I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pemisahan campuran menjadi komponen-komponen penyusunnya merupakan

hal yang penting dalam semua cabang kimia dan tidak kalah pentingnya

dalam banyak bidang-bidang lain di mana teknik-teknik kimia digunakan

untuk memecahkan masalah. Sehingga pemisahan begitu perlu dilakukan

untuk beberapa konteks tertentu. Pemisahan dengan cara kromatografi dapat

memisahkan campuran dengan lebih cepat dan lebih efektif dari sebelumnya.

Namun, ketelitian kromatografi jarang sekali ditekankan. Penggunaan

kromatografi yang luar biasadalam bidang biokimia yaitu dalam menyediakan

informasi mengenai struktur dan fungsi enzim dan protein-protein lainnya.

Kromatografi dikenalkan oleh ilmuwan Rusia bernama Michael Tswett pada

tahun 1960 di Universitas Warsawa , dimana ia memberikan gambaran

pertama dalam istilah yanag hampir modern tentang suatu pemisahan

kromatografi. Tswett menggambarkan pemisahan klorofil dan pigmen-

pigmen lainnya dalam satu ekstrak tumbuhan. Ada empat perkembangan

besar mengenai kromatografi yaitu kromatografi pertukaran ion, kromatografi

partisi, kromatografi gas dan kromatografi filtrasi-gel.

Karena nilainya yang sangat penting dalm banyak bidang penelitian,

kromatografi merupakan suatu bidang yang maju dan pesat. Perkembangan

terus berlanjut, beberapa di antaranya yaitu muncul detektor-detektor yang

lebih baik, bahan pengisi kolom yang baik, dan analisis dengan isntrumen lain

yang dapat meyenmpurnakan pemisahan, seperti spektrometer massa.

Pada percobaan kali ini akan dilakukan pemisah pigmen hijau dari daun

menggunakan kolom kromatografi dan diuji dengan menggunakan

Spektrometer UV-Vis.

1.2 Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini yaitu agar mahasiswa dapat memisahkan

pigmen warna dari suatu tumbuhan menggunakan kolom kromatografi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Daun merupakan salah satu organ tumbuhan yang tumbuh dari batang, umumnya

berwarna hijau daun dan terutama berfungsi sebagai penangkap energi cahaya

matahari melalui fotosintesis. Bentuk daun sangat beragam namun biasanya

berupa helaian, bisa tipis atau tebal. Daun juga bisa bermodifikasi menjadi duri

(misalnya kaktus) dan berakibat daun kehilangan fungsinya sebagai organ

fotosintetik. Warna hijau pada daun berasal dari kandungan klorofil pada daun.

Daun seringkali mengandung beberapa senyawa yang berwarna (pigmen) antara

lain klorofil (hijau), karoten (kuning) dan xantofil (kuning). Meskipun klorofil

mengandung bagian yang polar, akan tetapi secara keseluruhan strukturnya adalah

non polar, seperti hidrokarbon, sehingga klorofil mudah larut dalam pelarut non

polar seperti eter atau petroleum eter. Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan

klorofil b, yang membedakan kedua jenis klorofil ini adalah adanya gugus aldehid

pada struktur klorofil b yang menyebabkan klorofil b ini bersifat sedikit lebih

polar dibandingkan klorofil a.

Xantofil C40H50O2 adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil

dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten. Xantofil lebih larut

dalam alkohol dan sedikit larut dalam petroleum eter dibandingkan karoten.

Xantofil memiliki struktur yang mirip dengan karoten, hanya bedanya xantofil

memiliki gugus OH pada struktur sikliknya. Adapun struktur dari xantofil adalah

sebagai berikut.

Untuk mengekstraksi pigmen dari daun, terlebih dahulu dilakukan penggerusan

dengan mortar terhadap daun kering sampai halus. Pelarut yang dapat

mengekstraksi pigmen secara bertahap dengan urutan kepolaran yaitu petroleum

eter, kloroform, etanol, dan metanol (Robinson, 1995).

Untuk pemisahan pigmen dari tumbuhan, dapat dilakukan dengan kromatografi

kolom. Alat yang digunakan yaitu kolom yang di dalamnya berisi fase stasioner

(padat atau cair). Campuran ditambahkan ke kolom dari satu ujung dan campuran

akan bergerak dengan bantuan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan

dicapai oleh perbedaan laju turun masing-masing komponen dalam kolom, yang

ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau koefisien partisi antara fase gerak dan fase

diam (stationer).

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen dari campurannya.

Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena

kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih

kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa,

sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu

menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal (Gritter dkk, 1991).

Dalam pemisahan biasanya kromatografi kolom diikuti pemeriksaan secara

kualitatif dengan KLT untuk memonitor apakah pemeriksaan dengan cara

kromatografi kolom berhasil atau tidak. Dalam kromatografi lapis tipis (KLT)

fase diamnya biasanya adalah serbuk silika gel, alumina, tanah diatome, selulosa

dan lainnya yang mempunyai ukuran butir sangat kecil yaitu 0,063 – 0,125 mm

dilapiskan pada kaca, lembaran aluminium maupun plastik dengan tebal tertentu

(Hendayana, 2006).

III. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada percobaan ini diantaranya yaitu lumpang, kolom

kaca, erlenmeyer, pipet tets, gelas beker 100 mL, neraca digital, sentrifuge,

spektrometer UV-Vis, tabung reaksi, batang pengaduk dan corong kaca.

Bahan yang digunakan yaitu CaCO3, etanol, aseton dan daun atau bunga.

3.2 Diagram Alir

3.2.1 Penyiapan Kolom Kromatografi

- dimasukkan dalm gelas beker 100 mL- ditambahkan akuades 30 mL -diaduk hingga larut semua- dimasukkan ke dalam kolom kromatografi hingga ketinggian tertentu

CaCO3 25 gram

Hasil

3.2.2 Persiapan sampel

- dihaluskan di dalam cawan porselein- ditambah 20 mL etamol sedikit demi sedikit - dimasukkan ke dalam tabung sentrifius lalu disentrifius

3.2.3 Pemisahan dengan kolom kromatografi

- dimasukkan ke dalam kolom - klem kromatografi dibuka sambil dielusi dengan 25 mL aseton- diamati pemisahannya- analit ditampung dalam tabung reaksi lalu dianalisis dengan Spektrometer UV-Vis dengan panjang gelombang 350-650 nano meter

50 gram daun berwarna hijau

Hasil

1 mL ekstrak bahan

Hasil

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

No Perlakuan Hasil Keterangan1.

2.

Pemisahan sampel daun yang berwarna hijau menggunakan kolom kromatografi selama kurang lebih 3 jam alamanya

Ekstrak di analisis dengan Spektrometer UV-Vis pada panjang gelombang 350-650 nano meter

Di dalam tabung warna hijau dari daun lama kelamaan memisah menjadi warna sedikit kekuningan

Diperoleh spektrum dari sampel yang dipisahkan

Diperoleh larutan pigmen

Serapan nya tidak nampak

4.2 Pembahasan

Pemisahan pigmen dari daun berupa xantofil dilakukan dengan prosedur

diantaranya yaitu pertama penyiapan kolom kromatografi dan fase diamnya

CaCO3 dengan melarutkan fase diam dengan menggunakan akuades. Kemudian

persiapan sampel dengan menggunakan daun alpukat yang berwarna hijau muda,

daun dihaluskan di dalam lumpang sebanyak 50 gram. Kemudian bahan

ditambahkan etanol yang digunakan untuk mengekstrak klorofil. Untuk fraksi

yang larut bersama etanol dan metanol diduga mengandung xantofil (C40H50O2)

karena pigmen xantofil lebih larut dalam alkohol. Meskipun daun alpukat

berwarna hijau yang mana mengandung klorofil namun klorofil tidak larut di

dalm pelarut polar seperti halnya etanol. Klorofil mengandung sifat nonpolar

sehingga dapat larut dalam petroleum eter yang dan kloroform yang juga bersifat

nonpolar. Kenonpolaran klorofil dapat dilihat dari strukturnya di mana walaupun

klorofil mengandung bagian yang polar namun secara keseluruhan strukturnya

adalah nonpolar. Sesuai dengan literatur daun seledri mengandung klorofil a

(larutan berwarna hijau tua) dan klorofil b (larutan berwarna hijau muda).

Di samping itu, larutan pada fraksi ini berwarna kuning dan hal ini sesuai dengan

literatur bahwa xantofil memang merupakan pigmen yang berwarna kuning.

Dalam hal ini, xantofil merupakan pigmen yang bersifat polar sehingga dapat larut

dalam etanol yang juga bersifat polar.

Kemudian setelah itu sampel dimasukkan ke dalam tabung sntrifius untuk

kemudian disentrifius agar diperoleh ekstrak pigmen dari bahan tersebut.

Sebanyal 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam kolom kromatografi sambil dielusi

dengan 25 mL aseton. Aseton digunakan sebagai fase gerak pada pemisahan ini

karena melihat dari kepolaran bahan yang bersifat polar sehinnga digunakan fase

gerak yang nonpolar untuk membersihkan pengotor lainnya sehingga pigmen

dapat turun lebih cepat dari fase diamnya.

Hasil esktrak yang turun kemudian ditampung di dalam tabung rekasi untuk

selanjutnya dianalisis menggunakan Spektrometer UV-Vis pada panjang

gelombang visible yaitu 350-650 nano meter. Pada percobaan ini hasil yang

diperoleh kurang baik dikarenakan ada beberapa kesalahan pada saat mengambil

ekstrak dari kolom kromatografi seperti tercampurnya aseton dengan ekstrak dari

bahan sehingga merusak bentuk spektrum dari pigmen. Kelemahan dari teknik

kolom kromatografi ini yaitu banyak memakan waktu terutama saat memisahkan

dengan kolom kromatografi dikarenakan pada teknik ini hanya memanfaatkan

gaya gravitasi sampel agar turun sehingga memakan waktu hingga 3 jam lebih.

Komponen alat kolom kromatografi diantaranya yaitu terdiri dari statif, klem, dan

kolom dan cara penggunaan kromatografi kolom yaitu sampel yang dilarutkan

dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke

dalam adsorben (bahan penyerap).Komponen dalam sampel diadsorbsi dari

larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan

atas kolom. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing

komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap

zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar kolom dapat

ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom. 

Aplikasi dari penggunaan kromatografi ini yaitu untuk pengetahuan dalam

biokimia seperti struktur fungsi enzim dan protein-protein lainnya. Menghitung

polusi air dan udara, menentukkan residu pestisida pada buah-buahan,

mengidentifikasi dan mengklasifikasi bakteri, memantau gas-gas pernapasan

selma pembiusan, memurnikan bahan dan lain sebagainya.

Pada percobaan ini digunaka beberapa bahan yang sifta fisik dan kimia dijelaskan

berikut ini :

1. Etanol

Titik didih alkohol relatif tinggi. Hal ini merupakan akibat langsung dari daya

tarik intermolekuler yang kuat. Ingat bahwa titik didih adalah ukuran kasar dari

jumlah energi yang diperlukan untuk memisahkan suatu molekul cair dari molekul

terdekatnya.

Alkohol dengan massa molekul rendah larut dalam air. Kelarutan dalam air ini

lebih disebabkan oleh ikatan hidrogen antara alkohol dan air. Dengan

bertambahnya massa molekul relatif maka gaya-gaya Van der Waals antara

bagian-bagian hidrokarbon dari alkohol menjadi lebih efektif menarik molekul-

molekul alkohol satu sama lain. Oleh karena itu, semakin panjang rantai karbon

semakin kecil kelarutannya dalam air.

Alkohol dapat meggalami reaksi dehidrasi, oksidasi , reaksi dengan logam Na dan

K, reaksi eterifikasi dan reaksi dengan hidrogen halida.

2. Aseton

Sifat – Sifat dari Aseton :

 Sifat Kimia :

 1.    bersifat polar 

2.    dapat direduksi dengan LiAlH4 menjadi alkohol

 3.    merupakan basa lewis lemah dengan mereaksikannya dengan asam kuat.

 4.    tahan terhadap oksidasi atau tidak dapat dioksidasi, kecuali dalam keadaan

tertentu dimana rantai karbon pecah. 

5.    larut dalam air 

Sifat Fisika : 

1.    berat jenis 0,787 g/mL

 2.    titik didih 56oC

 3.    titik beku -95oC

 4.    tidak berwarna 

5.    baunya sengit

 6.    memiliki berat molekul 58 g/mol

3. CaCO3

Seperti namanya, kalsium karbonat ini terdiri dari 2 unsur kalsium dan 1 unsur

karbon dan 3 unsur oksigen. Setiap unsur karbon terikat kuat dengan 3 oksigen,

dan ikatan ini ikatannya lebih longgar dari ikatan antara karbon dengan kalsium

pada satu senyawa. Kalsium karbonat bila dipanaskan akan pecah dan menjadi

serbuk remah yang lunak yang dinamakan calsium oksida (CaO). Hal ini terjadi

karena pada reaksi tersebut setiap molekul dari kalsium akan bergabung dengan 1

atom oksigen dan molekul lainnya akan berikatan dengan oksigen menghasilkan

CO2 yang akan terlepas ke udara sebagai gas karbon dioksida. dengan reaksi

sebagai berikut:

CaCO3 --> CaO + CO2 

Reaksi ini akan berlanjut apabila ditambahkan air, reaksinya akan berjalan dengan

sangat kuat dan cepat apabila dalam bentuk serbuk, serbuk kalsium karbonat akan

melepaskan kalor. Molekul dari CaCO3 akan segera mengikat molekul air (H2O)

yang akan menbentuk kalsium hidroksida, zat yang lunak seperti pasta.

Sebagaimana ditunjukkan pada reaksi sebagai berikut:

CaCO3 + H2O --> Ca(OH)2 + CO2 

V. KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang diperoleh dari percobaan ini diantaranya yaitu :

1. Pemisahan pigmen dari tanaman dari semua sampel tanaman dilakukan

dengan cara ekstraksi menggunakan pelarut yaitu etanol untuk

melarutkan pigmen sampel daun.

2. Pemisahan dengan kromatografi kolom dicapai oleh perbedaan laju

turun masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh

kekuatan adsorspi atau koefisien partisi antara fasa gerak dan fasa

diam.

3. Di dalam daun alpukat terdapat xantofil yang berisifat polar sehingga

digunakan pelarut etanol yang polar untuk mengekstraknya.

DAFTAR PUSTAKA

Gritter, J., dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung.

Hendayana, Sumar. 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Remaja Rosdakarya.Bandung.

Robinson, Trevon. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB. Bandung.