas berulang : data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik

pada studi toksisitas akut

Neurotoksisitas tertunda : data tidak tersedia.


11

B. Kandungan Buah Melon

Kandungan gizi buah melon dapat dilihat pada Tabel.

Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon tiap 100 gram

Komposisi Gizi Banyaknya (Jumlah)

Energi 29 kcal.

Protein 0,50 gram

Lemak 0,10 gram

Karbohidrat 6,8 gram

Serat 0,70 gram

Abu 0,70 gram

Kalsium 6 mg

Fosfor 6 mg

Kalium 180,00 mg

Zat besi 0,18 mg

Natrium 11 mg

Thiamin 0,07 mg

Riboflavin 0,01 mg

Vitamin B6 0,07 mg

Vitamin C 8,0 mg

Niacin 0,40 mg

Air 91,0 gram

(Roe, 2013).


12

C. Solid Phase Extraction (SPE)

SPE C18 kolom digunakan untuk menyaring komponen matriks sampel

nonpolar, terutama pigmen dari ekstrak sampel. Ketika suatu ekstrak yang dielusikan

dengan asetonitril-air, aseton-air, atau asetonitril ke dalam kolom SPE C18, maka

pigmen dan lipid yang bersifat non-polar akan tertahan didalam kolom.

Dua strategi yang diterapkan dalam clean-up SPE untuk ekstrak sampel yaitu

isolasi analit dan isolasi matriks. Pada isolasi analit, analit akan teradsorbsi dalam

sorben SPE non polar. Kolom SPE dapat dibilas dengan larutan berair untuk

menghilangkan campuran koekstraktan, diikuti elusi dari analit yang terjebak dalam

kolom dengan pelarut organik. Analit pestisida dielusi melalui kolom. Strategi kedua

isolasi matriks, strategi ini lebih banyak digunakan dalam clean-up residu pestisida.

Pada umumnya prosedur clean-up dengan SPE isolasi matriks dirancang untuk

menjebak komponen matriks dalam kolom dan mengelusi baik pestisida polar

maupun non-polar melalui kolom.

Gambar 2. Proses Skematik prosedur SPE


13

GC merupakan suatu metode deteksi yang selektif terutama untuk determinasi

pestisida. Sistem GC digunakan untuk skrining berbagai pestisida yang mengandung

heteroatom seperti halogen, fosfor, sulfur dan nitrogen. Detektor sistem GC tidak

hanya memiliki sensitivitas yang tinggi, tetapi juga memiliki spesifitas yang baik,

oleh karena itu suatu clean-up sampel dipersyaratkan sebelum suatu sampel

dideterminasi dengan GC. Pada metode QuEChERS, sampel diekstraksi dengan

gojogan yang kuat dalam pelarut asetonitril. Magnesium sulfat dan NaCl

ditambahkan dan kemudian gojog kuat dan di sentrifugasi. Aliquot yang

menghasilkan supernatan kemudian di clean-up menggunakan dispersive SPE,

dicampur dengan sorben SPE PSA dan MgSO4. Beberapa tipe kolom yang sering

digunakan untuk clean-up dengan SPE yaitu C18, styrene-divivyl benzene (SDVB),

aminopropyl (NH2) , primary secondary amine (PSA), trimethyl ammonium strong

exchange (SAX), graphitized carbon black (GCB), florisil, silica, dan alumina.

Analysis of pesticides in food and environmental sampel (Tadeo,2008)

Ada empat tahapan dalam prosedur SPE yaitu

a. Pengkondisian

Kolom penjerap dialiri dengan menggunakan pelarut sampel untuk

membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama,

sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diinginkan ketika sampel

diaplikasikan dapat dihindari. Penjerap nonpolar dan penjerap penukar ion

dikondisikan menggunakan metanol kemudian akuades.


14

b. Retensi sampel. Sampel dalam pelarut organik dilewatkan ke catridge baik

untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau

untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang

diharapkan terelusi.

c. Pembilasan. Seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama

tahap retensi.

d. Elusi. Tahap akhir dari penggunaan SPE untuk mengambil analit yang dituju

jika analit tersebut tetahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2009).

D. Ekstraksi

Liquid-liquid Extraction (LLE) merupakan salah satu ekstraksi yang sering

digunakan untuk memisahkan suatu analit dari komponen lain yang tidak diharapkan.

LLE adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan 2 fase pelarut yang saling

tidak bercampur dengan memperhatikan nilai P-nya. Metode ini digunakan dengan

menggunakan tabung sentrifuge dimana hanya memerlukan sampel yang lebih sedikit

(Cairns, 2004).

Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau

clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks

yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di samping itu,

ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel

dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi

atau kuantifikasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).


15

Dalam bentuk paling sederhana, suatu alikuot larutan air digojog dengan

pelarut organik yang tidak campur dengan air. Kebanyakan prosedur ekstraksi cair-

cair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang bersifat

non polar atau agak polar seperti heksana, metilbenzen, atau diklorometan. Meskipun

demikian, proses sebaliknya (ekstraksi analit dari pelarut organik non polar ke dalam

air) juga mungkin terjadi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-

molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat non

polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan senyawa-senyawa

yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air (Gandjar dan Rohman,

2007).

Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang

menyatakan bahwa “Pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan

terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak

campur.” Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut

dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (KD) dan dirumuskan sebagai

berikut: KD =

Keterangan:

KD = koefisien partisi

[S]org = konsentrasi analit dalam fase organik

[S]aq = konsentrasi analit dalam fase air


16

Pada prakteknya, analit seringkali berada dalam bentuk kimia yang berbeda

karena adanya disosiasi (ionisasi), protonasi, dan juga kompleksasi atau polimerasi

karenanya ekspreksi yang lebih berguna adalah rasio distribusi atau rasio partisi (D).

Persamaannya adalah sebagai berikut:

D =

Keterangan:

D = rasio partisi

(Cs)org = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase organik

(Cs)aq = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase air

Analit yang mempunyai rasio distribusi besar (104 atau lebih) akan mudah

terekstraksi ke dalam pelarut organik meskipun proses kesetimbangan (yang) berarti

100% solut terekstraksi atau tertahan) tidak pernah terjadi (Gandjar dan Rohman,

2007). Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan corong pisah dalam

waktu beberapa menit. Akan tetapi untuk efektivitas ekstraksi analit dengan rasio

distribusi yang kecil (< 1), ekstraksi hanya dapat dicapai dengan mengenakan pelarut

baru pada larutan sampel secara terus menerus (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi pelarut adalah pelarut yang

mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga

memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan

mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi sampel

(Gandjar dan Rohman, 2007).


17

Beberapa masalah yang sering dijumpai ketika melakukan ekstraksi pelarut

yaitu terbentuknya emulsi, analit terikat kuat pada partikulat, analit terserap oleh

partikulat yang mungkin ada, analit terikat pada senyawa yang mempunyai berat

molekul tinggi, dan adanya kelarutan analit secara bersama-sama dalam kedua fase.

Terjadinya emulsi merupakan hal yang paling sering dijumpai. Oleh karena itu, jika

emulsi antara kedua fase ini tidak dirusak maka recovery yang diperoleh kurang baik.

Emulsi dapat dipecah dengan cara:

a. Penambahan garam ke dalam fase air

b. Pemanasan atau pendinginan corong pisah yang digunakan

c. Penyaringan melalui glass-wool

d. Penyaringan dengan menggunakan kertas saring

e. Penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda

f. Sentrifugasi (Gandjar dan Rohman, 2007).

E. Gas Chromatography( GC)

1. Pengertian

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang

didasarkan pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran

tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase

gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar

yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (McNair & Miller, 1998).

Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang mana solut-solut yang

mudah menguap dan stabil dengan pemanasan bermigrasi melalui kolom yang


18

mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio

distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).

Kromatografi gas pada dasarnya merupakan metode pemisahan yang

tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tanpa menggunakan

baku pembanding. Optimasi kromatografi gas antara lain sensitivitas dan

selekstivitas/spesifitas instrumen terhadap analit yang dianalisis. Polaritas dan

volatilitas dari komponen yang akan dipisahkan menjadi pertimbangan untuk

memilih fase diam yang cocok (Grob, 1995).

Kromatografi Gas merupakan teknik analisis yang cepat, memiliki

hasil yang baik untuk analisis pestisida multikomponen, memiliki sensitifitas

tinggi dengan detektor yang spesifik (Nollet, 2004). Kromatografi gas dapat

digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif

dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi dari komponen yang

kita analisis dengan waktu retensi zat baku pembanding (standar) pada kondisi

analisis yang sama. Analisis kuantitatif diakukan dengan cara perhitungan

relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram komponen yang dianalisis

terhadap zat baku pembanding (standar) yang dianalisis (Johnson &

Stevenson, 1991).

Komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan diantara

fase diam dan fase gerak. Suatu kromatografi gas yang baik terdiri dari

komponen-komponen penting yaitu gas pembawa dan regulator tekanan,


19

injektor, kolom, oven, detektor, dan pencatat signal (Rouessac dan Annick

2007; Orejuela dan Silva, 2004).

2. Prinsip pemisahan

Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu

senyawa dikurangi dengan interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan

fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom

lalu menghantarkannya ke detektor. Fase gerak dalam kromatografi gas juga

biasa disebut sebagai gas pembawa. Syarat gas pembawa adalah tidak reaktif,

dan murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada kromatografi gas, fase diam selalu ditempatkan di dalam sebuah

kolom. Fase diam ini dapat berupa suatu padatan ( Kromatografi Gas-Padat/

Gas Solid Chromatography). Cara penyerapan komponen pada kromatografi

gas padat merupakan proses adsorpsi pada permukaan, sedangkan

Kromatografi Gas Cair dinamakan kromatografi partisi (Soeryadi,1997).

Pemisahan pada kromatografi gas dapat dilakukan pada suhu tetap

yang basanya disebut dengan pemisahan isotermal dan dapat dilakukan

dengan menggunakan suhu yang berubah secara terkendali yang disebut

dengan pemisahan suhu terprogram. Pemisahan isotermal paling baik dipakai

pada analisis rutin atau jika kita mengetahui agak banyak sifat sampel yang

akan dipisahkan. Pilihan awal pada pemisahan isotermal ini adalah suhu yang

digunakan beberapa derajat di bawah titik didih komponen campuran utama.


20

Ada 2 hal yang perlu diperhatikan terkait dengan penggunaan pemisahan

isotemal ini, yaitu: (1) terkait dengan pemilihan suhu. Jika suhu yang

diguanakan terlalu tinggi maka komponen akan terelusi tanpa terpisah,

sementara jika suhu terlalu rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi

akan keluar sangat lambat atau bahkan tetap dalam kolom sehingga akan

mengacaukan proses kromatografi selanjutnya, dan (2) terkait dengan proses

kromatografi, karena makin lama suatu sampel dalam kolom maka semakin

lebar alas puncaknya. Kedua hal ini dapat diatasi jika digunakan pemisahan

dengan suhu terprogram (Gandjar & Rohman,2007).

Pemisahan dengan suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni

mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran

yang mempunyai titik didih pada kisaran yang luas. Disamping itu, pada suhu

terprogram juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena

senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat (Gandjar

& Rohman,2007).

3. Kinerja GC

Pemisahan yang terjadi pada analisis dengan kromatografi gas

dipengaruhi oleh efisiensi kolom dan efisiensi pelarut. Efisiensi kolom

menentukan pelebaran puncak kromatogram. Efisiensi kolom dapat diukur

dengan menghitung jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang kolom yang

sesuai dengan plat teoritis (Height Equivalent to a Theoritical Plate, HETP).

HETP adalah panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan


21

komponen cuplikan diantara fase gerak yang bergerak dan fase diam yang

diam. Semakin banyak jumlah lempeng teoritis, semakin kecil HETP, maka

efisiensi kolom meningkat dan pemisahan yang terjadi akan semakin baik (

Jennings, et all., 1987).

Faktor ikutan didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak tepi

muka sampai tepi belakang puncak dibagi dua kali jarak dari maksimum

puncak sampai tepi muka puncak, jarak-jarak tersebut diukur pada titik yang

ketinggiannya 5% dari tinggi puncak di atas garis dasar. Untuk suatu puncak

yang simetris, factor ikutan (Tf) besarnya satu, dan besarnya harga Tf ini akan

bertambah jika kromatogram semakin tambah berekor (Jennings, et all.,

1987).

Pemisahan yang sebenarnya dari dua puncak yang berurutan diukur

dengan resolusi atau daya pisah. Resolusi merupakan suatu ukuran

keefisienan kolom dan pelarut yang dapat menerangkan sempitnya puncak

dan juga pemisahan antara dua maksimum puncak. Resolusi didefinisikan

sebagai jarak antara dua puncak dibagi dengan jumlah lebar masing-masing

puncak dengan diukur dari alas puncak. Bila nilai resolusi adalah 1 maka

kesempurnaan pemisahan dua puncak adalah 99,7%. Umumnya dalam

praktek, nilai resolusi 1,0 tidak cukup baik karena derajat overlap. Pemisahan

yang baik dicapai pada resolusi sekitar 1,5 atau lebih (Wittkowski &

Matissek,1990).

4. Instrumentasi


22

Pada gambar dibawah ini dapat dilihat skematik dari komponen GC-ECD:

Gambar 3. Diagram skematik kromatografi gas (Nagel, 2004)

1. Gas pembawa. Fase gerak dalam kromatografi gas disebut gas pembawa dan

harus murni dan inert secara kimia. Gas pembawa yang umumnya digunakan

adalah helium, nitrogen, argon, dan hidrogen (Skoog, West, Holler,and

Crouch, 2004).

Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan

jenis detektor yang digunakan. Gas pembawa untuk detektor ECD biasanya

adalah N2 dengan kecepatan alir 30-60 mL/menit.Untuk setiap pemisahan

dengan kromatografi gas terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang

tergantung pada diameter kolom. Kolom kapiler menggunakan kecepatan alir

gas yang rendah, yakni antara 0,2 – 2 mL/menit. Karena kecepatan alir gas

pembawa pada kolom kapiler sangat rendah, maka pada kebanyakan detektor

ditambah gas tambahan yang ditambahkan ke dalam eluen setelah keluar dari

kolom tetapi belum mencapai detektor. Gas tambahan umumnya sama dengan


23

gas pembawa, meskipun kadangkala digunakan helium. Gas pembawa bekerja

paling efisien pada kecepatan alir tertentu. Gas nitrogen akan efisien jika

digunakan dengan kecepatan alir ± 10 mL/menit, sementara helium akan

efisien pada kecepatan alir 40 mL/menit (Gandjar dan Rohman, 2007).

2. Sample Injector. Ruang injektor atau inlet berfungsi untuk menghantarkan

sampel ke dalam aliran gas pembawa. Sampel yang akan dikromatografi

dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang biasanya

berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang suntik

harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan umumnya 10 – 15 ºC

lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan

menguap segera setelah sampel disuntikkan (Gandjar dan Rohman, 2007).

Pada kolom kapiler, sampel yang diperlukan sangat sedikit bahkan

sampai 0,01 μL, karenanya berbeda dengan kolom kemas yang memerlukan 1

–100 μL sampel. Karena pengukuran secara akurat sulit dilakukan jika sampel

yang disuntikkan terlalu kecil (pada kolom kapiler), maka ditempuh suatu cara

untuk mengecilkan ukuran sampel setelah penyuntikan. Salah satu cara yang

dilakukan adalah dengan menggunakan teknik pemecah suntikan (split

injection). Dengan menggunakan pemecah suntikan ini, sampel yang

banyaknya diketahui, disuntikkan ke dalam aliran gas pembawa dan sebelum

masuk ke kolom, gas pembawa ini dibagi menjadi 2 aliran. Satu aliran masuk

ke dalam kolom dan satunya lagi akan dibuang. Aliran relatif dalam kedua

aliran ini dikendalikan dengan sejenis penghambat seperti katup jarum pada


24

aliran yang dibuang. Laju alir di dalam kedua aliran diukur dan ditentukan

nisbah (rasio) pemecahannya. Jika 1 μL sampel dimasukkan ke dalam

pemecah aliran yang mempunyai nisbah pemecahan 1:100, maka sebanyak

0,01 μL sampel masuk ke dalam kolom dan sisanya akan dibuang (Gandjar

dan Rohman, 2007).

3. Kolom. Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di

dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen

sentral pada kromatografi gas. Terdapat 2 jenis tipe kolom yang digunakan

dalam gas kromatografi, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler atau sering

disebut open tubular columns. Dahulu, lebih banyak digunakan kolom kemas

untuk melakukan analisis menggunakan gas kromatografi. Untuk aplikasi

masa kini, kolom kemas digantikan dengan kolom kapiler karena lebih efisien

dan lebih cepat (Skoog, West, Holler, and Crouch, 2004). Semakin sempit

diameter kolom, maka efisiensi pemisahan kolom semakin besar atau puncak

kromatogram yang dihasilkan semakin tajam. Pada umumnya, seorang analis

akan memilih kolom dengan diameter 0,2 mm atau yang lebih kecil ketika

menganalisis sampel dengan konsentrasi sekelumit atau ketika seorang analis

akan memisahkan komponen yang sangat kompleks (Gandjar dan Rohman,

2007). Kolom kapiler terbuat dari silica (SiO2) dan dilapisi dengan polymide

(plastik yang mampu menahan suhu 350 ºC). Pada bagian dalam terdapat

rongga yang menyerupai pipa, oleh karena itu kolom kapiler juga disebut

Open Tubular Columns. Fase diam melekat mengelilingi dinding dalam


25

kolom. Terdapat 4 macam jenis lapisan pada kolom kapiler ini, yaitu: WCOT

(Wall Coated Open Tubular Column), SCOT (Support Coated Open Tubular

Column), PLOT (Porous Layer Open Tubular Column), dan FSOT (Fused

Silica Open Tubular Column). WCOT (Wall Coated Open Tubular Column)

memiliki 0,1–5 μm lapisan tipis fase diam cair yang terdapat pada dinding

bagian dalam kolom. SCOT (Support Coated Open Tubular Column)

memiliki partikel solid yang dilapisi dengan fase diam cair yang terdapat pada

bagian dalam dinding. Pada PLOT (Porous Layer Open Tubular Column)

partikel padat sebagai fase diam aktif. Dengan besarnya luas area yang

dimiliki, SCOT dapat menampung sampel lebih besar daripada WCOT.

Performa SCOT berada diantara WCOT dan kolom kemas. Diameter dalam

kolom kapiler memiliki ukuran 0,10 – 0,53 mm dengan panjang 15 sampai

100 m, umumnya adalah 30 m (Harris, 2010). Menurut Moffat, Osselton, and

Widdop (2011) kolom kapiler menghasilkan resolusi, sensitivitas, daya tahan

yang lebih baik daripada kolom kemas. Kolom kapiler sangat banyak dipakai

atau lebih disukai oleh para ilmuwan. Salah satu penyebabnya adalah

kemampuan kolom kapiler memberikan harga jumlah plat teori yang sangat

besar (> 300.000 plat). Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat

bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling

banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE- 30; CPSIL-5)

dan fenil 5%- metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL- 8). Fase

diam semi polar adalah seperti fenil 50% - metilpolisiloksan 50% (HP-17;


26

DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah seperti

polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis fase

diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran.

Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan

komponen-komponen dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Kolom

kemas mengandung partikel padat berukuran halus yang dilapisi dengan fase

diam cair yang dapat menguap. Dibandingkan dengan kolom kapiler, kolom

kemas memiliki kapasitas sampel yang lebih besar tetapi menghasilkan

puncak lebih lebar, waktu retensi lebih lama, dan resolusi yang lebih buruk.

Kolom kemas umumya dibuat dari logam tahan karat atau gelas dengan

diameter dalam 3–6 mm dan panjang 1 – 5 m (Harris, 2010). Efisiensi kolom

akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya partikel fase diam ini.

Semakin kecil diameter partikel fase diam, maka efisiensinya akan meningkat.

Ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara 60 – 80 mesh (250 – 170

μm) (Gandjar dan Rohman, 2007).

4. Detektor penangkap electron (Electron capture detector/ECD). Detektor

penangkap elektron (ECD) merupakan detektor yang dilengkapi dengan

sumber radioaktif titrium atau 63

Ni yang menghasilkan partikel-β. Partikel

radioaktif ini bertubrukan dan mengioniasi gas pembawa (make up) gas.

Reaksi ini membentuk awan elektron yang stabil pada sel detektor ECD.

Analit yang mempunyai gugus elektronegatif akan menangkap elektron bebas

yang akan mengurangi jumlah elektron bebas pada awan elektron dalam sel


27

detektor ECD. Penangkapan elektron menyebabkan penurunan arus detektor

(Grob, 1995).

Bila fase gerak (gas pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka

sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi ion-ion N2+

dan menghasilkan

elektron (bebas) yang akan bergerak ke anoda dengan lambat. Dengan

demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan elektron bebas

yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang terkumpul pada

anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline curent) yang steady dan

memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen sampel (senyawa

dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke ruang detektor yang

dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan menangkap elektron sehingga

membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini akan dibawa oleh fase gerak

(carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif dibawa keluar detektor, berarti

menyingkirkan satu elektron dari sistem sehingga arus listrik yang steady tadi

akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat oleh rekorder sebagai

puncak pada kromatogram ( Gandjar & Rohman, 2007).

Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom

tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil

pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang

berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di

dalamnya menjadi sinyal elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).


28

Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector/ECD)

menggunakan sumber radioaktif yaitu tritium (3H) atau nikel (63

Ni) yang

ditempatkan diantara dua elektroda. Tegangan listrik yang dipasang antara

katoda dan anoda tidak terlalu tinggi, antara 2-100 volt. Dasar kerja detektor

ini adalah penangkapan elektron oleh senyawa yang memiliki afinitas

terhadap elektron bebas, yaitu senyawa yang mempunyai unsur-unsur

elektronegatif (Gandjar danRohman, 2007). Bila fase gerak (gas pembawa N2)

masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi

ion dan menghasilkan elektron bebas yangakan bergerak ke anoda dengan

lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan

elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang

terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline current)

yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen

sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke

dalam ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan

menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul

ini akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel

negatif dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari

sistem, sehingga arus listrik yang steady akan berkurang. Pengurangan arus

ini akan dicatat oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram (Gandjar dan

Rohman, 2007).


29

5. Oven.Pemilihan temperatur pada kromatografi gas tergantung pada beberapa

faktor. Temperatur injeksi harus relatif tinggi yang memberikan kecepetan

penguapan yang paling tinggi sehingga memberikan resolusi yang baik.

Temperatur injeksi terlalu tinggi dapat menyebabkan karet septum menjadi

rusak dan menyebabkan tempat injeksi menjadi kotor. Temperatur kolom

berhubungan dengan kecepatan, sensitivitas, dan resolusi. Pada temperatur

kolom yang tinggi, komponen sampel lebih banyak berada pada fase gas

sehingga akan cepat terleusi tetapi resolusi nya menjadi buruk. Pada

temperatur rendah, komponen sampel akan memiliki lebih banyak waktu

untuk berada pada fase diam dan terelusi secara perlahan, resolusi menjadi

meningkat tetapi sensitivitas menurun karena puncak yang dihasilkan akan

melebar. Temperatur detektor harus cukup tinggi untuk mencegah kondensasi

sampel (Christian, 2004).

F. Validasi metode analisis

Metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang dapat diterima

dalam mendapatkan hasil analisis suatu sampel. Validasi merupakan proses

verifikasi metode yang sesuai dengan tujuan analisis. Metode dapat berupa hasil

pengembangan metode lain, yang didapat dari suatu literatur atau bahkan dari

pihak ketiga lainnya. Suatu metode mungkin diadaptasikan atau dimodifikasi

untuk dapat memenuhi persyaratan dan kemampuan dari sebuah laboratorium dan

atau untuk tujuan metode yang akan digunakan. Beberapa garis besar kriteria


30

validasi metode residu fungisida menurut CCPR 2003 meliputi akurasi, presisi,

kisaran linearitas, linearitas, dan IQL (CCPR,2003).

Tabel II.Kriteria Validasi

a. Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan nilai antara hasil uji dan hasil referensi yang

diketahui. Akurasi dapat ditetapkan dari hasil perolehan kembali (% recovery).

Recovery merupakan fraksi atau persentase dari perolehan kembali suatu analit

setelah ekstraksi dan analisis sampel kosong yang telah ditambahkan standar dengan

konsentrasi yang diketahui (adisi menggunakan reference material). Suatu %

recovery yang dikatakan memenuhi parameter validasi metode residu fungisida jika

berada pada rentang 70 - 120% untuk kisaran konsentrasi > 0,01 mg/kg ≤ 0,1 mg/kg

( CCPR, 2014).

b. Presisi

Presisi adalah Kedekatan antara hasil uji yang diperoleh di bawah kondisi

yang ditetapkan. Presisi dapat ditentukan dengan ≥ 3 replikasi pada ≥ 5 level. Presisi


31

dapat ditetapkan dengan melihat % RSD. Suatu metode dikatakan memiliki

keterulangan yang baik jika % RSD < 20 % (CCPR,2003).

c. Linearitas dan rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang

secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional

terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Suatu linearitas metode

analisis residu fungisida dapat dikatakan baik jika R2 ≥ 0,990 (CCPR,2003).

d. Limit of Quantitation(LOQ)

Konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur. Umumnya didefinisikan sebagai

konsentrasi minimum analit dalam sampel uji yang dapat ditentukan dengan presisi

yang dapat diterima (pengulangan) dan akurasi di bawah kondisi yang dinyatakan

dalam hasil uji. IQL yang dapat diterima harus kurang dari ½ MRL atau dibawah

positive list sebesar 0.01 g/g (CCPR,2003).

G. Metode kuantifikasi

Metode kuantifikasi dan proses kalibrasi adalah sama digunakan pada

suatu teknik instrumenal untuk analisis senyawa organik seperti contohnya

pada instrumen kromatografi gas. Determinasi kuantitatif suatu komponen

organik didasarkan pada perbandingan respon instrumental dari suatu

senyawa yang tidak diketahui dengan kalibran. Kalibran disiapkan dengan

standard reference yang diketahui memiliki kemurnian yang tinggi. Beberapa


32

pendekatan untuk kuantifikasi yaitu dengan menggunakan metode standar

eksternal, metode standar internal dan metode standar adisi (Czichos, 2006).

1. Metode standar eksternal

Metode standar eksternal merupakan metode yang digunakan untuk

menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya

dalam suatu sampel dengan menggunakan plot kalibrasi kurva baku

eksternal. Larutan-larutan kurva baku eksternal disiapkan dan

dianalisis secara terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada

dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan

ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan,selanjutnya diinjeksikan

dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut

ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara

numeric (Rohman, 2009).

2. Metode standar internal

Metode standar internal berdasarkan pada perbandingan respon

relative dari analit terhadap respon satu atau lebih suatu

senyawa.Standar internal ditambahkan ke dalam sampel dan kalibran.

Baku stndar internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit ,

meskipun demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama

proses pemisahan. Baku internal dapat menghilangkan pengaruh

karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel atau

konsentrasi karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel


33

atau konsentrasi darena variasi instrumen.suatu baku internal

digunakan jika suatu sampel memerlukan perlakuan sampel yang

sangat signifikan. Perlakuan yang dimaksud adalah tahapan-tahapan

yang meliputi derivatisasi, ekstraksi, filtrasi, dan sebagainya yang

mengakibatkan sampel berkurang. Jika baku internal ditambahkan

pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku internal

dapat menjadi faktor koreksi hilangnya sampel-sampel ini. Dalam

penelitian ini baku internal yang digunakan adalah standar internal

DCB karena preparasi pada metode ini melewati tahapan-tahapan

ekstraksi yang cukup panjang.

3. Metode standar adisi

Metode standar adisi didasarkan pada adisi suatu senyawa kalibran

yang diketahui kuantitas atau konsentrasinya kemudian ditambahkan

pada sampel yang tidak diketahui jumlah/konsentrasinya (dengan atau

tanpa penambahan standar internal. Dengan menambahkan paling

sedikit dua atau lebih alikuot standar, suatu kurva dapat disiapkan.

Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan dengan ekstrapolasi

kurva kalibrasi. Respon analit harus linier pada kisaran konsentrasi

yang digunakan dalam kurva baku kalibrasi. Suatu pendekatan dalam

standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa

bagian yang sama kemudian diadisi dengan konsentrasi standar adisi


34

yang meningkat. Selanjutnya dianalisis antara respon analit dengan

konsentrasi yang diinjeksikan (Rohman,2009).

H. Landasan Teori

Difenokonazol merupakan fungisida yang sering digunakan oleh

petani melon untuk mencegah dan mengatasi penyakit pada buah melon,

terutama jamur/fungi antraknosa. mekanisme aksi difenokonazol adalah

dengan menghambat demetilasi sintesis ergosterol. Menurut FAO/WHO

pemaparan pestisida di lingkungan dan residu pestisida menganggu kesehatan

masyarakat, sehingga ditetapkannya batas minimum residu (BMR) yang

diperbolehkan ada dalam buah melon yaitu sebesar 0,7 mg/kg (CCPR,2014).

Pada kenyataannya untuk memantau kadar residu difenokonazol yang berada

dalam buah melon dianalisis menggunakan LC MS/MS. Pada penelitian ini

determinasi dimodifikasi menggunakan GC-ECD. Suatu instrumen GC-ECD

dinyatakan berada pada kondisi optimum ketika mampu memberikan kinerja

efisiensi kolom, selektivitas, keajegan tR dan TF yang baik, demikian pula

%RSD, RF, %D sesuai spesifikasi yang dipersyaratkan.

Pada penelitian dilakukan ekstraksi difenokonazol dengan metode

QuEChERS. Dilakukan clean-up dengan SPE C18 untuk memisahkan

difenokonazol dari koekstraktan yang mengganggu. Proses clean-up bertujuan

untuk memisahkan difenoconazol dari koekstraktan matriks sehingga saat

determinasi puncak difenokonazol tidak terganggu. Selanjutnya dilakukan


35

validasi penuh metode analisis penetapan kadar difenokonazol dalam buah

melon. Metode yang valid selanjutnya digunakan untuk penetapan kadar.

Hasil clean-up diinjeksikan ke GC-ECD yang telah teroptimasi. Proses

clean-up dikatakan berhasil apabila puncak difenokonazol terpisah dari

puncak lainnya. Parameter validasi metode yang diuji dalam penelitian ini

adalah adalah IDL, IQL, recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi

maupun clean up, determinasi analit dan kisaran kalibrasi.

I. Hipotesis

1. Pelarut yang polaritasnya mendekati difenokonazol dapat digunakan untuk

mengekstraksi difenokonazol pada kulit dan daging buah melon secara

kuantitatif.

2. SPE C18 dapat digunakan sebagai sarana clean up untuk memisahkan matriks

dengan difenokonazol perlu fase gerak yang sesuai.

3. Difenokonazol dapat dipisahkan dengan matriks dengan GC dan ditetapkan

dengan detector ECD.


36

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol Dalam

Buah Melon (Cucumis melo L.)” merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental

murni karena terdapat perlakuan terhadap subjek uji. Subjek uji yang dimaksud disini

adalah buah melon.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel

a. Variabel bebas.Variabel bebas dalam penelitian ini adalah massa adisi

difenokonazol yang diadisikan ke dalam ekstrak buah melon, volume fase

gerak saat clean-up, lama sentrifugasi.

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah

jumlah supernatan yang diperoleh, lama sentrifugasi, waktu retensi,

resolusi, efisiensi kolom dengan jumlah lempeng (N), tailing factor, %

perolehan kembali dengan SPE C18, koefisien korelasi (r) antara massa

total difenokonazol dan AUC, slope kurva baku adisi, presisi, limit of

detection (LOD) atau IDL, IQL, limit of quantification (LOQ), koefisien

variansi (CV) dan % perolehan kembali metode standar adisi.


37

c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam

penelitian ini adalah kemurnian pelarut yang digunakan, yang dapat

diatasi dengan menggunakan pelarut pro analysis (p.a.) yang memiliki

kemurnian tinggi.

C. Definisi Operasional

1. Difenokonazol yang dianalisis adalah fungisida yang digunakan untuk

mengontrol berbagai sayuran, buah-buahan dan berbagai jenis tanaman, yang

beraksi dengan menghambat demethylasi sintesis ergosterol.

2. Buah melon yang dianalisis adalah buah melon yang berasal dari beberapa pasar

dan toko buah yang ada di Yogyakarta, yang tidak mengandung difenokonazol.

3. Sistem GC-ECD yang digunakan adalah seperangkat GC yang dilengkapi dengan

detektor ECD dengan fase diam C18, suhu kolom, suhu oven, suhu kolom,

injektor, CBM (communication bus module), komposisi fase gerak, gas pembawa

nitrogen, flow rate yang optimum serta komputer yang dilengkai aplikasi penyaji

data kromatogram.

4. Parameter validasi metode clean-up difenokonazol dengan SPE adalah linearitas

yang dilihat dari koefisien korelasi (r) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan

kembali.

5. Parameter validasi metode analisis penetapan kadar difenokonazol dengan GC-

ECD yang diamati dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, linearitas, IDL,

dan IQL.


38

6. Instrument Detection Limit (IDL) merupakan nama lain dari Limit of Detection

(LOD) yaitu konsentrasi terendah yang dapat dideteksi namun tidak dapat

dikuantifikasi.

7. Instrument Quantification Limit (IQL) merupakan batas konsentrasi terendah

yang dapat dikuantifikasi yang memenuhi presisi dan akurasi.

8. Lower Limit Method Validation (LLMV) merupakan konsentrasi terkecil pada

sebuah metode yang telah di validasi.

9. DCB (dekaklorobifenil) merupakan standar internal yang digunakan sebagai

faktor koreksi.

10. QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged And Safe) adalah metode

ekstraksi menggunakan pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS.

11. Campuran garam QuEChERS yang dimaksud dalam penelitian ini adalah

campuran garam QuEChERS campuran MgSO4 4 gram ; NaCl 1 gram ; Na3sitrat

0,5 gram; 0,25 gram Na2Hsitrat.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku difenokonazol

(baku dari PT.Syngeta), standar DCB (Sigma Aldrich) metanol (p.a. E. Merck),

asetonitril (p.a E. Merck), aseton (p.a. E. Merck), akuades (Laboratorium Analisis

Instrumenal Farmasi USD), akuabides (Laboratorium Analisis Instrumenal Farmasi


39

USD), gas nitrogen UHP dan teknis, sampel buah melon dari berbagai pasar, toko

buah dan swalayan di daerah Yogyakarta.

E. Alat Penelitian

Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas

(HP, GC-5890 Series II) dilengkapi dengan detektor ECD 63

Ni, Kolom SPE C18

(SPE C18 0,4 g), neraca analitik (Precisi 125 A. SCS Swiss Quality),

ultrasonifikasi,Vortex, Sentrifugasi, hotplate, stopwatch, ultrasonifikasi, seperangkat

komputer dengan CBM-102 (Shimadzu), perangkat lunak Shimadzu Lab solutions:

GC Solution versi 2.30.00SU4), perangkat lunak Powerfit v.6.05, vakum,

mikropipet, glass fin, syringe, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di

laboratorium analisis.

F. Tata Cara Penelitian

1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD

Penelitian ini merupakan analisis tingkat kelumit sehingga untuk

mencapai akurasi dan presisi yang baik diperlukan suatu metode analisis dengan

sensitivitas yang cukup tinggi. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan

bahwa Sistem yang akan digunakan untuk analisis sesuai dengan tujuannya.

Optimasi terhadap sistem GC-ECD di lakukan dalam uji kesesuaian sistem.

Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditetapkan

dalam petunjuk operasional alat.


40

2. Preparasi sampel dengan metode QuEChERS

a. Pengecekan kadar air dalam buah melon. Buah melon dibelah menjadi 4

bagian, diambil salah satu bagian tersebut secara acak. Dipotong sekecil

mungkin menggunakan pisau dan telenan yang sudah dicuci. Kemudian

diblender hingga halus. Ditimbang 5 gram buah melon yang telah

dihomogenkan dengan blender, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu

60°C. Replikasi sebanyak 3 kali. Hasil pengeringan ditimbang dan

dihitung berat rata-ratanya sebagai % kandungan air buah melon.

b. Penentuan waktu dan kecepatan sentrifugasi. Ditimbang dalam tabung

sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan

blender. Kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS. Gojog

larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan

disentrifugasi selama ( 5 menit, 10 menit dan 15 menit dalam 5000

rpm). Amati dan bandingkan jumlah supernatan yang terbentuk.

3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol

a. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok induk). Sejumlah lebih

kurang 52.6 mg baku difenokonazol ditimbang dengan seksama lalu

dilarutkan ke dalam 1 mL toluen hingga didapat larutan stok induk 52,6

mg/mL.

b. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok A). Sebanyak 40 µL stok

induk difenokonazol dilarutkan dalam 1000 µL toluen hingga didapat


41

konsentrasi sebesar 0.526 µg/µL yang kemudian disebut dengan stok

A.

c. Pembuatan larutan intermediet. Sejumlah 10 µL stok A diambil dengan

Syringe add dalam 1000 µL heksan sehingga diperoleh larutan

intermediet dengan konsentrasi 0.526 x 10-2

µg/µL.

d. Pembuatan larutan kurva baku solven. Diambil sebanyak 20µL ; 15µL

; 10µL; 7 µL ;5µL ; 4 µL; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok

B kemudian ditambahkan 2 µL DCB add hingga 200 µL dengan pelarut

heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2

µL.

e. Pembuatan larutan kurva baku adisi .Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ;

13 µL ; 10µL; 5µL ; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B

kemudian ditambahkan 2 µL DCB ke dalam flakon berisi ekstrak

matriks yang telah kering add hingga 200 µL dengan pelarut heksan

kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL.

f. Pencucian flakon wadah sampel supernatan. Flakon dicuci

menggunakan akuades kemudian aseton dilanjutkan dengan metanol

dan dikeringkan dalam oven.

g. Pencucian syringe. Syringe dicuci menggunakan aseton kemudian

metanol dan dilanjutkan dengan 5 µL standar difenokonazol. Diulangi

hingga 3 kali.


42

4. Optimasi Clean-Up SPE C18

a. Penentuan Kapasitas Solid Phase Extraction (SPE) C18. Ditimbang

dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah

dihomogenkan kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS.

Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan

disentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm. Supernatan yang

terbentuk pada lapisan paling atas diambil sebanyak 1 mL dimasukan

dalam flakon dan dikeringkan dalam oven 60°C hingga tercapai bobot

tetap. Replikasi 3 kali. Kemudian ditimbang dan dihitung rata-rata

berat setelah dikeringkan.

b. Optimasi Washing SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah

dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,

kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan

asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian

vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan

kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya

dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan

menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi

yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1

menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan

yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan

digabung ke dalam flakon supernatant sebelumnya kemudian


43

ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate

dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan

dalam 0,5 mL akuabides selanjutnya di-degassing dengan

ultrasonifikator selama 5 menit. Aplikasikan sampel yang telah di-

degassing ke dalam kolom SPE. Washing SPE C18 dengan berbagai

macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL akuabides tanpa fraksinasi

; 5 mL metanol 5% dengan 5 fraksinasi ; 5 mL UPW 100% dengan 5

fraksinasi. Selanjutnya cuci ekstrak dalam flakon dengan 3 mL

metanol dan elusikan dalam kolom SPE kemudian ditampung dalam

flakon baru untuk dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas

nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan

dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke

dalam sistem GC-ECD.

c. Optimasi Elusi SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah

dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,

kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan

asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian

vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan

kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya

dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan

menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi

yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1


44

menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan

yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan

digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian

ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate

dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan

dengan 1 mL akuabides kemudian di-degassing dengan

ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke

dalam kolom SPE C18. Washing dengan menggunakan akuabides

sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas

nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan (1

mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL) metanol. Masukan metanol ke dalam

flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom

SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel

dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel

yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan

DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-

ECD.

5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram

buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung

sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan

asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama

2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm.


45

Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon.

Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam

tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan

selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang

terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam

flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan (7 µL ; 10 µL) Standar stok C

dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah

kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5

menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan

pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon

berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan

dalam kolom SPE C18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen.

Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol

digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak

tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE

ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas

nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan

ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem

GC-ECD.

6. Validasi Metode Analisis


46

Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk

membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,

yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode

dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang

digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan

menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem

kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan

langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi:

Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender

ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam

QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit

kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan

5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam

flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke

dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan

selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang

terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon

supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan

di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan

dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah

di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk


47

diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak

dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan

bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan

metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga

semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan

ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan

dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.

Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi

metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut :

a. Presisi (keterulangan) sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai

CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL

larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B

1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul, ke dalam sistem GC-ECD

sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari

masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai

rata-rata, SD dan %CV.

b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon

sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) merupakan parameter yang

diperlukan untuk menentukan linearitas hubungan massa baku

difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal.

Koefisien korelasi (r) diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan


48

ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ;

0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ng/µL ke dalam sistem GC-

ECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan

terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung

parameter statistiknya seperti intersep (a), slope (b), dan koefisien korelasi

(r) dengan menggunakan program powerfit.

c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah

optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua

parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2

µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke

dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari

persamaan kurva baku hasil injeksi.

G. Analisis Hasil

1. Uji kesesuaian instrument GC-ECD

a. Analisis hasil optimasi sistem GC-ECD. Analisis hasil optimasi sistem GC-

ECD dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Optimasi kecepatan

alir gas, inisial temperatur, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan suhu

oven yang optimal akan memberikan pemisahan puncak senyawa yang

optimum.

b. Analisis Kinerja instrumen GC-ECD. GC-ECD yang telah optimal untuk

analisis kadar residu difenokonazol, dibuktikan oleh nilai Rs, TF, N, dan tR


49

yang memenuhi syarat-syarat batasan yang harus dicapai sebagaimana telah

dijelaskan pada beberapa teori .

1) Waktu retensi (tR).Waktu retensi dari masing-masing senyawa dapat

dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Keajegan rasio tR/standar

internal dan rasio AUC standar/DCB dari penginjekan 6 kali.

Kejegannya dihitung dengan rumus % RSD:

%RSD = 100-%recovery (Harmita,2004).

2) Daya pisah (resolusi). Resolusi dalam penelitian ini ada 2 yaitu

resolusi awal dan resolusi akhir. Resolusi dapat dihitung dengan

rumus:

Rs=

Keterangan : tR= waktu retensi W1 dan W2 = rata-rata lebar zona

3) Tailing factor (TF). Tailing factor atau TF dapat diterima apabila

memiliki nilai <1,2. Jika TF lebih >1,2 maka puncak kromatogram

tersebut mengalami tailing/ pengekoran (Dolan et al,2002)

TF=

4) Jumlah lempeng teoritik (N). Jumlah lempeng teoritik atau N dapat

dihitung dengan rumus :

N= 16(

2

Keterangan : tR: waktu retensi Wb=lebar dasar puncak


50

c. Analisis hasil kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif. Analisis hasil Uji

Kesesuaian Sistem GC-ECD secara kuantitatif menghitung parameter-

parameter yang dibutuhkan, berikut ditentukan syarat-syarat nilai parameter

dari nilai CV, r, IDL, dan slope yang harus dicapai agar suatu sistem GC-ECD

dapat dinyatakan sesuai untuk penentuan kadar difenokonazol.

1) Linearitas

Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh

dari kurva baku solven hasil plot antara rasio luas puncak

difenokonazol/DCB dan massa standar baku yang diinjeksikan

kedalam regresi linear dengan persamaan y = a + bx dengan

menggunakan powerfit.

2) Sensitivitas

Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung nilai slope, IDL,

IQL dengan rumus :

Slope dapat diperoleh dari persamaan regresi linear y=a+bx (b=slope;

a=intersep)

IDL dapat dihitung dengan rumus:

3,3 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope

k=3,3.


51

3) Presisi (keterulangan)

Nilai presisi atau keterulang dapat diperoleh dengan menghitung

%kesalahan acak (%KV) dengan rumus:

Kesalahan Acak (%KV)=

x 100%

4) Percent Difference (%D)

Percent Difference (%D) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut

% D=

x 100 %

d. Analisis hasil Optimasi Preparasi Sampel. Pengecekan kadar air dalam buah

melon.Kadar air didalam melon dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Kadar air =

x 100%

e. Validasi metode analisis Hasil modifikasi QuEChERS dan clean-up

1) Linearitas

Linearitas suatu kurva baku ditentukan oleh nilai koefisien korelasi (r).

Koefisien korelasi dapat diperoleh dengan mengeplotkan data antara

rasio luas puncak difenokonazol/standar internal DCB sebagai sumbu

y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x ke dalam

program Powerfit® sehingga didapatkan persamaan regresi linear y=

a + bx.

2) Selektifitas. Data kromatogram antara sampel sebelum dan sesudah

SPE dibandingkan selain itu resolusi antara puncak analit


52

difenokonazol dengan puncak terdekat dihitung (ICH Harmonised

Tripartite,2005).

3) Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :

Perolehan kembali (recovery) =

× 100%

4) Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :

Kesalahan Acak (%RSD) =

× 100%

5) Sensitivitas. Limit of Quantitation(LOQ) dihitung dengan rumus :

10 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope

k=10

6) Limit of Detection (LOD). Limit of Detection (LOD) suatu sistem

GC-ECD dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi

linear suatu kurva baku. Berikut adalah rumus untuk menghitung

LOD:

LOD= 3,3 ×

Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope,

k=3,3 (ICH Harmonised,2005).


53

H. Rancangan Penelitian

1. Metode Adisi

Pada metode adisi dilakukan adisi jalur A, B, dan C untuk membuktikan

hipotesis 1.

Sampel blanko

Adisi A: Sampel +

standard (Ekstraksi)

Adisi B: Sampel

+standard

(Cleanup)

Adisi C: Sampel

+ standard

(Determinasi_

Sampel

sesungguhnya

Kesalahan

ekstraksi +

cleanup +

determinasi

Kesalahan

cleanup +

determinasi

Kesalahan

determinasi


54

2. Proses Preparasi Sampel : Ektraksi dengan Metode QuEChERS, Clean-up

SPE C18 dan Determinasi GC-ECD

sampling melon dilakukan secara acak dari beberapa pasar di Yogyakarta

Preparasi sampel secara kuartering, kemudian blender dan ditimbang sebanyak 5 gram sampel dalam seuah tabung sentrifugasi

tambahkan 5 mL pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS kemudian gojog kuat selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan lakukan sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000

rpm.

supernatan pada lapisan yang paling atas yang atas diambil. lakukan reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril ke dalam tabung sentrifugasi, gojog, vortex dan sentrifugasi. supernatan yang terbentuk dimasukan dalam 1 flakon supernatan

awal.

keringkan supernatan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.

tambahkan 500 µL akuabides ke dalam flakon yang beerisi ekstrak kemudian lakukan degassing selama 5 menit.

aplikasikan hasil degassing ke dalam kolom SPE yang telah di conditioning dengan 5 mL metanol dan 5 mL akuabides.

washing SPE dengan 5 mL akuabides

dan elusi sampel dalam kolom SPE dengan 3 mL metanol. tampung eluat yang keluar dalam sebuah flakon kemudian keringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.

larutkan ekstrak dalam 100 µL heksan ambil 2 µL untuk diinjeksikan ke dalam GC-ECD. analisis kromatogram yang dihasilkan. untuk membuktikan Hipotesis 3.

Tahap 1 : Proses Sampling

dan ekstraksi

Tahap 2 : Proses Cleanup

Tahap 3: Proses Determinasi


3. Fraksinasi Elusi SPE C18 Metanol

melon melon melon

Potong melon secara

kuartering dan blender

Timbang 5 gram melon yang

telah diblender

Tambahkan campuran garam

QuEChERS :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3Sitrat

0,25 gram Na2HCitR

55


56

Tambahkan 5 ml asetonitril

Gojog 1 menit dan vortex 2

selama menit

Sentrifugasi selama 5

menit dalam 5000rpm

Ambil semua supernatan. lakukan

reekstraksi dan gabung supernatan yang

terbentuk dan Tambahkan 50 µL standar A

Uapkan di atas hotplate

dengan bantuan gas nitrogen

Tambahkan 1mL akuabides

Degassing selama 5 menit

Loading pada SPE yang telah

di conditioning

Fraksinasi masing-masing 1

mL

Washing dengan 5 mL

akuabides


57

Keringkan

1 5 2 3 4

Larutkan dengan 200 µL heksan

Dan tambah 2 µL DCB. Ambil 2 µL

kemudian injeksikan ke dalam GC-ECD

Analisis hasil untuk membuktikan

HIPOTESIS 2


58

4. Optimasi Washing SPE

melon melon melon

Potong melon secara


Timbang 5 gram melon

yang telah diblender

Tambahkan campuran

garam QuEChERS :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3Sitrat

0,25 gram Na2HCitR


59


Gojog 1 menit dan vortex 2 selama menit

Sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000rpm

Ambil supernatant lapisan atas yang terbentuk.

Lakukan reekstraksi dengan 5 mL asetonitril.

Tambahkan 50 µL standar larutan A

Uapkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen

Tambahkan 0,5mL akuabides


Loading pada SPE yang telah di conditioning


60

B

Washing dengan

5% MeOH

Washing dengan

100 %UPW

Elusikan dengan 3

mL MeOH

Washing dengan

5% MeOH

Tampung hasil

Tampung hasil eluat

Keringkan dan larutkan dalam 200 uL heksan

tambahkan 2 uL DCB

Kemudian injeksikan eluat hasil elusi dan

tampungan washing

A

Analisis hasil kromatogram yang didapatkan

untuk membuktikan Hipotesis 1


61

5. Uji Kelayakan SPE untuk Digunakan lebih dari 1 kali

melon melon melon

Potong melon secara


Timbang 5 gram melon

yang telah diblender

Tambahkan campuran

garam QuEChERS :

2 gram MgSO4

0,5 gram NaCl

0,5 gram Na3Sitrat

0,25 gram Na2HCitR


62


Gojog 1 menit dan vortex 2 selama

menit

Sentrifugasi selama 5 menit

dalam 5000rpm

Ambil 5 ml supernatant lakukan

reekstraksi

Uapkan di atas hotplate dengan

bantuan gas nitrogen

Tambahkan 1mL akuabides


Loading pada SPE yang telah di

conditioning


63

Washing dengan 3 mL

akuabides

Washing dengan 3 mL

akuabides

Elusi dengan 3 mL metanol

Tamping eluat dan keringkan diatas

hotplate dengan gas nitrogen

Cuci SPE dengan 30 mL metanol

dan 10 mL akuabides

Loading sampel ke-2 dan 3

dengan langkah seperti diatas

Larutkan sampel dalam 200 uL

heksan kemudian injeksikan ke GC-

ECD dan analisis kromatogram

Dan analisis hasil


64

BAB IV

PEMBAHASAN

Penelitian yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol

pada Buah Melon (Cucumis melo L.)” dilakukan untuk membuktikan bahwa metode

ini dapat digunakan untuk analisis difenokonazol dengan dasar QuEChERS (Quick

Easy Cheap Effective Rugged And Safe). Metode ini merupakan hasil modifikasi dari

metode analisis baku AOAC 2007.01 yang merupakan metode analisis multi residu

dengan dasar preparasi sampel QuEChERS. QuEChERS sendiri merupakan ekstraksi

dengan asetonitril, clean-up dengan SPE yang didispersikan kedalam ekstrak dan

karena kesetimbangan yang terjadi pada dispersive SPE hanya satu kali diperlukan

suatu instrumen yang selektifitasnya tinggi untuk determinasi yaitu LC MS/MS.

Determinasi menggunakan LC MS/MS menjadi kendala untuk menerapkan metode

ini di Indonesia. Pada umumnya laboratorium tresida pestisida di Indonesia tidak

memiliki instrumen tersebut, juga alternatif metode baku analisis residu

difenokonazol dalam buah melon belum tersedia hingga saat ini. Salah satu tujuan

penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah tersebut yaitu dengan melakukan

modifikasi pada tahapan cleanup dan instrumen untuk determinasinya. Difenokonazol

merupakan suatu senyawa yang memiliki banyak atom klorida, oksida, dan N dengan

elektronegativitas yang tinggi yang dapat dideteksi dengan GC-ECD, sehingga

instrumen GC-ECD digunakan untuk mendeterminasi residu pestisida difenokonazol

dalam buah melon. GC-ECD kurang selektif apabila dibandingkan dengan LC


65

MS/MS, sehingga perlu adanya suatu penyesuaian, terutama pada tahap clean-up.

Clean-up dengan SPE kolom dapat memberikan kesetimbangan yang jauh lebih

banyak sehingga ekstrak yang didapat lebih bersih.

Penelitian ini dimulai dari uji kesesuaian sistem GC-ECD diikuti dengan

optimasi preparasi sampel kemudian dilanjutkan dengan validasi penuh metode

analisis.

Gambar 4. Struktur difenokonazol

(EFSA, 2011).

A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD

1. Optimasi instrumen GC-ECD

Optimasi Instrumen ini dilakukan untuk mengetahui dan mendapatkan

kondisi optimum dari instrumen GC-ECD yang akan digunakan, sehingga

instrumen mampu memisahkan analit target dari koekstraktan matriks yang

menggganggu. Parameter yang dioptimasi meliputi penetapan tipe kolom yang

digunakan, tekanan gas/kecepatan alir (flow rate) gas pembawa baik pada kolom,


66

detektor, inlet kolom, suhu injektor, kolom, oven dan detektor. Pada penelitian ini

gas pembawa yang digunakan adalah nitrogen dengan kualitas Ultra High Pure

(UHP) dengan tipe kolom C18. Berdasarkan optimasi yang dilakukan, didapatkan

kondisi GC-ECD yang optimal sebagai berikut :

Tabel III. Hasil optimasi kondisi GC-ECD

Parameter Kondisi optimum

1. Injector (split)

Suhu injector 230ºC

Volume injector 2uL

2. Oven

Panjang kolom 12-50 m

Fase diam 5%-phenyl-methylpolysiloxane

Temperature Terprogram 100 C (3 menit)

30ºC/menit, 245ºC (30 menit)

30ºC/menit, 260ºC(15 menit)

3. Detektor

Detektor ECD63

Ni

Suhu detektor 295ºC

4. Gas

Gas N2 UHP

Flowrate gas 1mL/menit

2. Kinerja instrumen GC-ECD

Instrumen GC-ECD yang telah optimal akan menghasilkan kinerja yang

optimum. Penentuan kinerja GC-ECD baik secara kualitatif maupun kuantitatif

ditunjukkan melalui kromatogram yang dihasilkan. Kromatogram memberikan

informasi berupa puncak-puncak senyawa-senyawa yang ada dalam matriks, dari

hasil tersebut diharapkan instrumen mampu memisahkan antara puncak senyawa


67

difenokonazol dengan koekstraktan matriks. Berikut kromatogram hasil kinerja GC-

ECD yang diperoleh pada penelitian ini:

a. Kinerja Pemisahan dengan GC-ECD

Gambar 5. Kromatogram kurva baku difenokonazol dalam

pelarut heksan

Gambar 5 menunjukan bahwa instrumen mampu memisahkan

difenokonazol dari senyawa lainnya. Kinerja pemisahan dengan GC-

ECD dapat dievaluasi berdasarkan nilai N, Rs, dan TF yang

dihasilkan. Berikut tabel nilai rata-rata yang didapat dari hasil 6 kali

penginjekan standar dengan konsentrasi yang sama:

DC

B

Difen

ok

on

azo

l

Azo

xy

strob

in


68

Tabel IV. Nilai rata-rata N, Rs, dan TF puncak baku difenokonazol

Parameter Nilai rata-rata

N 42500,088

Rs awal 11,423

Rs akhir 6,809

TF 0,833

Nilai rata-rata N dalam Tabel IV diperoleh dengan

menginjeksikan sebanyak enam kali standar difenokonazol dalam

pelarut heksan dengan konsentrasi 0,526 µg/mL ke sistem GC-ECD.

Jumlah lempeng teoritis (N) menggambarkan jumlah kesetimbangan

yang terjadi dalam sebuah kolom. Semakin tinggi nilai N, semakin

banyak kesetimbangan yang terjadi di dalam kolom. Menurut Grob,

nilai jumlah plat teoritik (N) yang dipersyaratkan adalah lebih dari

7000. Nilai rata-rata yang didapat pada penelitian ini lebih dari 7000

yaitu sebesar 42500,088 sehingga diharapkan frekuensi terjadinya

kesetimbangan analit dalam fase diam dan fase gerak dapat

memungkinkan tercapainya pemisahan difenokonazol secara

sempurna.

Resolusi (Rs) merupakan perbedaan antara waktu retensi 2

puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.

Sistem GC-ECD dapat dikatakan memiliki kinerja pemisahan yang

baik apabila dapat memberikan nilai Rs <1,5 . Pada Rs lebih dari 1,5


69

, GC-ECD mampu memberikan pemisahan puncak yang baik. Nilai

Rs yang diperoleh pada penelitian ini adalah sebesar 11,423 untuk

resolusi awal dan 6,809 untuk resolusi akhir. Resolusi awal ialah

rasio puncak difenokonazol dengan puncak terdekat yang memiliki

tR sebelum puncak difenokonzole (puncak DCB), sedangkan

resolusi akhir ialah rasio puncak difenokonazol dengan puncak

terdekat yang memiliki tR setelah puncak difenokonazol (puncak

azoxystrobin). Berdasarkan hasil resolusi awal dan akhir seperti

yang telah ditunjukan pada tabel di atas, dapat dikatakan bahwa

sistem GC-ECD dalam penelitian memiliki kinerja pemisahan yang

baik.

Puncak yang memberikan nilai TF>1 menunjukan bahwa

puncak tersebut mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar

harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Pada

penelitian ini diperoleh nilai TF rata-rata sebesar 0.833 sehingga

dapat dikatakan bahwa efisiensi kolom sistem GC-ECD untuk

analisis senyawa difenokonazol cukup baik.

Pada kromatogram di atas senyawa difenokonazol

muncul sebagai puncak pada tR 25,88 dan 25,708. Hal ini karena

difenokonazol memiliki sifat diastereoisomer cis dan trans dengan

dua cincin C kiral pada strukturnya (EFSA,2011). Adanya dua


70

isomer yang memiliki cincin C kiral ini menyebabkan struktur

difenokonazol dapat berputar untuk mencapai posisi stabil. Dua

isomer yang berbeda ini memiliki sifat fisika kimia yang berbeda

dan akan terdeteksi oleh ECD pada tR yang berbeda

(Fessenden,1986).

Pada analisis residu pestisida tidak jarang ditemukan suatu

senyawa yang memiliki multi-peak. Kuantifikasi senyawa multi-

peak seperti difenokonazol dapat dilakukan dengan menggunakan

AUC peak terbesar atau dengan menjumlahkan AUC kedua peak

(USDA,2015). Pendekatan yang lebih sering dilakukan ialah dengan

menjumlahkan AUC peak difenokonazol yang muncul untuk

memperoleh residu keseluruhan. Pendekatan ini lebih sering

diterapkan untuk meminimalkan kesalahan kuantifikasi (Cajka,

2007). Pada penelitian ini kuantifikasi dilakukan dengan

menjumlahkan AUC dua peak difenokonazol yang muncul.

b. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kualitatif

Kinerja instrumen GC-ECD secara kualitatif dapat dilihat dari

parameter %RSD dan keajegan tR serta luas area difenokonazol.

CCPR menyatakan bahwa spesifikasi persyaratan untuk %RSD>20%.

Hasil %RSD dalam penelitian ini memenuhi spesifikasi persyaratan.


71

Tabel V. Nilai %RSD

Kadar (ng)

Rasio

difenokonazol/DCB

Rasio AUC

difenokonazol/DCB

0.789

1,208 1,538

1,219 1,317

1,218 1,575

1,224 1,821

1,208 1,538

Rata-rata 1,215 1,558

SD 0,007 0,179

%RSD 0,591 11,514

c. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif

Pada penelitian ini evaluasi optimasi uji kesesuaian sistem juga

dilakukan untuk kinerja instrumen GC-ECD secara kuantitatif.

Evaluasi ini dilakukan dengan menghitung nilai koefisien korelasi

untuk linearitas, kisaran linearitas, slope, IDL untuk sensitivitas,

presisi area standar/standar internal dan %CV untuk akurasi.

Parameter-parameter tersebut diperoleh dari seri kurva baku solven.

1) Linearitas

Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva

kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi

(x). Kurva baku untuk mencari linearitas dalam penelitian ini

menggunakan kurva baku solven yang menghubungkan antara respon

yang berupa rasio luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB)


72

(y) dengan konsentrasi difenokonazol yang diinjeksikan (x). Besarnya

konsentrasi yang akan diukur berbeda-beda yaitu dimulai dari 0,105-

1,052 ng sesuai kisaran sampel yang akan ditetapkan dan ditambah

standar internal dekaklorobifenil (DCB) dengan konsentrasi 0,0001

mg/mL. Penambahan standar internal dekaklorofenil (DCB) dilakukan

secara konstan yaitu 1 µL dalam 100 µL. Dekaklorofenil (DCB)

berperan sebagai faktor koreksi kesalahan yang terjadi dalam sistem

GC-ECD. Data yang diperoleh kemudian diolah sehingga didapatkan

hasil akhir berupa persamaan regresi linear dengan R2 sebesar 0,999

seperti pada gambar berikut ini :

Gambar 6. Kurva baku solvent antara rasio luas puncak

difenokonazol/DCB vs kadar difenokonazol

Batas nilai R2 yang dipersyaratkan dalam uji kategori

impurities, yaitu ≥0.9900 pada kadar maksimum 1 ppb (AOAC, 2005).

y = 2.1034x + 0.0135 R² = 0.9995

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200

rasi

o lu

as p

un

cak

dif

eno

con

azo

le/s

tan

dar

inte

rnal

kadar yang ditambahkan (ng)

Difenokonazol


73

Berdasarkan pada hasil penelitian diatas metode hasil modifikasi

QuEChERS ini memiliki linearitas yang cukup baik.

2) Sensitivitas

Sensitivitas suatu sistem GC-ECD dinyatakan dalam nilai

sebuah Instrument Detection Limit (IDL). IDL didefinisikan sebagai

konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi,

meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sinyal yang berbeda

signifikan dari blanko adalah intersep+3s intersep, oleh karena itu

nilai IDL difenokonazol dalam penelitian ini adalah konsentrasi

difenokonazol yang memberikan sinyal sebesar intersep + 3s intersep.

Pada penelitian ini nilai IDL diperoleh dari 3 kurva baku dengan 7

konsentrasi terendah. Kurva baku pada kisaran linearitas 0,053-0,526

ng memiliki nilai IDL sebesar 0,01 g/g.

Tabel VI. Uji sensitivitas

Replikasi Persamaan Linearitas Sa0 Slope

(b)

IDL

(ng/µL)

I F(x) = 0,15707 + 3,03655

x

0,997 0,0297 3,037 0,015

II F(x) = 0,02169 + 2,06485

x

0,999 0,0132 2,065 0,010

III F(x) = -0,07459 + 3,78718 x 0,890 0,183 3,787 0,072

Instrument Quantitation Limit merupakan konssentrasi terkecil

dari kurva baku. IQL dapat diterima keterulangannya dengan nilai


74

%RSD<20%. GC-ECD pada penelitian ini memiliki kemampuan

mendeteksi nilai IQL sebesar 0,053 ng.

3) Presisi

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang

diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel

yang berbeda signifikan secara statistik. Nilai presisi secara kuantitatif

dinyatakan dalam suatu nilai Respon Faktor, dalam penelitian ini

antara rasio jumlah luas area puncak difenokonazol/standar internal

(DCB) dengan konsentrasi standar difenokonazol. Berikut ini adalah

hasil presisi dari masing-masing dalam penelitian ini :

Tabel VII. Nilai Response factor

Kadar

(ng)

Nilai RF

R1 R2

0,053 5,236 2,156

0,105 4,763 2,214

0,158 3,861 2,393

0,210 3,936 2,185

0,263 3,849 2,097

0,368 3,369 2,155

0,526 3,317 2,088

0,789 3,527 2,123

1,052 3,656 2,122

Rata-

rata 3,946 2,170

SD 0,646 0,093

%RSD 16,367 4,273


75

Suatu metode dapat dikatakan baik jika memiliki presisi % RF

<20% pada konsentrasi maksimum 1ppb (CCPR,2003). Berdasarkan

literatur tersebut, presisi penelitian ini dapat diterima dan dikatakan

cukup baik.

4) Akurasi

Kedekatan hasil injeksi antara larutan standar kurva baku

dengan nilai sebenarnya yang digunakan untuk melihat akurasi dalam

penelitian ini dinyatakan dalam percent difference (%D). Syarat

Percent Difference dapat dinyatakan baik apabila nilainya ≤20%

(United State Departement of Agriculture Agricultural Marketing

Service, Sciene & Technology Pesticide Data Program,) Nilai %D

menggambarkan perbedaan antara % analit terukur dengan analit yang

sebenarnya dari sampel. Hasil % D dalam penelitian ini diperoleh :


76

Tabel VIII. Nilai %D

Kadar

(ng)

Kadar yang

ditemukan

(ng)

% D

0,053 0,044 15,568

0,105 0,102 2,757

0,158 0,172 9,216

0,210 0,212 0,808

0,263 0,257 2,461

0,368 0,374 1,532

0,526 0,521 0,896

0,789 0,801 1,495

1,052 1,071 1,788

Rata-rata

1,497

SD

0,608

%RSD

0,407

Berdasarkan pada tabel VI di atas, nilai %D difenokonazol masuk

kriteria persyaratan yaitu %D < 20% .

Kesimpulan : Berdasarkan pada nilai presisi, akurasi, kisaran dan

linearitas kurva baku serta IDL dan IQL yang dicapai, GC-ECD dapat

digunakan dalam penetapan kadar residu fungisida difenokonazol.

B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS

Preparasi sampel merupakan tahapan penting dalam suatu analisis. Optimasi

pada tahapan preparasi sampel perlu dilakukan dengan tujuan mendapatkan hasil

optimal. Pada penelitian ini optimasi dilakukan terhadap cara kerja preparasi matriks


77

sampel melon dengan metode modifikasi QuEChERS dan optimasi fase diam SPE

C18.

1. Optimasi ekstraksi matriks buah melon

a. Pengecekan kadar air dalam buah melon

Suatu sampel yang digunakan dalam suatu penelitian harus memiliki

kesempatan yang sama untuk dijadikan sampel, sehingga sampling dilakukan

secara acak. Sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah buah melon

dari beberapa pasar di Yogyakarta. Sampling analytical portion untuk buah

melon dilakukan dengan metode kuartering dan dihomogenkan dengan

blender.

Tujuan dari pengecekan kadar air dalam buah melon adalah untuk

menentukan perlu atau tidaknya tambahan air dalam proses homogenisasi

sampel dengan blender. Proses preparasi sampel dengan metode QuEChERS

mempersyaratkan bahwa kadar air harus >80% tidak diperlukan tambahan air

(Anastasiades). Pada penelitian ini kadar air yang terkandung dalam buah

melon sangat tinggi yaitu lebih dari 90% sehingga tidak perlu adanya

penambahan air dalam homogenisasi sampel.

Tabel IX. Kadar air dalam buah melon

Awal (gram) Berat akhir setelah oven (gram) Selisih

R1 10,068 0,402 9,666

R2 10,007 0,845 9,162

Rata-rata 9,378

% kadar air 93,78%


78

1) Ekstraksi dan clean-up dengan metode modifikasi QUECHERS

Metode yang digunakan untuk preparasi sampel pada penelitian ini

adalah metode QuEChERS yaitu ekstraksi dengan pelarut asetonitril dan

campuran garam QuEChERS, clean-up dengan SPE yang didispersikan ke

dalam ekstrak dan dideterminasi.

Pada metode QuEChERS, garam-garam yang digunakan adalah

Magnesium sulfat, Natrium Klorida, Natrium Sitrat dan disodium sitrat

hydrogenate sesquihydrate. Masing-masing garam memiliki kegunaan

yang berbeda, magnesium sulfat anhidrat berfungsi untuk menarik air,

natrium klorida berfungsi sebagai agen salting out effect, sedangkan

natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate seshydrate ditambahkan

untuk mengontrol pH antara 4-6 (Leung phenoomenex,2012-UCT).

pH sampel dijaga antara 4-6, hal ini dkarenakan pada kisaran pH

4-6 jumlah koekstraktan dalam hasil ekstraksi lebih sedikit dibandingkan

dengan jumlah koekstraktan pada raw material.

Sampel yang telah ditambahkan garam dalam tabung sentrifuge

ditambahkan pelarut asetonitril kemudian di gojog dan di vortex.

Penggojogan bertujuan untuk memecah gumpalan matriks sampel untuk

memperoleh luas permukaan yang besar sehingga kesetimbangan yang

optimum akan lebih mudah tercapai.


79

Sampel memiliki partikel dengan ukuran dan berat jenis yang

bebeda-beda, untuk memisahkan senyawa yang memiliki ukuran dan

berat jenis yang berbeda dilakukan sentrifugasi. Optimasi sentrifugasi

perlu dilakukan untuk mendapatkan waktu dan kecepatan sentrifugasi

yang optimum.Pada penelitian ini optimasi sentrifugasi dilakukan pada

kecepatan 5000 rpm selama 5, 10.Dan 15 menit. Hasil akhir menunjukan

bahwa selisih supernatan yang terbentuk dari 3 waktu yang berbeda diatas

tidak berbeda signifikan, sehingga waktu yang paling singkat yaitu 5

menit yang digunakan untuk preparasi sampel selanjutnya.

Tabel X. Hasil optimasi lama sentrifugasi

Waktu sentrifugasi

dalam 5000 rpm (menit)

Jumlah supernatant

(mL)

5 4,0

10 4,0

15 4,2

Ada 3 lapisan yang terbentuk setelah sampel disentrifugasi,

berdasarkan berat jenisnya asetonitril (0,789 g/cm3) berada pada

lapisan yang paling atas sedangkan air (1 g/cm3) berada di lapisan

bawah. Difenokonazol memiliki kelarutan yang cukup tinggi dalam air

yaitu 15 mg/L sehingga untuk mengurangi kelarutannya dalam air

sampel ditambahkan garam NaCl yang berfungsi untuk memberikan

salting out effect. Lapisan asetinitrik diambil untuk di analisis

selanjutnya. Pada penelitian ini dilakukan reekstraksi sampel untuk


80

mengantisipasi tertinggalnya analit difenokonazol karena masih

tertahan di dalam matriks sampel. Reekstraksi bertujuan

memaksimalkan ekstraksi analit, sehingga %recovery yang diperoleh

lebih baik. Total supernatan yang diperoleh dari 5 gram sampel

tersebut dikeringkan dengan nitrogen untuk kemudian di clean-up

dengan SPE C18 dan dideterminasi dengan GC-ECD.

a. Optimasi Clean-up dengan SPE C18

Melon merupakan matriks yang kompleks, sebagian besar

kandungan melon bersifat polar salah satu contohnya vitamin C

dan karbohidrat. Senyawa yang menjadi analit target pada

penelitian ini adalah difenokonazol. Clean-up menjadi salah satu

tahapan penting untuk meminimalisir kandungan matriks yang

mengganggu analit target. Clean-up merupakan praperlakuan

sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen-

komponen matriks yang mungkin menggangu pada saat

pengukuran atau deteksi analit. Clean-up dalam penelitian ini

menggunakan SPE C18 sistem fase terbalik. Clean-up dengan

metode Solid Phase Extraction (SPE) praktis dan hemat pelarut

(Watson,1999). Strategi yang digunakan dalam penelitian ini

diharapkan fase gerak atau pelarut mampu menahan semua residu

analit difenokonazol dalam sebuah SPE C18 dengan ikatan lemah

sehingga analit dapat terelusi. Senyawa-senyawa yang cenderung


81

lebih polar akan ikut terelusi dengan fase gerak. Akuabides

digunakan sebagai fase gerak saat washing sedangkan metanol

digunakan sebagai fase gerak saat elusi. Berdasarkan pada sifat

fisika-kimia, difenokonazol memiliki kelarutan sebesar 15 mg/L

di dalam air sedangkan dalam metanol sebesar 500 g/L, yang

berarti kelarutannya lebih tinggi dalam metanol.

Optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini

adalah optimasi penentuan kapasitas SPE C18, washing dan elusi

SPE C18.

a) Penentuan kapasitas SPE C18

Penentuan kapasitas SPE C18 yang akan digunakan

dalam penelitian dilakukan dengan menimbang berat

ekstrak untuk setiap 1 ml. Hasil penimbangan tersebut

didapatkan bahwa 1 ml sampel yang telah dikeringkan

dalam oven, memiliki bobot sebesar 2,5 mg. Persyaratan

yang harus dipenuhi yaitu bahwa sampel yang akan

diloadingkan ke dalam SPE tidak boleh 5% melebihi berat

catdrige, sehingga SPE yang digunakan dalam penelitian

ini adalah harus lebih dari 50 mg. Semakin besar SPE yang

digunakan kapasitas efisiensi penjerapan analit semakin

besar. Penelitian ini menggunakan SPE C18 denga berat

400 mg.


82

Tabel XI. Penentuan kapasitas SPE (Sigmaaldrich).

Bobot

sampel

Volume SPE Minimum

volume eluat

Kapasitas SPE

yang

digunakan

50-100 mg 1 mL 100-200 uL 2,5-10 mg

500mg 3 mL 1-3 mL 25-100 mg

0,5-0,1 g 6 mL 2-6 mL 25-100 mg

2 g 12 mL 10-20 mL 0,1-0,2 g

5 g 20 mL 20-40 mL 1,25-2,5 g

10 g 60 mL 40-100 mL 0,5-1 g

Berdasarkan pada optimasi uji kualitatif pencucian

SPE, SPE layak untuk digunakan berulang sebanyak 3 kali

dengan syarat setiap kali selesai pemakaian, SPE dicuci

dengan 10 ml metanol dan 10 ml akuades. Berikut ini

adalah data dari penentuan kapasitas SPE C18:

Tabel XII. Optimasi penentuan kapasitas SPE C18

R1 R2 R3 R4 Rata-rata (gram)

Berat awal

zat(gram/ml)

0,793 0,788 0,796 0,792

Berat setelah

oven (gram)

0,003 0,003 0,003 0,001 0,0025

b) Optimasi washing SPE C18

Optimasi SPE C18 juga dilakukan pada tahap washing.

Fraksinasi washing dilakukan dengan memvariasi pelarut


83

yang digunakan yaitu 5% MeOH dan 100% UPW. Pada

fraksinasi dengan pelarut 5% MeOH sampel diadisi dengan

2 µl larutan standar intermediet A. Berikut grafik luas

puncak (AUC) difenokonazol dengan hasil optimasi

washing dengan pelarut 5% MeOH dan 100% UPW:

Gambar 7. Luas puncak difenokonazol yang diperoleh dari hasil

Fraksinasi setelah washing dengan 5% MeOH (washing 1) vs 100% UPW

(washing 2)

Diagram diatas menjelaskan bahwa eluat setelah washing

dengan 5% MeOH menghasilkan luas puncak yang lebih

kecil dibandingkan washing dengan 100% UPW.Artinya

senyawa pada saat washing dengan 5% MeOH, analit

difenokonazol banyak yang hilang ikut tercuci sehingga

saat diinjeksikan eluat menghasilkan respon luas puncak

1 2

AU

C

fraksinasi setelah washing

160506 568132,5

Washing 1


84

yang lebih rendah dibandingkan dengan eluat setelah

washing menggunakan 100% UPW.

c) Optimasi elusi SPE C18

Optimasi elusi SPE C18 dilakukan dengan fraksinasi

menggunakan pelarut metanol dan konsentrasi adisi 2µL

larutan standar stok A yang memiliki konsentrasi sebesar

0,526 g/L. Berikut grafik fraksinasi elusi dengan pelarut

metanol :

G

Gambar 8. Luas puncak hasil elusi difenokonazol

dalam SPE C18 per mL metanol

1 2 3 4 5

AU

C

jumlah Metanol untuk elusi (ml)

342216,75 336295

82787 0 30562,5


85

Gambar diatas menjelaskan bahwa dengan 3 mL

pelarut MeOH sudah cukup untuk mengelusi analit yang

diharapkan.

d) Optimasi kelayakan penggunaaan SPE secara berulang

Penggunaan SPE berulang dalam penelitian ini

didasarkan pada hasil optimasi yang menyatakan bahwa

SPE C18 400 gram dapat digunakan tidak lebih dari tiga

kali. Optimasi dilakukan dengan mengaplikasikan standar

difenokonazol 0,789 ng ke dalam sebuah SPE yang sama

sebanyak tiga kali. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk

melihat %perolehan kembali. Diharapkan bahwa

penggunaan SPE berulang tidak mempengaruhi perolehan

kembali dari masing-masing sampel.

Tabel XIII. %Recovery optimasi kelayakan penggunaan

SPE berulang

Massa

(ng)

AUC

DCB

AUC

difenokonazol Ratio % Recovery % Kesalahan

0,789 16110,5 30015,1 1,863 110,743 10,74292

0,789 20158,1 36603,9 1,816 109,349 9,349369

0,789 25368,2 46977,3 1,852 107,309 7,309574

Rata-Rata 1,8437 109,134 9,133954

SD 1,727

% RSD 1,583


86

Berdasarkan pada data diatas didapatkan % kesalahan

≤20% yang berarti bahwa data optimasi memenuhi kriteria

persyaratan dan bahwa SPE dapat digunakan 3 kali

(AOAC,2005).

Hasil optimasi clean-up dengan SPE C18 pada

penelitian ini adalah sebagai berikut:

Tabel XIV. Hasil optimasi clean-up SPE C18

Optimasi Hasil

Kapasitas SPE C18 ≥ 50 mg, yang digunakan 400

mg

Washing SPE 5 mL akuades

Elusi SPE 3 mL metanol

C. Validasi Metode Analisis

Validasi metode adalah serangkaian proses yang dilakukan untuk

membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,

yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Kriteria validasi metode analisis residu

pestisida untuk suatu modifikasi metode analisis yang sudah ada adalah LOD, LOQ,

recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi maupun clean-up, determinasi analit

dan kisaran kalibrasi (CCPR,2014).


87

Pada penelitian ini parameter validasi metode yang diukur adalah linearitas,

kisaran linearitas, selektivitas, sensitivitas, akurasi, presisi, dan LOQ. Kinerja clean-

up dan GC-ECD dievaluasi dalam penelitian ini. Clean-up dilakukan dengan

menggunakan SPE C18, untuk menguji kinerja clean-up SPE C18 yang telah

teroptimasi dilakukan adisi pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE dalam

penelitian ini disebut Adisi B. Selanjutnya untuk menguji kinerja GC-ECD dalam

menetapkan difenokonazol dalam matriks ekstrak melon bersih ( setelah melalui

clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada ekstrak bersih pada penelitian ini

disebut adisi C. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan % recovery yang

dipersyaratkan dalam CCPR yaitu 70-120%, dilakukan penetapan akurasi pada

metode analisis ini. Pada penelitian ini LOQ metode teroptimasi ditetapkan pada

konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi.

1) Adisi C

Penambahan standar adisi ekstrak melon setelah clean-up dilakukan dan

tepatnya sebelum sampel diinjeksikan ke dalam GC. Adisi jalur C bertujuan untuk

menguji kinerja GC-ECD dalam menetapkan difenokonazol dalam matriks

ekstrak buah melon.Berdasarkan pada kromatogram hasil injeksi sampel yang

diadisi, puncak difenokonazol dapat terpisah secara sempurna dari senyawa-

senyawa koekstraktan matriks yang mengganggu. Secara kuantitatif melihat

presisi dan akurasi dari kinerja GC-ECD pada adisi jalur C, nilai recovery standar

yang ditambahkan dan %D dihitung.


88

Tabel XV. Nilai %Recovery dan %D metode adisi C

Kadar yang ditmbahkan

(ng) Recovery

I Recovery

II Recovery

III Rata-rata Recovery %Kesalahan

0,158 66,957 87,274 104,076 86,102 13,898

0,263 81,126 73,215 107,023 87,121 12,879

0,368 85,421 68,960 119,607 91,329 8,671

0,526 85,161 64,120 115,857 88,380 11,620

0,684 84,574 66,968 112,946 88,162 11,838

Tabel XVI. Nilai %D metode adisi C

Kadar yang

ditambahkan

(ng) Replikasi I Replikasi II Replikasi III

0,158 8,462 17,648 13,491

0,263 5,890 2,365 0,152

0,368 3,017 1,487 2,578

0,526 2,607 6,888 5,088

0,684 6,082 1,486 9,857

1) Adisi B

Pada adisi jalur B, adisi ekstrak melon dilakukan sebelum clean-up

dengan SPE C18. Tujuan dari adisi jalur B adalah untuk menguji kinerja clean-

up dengan kolom SPE C18. Kinerja clean-up dengan kolom SPE C18 dapat

dievaluasi dengan nilai recovery kadar yang ditambahkan dan %D yang

menggambarkan akurasi dan presisi dari adisi jalur B.


89

Tabel XVII. Nilai %Recovery metode adisi B

Massa

(ng)

Recovery

I

Recovery

II

Recovery

III

Rata-rata

Recovery %kesalahan

0,105 81,001 111,599 131,955 108,185 8,185

0,158 69,174 115,640 131,309 105,375 5,375

0,263 91,151 134,959 113,055 13,055

0,368 106,512 112,022 133,738 117,424 17,424

0,526 114,330 120,759 130,603 121,897 21,897

Tabel XVIII. Nilai %D metode adisi B

Massa

(ng) Replikasi I Replikasi II

Replikasi

III

0,105 20,261 5,381 6,301

0,158 8,512 0,784 2,437

0,263 8,090 4,029

0,368 3,478 10,569 4,544

0,526 2,781 6,052 3,134

0,684 3,559 8,682 0,749

2) Adisi A

Pada adisi jalur A, adisi dilakukan sebelum sampel di clean-up dengan

SPE C18. Tujuan dari adisi jalur A adalah untuk menguji keseluruhan proses

dari ekstraksi menggunakan QuEChERS dan kinerja clean-up dengan kolom

SPE C18. Parameter yang teroptimasi pada adisi jalur adisi A adalah akurasi dan

presisi. Berikut ini adalah tabel perolehan kembali atau %recovery dari kadar

yang ditambahkan dan % D selama proses ekstraksi berlangsung :


90

Tabel XIX. Nilai %Recovery dan %D metode adisi A

Massa

(ng)

Recovery

I

Recovery

II

Recovery

III

Rata-rata

Recovery %Kesalahan

0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401

0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737

0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558

0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732

0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336

Massa (ng) Replikasi I

Replikasi II Replikasi III

0,158 28,198 25,193 19,320

0,263 12,010 19,238 16,663

0,368 9,949 9,854 3,845

0,526 11,129 5,828 3,871

0,684 2,921 0,557 68,208

Dari metode adisi tahap A, B, dan C dapat disimpulkan kesalahan dari

masing-masing tahap. Pada tahap A atau metode adisi untuk melihat kinerja

metode analisis sampel blanko yang di fortifikasi memiliki kesalahan ekstraksi

sebesar 0,133% pada LLMV. Pada metode tahap B, sampel blanko yang

difortifikasi sebelum clean-up memiliki kesalahan sebesar 8,753%, dan pada

tahap C memiliki kesalahan sebesar 8,670%.

a) Linearitas

Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh

hasil-hasil uji proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang

diberikan. Linearitas kurva baku adisi menghubungkan antara rasio


91

respon luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB) sebagai

sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x. Hasil

plot kurva baku adisi pada kisaran linearitas 0,105-0,684 ng tersebut

diperoleh slope koefisien korelasi (r) sebesar 0,974. Menurut

Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005 ) dari suatu

metode dikatakan linear apabila >0.9900. Berdasarkan pada kriteria

tersebut nilai koefisien korelasi yang didapat tidak mencapai

spesifikasi persyaratan yang telah ditetapkan oleh AOAC, hal ini

karena konsentrasi pada penelitian ini sangat kecil mencapai kadar

ppb.

Gambar 9. Linearitas kurva adisi

y = 1.0133x - 0.0034

R² = 0.9743

0.000

0.100

0.200

0.300

0.400

0.500

0.600

0.700

0.800

0.000 0.200 0.400 0.600 0.800

rasi

o A

UC

/DC

B

massa (ng)


92

b) Selektivitas

Selektivitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang

dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen

lain di dalam matriks sampel. Selektivitas dilakukan untuk matriks

yang kompleks dalam hal ini matriks melon dikategorikan sebagai

matriks yang kompleks, karena di dalam matriks tersebut tidak hanya

terdapat analit target. Optimasi clean-up dengan SPE C18 dapat

meningkatkan selektivitas. Dengan optimasi clean-up, senyawa-

senyawa koekstraktan dalam matriks yang mengganggu dapat

diminimalisir sehingga difenokonazol dapat terpisah sempurna dari

senyawa-senyawa tersebut. Gambar 10 merupakan kromatogram

sampel setelah di clean-up dengan SPE C18. Terlihat bahwa pada

kromatogram sebelum clean-up puncak yang terdeteksi sangat rimbun

sedangkan pada kromatogram setelah clean-up puncak-pucak

koekstraktan matriks berkurang.


93

Gambar 10.kromatogram kurva adisi

Adanya pemisahan yang baik puncak difenokonazol dengan impurities

lain dibuktikan dengan nilai Rs, TF, N, dan keajegan tR yang ada

dalam Tabel berikut ini :

Tabel XX. Nilai N, Rs, dan tR dari kurva adisi A

Replikasi N Rs awal Rs akhir Tr

1 358888,330 1,732 5,636 29,342

2 123879,864 1.436 4,543 28,064

3 79651,139 3,252 5,312 27,396

4 80304,476 1,211 4,186 27,506

5 63957,803 1,809 1,710 29,459

6 68941,955 1,236 4,224 30,193

d

i

f

e

n

o

k

o

n

a

z

o

l

D

C

B


94

c) Akurasi

Ketelitian suatu metode analisis terhadap nilai yang terukur dengan

nilai yang diperoleh atau nilai sebenarnya dapat dilihat dengan

menghitung akurasi.Standar internal DCB ditambahkan sebagai faktor

koreksi analit yang hilang. Akurasi diekspresikan dalam %recovery

atau persen perolehan kembali. Tabel XXI di bawah menunjukan hasil

%recovery pada kisaran 0,263-0,789 ng yang diperoleh dalam

penelitian ini :

Tabel XXI. Hasil % recovery pada kisaran 0,263-0,684 ng

Massa

(ng)

Recovery

I

Recovery

II

Recovery

III

Rata-rata

Recovery %Kesalahan

0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401

0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737

0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558

0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732

0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336

Persen perolehan kembali (%recovery) yang di persyaratkan menurut

CCPR yaitu 70-120%.Tabel menunjukan bahwa dari 3 replikasi diatas

%perolehan kembali senyawa residu difenokonazol memenuhi

persyaratan sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini akurat.

d) Presisi

Presisi merupakan ukuran kedekatan anta serangkaian hasil analisis

yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel dengan


95

konsentrasi yang sama. Parameter presisi diekspresikan dengan %D.

Spesifikasi persyaratan %D dapat diterima apabila <20%. Hasil dari

%D yang diperoleh dalam penelitian ini disajikan dalam tabel

.Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa metode hasil

modifikasi QUEChERS memiliki presisi yang baik.

Tabel XXII. Hasil %D

Massa (ng) Replikasi I

Replikasi II Replikasi III

0,158 28,198 25,193 19,320

0,263 12,010 19,238 16,663

0,368 9,949 9,854 3,845

0,526 11,129 5,828 3,871

0,684 2,921 0,557

e) Sensitivitas

Limit of Quantification (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit

terendah dalam sampel yang dapat dideteksi. LOQ menunjukan

sensitivitas dari suatu sistem GC-ECD. Semakin kecil LOQ maka

dapat dikatakan bahwa GC-ECD memiliki sensitivitas yang semakin

tinggi.

Konsentrasi difenokonazol yang harus terdeteksi dalam penelitian ini

adalah setengah dari nilai Batas Minimum Residu (BMR)

difenokonazol yang diketahui yaitu 0,035mg/kg (Codex,2014),


96

sehingga LOQ sistem GC-ECD harus lebih rendah dari konsentrasi

tersebut. LOQ yang didapat dalam penelitian ini adalah 0,002 µg/g.


97

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi

difenokonazol dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 0,133 pada

LLMV 7,364 ng/g.

2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan

difenokonazol pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum clean-

up dengan kolom SPE C18 113-121% dengan kesalahan 8,753% pada

LLMV.

3. Validasi metode analisis yang dilakukan pada sampel blanko dan sampel

yang di fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi.

a. Kinerja kuantitasi GC teroptimasi adalah rata-rata %D<20%, linearitas

0,890-0,999 pada kisaran 0,053-0,526 ng, dengan IDL 0,01– 0,07ng/mL

dan IQL 1,06 ng/g.

b. Kinerja GC pada ekstrak blanko yang di fortifikasi pada kadarr 0,158-

0,684 ng sebelum diinjeksikan menghasilkan recovery sebesar 86-91%,

dengan kesalahan 8,670% pada LLMV.

c. Kinerja metode analisis sampel blanko yang difortifikasi 0,158-0,684 ng

memberikan recovery pada kisaran 71-115% dan LOQ 0,002 g/g.

Dengan demikian validasi metode analisis ini memenuhi spesifikasi


98

persyaratan untuk memantau kadar residu difenokonazol dalam buah

melon dibawah Batas Minimum Residu (BMR) yang diperbolehkan yaitu

0,7 mg/kg.

B. Saran

1. Perlu membandingkan hasil proses ekstraksi jika menggunakan PSA.


99

DAFTAR PUSTAKA

Anastassiades, Michelangelo., 2006, QuEChERS Method Background

Informationand Recent Developments, Community Reference

LaboratoryPesticide Residuesusing Single Residue Methods, Stuttgart, p.50,66.

AOAC, 2007, Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and

Partitioning with Magnesium Sulfate Gas Chromatography/Mass Spectrometry

and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, AOAC International,

diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.

AOAC International, 2012,Appendix F: Guidelines for Standard Method Perfomance

Requirements, AOAC International, P.9.

Cajka,Thomas, et all, 2007, Rapid analysis of Multiple Pesticide Residues in Fruit-

Based Baby Food Using Programmed Temperature Vaporiser Injection-Low-

Pressure Gas Chromatography-High-Resolution Time-of-Flight mass

Spectrometry, Eselvier, p.290.

CCPR,2003, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Codex Alimentarius

Commission, Twenty-Fifth Session, Fao-Who, Italy, P 1-106.

CCPR,2014, Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius

Commission: Report Of The 46th Session Of The Codex Committee On

Pesticide Residues, Switzerland.


100

Czichos Horst, Tetsuy Saito, and Leslie Smith, 2006, Handbook of Material

Measurement Methods,CRC Press, New York.pp.160-163.

European Food Safety Authorithy (EFSA),2011,Conclusion on the Peer Review of the Pesticide Risk

Assesment of the Active Substance Difenoconazole,EFSA, Journal.9 (1),22-23.

Ermer, J., and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical

Analysis, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Qeinheim, pp.3,21,63,80.

Fessenden, R.j dan Fessenden, J.S., 1986, Kimia Organik, Jilid 2, Edisi Ketiga

Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D., Erlangga, Jakarta. pp.113-

137.

Gandjar,I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta,

hal.46,53-55,323-324,378-379,460,463-464,468.

Grob, L.R., 1995, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley and Sons

Inc., New York. P.291-295.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungan,

Majalah Ilmu Farmasi, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp.117-128.

Horwitz, W., 1984, Official Methods of Analysis of AOAC Interational, 13rd Edition,

AOAC International, USA, p.16.

Jennings, E. L., Mittlehldt, E., & Stremple, P., 1987, Analytical Gas

Chromatography, 2nd

Edition, California, Academic Press, pp 37-61.


101

Johanes,Oei, 2014, Pengembangan Metode Analisis Deltametrin dalam Matriks Ikan

Nila (Oreochromis niloticus) Dan Aplikasinya Pada Asesmen Resiko

Deltametrin Melalui Asupan Ikan Nila, Usd, Yogyakarta, Hal 36-42.

McNair, H. M. & Miller, J. M., 1998, Basic Gas Chromatography, New York, John

Willey & Sons.

Nollet, Leo., et all., 2005,Chromatographic Analysis of the Environment, Third

Edition, Volume 93, CRC Press (Taylor & Francis Group), New York, p. 46-

49.

RAM 305/03, 2004, Standard Operating Procedure “Residue Analytical Method for

the Determination of Residue of Difenokonazol (ICI5504) and R230310 in Crop

Samples Final Determination by LC-MS/MS”, Syngenta, p.6.

Roe,M., Church,S., Pinchen,H.,Finglas, P., 2013, Nutrient Analysis of Fruit and

Vegetables; Analytical Report,Institute of Food Research, UK,pp.65.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu,

Yogyakarta, pp.217-230.

Samadi, Budi., 2007, Melon Usaha Tani Dan Penanganan Pasca Panen, kanisius,

yogyakarta, hal. 12,18, 85.

Sanco, 2013, Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation

Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, European, pp 3-36.


102

Sigma-Aldrich,1998, Guide to Solid Phase Extraction, Supelco Bulletin 910,12.

Sigma Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-

preparation/spe/tube-configuration-guide.html.

Skoog, D.A., West, D.M., Holler F.J., and Crouch S.R., 2004, Fundamental

ofAnalytical Chemistry, 8th edition, Thomson learning, Inc., USA, pp. 948-950,

959.

Soeryadi, I., 1997, Kromatografi, Warta Insinyur Kimia, 17-19.

Sudarmo, Subiyakto., 1991, Pestisida, Kanisius, Yogyakarta, hal 5-10.

UCT, Pesticide Residue Analysis: QuEChERS Informational Booklet, Enviro, USA,

diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.

Sueki H. Leung, Monika M. Kansal, Carl Sanchez, Art Dixon, and Erica Pike

Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA, Analyzing

Pesticide Residues in Lettuce by the EN 15662 Method using Phenomenex

roQ™ QuEChERS Kits Followed by LC/MS/MS and GC/MS Analysis, TN-

0052, APPLICATIONS, p. 1.

USDA/AMS PDP, 2015, United States Department of AgricultureAgricultural

Marketing Service, Science & Technology, Pesticide Data Program, US, pp 2-

29.


http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html

http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-preparation/spe/tube-configuration-guide.html

103

Watson, D. G., 1999, Pharmaceutical Analysis : A Textbook for Pharmaceutical

Students and Pharmaceutical Chemist, Churcill Livingstone, London,p. 238-

239,320.

Wilson, Keith and John Walker, 2001, Principles and Techniques of Practical

Biochemistry, fifth edition, United Kingdom, Cambridge, p 262-264.

Wittkowski, R., & Matissek, R., ,1990, Cappilary Gas Chromatography in Food

Control and Research, Pennsylvania: Technomic Publishing.


104

LAMPIRAN


105

Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs)

Rs=

Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1=

=12,277

Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1=

=6,437

Lampiran 2. Perhitungan LOQ dan LOD

koefisien korelasi (r) Persamaan Sa0 B ng ng/ul ng/g

LOQ ug/g

0.92972 F(x) = -0.05393 + 1.23509 x 0.04824 1.23509 0.117175 0.058587 2.343492 0.002343

d

i

f

e

n

k

o

n

a

z

z

o

l

l

P

e

n

g

o

t

o

r

1

P

e

n

g

o

t

o

r

2

2


106

LOQ=

= 10 X

= 0,117 ng

LOQ= 0,117 ng/ 2µL= 0,058 ng/µL

LOQ= 0,058 ng/µL X

= 2,343 ng/g= 0,002 µg/g

LOD

Kode Senyawa FX sy/x a0 a1 b Ng ng/ul

5 F(x) = 0.15707 +

3.03655 x 2.98E-02 1.05E-01 3.03655 0.029396 0.014698

7 F(x) = 0.02169 +

2.06485 x 0.013201 0.046498 2.06485 0.019179 0.00959

11 F(x) = -0.07459 +

3.78718 x 0.183007 0.86621 3.78718 0.144968 0.072484

LOD=

= 3,3 X

= 0,02 ng

LOD=0,02ng/2µL= 0,01 ng/µL.


107

Lampiran 3. Certificate of Analysis DCB

3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103 USA Email USA: [email protected] Outside USA: [email protected]

Certificate of Analysis Product Name: DECACHLOROBIPHENYL

purum p.a., >= 99.0 % T Product Number: 442537 Batch Number: WEBC0771Q Brand: Sigma-Aldrich CAS Number: 2051-24-3 Formula: C12Cl10 Formula Weight: 498,66 Quality Release Date: 23 OCT 2013 TEST SPECIFICATION RESULT APPEARANCE (COLOR) COLORLESS WHITE APPEARANCE (FORM) SOLID SOLID MELTING POINT >290,0°C >290,0 °C FLASH POINT >100,0 °C >100,0 °C

Dr. Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland

Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication. The currentspecification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com. For further inquiries, please

contact Technical Service.Purchaser must determine the suitability of the productfor its particular use. See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale.

Sigma-Aldrich Certificate of Analysis - Product 71635 Lot BCBM0371V

Page 1 of 1


108

Lampiran 4. Certificate of Analysis Asetonitril


109

Lampiran 5. Certificate of Analysis Heksan


110

Lampiran 6. Certificate of Analysis Metanol


111


112

Lampiran 7. Certificate of Analysis Magnesium Sulfat


113

Lampiran 8. Certificate of Analysis Na2Hsitrat


114

Lampiran 9. Certificate of Analysis Na3Sitrat


115

Lampiran 10. Certificate of Analysis NaCl


116


117

Lampiran 11 . Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari

PT Syngenta


118

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Analisis Residu

Difenokonazol Pada Buah Melon (Cucumis melo L.)”

memiliki nama lengkap Florentina Silviana Devi. Penulis

dilahirkan di Pajar mataram Lampung pada tanggal 26

Juni1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Lukas

Sumari dan Katarina Katrin. Pendidikan formal yang pernah ditempuh oleh

penulis yaitu di TK Fransiskus Xaverius Pajar Mataram Lampung Tengah

(1997-1999), SD Negeri 3 Pajar Mataram Lampung Tengah (1999-2005),

SMP Negeri 2 Qurnia Mataram Lampung Tengah (2005-2008), SMA

Xaverius Pringsewu Lampung (2008-2011). Penulis melanjutkan

pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun

2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain

Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi „‟ Membuka Langkah Untuk Menggapai

Impian‟‟, Guest Lecture On Medicinal Chemistry By Dr. Rob Leurs (Vrije

Universeit, The Netherlands), Seminar Nasional „‟ Pemberdayaan Pasien Self

Management Diabetes Melitus Untuk Meningkatkan Kualitas Hidup‟‟. Hari

Aids Sedunia „‟ Kubangun Dan Kujaga Generasiku Bebas HIV AIDS‟‟

Pelaksanaan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · c. solid phase extraction (spe) ... e. alat...

Documents