pengaruh preventif ekstrak etanol jintan hitam …repository.ub.ac.id/4033/1/dita...

of 87/87
PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK ETANOL JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP PROFIL PITA PROTEIN SERUM DAN HISTOPATOLOGI LIMPA TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIBERI PAPARAN ASAP ROKOK SKRIPSI Oleh: DITA YULIANINGSIH 135130100111021 PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2017

Post on 04-Dec-2020

0 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

  • PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK ETANOL

    JINTAN HITAM (Nigella sativa) TERHADAP PROFIL

    PITA PROTEIN SERUM DAN HISTOPATOLOGI

    LIMPA TIKUS (Rattus norvegicus) YANG

    DIBERI PAPARAN ASAP ROKOK

    SKRIPSI

    Oleh:

    DITA YULIANINGSIH

    135130100111021

    PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

    FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

    UNIVERSITAS BRAWIJAYA

    MALANG

    2017

  • ii

    PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK ETANOL JINTAN HITAM (Nigella

    sativa) TERHADAP PROFIL PITA PROTEIN SERUM DAN GAMBARAN

    HISTOPATOLOGI LIMPA TIKUS (Rattus norvegicus) YANG

    DIBERI PAPARAN ASAP ROKOK

    SKRIPSI

    Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

    Sarjana Kedokteran Hewan

    Oleh:

    DITA YULIANINGSIH

    135130100111021

    PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

    FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

    UNIVERSITAS BRAWIJAYA

    MALANG

    2017

  • iii

    LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

    PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK ETANOL JINTAN HITAM (Nigella

    sativa) TERHADAP PROFIL PITA PROTEIN SERUM DAN GAMBARAN

    HISTOPATOLOGI LIMPA TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIBERI

    PAPARAN ASAP ROKOK

    Oleh:

    DITA YULIANINGSIH

    135130100111021

    Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji

    Pada tanggal 15 Agustus 2017

    dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar

    Sarjana Kedokteran Hewan

    Pembimbing I Pembimbing II

    Dra. Anna Roosdiana, M.App.Sc

    drh. Fajar Shodiq Permata, M.Biotech

    NIP. 19580711 199203 2 002 NIP. 19870501 201504 1 001

    Mengetahui,

    Dekan Fakultas Kedokteran Hewan

    Universitas Brawijaya

    Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

    NIP. 19600903 198802 2 001

  • iv

    LEMBAR PERNYATAAN

    Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

    Nama : Dita Yulianingsih

    NIM : 1251301111019

    Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan

    Penulis Skripsi berjudul :

    Pengaruh Preventif Ekstrak Etanol Jintan Hitam (Nigella sativa)

    terhadap Profil Pita Protein Serum dan Gambaran Histopatologi

    Limpa Tikus (Rattus norvegicus) yang Diberi Paparan Asap Rokok

    Dengan ini menyatakan bahwa:

    1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan

    tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di

    isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

    2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil

    jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan

    saya terima.

    Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

    Malang, 15 Agustus 2017

    Yang menyatakan,

    Dita Yulianingsih

    NIM. 135130100111021

  • v

    PENGARUH PREVENTIF EKSTRAK ETANOL JINTAN HITAM (Nigella

    sativa) TERHADAP PROFIL PITA PROTEIN SERUM DAN GAMBARAN

    HISTOPATOLOGI LIMPA TIKUS (Rattus norvegicus) YANG DIBERI

    PAPARAN ASAP ROKOK

    ABSTRAK

    Radikal bebas dalam asap rokok dapat menyebabkan inflamasi sistemik

    dan menimbulkan stress oksidatif yang mempengaruhi limpa sebagai organ

    limfoid sekunder dan produksi protein stress dalam serum darah. Aktivitas radikal

    bebas dapat dihambat oleh antioksidan yang terkandung dalam jintan hitam

    (Nigella sativa). Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh

    preventif pemberian ekstrak etanol jintan hitam terhadap profil pita protein serum

    dan gambaran histopatologi limpa tikus yang diberi paparan asap rokok selama

    21 hari. Penelitian eksperimental ini menggunakan 20 ekor tikus (Rattus

    norvegicus) strain Wistar jantan yang dibagi menjadi lima kelompok, terdiri dari

    kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan 1, 2,

    dan 3 (masing-masing diberi ekstrak etanol jintan hitam dengan variasi dosis 0,6;

    1,2; 2,4 g/kgBB/hari secara berurutan dan dipapar asap rokok kretek). Analisis

    kualitatif deskriptif digunakan untuk menganalisis profil pita protein serum dan

    gambaran histopatologi limpa pada masing-masing perlakuan dan dibandingkan

    dengan kondisi normal. Profil pita protein ditentukan dengan menggunakan

    teknik SDS-PAGE dan limpa tikus dijadikan preparat histopatologi menggunakan

    pengecatan haematoxcylin eosin (HE) untuk diamati perubahan struktur pulpa

    putih dan sel-sel penyusunnya menggunakan mikroskop pada pembesaran 100

    dan 400X. Hasil menunjukkan pemberian ekstrak etanol jintan hitam dapat mencegah kerusakan struktur pulpa putih dan limfosit limpa serta menurunkan

    ekspresi Heat Shock Protein 54 kDa, 69 kDa, dan 94 kDa. Kesimpulan dari

    penelitian ini adalah ekstrak etanol jintan hitam dosis 2.4 g/kgBB dapat digunakan

    sebagai preventif pada tikus yang diberi paparan asap rokok.

    Kata Kunci: Antioksidan, Limpa, Nigella sativa, Protein, Radikal bebas, Rattus

    norvegicus, Serum

  • vi

    THE PREVENTIVE EFFECT OF BLACK SEED (Nigella sativa) ETANOL

    EXTRACT ON SERUM PROTEIN PROFILES AND SPLEEN

    HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS OF RATS (Rattus

    norvegicus) EXPOSED BY CIGARATTE SMOKE

    ABSTRACT

    Free radicals in cigarette smoke can cause systemic inflammation and

    induce oxidative stress that affects the spleen as secondary lymphoid organs and

    the production of stress proteins in blood serum. Free radical activity can be

    inhibited by antioxidants contained in black seed (Nigella sativa). The purpose of

    this study was to assess the effect of black seed extract on serum protein profiles

    and spleen histopathological findings in 21 days nonfilter-tipped cigarette smoke

    exposed rats. An experimental study used 20 male rats (Rattus norvegicus) strain

    Wistar. The rats were divided into five groups, as follows: the negative control

    group, the positive control group, the first, the second, and the third treatment

    groups (exposed to nonfilter-tipped cigarette smoke and treated with black seed

    extract 0.6; 1.2; 2.4 g/kg/day subsequently). Descriptive qualitative analysis is

    used to analyze spleen histopathological findings and serum protein profiles on

    each treatment and compared to normal condition. Protein profile is determined

    using electrophoresis techniques and spleen histopathology preparations made

    using haematoxcylin eosin (HE) staining to observe changes in the structure of

    the red pulp and white pulp using a microscope at 100 and 400X magnification.

    The results showed that the extract ethanol of black seed prevented the damage of

    white pulp structure and spleen lymphocyte and decreased expression of Heat

    Shock Protein 54 kDa, 69 kDa and 94 kDa. The conclusion of this research is

    ethanol extract of black seed dose 2.4 g / kgBB can be used as a preventive in rats

    given exposure to cigarette smoke.

    Keywords: Antioxidant, Free radical, Nigella sativa, Protein, Rattus norvegicus,

    Serum, Spleen

  • vii

    KATA PENGANTAR

    Segala puji bagi Allah SWT yang senantiasa melimpahkan rahmat dan

    hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Skripsi yang berjudul

    “Pengaruh Preventif Ekstrak Etanol Jintan Hitam (Nigella sativa) terhadap

    Profil Pita Protein Serum dan Gambaran Histopatologi Limpa Tikus (Rattus

    norvegicus) yang Diberi Paparan Asap Rokok”. Penelitian ini sebagai salah

    satu syarat memperoleh gelar sarjana Kedokteran Hewan. Tidak lupa penulis

    ucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang membantu terselesaikannya skripsi

    ini:

    1. Dra. Anna Roosdiana, M.App.Sc selaku dosen pembimbing pertama atas

    bimbingan, kesabaran, fasilitas dan waktunya.

    2. drh. Fajar Shodiq Permata, M.Biotech selaku dosen pembimbing kedua

    yang telah membimbing dengan kesabaran, koreksi dan waktunya.

    3. drh. Aulia Firmawati, M.Vet dan drh. Desi Wulansari, M.Vet selaku

    dosen penguji atas koreksi, kritik, saran, kesabaran dan waktu.

    4. Dr. Dra. Herawati, MP selaku dosen pembimbing akademik atas

    bimbingan, saran dan nasehatnya.

    5. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES selaku Dekan Fakultas Kedokteran

    Hewan Universitas Brawijaya.

    6. Keluarga tercinta, orang tua Maria Ningsih dan Daud Fansuri, kakak

    Nirma dan Rian serta kedua adik Devi dan Rafi yang senantiasa

    memberikan semangat dan doa yang tiada henti demi keberhasilan

    penulis.

    7. Teman-teman kelompok penelitian Debora, Desi, Yuyun, dan Walda yang

    telah berjuang bersama dalam penelitian ini yang senantiasa memberikan

    motivasi, bantuan dan semangat.

    8. Keluarga besar kelas 2013-B yang senantiasa memberikan motivasi,

    semangat, inspirasi, bantuan, kebersamaan dan semua hal yang sangat luar

    biasa.

  • viii

    9. Semua pihak yang telah membantu penulis dalam penyelesaian penulisan

    karya tulis ini yang tidak sempat disebutkan.

    Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT membalas segala

    kebaikan yang telah diberikan dan skripsi ini dapat memberikan manfaat dan

    menambah pengetahuan tidak hanya bagi penulis tetapi juga bagi pembaca. Kritik

    dan saran yang membangun dari pembaca sangat penulis harapkan demi

    kesempurnaan penulisan selanjutnya.

    Malang, 15 Agustus 2017

    Penulis

  • ix

    DAFTAR ISI

    Halaman

    HALAMAN JUDUL ................................................................................... ii

    HALAMAN PENGESAHAN .................................................................... iii

    HALAMAN PERNYATAAN ..................................................................... iv

    ABSTRAK .................................................................................................. v

    ABSTRACT ................................................................................................ vi

    KATA PENGANTAR ................................................................................. vii

    DAFTAR ISI .............................................................................................. ix

    DAFTAR TABEL ...................................................................................... xi

    DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xii

    DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xiii

    DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG ..................................................... xiv

    BAB 1. PENDAHULUAN .......................................................................... 1

    1.1 Latar Belakang ............................................................................ 1

    1.2 Rumusan Masalah........................................................................ 3

    1.3 Batasan Masalah .......................................................................... 4

    1.4 Tujuan Penelitian ......................................................................... 5

    1.5 Manfaat Penelitian ....................................................................... 5

    BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ................................................................ 6

    2.1 Radikal Bebas .............................................................................. 6

    2.1.1 Mekanisme Kerja Radikal Bebas .......................................... 6

    2.1.2 Macam Radikal Bebas .......................................................... 8

    2.1.3 Mekanisme Pertahanan Tubuh .............................................. 9

    2.1.4 Sumber Radikal Bebas ......................................................... 10

    2.2 Rokok .......................................................................................... 11

    2.3 Antioksidan ................................................................................ 13

    2.3.1 Mekanisme Kerja Antioksidan ............................................. 14

    2.3.2 Sumber Antioksidan ............................................................. 15

    2.4 Jintan Hitam ................................................................................ 16

    2.4.1 Morfologi Jintan Hitam ........................................................ 17

    2.4.2 Kandungan Jintan Hitam ...................................................... 18

    2.4.3 Manfaat Jintan Hitam ........................................................... 20

    2.5 Limpa .......................................................................................... 21

    2.5.1 Anatomi Limpa .................................................................... 22

    2.5.2 Histologi Limpa ................................................................... 23

    2.5.3 Fungsi Limpa ....................................................................... 26

  • x

    2.5.4 Patologi Limpa ..................................................................... 27

    2.6 Serum .......................................................................................... 28

    2.7 Profil Pita Protein ........................................................................ 29

    2.8 Tikus Putih .................................................................................. 31

    BAB 3. KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN ........ 34

    3.1 Kerangka Konsep ........................................................................ 34

    3.2 Hipotesis Penelitian ..................................................................... 37

    BAB 4. METODELOGI PENELITIAN .................................................... 38

    4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 38

    4.2 Sampel Penelitian ........................................................................ 38

    4.3 Rancangan Penelitian ................................................................... 39

    4.4 Variabel Penelitian....................................................................... 40

    4.5 Alat dan Bahan Penelitian ............................................................ 41

    4.5.1 Alat Penelitian ...................................................................... 41

    4.5.2 Bahan Penelitian .................................................................. 41

    4.6 Tahapan Penelitian....................................................................... 42

    4.7 Prosedur Kerja ............................................................................. 42

    4.7.1 Persiapan Hewan Coba ......................................................... 42

    4.7.2 Persiapan Ekstrak Etanol Jintan Hitam ................................. 43

    4.7.3 Penentuan Dosis Ekstrak Etanol Jintan Hitam ...................... 44

    4.7.4 Perlakuan Hewan Coba ........................................................ 45

    4.7.5 Koleksi Serum Darah ........................................................... 46

    4.7.6 Pengamatan Profil Pita Protein ............................................. 47

    4.7.7 Pembuatan Preparat Histologi Limpa.................................... 50

    4.7.8 Analisis Data ........................................................................ 51

    BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................... 52

    5.1 Profil Pita Protein Serum ............................................................. 52

    5.2 Histopatologi Limpa .................................................................... 58

    BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................... 66

    6.1 Kesimpulan ................................................................................. 66

    6.2 Saran .......................................................................................... 66

    DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 67

    LAMPIRAN ................................................................................................ 74

  • xi

    DAFTAR TABEL

    Tabel Halaman

    2.1 Sumber radikal bebas ............................................................................. 11

    2.2 Data biologis tikus .................................................................................. 33

    4.1 Rancangan kelompok penelitian .............................................................. 40

    5.1 Profil pita protein serum .......................................................................... 53

  • xii

    DAFTAR GAMBAR

    Gambar Halaman

    2.1 Jintan hitam ............................................................................................ 17

    2.2 Limpa normal secara mikroskopik ........................................................... 24

    2.3 Tikus putih ............................................................................................. 32

    3.1 Kerangka konsep penelitian .................................................................... 34

    5.1 Profil pita protein serum .......................................................................... 52

    5.2 Histopatologi limpa ................................................................................. 58

  • xiii

    DAFTAR LAMPIRAN

    Lampiran Halaman

    1. Sertifikat Laik Etik ................................................................................. 75

    2. Kerangka Operasional ............................................................................ 76

    3. Pembuatan Ekstrak Etanol Jintan Hitam ................................................. 77

    4. Hasil Analisa LCMS Ekstrak Etanol Jintan Hitam .................................. 78

    5. Perhitungan Dosis Ekstrak Etanol Jintan Hitam ..................................... 79

    6. Komposisi Larutan dalam SDS-PAGE ................................................... 81

    7. Penentuan Profil Pita Protein dengan SDS-PAGE .................................. 82

    8. Perhitungan Berat Molekul Protein ........................................................ 83

    9. Pembuatan Histopatologi Limpa ............................................................ 86

    10. Dokumentasi Penelitian......................................................................... 88

  • xiv

    DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG

    Simbol/singkatan

    WHO

    CRP

    HSP

    HE

    PUFA

    ROS

    PAH

    DNA

    SOD

    CO

    RES

    APC

    SDS-PAGE

    HSP

    ATP

    ADP

    PALS

    RNS

    MDA

    Keterangan

    World Health Organization

    C-Rective Protein

    Heat Shock Protein

    Hematoxylin Eosin

    Polyunsaturated Fatty Acids

    Reactive Oxygen Species

    Polycyclic Aromatic Hydrocarbons

    Deoxyribonucleic Acid

    Superoxide Dismutase

    Carbon Monoxide

    Reticuloendothelial System

    Antigen Presenting Cell

    Sodium Dodecyl Sulfate

    Polyacrylamide Gel Electrophoresis

    Heat Shock Protein

    Adenosine Triphosphate

    Adenosine Difosfat

    Periarteriolar Lymphatic Sheath

    Reactive Nitrogen Species

    Malondialdehyde

  • 1

    BAB 1 PENDAHULUAN

    1.1 Latar Belakang

    Berdasarkan data yang dihimpun oleh Kemenkes RI (2015), prevalensi

    perokok di Indonesia sebesar 34,8%, dan sebanyak 67% laki-laki di Indonesia

    adalah perokok (angka terbesar didunia), sedangkan untuk perokok wanita pada

    tahun 2013 diketahui sebesar 6,7%. Ruangan yang di dalamnya terdapat orang

    yang merokok akan mengganggu pada lebih banyak orang yang bukan perokok

    yang berada dalam ruangan tersebut, karena asap yang dihasilkan terbanyak

    merupakan asap yang dihembuskan ke lingkungan (Widodo, 2006). Hewan

    peliharaan dapat terganggu karena menghirup asap yang dihasilkan dari pemilik

    yang merokok. Menurut Bertone et al (2002) kucing dalam lingkungan perokok

    memiliki resiko 2,4 kali lebih besar untuk terserang malignant lymphoma dalam

    rentang waktu dua tahun, bahkan resiko dapat meningkat menjadi 3,2 kali lipat

    dalam rentang waktu lima tahun atau lebih.

    Setiap batang rokok yang dibakar dapat mengeluarkan 4000 bahan kimia

    beracun yang membahayakan dan dapat mengakibatkan kematian, 50 senyawa

    diantaranya sebagai zat karsinogenik (Triswanto, 2007). Senyawa toksik utama

    pada rokok yang paling berbahaya adalah nikotin, karbon monoksida dan tar

    (Khoirudin, 2009) yang dapat menjadi radikal bebas dalam tubuh.

    Komponen gas dan partikulat asap rokok pertama berinteraksi dengan

    sistem kekebalan pada permukaan mukosa yang melapisi rongga mulut, sinus, dan

    saluran udara (Huang et al., 2005). ROS merusak sel epitel yang melapisi saluran

  • 2

    udara dengan menginduksi peroksidasi lipid dan unsur membran sel lainnya,

    mengaktifkan jalur oxidative-sensitive cellular dan menginduksi kerusakan DNA

    (Valavanidis et al., 2009). Komponen asap rokok (terutama ROS) mengaktifkan

    kaskade sinyal intraselular sel epitel yang menyebabkan aktivasi gen inflamasi

    [misalnya, interleukin-8 atau IL-8 dan tumor necrosis factor-alpha (TNFα)]

    (Churg et al., 2002; Chung, 2005). Sekresi mediator inflamasi ini mendorong

    perekrutan sel-sel imunitas kronis dan inflamasi (Lee et al., 2012). Sel inflamasi

    tersebut meliputi makrofag dan neutrofil. Limpa berperan dalam mengatur reaksi

    sistem kekebalan tubuh terhadap sel-sel inflamasi tersebut (Diniz et al., 2013).

    Limpa adalah organ limfoid terbesar dalam tubuh dan merupakan salah

    satu organ yang terlibat dalam filtrasi darah sehingga limpa merupakan organ

    penting pada pertahanan terhadap antigen dalam darah. Sebagaimana halnya

    organ limfoid sekunder lainnya, limpa adalah tempat produksi antibodi dan

    limfosit aktif yang dihantarkan ke dalam darah (Putri, 2014). Partikel yang

    terkandung dalam asap rokok akan dikenali sebagai antigen dalam darah, dengan

    demikian limpa akan menjalankan fungsinya sebagai organ yang berfungsi dalam

    sistem pertahanan tubuh terhadap antigen yang berasal dari asap rokok.

    Asap rokok sebagai radikal bebas eksogen dikenali sebagai stress atau

    gangguan dalam tubuh. Sel mengubah pola sintesis protein dalam menanggapi

    stress lingkungan dengan cara menurunkan sintesis protein normal dan

    mensintesis protein spesifik yang disebut Heat Shock Protein (HSP) atau protein

    stres, sehingga protein tersebut dalam serum dapat digunakan sebagai marker

    adanya gangguan atau kerusakan jaringan dalam tubuh akibat radikal bebas.

  • 3

    Radikal bebas dapat dinetralisir atau dihancurkan oleh senyawa

    antioksidan (Sizer and Whitney, 2000). Thymoquinone merupakan kandungan

    utama yang berperan sebagai antioksidan dalam ekstrak jintan hitam. Efek

    farmakologis dari thymoquinone telah banyak diteliti. Banyak peneliti seperti

    Ismail et al., (2010), Khattak et al., (2008), dan Thippeswamy dan Naidu (2005)

    yang telah melaporkan bahwa Nigella sativa memiliki aktivitas antioksidan yang

    menjanjikan melalui penurunan kekuatan dan inhibisi dari peroksidasi. Jintan

    hitam juga sudah terbukti memiliki fungsi lain seperti aktivitas anti kanker

    (Salomi et al., 1992), aktivitas anti diabetes (Al-Awadi dan Gumma, 1987),

    aktivitas antimikroba (Topozada et al., 1965), aktivitas antiparasit (Mahmoud et

    al., 2002; Elswenawy et al., 2008), antimalaria (Abdulelah et al., 2007; El-Hadi et

    al., 2010), aktivitas analgesik dan anti-inflamasi (Houghton et al., 1995), aktivitas

    anti-ulcer (Rajkapoor et al., 1996), dan anti histamin (Dakhakhany et al., 1982).

    1.2 Rumusan Masalah

    Berdasarkan latar belakang di atas, rumusan masalah dalam penelitian ini

    adalah sebagai berikut:

    1. Apakah terdapat pengaruh ekstrak etanol jintan hitam (Nigella sativa)

    terhadap perubahan profil pita protein serum darah tikus (Rattus

    norvegicus) hasil paparan asap rokok?

    2. Apakah ekstrak etanol jintan hitam (Nigella sativa) dapat menghambat

    kerusakan histologi limpa pada tikus (Rattus norvegicus) hasil paparan

    asap rokok?

  • 4

    1.3 Batasan Masalah

    Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini

    dibatasi pada:

    1. Hewan model yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus)

    jantan yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi Fakultas

    Kedokteran Universitas Brawijaya dengan umur 8-12 minggu dan

    berat badan 150-200 g. Penggunaan tikus telah mendapat persetujuan

    dari Komisi Etik Penelitian UB.

    2. Jintan hitam yang digunakan merupakan jintan hitam yang diimpor

    dari India. Ekstraksi jintan hitam dilakukan dengan cara maserasi

    menggunakan etanol 96%.

    3. Ekstrak etanol jintan hitam diberikan secara per oral dengan sonde

    selama 21 hari.

    4. Dosis preventif ekstrak etanol jintan hitam yang diberikan yaitu 0,6

    g/KgBB/hari (P1), 1,2 g/KgBB/hari (P2) dan 2,4 g/KgBB/hari (P3)

    selama 21 hari.

    5. Pemaparan asap rokok dengan menggunakan rokok kretek non filter

    merek Trumbus melalui smooking pump sebanyak 2

    batang/hari/kandang dalam kurun waktu 21 hari kepada setiap

    kelompok tikus pelakuan I, II, III, dan kontol positif. Pemaparan

    dilakukan dalam kandang transparan berbahan plastik.

  • 5

    1.4 Tujuan Penelitian

    Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka tujuan dari

    penelitian ini adalah:

    1. Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol jintan hitam (Nigella

    sativa) terhadap profil pita protein serum tikus (Rattus norvegicus)

    yang diberi paparan asap rokok.

    2. Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol jintan hitam (Nigella

    sativa) terhadap gambaran histopatologi limpa tikus (Rattus

    norvegicus) yang diberi paparan asap rokok.

    1.5 Manfaat Penelitian

    Manfaat yang dapat diperoleh dari penelitian ini yakni:

    1. Manfaat Khusus

    a. Menambah wawasan dan keterampilan penelitian dan lab skill.

    b. Memiliki pioner produk antioksidan terhadap paparan asap rokok.

    2. Manfaat Umum

    a. Memberikan informasi tentang potensi ekstrak etanol jintan hitam

    sebagai antioksidan dari paparan asap rokok.

    b. Alternatif herbal sebagai preventif gangguan sistemik akibat

    paparan asap rokok.

    c. Sebagai bahan kajian pustaka untuk mengetahui pengaruh

    pemberian ekstrak etanol jintan hitam terhadap perubahan profil

    pita protein serum dan pencegahan kerusakan histologi limpa pada

    hewan model tikus (Rattus norvegicus) hasil paparan asap rokok.

  • 6

    BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

    2.1 Radikal Bebas

    Radikal bebas (Latin: radicalis) merupakan molekul yang memiliki

    sekelompok atom dengan elektron yang tidak berpasangan. Radikal bebas adalah

    bentuk radikal yang sangat reaktif dan mempunyai waktu paruh yang sangat

    pendek. Jika radikal bebas tidak diinaktivasi, reaktivitasnya dapat merusak seluruh

    tipe makromolekul seluler, termasuk karbohidrat, protein, lipid dan asam nukleat

    (Dawn dkk., 2000). Menurut Winarti (2010), radikal bebas adalah atom, molekul

    atau senyawa yang dapat berdiri sendiri yang mempunyai elektron tidak

    berpasangan, oleh karena itu bersifat sangat reaktif dan tidak stabil. Elektron yang

    tidak berpasangan selalu berusaha untuk mencari pasangan baru, sehingga mudah

    bereaksi dengan zat lain (protein, lemak maupun DNA) dalam tubuh.

    2.1.1 Mekanisme Kerja Radikal Bebas

    Radikal bebas dapat terbentuk melalui mekanisme baik yang

    bersifat endogen maupun eksogen. Reaksi berikutnya adalah peroksidasi

    lipid membran dan sitosol yang mengakibatkan terjadinya serangkaian

    reduksi asam lemak sehingga terjadi kerusakan membran dan organel sel

    (Dawn dkk., 2000). Radikal bebas dapat terbentuk secara in-vivo dan in-

    vitro yaitu dengan pemecahan satu molekul normal secara homolitik

    menjadi dua, kehilangan satu elektron dari molekul normal dan

    penambahan elektron pada molekul normal (Muhammad, 2009).

  • 7

    Radikal bebas bersifat sangat reaktif sehingga dapat menimbulkan

    perubahan kimiawi dan merusak berbagai komponen sel hidup seperti

    protein, lipid dan nukleutida. Pada protein, radikal bebas dapat

    menyebabkan fragmentasi sehingga mempercepat terjadinya proteolisis,

    Pada lipid dapat menyebabkan reaksi peroksidasi yang akan mencetus

    proses otokatalik dan pada nukleutida dapat menyebabkan terjadinya

    perubahan struktur DNA dan RNA sehingga terjadi mutasi atau

    sitotoksisitas. Kerusakan sel oleh radikal bebas didahului oleh kerusakan

    membran sel dengan proses sebagai berikut: 1) Terjadi ikatan kovalen

    antara radikal bebas dengan komponen membran, sehingga terjadi

    perubahan struktur dari fungsi reseptor; 2) Oksidasi gugus tiol pada

    komponen membran oleh radikal bebas yang menyebabkan proses transpor

    lintas membran terganggu; 3) Reaksi peroksidasi lipid dan kolesterol

    membran yang mengandung asam lemak tidak jenuh majemuk (PUFA).

    Hasil peroksidasi lipid membran oleh radikal bebas berpengaruh langsung

    terhadap kerusakan membran sel antara lain struktur dan fungsi dalam

    keadaan yang lebih ekstrim yang akhirnya akan menyebabkan kematian

    sel (Gitawati, 1995).

    Menurut Kumalaningsih (2007), oksidasi lemak terjadi melalui

    beberapa tahap yaitu tahap inisiasi, dimulai dengan pembentukan radikal

    asam lemak yaitu suatu senyawa turunan asam lemak yang bersifat tidak

    stabil dan sangat reaktif akibat hilangnya satu atom hidrogen, dengan

    reaksi sebagai berikut:

  • 8

    ROOH + logam (n)+

    ROO˙ + logam (n)+

    + H+

    X˙ + RH R˙ + XH

    Selanjutnya tahap propagasi yaitu radikal asam lemak akan

    bereaksi dengan oksigen membentuk radikal peroksil dengan reaksi

    sebagai berikut:

    R˙ + O2 ROO˙

    ROO˙ + RH ROOH + R˙

    Tahap terminasi yaitu radikal peroksil yang telah terbentuk

    kemudian menyerang asam lemak sehingga menghasilkan hidroperoksida

    dan radikal asam lemak baru, dengan reaksi sebagai berikut:

    ROO˙ + ROO˙ ROOR + O2

    ROO˙ + R˙ ROO

    R˙ + R˙ RR

    Prekursor molekul untuk memulai proses ini umumnya berupa

    produk hidroperoksida (ROOH), maka oksidasi lemak merupakan

    rangkaian reaksi bercabang dengan berbagai efek yang memiliki potensi

    untuk merusak.

    2.1.2 Macam Radikal Bebas

    Radikal bebas terpenting dalam tubuh adalah senyawa

    pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif yang terdiri atas

    kelompok radikal bebas dan kelompok nonradikal yang disebut ROS

    (reactive oxygen species), yang terdapat dalam bentuk singlet oxygen

    (1O2

    *), anion superoksida (O2

    *), radikal hidroksil (OH

    *), nitrogen oksida

  • 9

    (NO*), peroksinitrit (ONOO

    -), asam hipoklorus (HOCl), hidrogen

    peroksida (H2O2), radikal alkoxyl (LO*), dan radikal peroksil (LO2

    *).

    Radikal bebas yang mengandung karbon (CCL3-

    ) yang berasal dari

    oksidasi radikal molekul organik. Radikal yang mengandung hidrogen

    hasil dari penyerangan atom H (H-). Bentuk lain adalah radikal yang

    mengandung sulfur yang diproduksi pada oksidasi 4-glutation

    menghasilkan radikal thiyl (R-S-). Radikal yang mengandung nitrogen

    juga ditemukan, misalnya radikal fenyldiazine (Halliwell dan Whiteman,

    2004; Proctor, 1984 dan Araujo et., al, 1998).

    2.1.3 Mekanisme Pertahanan Tubuh

    Menurut Winarsi (2007), tubuh memiliki sistem antioksidan untuk

    menangkal reaktivitas radikal bebas, yang secara kontinu dibentuk sendiri

    oleh tubuh. Bila jumlah senyawa oksigen reaktif ini melebihi jumlah

    antioksidan dalam tubuh, kelebihannya akan menyerang komponen lipid,

    protein, maupun DNA sehingga mengakibatkan kerusakan-kerusakan yang

    disebut stress oksidatif. Namun demikian, reaktivitas radikal bebas dapat

    dihambat melalui tiga cara berikut:

    1. Mencegah atau menghambat pembentukan radikal bebas baru.

    2. Menginaktivasi atau menangkap radikal dan memotong

    propagasi (pemutusan rantai).

    3. Memperbaiki (repair) kerusakan oleh radikal.

    Pertahanan yang bemacam-macam saling melengkapi satu sama

    lain karena bekerja pada oksidan yang berbeda atau dalam bagian seluler

  • 10

    yang berbeda. Suatu garis pertahanan yang penting adalah sistem enzim

    yang bersifat protektif atas radikal bebas seperti superoksida dismutase R

    (SOD), katalase, glutathion synthetase, glucose-6-phosphate

    dehydrogenase dan glutathion peroxidase (Dawn dkk., 2000).

    2.1.4 Sumber Radikal Bebas

    Sumber radikal bebas bisa berasal dari dalam tubuh (endogen), bisa

    pula berasal dari luar tubuh (eksogen). Secara endogen, sebagai respon

    normal dari rantai peristiwa biokimia dalam tubuh, radikal bebas yang

    terbentuk dan berpengaruh di dalam sel (intrasel) maupun ekstrasel.

    Radikal endogen terbentuk sebagai sisa proses metabolisme (proses

    pembakaran) protein, karbohidrat, dan lemak pada mitokondria, proses

    inflamasi atau peradangan, reaksi antara besi logam transisi dalam tubuh,

    fagosit, xantin oksidase, peroksisom, maupun pada kondisi iskemia. Secara

    endogen, radikal bebas dapat timbul melalui beberapa mekanisme yaitu:

    oto-oksidasi, aktivitas oksidasi (misalnya: siklooksigenase, lipoksigenase,

    dehidrogenase dan peroksidase), dan sistem transpor elektron (Sayuti dan

    Yenrina, 2015).

    Radikal bebas dapat berasal dari pencemaran lingkungan, asap

    kendaraan, bahan tambahan makanan dan rokok. Secara eksogen, sumber

    radikal bebas berasal dari bermacam-macam sumber diantaranya adalah

    polutan, berbagai macam makanan dan minuman, radiasi, ozon dan

    pestisida. Bagi perokok menghisap radikal bebas dari asap rokok sehingga

    mempunyai resiko yang tinggi mengidap berbagai macam penyakit. Begitu

  • 11

    pula dengan mereka yang berada dalam lingkungan bahan kimia yang

    bersifat volatile seperti bensin, cairan pembersih atau lingkungan yang

    udaranya terkontaminasi oleh asap kendaraan bermotor (Sayuti dan

    Yenrina, 2015).

    Tabel 2.1 Sumber radikal bebas (Dawn dkk., 2000)

    Sumber Internal Sumber Eksternal

    Mitokondria

    Fagosit

    Xantine oksidase

    Reaksi yang melibatkan besi dan

    logam transisi lainnya

    Arachidonat pathway

    Peroksisom

    Olah raga

    Peradangan

    Iskemia/reperfusi

    Rokok

    Polutan lingkungan

    Radiasi

    Obat-obatan tertentu, pestisida dan

    anestesi dan larutan industri

    Ozon

    2.2 Rokok

    Rokok adalah silinder dari kertas berukuran panjang antara 70 hingga 120

    mm dengan diameter sekitar 10 mm yang berisi daun-daun tembakau yang telah

    di cacah (Ambarwati dkk., 2014). Dalam proses merokok terjadi dua reaksi yaitu

    reaksi pembakaran dan reaksi pirolisa. Reaksi pembakaran dengan oksigen akan

  • 12

    membentuk senyawa CO2, H2O2, NO, So, dan Co. Reaksi pirolisa menyebabkan

    pemecahan struktur kimia rokok menjadi banyak senyawa kimia yang strukturnya

    sangat kompleks. Dilaporkan sekitar 100 senyawa tersebut bersifat toksik seperti

    bahan karsinogen, tar, nikotin, nitrosamin, karbon monoksida, senyawa PAH

    (polynuclear aromatic hydrogen), fenol, karbonil, klorin dioksin, dan furan

    (Sukmaningsih, 2009). Bahan yang termasuk ke dalam tiga komponen toksik

    utama dalam asap rokok adalah nikotin, tar dan karbon monoksida (CO).

    Nikotin adalah bahan dasar yang dapat menimbulkan sifat ketergantungan

    fisik dan psikis bagi perokok aktif atau disebut dengan kecanduan. Nikotin yang

    terkandung dalam rokok adalah sebesar 0,5-3 nanogram dan semuanya diserap

    sehingga dalam cairan darah didalam cairan darah ada sekitar 40-50 nanogram

    nikotin setiap 1 ml. Nikotin diserap ke dalam sistem peredaran darah melalui paru

    yang selanjutnya disirkulasikan ke otak dalam waktu yang sangat cepat. Nikotin

    bereaksi langsung ke jantung dengan merubah kecepatan denyut dan tekanan

    darah. Selain masuk dalam aliran darah, pada paru-paru nikotin akan menghambat

    aktivitas silia (Muhammad, 2009; Sukmaningsih, 2009).

    Tar adalah sejenis cairan kental berwarna coklat tua atau hitam yang

    merupakan substansi hidrokarbon yang bersifat lengket dan menempel pada paru-

    paru. Kadar tar dalam rokok antara 0,5-35 mg/batang. Tar merupakan suatu zat

    karsinogen yang dapat menimbulkan kanker pada saluran pernapasan dan paru-

    paru yang terdiri dari dua fasa yaitu fasa tar dan fasa gas. Pada fasa tar merupakan

    pembentuk radikal bebas seperti quinon, semiquinon dan hydroquinon dalam

    bentuk matriks polimer. Pada fasa gas mengandung nitrit oxida dan nitrit

  • 13

    peroksida yang dapat mengubah oksigen menjadi radikal bebas superoksida dan

    selanjutnya menjadi radikal bebas hidroksil yang sangat merusak (Muhammad,

    2009).

    Karbon monoksida merupakan produk pembakaran karbon yang tidak

    sempurna dari unsur arang atau karbon. Gas CO yang dihasilkan sebatang rokok

    dapat mencapai 3-6%. Gas ini mempunyai kemampuan mengikat hemoglobin

    yang terdapat dalam sel darah merah, lebih kuat dibandingkan oksigen. Sehingga

    sel tubuh akan kekurangan oksigen karena darah yang beredar miskin akan

    oksigen dan kaya akan karbon monoksida. Sel tubuh yang kekurangan oksigen

    akan melakukan spasme, yaitu menciutkan pembuluh darah. Bila hal ini terus

    berlangsung terus-menerus maka pembuluh darah akan mudah rusak. Rokok juga

    mengandung sejumlah bahan reaktif molekuler kimia seperti reaktif oksigen dan

    zat radikal. Pada asap rokok terdapat beberapa jenis bahan pembentuk radikal

    bebas diantaranya adalah aldehida, epoxida, peroksida, quinon, semiquinon dan

    hidroquinon (Church dan Pryor, 1985 dan Droge, 2002 dalam Muhammad 2009).

    2.3 Antioksidan

    Tubuh manusia atau pun hewan dalam keadaan normal mempunyai sistem

    antioksidan yang dapat menangkal aksi radikal bebas, yaitu sistem proses

    enzimatis dan nonenzimatis. Dalam pengertian kimia, antioksidan adalah

    senyawa-senyawa pemberi elektron. Dalam pengertian klasik, istilah antioksidan

    menunjukkan senyawa yang memiliki berat molekul rendah yang dapat

    menginaktivasi reaksi rantai dari peroksidasi lipid dengan mencegah terbentuknya

    radikal peroksida. Dalam arti biologi dan kedokteran, istilah tersebut digunakan

  • 14

    dalam pengertian yang luas, meliputi enzim yang dapat mendetoksifikasi

    senyawa-senyawa oksigen reaktif (Kartikawati, 1999).

    Antioksidan adalah senyawa yang mempunyai struktur molekul yang dapat

    memberikan elektronnya dengan cuma-cuma kepada molekul radikal bebas tanpa

    mengganggu dan memutuskan reaksi berantai dari radikal bebas. Antioksidan

    dapat menetralisir atau menghancurkan radikal bebas dengan cara berinteraksi

    langsung dengan oksidan atau radikal bebas, mencegah pembentukan jenis

    oksigen reaktif, mengubah oksigen reaktif menjadi kurang toksik dan

    memperbaiki kerusakan yang timbul. Antioksidan bekerja sebagai sebuah sistem

    untuk menghentikan kerusakan akibat radikal bebas (Sizer and Whitney, 2000).

    2.3.1 Mekanisme Kerja Antioksidan

    Menurut Sayuti dan Yenrina (2015), mekanisme antioksidan dalam

    menghambat oksidasi atau menghentikan reaksi berantai pada radikal

    bebas dari lemak yang teroksidasi, dapat disebabkan oleh empat macam

    mekanisme reaksi yaitu:

    a. Pelepasan hidrogen dari antioksidan.

    b. Pelepasan elektron dari antioksidan.

    c. Adisi asam lemak ke cincin aromatik pada antioksidan.

    d. Pembentuk senyawa kompleks antara lemak dan cincin

    aromatik dari antioksidan.

    Prinsip kerja dari antioksidan dalam menghambat otooksidan pada

    lemak meliputi: ikatan rangkap pada asam lemak yang tidak jenuh akan

    dioksidasi oleh oksigen bebas di udara. Kemudian radikal bebas yang

  • 15

    terbentuk akan beraksi dengan oksigen sehingga akan menghasilkan

    peroksida aktif.

    RH + O2 R* + OOH

    Asam lemak Oksigen Radikal bebas tidak jenuh

    R* + O2 ROO*

    Radikal bebas Oksigen Peroksida aktif

    Apabila dalam suatu asam lemak yang terdapat dalam minyak tidak

    mengandung antioksidan, maka peroksida aktif akan bereaksi dengan

    ikatan rangkap lemak. Apabila ditambah suatu antioksidan, maka

    peroksida aktif akan bereaksi dengan antioksidan tersebut. Sehingga

    pembentukan radikal bebas dapat dihentikan dengan penambahan suatu

    antioksidan (Sayuti dan Yenrina, 2015).

    2.3.2 Sumber Antioksidan

    Menurut Kumalaningsih (2007), berdasarkan penghasilnya

    (penyedia), maka antioksidan dapat dibagi menjadi tiga janis yaitu: 1)

    antioksidan yang dibuat oleh tubuh sendiri yang disebut antioksidan

    endogen yang berupa enzim antara lain; superoksida dismutase (SOD),

    glutathione peroxidase (GSH Px) dan katalase; 2) antioksidan alami yang

    diperoleh dari tumbuhan atau hewan seperti tokoferol, vitamin C,

    betakaroten, flavonoid dan senyawa fenolik; dan 3) antioksidan sintetik

    yang dibuat dari bahan-bahan kimia seperti butylated hroayanisole (BHA),

    butil hidroksi toluen (BHT), tert butil hidroksi quinon (TBHQ), dan propil

    galat (PG)

  • 16

    Antioksidan non-enzimatis banyak ditemukan dalam sayuran

    maupun buah-buahan, biji-bijian serta kacang-kacangan (Winarsi, 2007).

    Senyawa antioksidan alami tumbuhan umumnya adalah senyawa fenolik

    atau polifenolik yang dapat berupa golongan flavonoid, turunan asam

    sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik polifungsional.

    Golongan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan meliputi flavon,

    flavonol, isoflavon, katekin, flavonol dan kalkon. Sementara turunan asam

    sinamat meliputi asam kafeat, asam ferulat, asam klorogenat, dan lain-lain

    (Gordon, 1990 dalam Pazil, 2009). Senyawa antioksidan lain seperti

    thymoquinone, nigellone carvacrol, t-anethol, dan 4-terpineol yang

    terkandung dalam jintan hitam mempunyai efek antioksidan yang kuat dan

    distribusinya luas ke jaringan (Burits and Bucar, 2000).

    2.4 Jintan Hitam

    Jintan hitam atau habbatus sauda memiliki nama latin Nigella sativa, yang

    merupakan salah satu tanaman obat yang telah dikenal ribuan tahun yang lalu dan

    telah digunakan secara luas oleh masyarakat India, Pakistan, Mesir, dan negara-

    negara timur tengah lainnya untuk mengobati berbagai macam penyakit. Jintan

    hitam sering digunakan oleh masyarakat sebagai anti-inflamasi, antikanker,

    antiparasit, antibakteri, dan antioksidan (Musfiroh dkk., 2012).

  • 17

    Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Hussain, 2016)

    Menurut Tjitrosoepomo (2007), klasifikasi jintan hitam (Nigella sativa)

    adalah sebagai berikut:

    Divisi : Spermatophyta

    Kelas : Magnoliopsida

    Subkelas : Magnoliidae

    Ordo : Ranunculales

    Famili : Ranunculaceae

    Genus : Nigella

    Spesies : Nigella sativa Linn.

    2.4.1 Morfologi Jintan Hitam

    Jintan hitam merupakan tanaman bunga Fennel dari keluarga

    Buttercup (Ranunculaceae). Tanaman ini termasuk tanaman setahun,

    berbatang tegak dan biasanya berusuk serta berbulu kasar yang kadang-

    kadang rapat atau jarang. Bulu yang terdapat pada batang ini biasanya

    berkelenjar. Daun jintan hitam berbentuk lanset dan bergaris dengan

    panjang 1,5-2 cm, ujungnya meruncing, serta memiliki tiga tulang daun

  • 18

    yang berbulu. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas menguncup,

    sedangkan daun pembalut bunga relatif kecil. Bunganya memiliki lima

    kelopak bunga dengan bentuk bulat telur, ujungnya agak meruncing, serta

    pangkal mengecil membentuk sudut yang pendek dan besar. Pada

    umumnya, terdapat delapan mahkota bunga dengan bentuk agak

    memanjang, lebih kecil daripada kelopak bunga (Yulianti dan Junaedi,

    2006).

    Jintan hitam (Nigella sativa) dapat dijadikan obat tradisional. Salah

    satu bagian tanaman yang biasa dimanfaatkan adalah bijinya. Biji jintan

    hitam kecil dan pendek (panjangnya hanya 1-3 mm), berwarna hitam

    berbentuk trigonal (bersudut tiga tak beraturan), berkelenjar dan tampak

    seperti batu api jika diamati dengan mikroskop. Bijian ini berada dalam

    buah yang berbentuk bulat telur dan agak bulat (Yulianti dan Junaedi,

    2006).

    2.4.2 Kandungan Jintan Hitam

    Penelitian ekstensif telah dilakukan untuk mengidentifikasi

    komposisi biji jintan hitam, bahan yang ditemukan dari biji N. sativa

    meliputi: fixed oil, protein, alkaloid, saponin dan minyak esensial. Fixed

    oil (32-40%) mengandung: asam lemak tak jenuh yang meliputi:

    arachidonic, eicosadienoic, linoleic, linolenic, oleat, almitoleic, palmitic,

    stearic dan myristic acid serta beta-sitosterol, cycloeucalenol,

    cycloartenol, sterol ester dan sterol glukosida. Minyak esensial (0,4-

    0,45%) mengandung asam lemak jenuh yang meliputi: nigellone yang

  • 19

    merupakan satu-satunya komponen fraksi karbonil dari minyak,

    thymoquinone (TQ), thymohydroquinone (THQ), dithymoquinone, thymol,

    carvacrol, α dan β-pinene, d-limonene, d-citronellol, minyak esensial dari

    biji jintan juga mengandung: p-cymene, t-anethole, 4-terpineol dan

    longifoline. Kandungan utama jintan hitam thymoquinone (TQ),

    dithymoquinone (DTQ), thymohidroquinone (THQ), dan thymol (THY)

    berperan sebagai antioksidan. Nigellon dan glutathion dalam jintan hitam

    berfungsi sebagai protektor atau melindungi tubuh dari berbagai bahaya

    zat-zat asing (xenobiotics) (Tembhurne et al., 2014; Ahmad et al., 2013;

    Staphylakis and Gegiou 1986; Enomoto et al., 2001; Musfiroh dkk., 2012).

    Unsur-unsur kimia lain yang rerkandung dalam jintan hitam

    meliputi: air, protein, lemak, kalsium, vitamin A, vitamin B2, asam

    askorbat, niasin, fiber, dan abu. Selain unsur-unsur kimia diatas, Jintan

    hitam mengandung minyak esensial, 15 asam amino (alanin, arginin,

    isoleusin, lisin, triptofan, tirosin, treonin, asparagin, sistin, glisin, asam

    glutamat, metionin, dan prolin), zat besi, natrium, kalium, tiamin,

    riboflavin, piridoksin, niasin, tembaga, dan zinc. Senyawa flavonoid yang

    terkandung dalam biji jintan hitam meliputi quercetin, kaempferol 3-

    glucosyl (1-2) galactosyl (1-2) glusoside, dan quercitin-3-(6-ferulolyl

    glucosyl) (1-2) galactosyl (1 -2) glucoside (Musfiroh dkk., 2012;

    Tembhurne et al., 2014).

  • 20

    2.4.3 Manfaat Jintan Hitam

    Manfaat jintan hitam bagi kesehatan menurut Surya (2007) adalah

    sebagai berikut:

    1. Anti radang

    Kandungan jintan hitam yang berfungsi sebagai anti radang

    yaitu thymoquinone. Senyawa ini merupakan antioksidan yang

    ampuh dan efektif menghilangkan racun dalam tubuh.

    Thymoquinone berperan sebagai penghalang jalur

    lipooksigenase dan siklo-oksigenase sehingga dapat

    menghambat terjadinya radang.

    2. Menguatkan sistem kekebalan

    Jintan hitam dapat meningkatkan jumlah sel T yang baik untuk

    meningkatkan sel-sel pembunuh alami sehingga dapat

    meningkatkan sistem kekebalan tubuh.

    3. Meningkatkan daya ingat, konsentrasi, dan kewaspadaan

    Dengan kandungan asam linoleat (omega 6) dan asam linolenat

    (omega 3) jintan hitam merupakan nutrisi bagi sel otak yang

    berguna untuk meningkatkan daya ingat dan kecerdasan.

    4. Meningkatkan bioaktivitas hormon

    Hormon adalah zat aktif yang dihasilkan oleh kelenjar

    endokrin, yang masuk dalam peredaran darah. Salah satu

    kandungan jintan hitam adalah setrol yang berfungsi

    mensintesa dan sebagai bioaktivitas hormon.

  • 21

    5. Menetralkan racun dalam tubuh

    Racun dapat mengganggu metabolisme dan menurunkan

    fungsi organ penting seperti hati, paru-paru dan otak. Jintan

    hitam mengandung saponin yang dapat menetralkan dan

    membersihkan racun dalam tubuh.

    6. Anti histamin

    Histamin adalah sebuah zat yang dilepaskan oleh jaringan

    tubuh yang memberikan reaksi alergi seperti asma. Penelitian

    Nirmal Chakravaty MD pada tahun 1993 membuktikan bahwa

    minyak nigellone yang berasal dari minyak volatile jintan

    hitam dapat memberi efek suppresif, dapat menghambat

    proteinkinase C yang merupakan sebuah zat yang memicu

    pelepasan histamin.

    2.5 Limpa

    Sistem jaringan limfoid dapat diklasifikasikan ke dalam dua kelompok

    yaitu organ limfoid primer dan sekunder. Organ limfoid primer merupakan organ

    yang berfungsi mengatur produksi dan diferensiasi limfosit dan tempat pengaturan

    perkembangan limfosit. Sedangkan organ limfoid sekunder merupakan organ

    limfoid yang responsif terhadap stimulasi antigenik atau tempat interaksi limfosit-

    antigen dan pengontrolannya (Tizard, 1988 dalam Aziza 2010). Tizard dan

    Guyton (1997) mengelompokkan limpa sebagai organ limfoid sekunder.

    Limpa adalah organ terbesar yang menghasilkan antibodi dan limfosit

    yang berfuungsi sebagai sistem pertahanan dari antigen dalam darah. Sistem

  • 22

    pertahanan tubuh terbagi dua, yaitu: sistem imun non spesifik dan sistem imun

    spesifik. Sistem imun non spesifik merupakan sistem pertahanan tubuh terhadap

    berbagai jenis antigen baru yang belum diketahui. Komponen yang berperan

    dalam sistem imun non spesifik yaitu: interferon, lisozim, makrofag, leukosit, sel

    dendritik dan sel NK (necrosis killer cell). Sistem imun spesifik adalah sistem

    pertahanan tubuh yang bertindak sebagai respon yang ditimbulkan karena adanya

    antigen sudah pernah terpapar sebelumnya dan sudah dikenali. Sel limfosit

    berperan sebagai sistem imun spesifik yang dapat mengenali substansi asing yang

    masuk ke dalam tubuh. Limfosit terdiri dari limfosit B dan sel limfosit T. Limfosit

    T bertanggung jawab untuk mengenali adanya substansi asing dan menstimulasi

    berbagai reaksi imunitas sedangkan limfosit B bertanggung jawab membentuk

    antibodi spesifik terhadap antigen (Mescher, 2010; Pediatrician, 2012; Kresno,

    2001; Sompayrac, 2015; Radji dan Biomed, 2015).

    2.5.1 Anatomi Limpa

    Limpa adalah organ limfatik lunak yang terletak di sebelah kiri atas

    abdomen, di bawah tulang iga ke-9, 10 dan 11. Sumbu panjangnya paralel

    dengan iga ke-10. Limpa memiliki permukaan diafragmatik dan visceral,

    ujung superior dan inferior, serta batas anterior, posterior dan inferior.

    Bagian convex permukaan diafragmatik berhubungan dengan bagian

    costal diafragma. Permukaan visceral membentuk segitiga yang terbagi

    pada permukaan gastric, renal dan colic. Bagian punggung limpa

    memisahkan permukaan gastric (anterior) dengan permukaan renal

    (inferior). Pada bagian bawah, terdapat lengkungan, sebuah hilus, sebagai

  • 23

    tempat pembuluh darah dan saraf. Ujung inferior rata dan berakhir pada

    flexura kiri colic. Ujung superior (apex) berhubungan langsung dengan

    tulang Thoracal 11. Batas anterior memisahkan diafragma dari permukaan

    gastric, batas posterior yang bulat memisahkan diafragma dengan

    permukaan renal dan batas inferior memisahkan diafragma dari permukaan

    colic. Ujung pankreas dapat menyentuh limpa diantara permukaan colic

    dan hilus (Leeson CR dan Leeson TJ, 1989 dalam Aziza 2010).

    2.5.2 Histologi Limpa

    Secara histologis limpa terdiri dari stoma (kapsula dan trabekula)

    dan parenkim (pulpa limpa). Selain itu sediaan histologi limpa juga terdiri

    dari banyak sel-sel darah merah dan sel-sel darah putih dan sangat

    menyerupai kelenjar-kelenjar limfe. Leeson et al., (1993) dalam Aziza

    (2010) menerangkan bahwa kapsul dari limpa dilapisi oleh serosa yang

    terdiri dari serat kolagen, serat elastin dan beberapa otot polos, sedangkan

    trabekula tebal yang mengandung cabang-cabang besar arteri dan vena

    splenikus (lienalis) berjalan dari kapsula ke bagian dalam organ. Diantara

    trabekula terdapat anyaman serat retikulin yang menunjang parenkim

    limpa. Parenkim limpa terdiri dari dua bagian yaitu pulpa merah dan pulpa

    putih.

  • 24

    Gambar 2.2 Limpa normal secara mikroskopik (Elmesallamy dkk., 2011)

    Sebagian besar dari pulpa limpa berwarna merah dan mengandung

    banyak darah yang disimpan dalam jalinan retikuler. Pulpa merah terdiri

    dari arteriol pulpa, kapiler selubung serta kapiler terminal, sinus venous

    atau venula, dan bingkai limpa. Pulpa merah pada limpa ruminansia dan

    babi banyak mengandung sel-sel otot polos, sedangkan kuda dan anjing

    memiliki miofibroblas, sel yang mirip fibroblas tetapi memiliki sifat mirip

    otot polos (Dellman dan Brown, 1992 dalam Aziza, 2010).

    Pulpa putih tersusun atas zona marginal dengan sel retikuler

    (limfosit, makrofag) dan serabut retikuler. Limpa memiliki noduli limfatik

    (pulpa putih). Pada individu muda, nodul tersebut mengandung pusat-pusat

    germinal. Pusat germinal berwarna lebih terang mengandung limfosit. Sel-

    sel utama dalam nodulus adalah limfosit B, sedangkan limfosit T

    menempati pada daerah yang langsung mengitari arteri nodularis. Limpa

    tidak memiliki pembuluh limfe aferen, sedangkan pembuluh eferen utama

    ada dalam kapsula dan trabekula. Pembuluh tersebut menembus pulpa

    putih pada jarak pendek sepanjang arteri pulpa putih berikut cabangnya.

  • 25

    Pembuluh limfe dalam trabekula menyalurkan limfe ke dalam pulpa putih

    limpa (Setiasih dkk., 2011).

    Pada permukaan pulpa putih, retikulum membentuk beberapa lapis

    konsentris, yang langsung berbatasan dengan lapis terakhir adalah daerah

    marginal. Di daerah ini banyak terdapat makrofag dan populasi limfosit

    khusus. Semua unsur dari sel darah, demikian juga antigen, mengadakan

    kontak dengan makrofag dan limfosit setempat. Partikel yang

    mengambang dalam plasma darah difagositosis secara efisien oleh

    makrofag, dan merupakan kondisi ideal untuk penampilan antigen

    (Dellman dan Brown, 1992 dalam Aziza 2010).

    Ada beberapa teori mengenai hubungan antara arteriol dan venula

    pada limpa. Pertama adalah teori terbuka, yaitu darah akan mengalir keluar

    dari terminal arterial dalam pulpa merah sampai menemukan permulaan

    dari aliran venous. Kedua adalah teori tertutup, yaitu darah dari arteriol

    terminal masuk sinusoid atau sinus venous, valvulae aferen dan eferen dari

    sinus venous secara periodik membuka dan menutup. Hal ini

    memungkinkan terjadinya proses pengaliran, pengisian, penyimpanan dan

    pengosongan dari sinus venous. Pada proses penyimpanan sinus membesar

    dan makrofag mempergunakan kesempatan ini untuk mengangkut pecahan

    eritrosit. Teori terakhir adalah teori kombinasi yang merupakan gabungan

    antara teori terbuka dan tertutup yaitu bila limpa dalam kontraksi, sel

    retikulum epitel merapat sehingga membentuk sinus venous yang

    menghubungkan arteriola dan venula. Tapi bila limpa mengembang,

  • 26

    susunan sel retikulum epitel agak merenggang sehingga darah dapat keluar

    dalam jaringan (Hartono, 1989).

    2.5.3 Fungsi Limpa

    Organ ini merupakan organ tubuh kompleks dengan banyak fungsi

    diantaranya sebagai penyaring (filter) darah dan menyimpan zat besi untuk

    dimanfaatkan kembali dalam sintesis hemoglobin. Peranan organ ini dalam

    sistem pertahanan berkaitan dengan respon imunologi terhadap antigen

    yang berasal dari darah, dimana organ ini berfungsi sebagai organ limfoid

    sekunder. Sewaktu masa janin limpa membentuk sel darah merah dan pada

    individu dewasa limpa juga membentuk sel darah merah jika sum-sum

    tulang belakang rusak. Limpa juga berfungsi memisahkan sel darah merah

    yang telah usang dari sirkulasi. Limpa juga menghasilkan limfosit.

    Diperkirakan limpa juga bertugas menghancurkan sel darah putih dan

    trombosit. Sebagai dari bagian sistem retikulo endothelial, limpa juga

    terlibat dalam perlindungan terhadap berbagai penyakit dan menghasilkan

    zat-zat antibodi (Setiasih dkk., 2011; dan Pierce, 1979 dalam Putri, 2014).

    Dengan demikian, limpa terbagi atas dua bagian: satu bagian untuk

    menyimpan eritrosit, untuk penjeratan antigen dan untuk eritropoiesis,

    yang disebut pulpa merah; dan bagian yang lain yang di dalamnya terjadi

    tanggap kebal yang disebut pulpa putih.

    Fungsi lain limpa menurut Ressang (1984) dalam Aziza (2010)

    adalah:

  • 27

    1. Membentuk sel-sel darah putih yaitu limfosit, yang ada

    hubungannya dengan pembentukan globulin (antibodi).

    2. Pada hewan muda limpa ikut membentuk eritrosit bersama

    sumsum tulang.

    3. Pembinasaan eritrosit tua bersama dengan sumsum tulang dan

    sel RES hati. Oleh sebab itu limpa mengandung banyak lipid

    (kolesterol dan lesitin) dan besi. Hematin diubah limpa

    menjadi hemobilirubin.

    4. Menjaring kuman-kuman dari darah. Hal ini karena limpa

    terdiri dari banyak sel-sel RES.

    5. Ikut serta dalam metabolisme nitrogen terutama dalam

    pembentukan asam kemih.

    2.5.4 Patologi Limpa

    Menurut Volk dan Wheleer (1993) dalam Aziza (2010), perubahan

    ukuran, warna dan konsistensi limpa biasanya disebabkan oleh respon

    limpa terhadap benda asing dapat menimbulkan proses-proses reaktif,

    sehingga ketika diamati sacara mikroskopis limpa terlihat membengkak.

    Infeksi pada tubuh akan merangsang sel-sel limfosit dalam organ limfoid

    untuk membentuk antibodi. Jones et al., (2006) menyatakan bahwa

    pembesaran limpa bisa diakibatkan oleh beberapa mekanisme yang

    berbeda, yaitu gangguan sirkulasi, penyakit inflamasi, penyakit metabolik

    dan neoplasia. Perubahan patolgi yang terjadi pada limpa dianggap

    berkenaan dengan bangunan trabekula, sinus pada pulpa merah dan pulpa

  • 28

    putih, terutama pada kandungan darah, gambaran fibrosa, jumlah sel dan

    deposit lain (Thomas, 1979 dalam Aziza, 2010).

    Perubahan ukuran dan warna limpa dapat terlihat dengan

    pemeriksaan mikroskopis (histologis) pada sejumlah sel-sel darah yang

    banyak mengisis ruang limpa di sinus-sinus dan pulpa, serta pembuluh

    darah limpa yang membendung (hiperemi). Konsistensi limpa dapat

    menjadi keras dan ukurannya membesar oleh karena pertumbuhan jaringan

    retikulum dan hiperplasia sel serta pertumbuhan jaringan Reticulo

    Endothelial System (RES) sehingga menghasilkan sel-sel besar dan pucat

    yang mengisi sinusoid-sinusoid limpa maupun pada folikel limpa. Pada

    kondisi septisemia, terjadi pembesaran limpa dengan kongesti akut dan

    degenerasi dari folikel limfoid serta hiperseluler dari area sinus (Thomas,

    1979 dan Jubb et al., 1993 dalam Aziza, 2010).

    2.6 Serum

    Serum merupakan komponen yang bukan merupakan sel darah ataupun

    faktor pembeku darah, serum merupakan plasma darah dengan fibrinogen yang

    telah dipisahkan. Serum mengandung semua protein yang tidak digunakan dalam

    mekanisme pembekuan darah. Serum disebut juga sebagai protein darah yang

    dapat ditemukan dalam plasma. Serum mengandung semua elektrolit, antibodi,

    antigen, hormon, dan substansi eksogen (misalnya obat dan mikroorganisme)

    (Kresno, 2003).

    Protein darah juga disebut protein serum (serum proteins), merupakan

    protein yang ditemukan dalam plasma darah. Total serum protein dalam darah

  • 29

    adalah 7 g/dl, yang merupakan 7% dari total volume darah. Protein darah

    memiliki berbagai fungsi antara lain: (1) Tempat sirkulasi transpor molekul

    seperti lipid, hormon, vitamin dan mineral; (2) Enzim komplemen komponen,

    protease inhibitor, dan prekusor kinin; dan (3) Regulasi dari aktivitas acelular dan

    berperan penting dalam sistem imun (Hames, 1998 dalam Rahmawati, 2009).

    Serum adalah salah satu bagian dari plasma darah yaitu pada protein.

    Protein memiliki molekul yang cukup besar. Jika darah diputar dalam sentrifuge,

    maka protein tersebut akan mengendap, sisanya berupa cairan bening dan jernih

    yang disebut serum. Dalam serum terdapat zat antibodi untuk membinasakan

    protein asing atau antigen yang merangsang pembentukan zat antibodi, yang

    masuk kedalam tubuh. Pemisahan protein serum dapat dilakukan dengan

    elektroforesis, pemisahan tersebut merupakan alat diagnosis yang sangat berharga

    untuk memantau kemajuan klinis. Sehingga serum juga digunakan dalam

    beberapa tes diagnostik (Hames, 1998 dalam Rahmawati, 2009).

    2.7 Profil Pita Protein

    Protein terdapat dalam seluruh sistem kehidupan dan termasuk dalam

    komponen utama seluler dan mencapai setengah dari berat kering sel. Setiap jenis

    sel mengandung beberapa protein yang khas bagi sel tersebut. Sebagian besar

    protein disimpan di dalam jaringan otot, organ tubuh dan sisanya terdapat di

    darah. Protein berperan dalam menentukan bentuk dan struktur sebuah sel serta

    bertindak sebagai alat untuk pengenalan antar molekul dan proses katalis

    (Sumardjo, 2009). Protein memiliki beberapa fungsi bagi tubuh, diantaranya

    sebagai enzim, zat pengatur pergerakan, pertahanan tubuh, alat pengangkut dan

  • 30

    lain-lain bergantung pada stuktur 3-dimensional protein tersebut. Pada suatu

    protein dapat dibubuhkan suatu zat yang dapat merubah struktur sekunder, tersier,

    dan kuartener dari protein tersebut (Stryer, 2002).

    Protein merupakan makro-molekul, ukuran terkecilnya pun memiliki berat

    molekul sebesar 6000 Da dan ada protein yang memiliki berat molekul lebih besar

    dari 1 juta Da. Semua protein terdiri atas satu atau lebih polimer yang linier dan

    tak bercabang. Monomer yang membuat polimer ini disebut disebut asam amino.

    Pada umumnya, setiap protein terdiri atas 20 jenis asam amino. Asam amino

    terikat menjadi satu rantai dalam jumlah 100 sampai 300 (Kimball, 1993 dalam

    Rahmawati, 2009).

    Protein mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki oleh

    lemak atau karbohidrat. Molekul protein mengandung juga fosfor, belerang, dan

    ada jenis protein yang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga. Protein

    merupakan makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-amino yang

    dihubungkan oleh ikatan peptida, berbobot molekul tinggi dari 5000 sampai

    berjuta-juta. Suatu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu

    (Rahmawati, 2009).

    Radikal bebas dapat mempercepat fragmentasi protein sehingga protein

    lebih cepat mengalami proteolisis. Sel mengubah pola sintesis protein dalam

    menanggapi stress lingkungan dengan cara menurunkan sintesis protein normal

    dan mensintesis protein spesifik yang disebut Heat Shock Protein (HSP) atau

    protein stress. Protein stres melindungi komponen sel dari kerusakan dan

  • 31

    memungkinkan berlangsungnya aktivitas sel secara normal selama periode

    pemulihan (Yazid dkk., 2012).

    Protein berbeda satu sama lain dapat disebabkan karena perbedaan muatan

    listriknya, protein mungkin pula berbeda karena berat molekul atau jumlah ukuran

    molekulnya. Perbedaan tersebut disebabkan oleh jumlah asam amino yang

    menyusun protein. Berdasarkan perbedaan berat atau ukuran molekul ini, protein

    dapat dipisahkan satu sama lain dengan teknik elektroforesis menggunakan gel

    poliakrilamid sebagai medium pemisah. Pada teknik ini, langkah pertama yang

    perlu dilakukan adalah mendenaturasi protein dengan pemanasan dalam larutan

    datar yang mengandung sodium dodesil sulfat (SDS). Denaturasi ini memberikan

    muatan negatif pada seluruh protein dalam larutan, karena terjadi interaksi

    hidrofobik antara molekul protein dengan molekul SDS. Interaksi ini sebanding

    dengan ukuran-ukuran molekul protein. Jadi, makin besar ukuran molekul suatu

    protein, makin banyak muatan listrik. Kompleks protein terdenaturasi-SDS di

    dalam gel poliakrilamid akan berjalan satu arah menuju kutub positif (anoda).

    Jarak yang ditempuh ditentukan oleh ukuran molekul dalam menembus pori-pori

    gel. Makin kecil molekul tersebut, makin jauh jarak yang ditempuh. Dengan

    demikian terjadilah pemisahan protein berdasarkan berat molekul. Pada

    umumnya, teknik pemisahan protein dengan elektroforesis ini digunakan untuk

    tujuan analisis (Kurniati, 2002).

    2.8 Tikus Putih

    Malole dan Pramono (1989) dalam Putra (2009) menyebutkan bahwa tikus

    telah diketahui sifat-sifatnya dengan sempurna, mudah dipelihara, relatif sehat dan

  • 32

    cocok untuk berbagai penelitian. Tikus yang sudah menyebar ke seluruh dunia

    dan digunakan secara luas untuk penelitian di laboratorium ataupun sebagai

    hewan kesayangan adalah tikus putih yang berasal dari Asia Tengah dan tidak ada

    hubungannya dengan Norwegia seperti yang diduga dari namanya.

    Gambar 2.3 Tikus putih (Rattus norvegicus) (Pusat hewan laboratorium UFSJ, 2016)

    Sistem klasifikasi tikus putih menurut Myers dan Armitage (2004) dalam

    Putra (2015) adalah sebagai berikut:

    Kingdom : Animalia

    Filum : Chordata

    Subfilum : Vertebrata

    Kelas : Mammalia

    Ordo : Rodensia

    Famili : Muridae

    Subfamili : Murinae

    Genus : Rattus

    Species : Rattus norvegicus

  • 33

    Terdapat lima macam (basic stock) tikus putih (Albino Normay rat, Rattus

    norvegicus) yang biasa digunakan sebagai hewan percobaan di laboratorium yaitu

    Long Evans, Osborne Mendel, Sherman, Sprague Dawley, dan Wistar. Sprague

    Dawley memiliki ciri-ciri berwarna albino putih, berkepala kecil, dan ekornya

    lebih panjang daripada badannya. Long Evans lebih kecil ukuran badannya

    daripada Sprague Dawley dan memiliki warna yang gelap pada bagian atas kepala

    dan bagian depan tubuh. Wistar memiliki kepala yang besar dan ekornya lebih

    pendek (Baker et al., 1979 dalam Putra, 2009).

    Tabel 2.2 Data biologis tikus (Pollock, 2010)

    Keterangan Nilai

    Temperatur tubuh 99.9°F / 37.7°C

    Pulsus 300-500 bpm

    Respirasi 70-150 bpm

    Berat badan Jantan dewasa: 267-500 g

    Betina dewasa: 225-325 g

    Rata-rata masa hidup 2.5-3.5 tahun

    Kematangan seksual 37-75 hari

    Gestasi 21-23 hari

    Berat lahir 5-6 g

    Kebutuhan air 22-33 mL/hari

    Umur sapih 21 hari

    Suhu lingkungan yang cocok 50-68°F / 18-26°C

    Kelembaban lingkungan yang

    cocok 40-70%

  • 34

    BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

    3.1 Kerangka Konsep

    Paparan asap

    rokok

    Tikus (Rattus norvegicus)

    Ekstrak jintan

    hitam sebagai

    antioksidan

    ROS (Radical Oxygen Species)

    Stress Oksidatif

    Peroksidasi lipid

    Fregmentasi protein

    Kerusakan lipid,

    protein dan membran

    sel

    Perubahan struktur

    histologi limpa

    Sekresi sitokin

    Inflamasi

    Aktivitas makrofag

    Perubahan profil

    pita protein (Heat

    Shock Protein)

    Gambar 3.1 Kerangka konsep penelitian

    Keterangan:

    = Pengaruh paparan asap rokok = Induksi

    = Pengaruh ekstrak jintan hitam = Terapi

    = Menghambat kerja = Parameter yang diamati

    Aktivasi neutrofil

  • 35

    Dalam proses merokok terjadi dua reaksi yaitu reaksi pembakaran dan

    reaksi pirolisa. Reaksi pembakaran dengan oksigen akan membentuk senyawa

    CO2, H2O2, NO, So, dan Co (Sukmaningsih, 2009). Reaksi pirolisa menyebabkan

    pemecahan struktur kimia rokok menjadi banyak senyawa kimia yang strukturnya

    sangat kompleks. Senyawa tersebut terdiri atas, tar, nikotin, nitrosamin, karbon

    monoksida, senyawa PAH (Polynuclear Aromatic Hydrogen), fenol, karbonil,

    klorin dioksin, dan furan. Asap rokok akan masuk secara inhalasi melalui saluran

    pernafasan sehingga menghasilkan radikal bebas eksogen. Dalam jumlah yang

    berlebihan, radikal bebas dan oksidan (ROS) bersifat sangat reaktif sehingga dapat

    menimbulkan perubahan kimiawi dan merusak berbagai komponen sel hidup

    seperti protein, lipid dan nukleutida.

    Radikal bebas dalam asap rokok merupakan benda asing (antigen) dalam

    darah. Limpa merupakan tempat respon imun utama yang merupakan saringan

    terhadap antigen asal darah dengan cara mengaktifkan respon antibodi IgM dan

    sel-sel inflamasi yang dibutuhkan. Antigen dibawa APC (makrofag) masuk ke

    dalam limpa melalui sinusoid vascular, kemudian makrofag melakukan

    fagositosis. Selanjutnya makrofag akan mensekresi sitokin untuk menarik

    neutrofil bergerak ke daerah yang mengalami inflamasi. Asap rokok dapat

    menyebabkan inflamasi sistemik dalam tubuh, hal ini akan membuat limpa

    bekerja secara berlebihan. Kerja limpa dalam merespon antigen ini dapat

    mengakibatkan terjadinya kerusakan dan pembesaran limpa (Miera dkk., 2008;

    Baratawidjaja dan Rengganis, 2014).

  • 36

    Radikal bebas juga dapat menyebabkan perubahan pada profil pita protein

    dalam serum darah. Hal ini disebabkan karena radikal bebas dapat mempercepat

    fragmentasi protein dalam sel sehingga protein lebih cepat mengalami proteolisis.

    Sel mengubah pola sintesis protein dalam menanggapi stress lingkungan dengan

    cara menurunkan sintesis protein normal dan mensintesis protein spesifik yang

    disebut heat shock protein (HSP) sebagai sistem pertahanan (Snoeck et al., 2011).

    Famili dari HSP yang paling banyak diteliti dan banyak ditemukan adalah HSP

    dengan ukuran massa molekul 60 kDa (Hsp60), 70 kDa (Hsp70), dan 90 kDa

    (Hsp90). Perubahan profil pita protein dapat dianalisis menggunakan metode

    Sodium Dodecyl Sulphat-Polyacrylamid Gel Electrophoresis (SDS-PAGE).

    Radikal bebas dapat dinetralisir atau dihancurkan oleh senyawa-senyawa

    antioksidan seperti thymoquinon. Antioksidan merupakan senyawa yang

    mempunyai struktur molekul yang dapat memberikan elektronnya kepada molekul

    radikal bebas tanpa mengganggu dan memutuskan reaksi berantai dari radikal

    bebas. Antioksidan dapat menetralisir atau menghancurkan radikal bebas dengan

    cara berinteraksi langsung dengan oksidan atau radikal bebas, mencegah

    pembentukan jenis oksigen reaktif, mengubah oksigen reaktif menjadi kurang

    toksik dan memperbaiki kerusakan yang timbul. Dengan demikian, thymoquinon

    yang terkandung dalam ekstrak jintan hitam dapat menghambat kerusakan

    histologi limpa tikus yang dipapar asap rokok dan memperbaiki profil pita protein

    dalam serum.

  • 37

    3.2 Hipotesis Penelitian

    Berdasarkan permasalahan yang dirumuskan, maka hipotesis dari

    penelitian ini adalah sebagai berikut:

    1. Pemberian ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) dapat menyebabkan

    perbaikan profil pita protein ditandai dengan berkurangnya protein-

    protein penanda kerusakan jaringan dalam serum darah tikus (Rattus

    norvegicus) yang diberi paparan asap rokok.

    2. Pemberian ekstrak jintan hitam (Nigella sativa) dapat menghambat

    kerusakan histologi limpa tikus (Rattus norvegicus) yang diberi

    paparan asap rokok.

  • 38

    BAB 4 METODE PENELITIAN

    4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

    Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret-Juni 2017 di Laboratorium

    Farmakologi FK UB. Pengujian Fitokimia jintan hitam (Nigella sativa L.)

    dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik POLINEMA. Ekstraksi jintan hitam

    dilakukan di Laboratorium Farmakologi FK UB. Analisis profil pita protein serum

    dilakukan di Laboratorium Biomedik FK UB dan pembuatan preparat

    histopatologi limpa dilakukan di laboratorium Patologi Anatomi FK UB.

    4.2 Sampel Penelitian

    Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus)

    jantan strain Wistar berumur 8-12 minggu (Epstein, 2004) dan memiliki berat

    badan 150-200 gram. Hewan coba diaklimatisasi selama tujuh hari untuk

    menyesuaikan dengan kondisi di laboratorium. Penelitian ini bersifat

    eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL). Menurut

    Kusriningrum (2008), estimasi besar sampel dihitung dengan rumus:

    p (n-1) ≥ 15

    5 (n-1) ≥ 15

    5n-5 ≥ 15

    5n ≥ 20

    n ≥ 20/5

    n ≥ 4

    Keterangan:

    p = jumlah kelompok perlakuan

    n = jumlah ulangan yang diperlukan

  • 39

    Berdasarkan perhitungan di atas, maka untuk lima jenis kelompok

    perlakuan diperlukan jumlah ulangan minimal empat kali dalam setiap kelompok.

    Penelitian ini mengambil empat ulangan dalam setiap kelompok sehingga total

    hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini berjumlah 20 ekor.

    4.3 Rancangan Penelitian

    Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak

    Lengkap (RAL). Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok perlakuan, yaitu

    K (-) : Tikus tidak diberikan ekstrak etanol jintan hitam dan asap rokok.

    K (+) : Tikus diberi paparan asap rokok 2 batang/hari/kandang pada hari ke-

    8 sampai hari ke-28 namun tidak diberi ekstrak etanol jintan hitam.

    P1 : Tikus diberi ekstrak etanol jintan hitam 0,6 g/KgBB/hari paparan

    asap rokok 2 batang/hari/kandang pada hari ke-8 sampai hari ke-28.

    P2 : Tikus diberi ekstrak etanol jintan hitam 1,2 g/KgBB/hari dan paparan

    asap rokok 2 batang/hari/kandang pada hari ke-8 sampai hari ke-28.

    P3 : Tikus diberi ekstrak etanol jintan hitam 2,4 g/KgBB/hari dan paparan

    asap rokok 2 batang/hari/kandang pada hari ke-8 sampai hari ke-28.

  • 40

    Tabel 4.1 Rancangan kelompok penelitian

    Kelompok

    Variabel yang Diamati

    Profil Pita Protein Serum

    Histopatologi Limpa

    1 2 3 4

    Kelompok Kontrol Negatif (K-) tanpa perlakuan

    Kelompok Kontrol Positif (K+) dipapar asap rokok

    2 batang/hari

    Kelompok preventif 0,6 g/KgBB/hari (P1) dan

    dipapar asap rokok 2 batang/hari

    Kelompok preventif 1,2 g/KgBB/hari (P2) dan

    dipapar asap rokok 2 batang/hari

    Kelompok preventif 2,4 g/KgBB/hari (P3) dan

    dipapar asap rokok 2 batang/hari

    4.4 Variabel Penelitian

    Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah:

    Variabel bebas : Ekstrak etanol jintan hitam, dosis paparan asap rokok

    Variabel tergantung : Perubahan profil pita protein dan struktur histologi

    limpa

    Variabel kontrol : Berat badan tikus, umur tikus, jenis kelamin tikus, dan

    pakan

  • 41

    4.5 Alat dan Bahan Penelitian

    4.5.1 Alat Penelitian

    Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain,

    kandang pemeliharaan hewan coba, smoking pump, kandang pengasapan

    (38 cm x 26 cm x 12,5 cm), timbangan analitik, sonde, botol air minum,

    botol sediaan obat, alat bedah, pot organ, plastik klip, gelas ukur, spuit,

    vacutainer, sentrifus, vortex, evaporator, kertas saring, oven, Erlenmeyer,

    tabung polipropile, sonikator, plate pembentuk gel, tabung reaksi, perangkat

    elektroforesis, syringe Hamilton, block preparat, obyek gelas, eppendorf,

    freezer, kulkas, kotak preparat, mikroskop cahaya, dan kamera.

    4.5.2 Bahan Penelitian

    Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi biji jintan hitam

    dalam kemasan yang diperoleh dari toko obat di Kota Malang, etanol 70%,

    Tikus putih (Rattus norvegicus) jantan galur Wistar dengan berat 150-200

    gram sebanyak 20 ekor, pakan tikus, rokok kretek (non filter), sekam padi,

    bis-akrilamida 30%, 1 M Tris pH 6,8, aquabides, SDS 10%, TEMED, APS

    10%, Coomassie Blue R-250, methanol, aquades, asam asetat glasial,

    paraffin cair, larutan etanol 70%, 80%, 90%, 95%, dan 96%, formalin 10%,

    alkohol 70%, alkohol 96%, alkohol absolut, alkohol xylol, xylol I, II, dan

    III, paraffin cair, pewana hematoksilin-eosin.

  • 42

    4.6 Tahapan Penelitian

    Penelitian dilakukan pada minggu pertama bulan Maret 2017 dengan

    tahapan sebagai berikut:

    1. Pembuatan ekstrak etanol jintan hitam

    2. Persiapan hewan coba

    3. Perlakuan hewan coba

    4. Koleksi serum darah

    5. Pengamatan profil pita protein serum

    6. Pembuatan histopatologi limpa

    7. Analisis data

    4.7 Prosedur Kerja

    4.7.1 Persiapan Hewan Percobaan

    Tikus akan dipelihara pada kandang yang sudah dipersiapkan

    terlebih dahulu bersama tempat pakan dan tempat minum. Tikus yang

    digunakan untuk penelitian diadaptasikan terhadap lingkungan selama tujuh

    hari dengan pemberian pakan berupa ransum basal (buras). Pakan tikus bisa

    berbentuk serbuk atau pelet dan harus diberikan secara teratur setiap satu

    kali sehari. Tikus dibagi dalam 5 kelompok perlakuan. Setiap kelompok

    perlakuan terdiri dari 5 ekor tikus yang dipelihara dalam kandang berukuran

    17,5 x 23,75 x 17,5 cm. Kandang pemeliharaan terbuat dari wadah plastik.

    Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24o C dengan kelembaban

    udara 50-60%.

  • 43

    4.7.2 Persiapan Ekstrak Etanol Jintan Hitam

    a. Pembuatan Ekstrak Etanol Jintan Hitam

    Prosedur pembutan ekstrak etanol jintan hitam dilakukan dengan tiga

    prosedur, yaitu pengeringan, ekstraksi, dan evaporasi. Proses pengeringan,

    jintan hitam dicuci sampai bersih (sampel basah), kemudian dipanggang

    dalam oven dengan suhu 80°C atau dengan panas matahari sampai kering

    (bebas kandungan air). Pada proses ekstraksi, jintan hitam dihaluskan

    dengan blender hingga menyerupai bubuk lalu ditimbang dengan timbangan

    analitik sebanyak 100 gram (sampel kering) kemudian dimasukkan ke

    dalam gelas ekstraksi/labu erlenmeyer ukuran 1 L dan direndam dalam

    etanol, setelah itu dikocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit) dan

    kemudian diinapkan selama satu malam (12 jam) sampai mengendap.

    Dalam proses evaporasi, larutan yang telah diinapkan selama satu malam

    diambil lapisan atas dari hasil campuran etanol dengan zat aktif yang sudah

    terambil kemudian dimasukkan dalam labu evaporasi 1L yang selanjutnya

    labu evaporasi dipasang pada evaporator dan diisi water bath dengan air

    sampai penuh. Semua rangkaian alat dipasang, termasuk rotary evaporator,

    pemanas water bath (diatur sampai 90°C), disambungkan dengan alat listrik,

    selanjutnya dibiarkan sampai larutan etanol memisah dengan zat aktif yang

    sudah ada dalam labu (±1,5–2 jam untuk 1 labu). Hasil yang diperoleh kira-

    kira ½ dari bahan alam kering. Ekstrak jintan hitam dimasukkan dalam botol

    plastik dan disimpan dalam freezer sampai digunakan, sebelum penggunaan

  • 44

    perlu dibiarkan terlebih dahulu agar suhu sama dengan suhu ruangan

    (Kurnia, dkk., 2011).

    b. Uji Fitokimia (Thymoquinone) Eksrak Etanol Jintan Hitam

    Analisis fitokimia merupakan uji kualitatif untuk mengetahui

    keberadaan golongan senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak jintan

    hitam (Nigella sativa). Uji fitokimia ini dilakukan menggunakan metode

    LC-MS. Uji Thymoquinone dilakukan dengan memanaskan 10 μL sampel

    ekstrak etanol jintan hitam pada suhu 50°C selama 5 menit. Selanjutnya,

    ekstrak diambil dan ditambah dengan 5 tetes larutan asam sulfat pekat.

    Warna merah yang terbentuk menunjukkan bahwa sampel mengandung

    senyawa thymoquinone. Dilanjutkan dengan uji LCMS yang ditemukan

    beberapa spot menunjukkan thymoquinone pada ekstrak jintan hitam.

    Dilakukan uji lanjutan dengan spektofotometri UV diketahui bahwa terdapat

    serapan thymoquinone dengan berat molekul 165 g/mol. (Lampiran 4).

    4.7.3 Penentuan Dosis Ekstrak Etanol Jintan Hitam

    Penelitian dengan variasi dosis ekstrak etanol jintan hitam 0,6

    g/kgBB, 1,2 g/kgBB, dan 2,4 g/kgBB sebelumnya telah dilakukan oleh

    Kurnia, dkk. (2011) untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol jintan hitam

    terhadap MDA dan sel spermatogonium tikus yang dipapar asap rokok

    kretek subakut. Penelitian dengan dosis yang sama juga dilakukan oleh

    Marwan, dkk. (2005) untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak biji

    jintan hitam terhadap kadar GSH, MDA, jumlah serta fungsi sel makrofag

  • 45

    alveolar paru tikus wistar yang dipapar asap rokok kronis. Kedua penelitian

    tersebut telah membuktikan bahwa ekstrak jintan hitam memiliki efek

    antioksidan yang dapat memberikan perbaikan dan mencegah stres oksidatif

    akibat paparan asap rokok pada parameter yang diteliti. Berdasarkan

    penelitian tersebut, peneliti mengambil dosis ekstrak jintan hitam yang sama

    untuk penelitian kali ini, sehingga dosis yang diberikan pada tikus dengan

    berat rata-rata 200 gram yaitu 120 mg/ekor/hari, 240 mg/ekor/hari dan 480

    mg/ekor/hari.

    4.7.4 Perlakuan Hewan Coba

    Perlakuan awal pada hewan coba adalah dilakukannya aklimatisasi

    pada hari ke-1 sampai hari ke-7 dalam kandang pemeliharaan. Selanjutnya

    pada hari ke-8 sampai hari ke-28 diberi ekstrak etanol jintan hitam sebagai

    antioksidan dan dilakukan pemaparan asap rokok menggunakan jenis rokok

    kretek (non-filter). Paparan asap rokok bertujuan sebagai sumber radikal

    bebas sehingga dapat menyebabkan stres oksidatif dan inflamasi sistemik

    yang berdampak pada gambaran histologi limpa dan profil pita protein.

    Asap rokok dihembuskan dengan smoking pump ke dalam kandang tertutup

    berbentuk kaca sebanyak dua batang/hari setiap kelompok dalam waktu 21

    hari.

    Penelitian ini menggunakan lima kelompok tikus secara acak.

    Kelompok pertama adalah kelompok kontrol negatif (K-) dimana masing-

    masing tikus tidak diberi perlakuan apapun mulai dari hari pertama sampai

    dengan hari ke-28. Kelompok kedua adalah kelompok kontrol positif (K+)

  • 46

    yang mulai hari ke-8 sampai hari ke-28 diberi paparan asap rokok dua kali

    sehari per batang, namun tidak diberikan jintan hitam. Kelompok ketiga

    adalah perlakuan 1 (P1), dalam satu kelompok diberi ekstrak etanol jintan

    hitam sebanyak 0,6 g/KgBB/hari secara peroral (PO) dan diberi paparan

    asap rokok dua kali sehari per batang pada hari ke-8 sampai hari ke-28.

    Kelompok keempat adalah perlakuan 2 (P2) yang diberi ekstrak etanol

    jintan hitam sebanyak 1,2 g/KgBB/hari secara peroral (PO) dan dilakukan

    pemaparan asap rokok dua kali sehari per batang pada hari ke-8 sampai hari

    ke-28. Kelompok kelima adalah perlakuan 3 (P3) yang diberi ekstrak etanol

    jintan hitam sebanyak 2,4 g/KgBB/hari secara peroral (PO) dan dilakukan

    pemaparan asap rokok dua kali sehari per batang dan pada hari ke-8 sampai

    hari ke-28.

    4.7.5 Koleksi Serum Darah

    Koleksi sampel darah dilakukan dengan pengambilan langsung pada

    jantung menggunakan spuit yang steril. Darah yang sudah dikoleksi

    dimasukkan kedalam vacutainer tanpa anti-koagulan (berwarna merah) dan

    dimiringkan dengan sudut 45° kurang lebih selama tiga jam hingga

    terbentuk dua lapisan. Lapisan paling atas yang berwarna kuning kecoklatan

    diambil dan disentrifugasi dengan kecepatan 300 rpm selama 15 menit.

    Supernatan yang terbentuk dipisahkan dan kemudian dilakukan sentrifugasi

    kembali dengan kecepatan dan waktu yang sama. Supernatan diambil dan

    dipindahkan ke tabung ependorf baru dan disimpan dalam freezer (Ganong,

    2008).

  • 47

    4.7.6 Pengamatan Profil Pita Protein

    a. Isolasi Protein

    Serum yang telah diperoleh dilakukan isolasi protein, serum

    dimasukkan ke dalam tabung polipropilen steril dan disonifikasi

    selama 10 menit pada sonikator. Sonikasi merupakan suatu proses

    pengubahan sinyal listrik menjadi getaran mekanis yang dapat

    diarahkan menuju suatu zat yang dilakukan untuk memecahkan

    ikatan antar molekul atau untuk merusak sel. Supernatan diambil dan

    ditambahkan dengan etanol absolute dingin dengan perbandingan

    1:1, dibiarkan selama semalam hingga terbentuk endapan. Kemudian

    supernatan disentrifugasi selama 15 menit (10.000 rpm), endapan

    diambil dan dikeringkan hingga bau etanol menghilang. Endapan

    yang diperoleh ditambah dengan larutan 0,02 M Tris-HCL pH 6,5

    dingin dengan perbandingan 1:1 (Walter, 1984 dalam Hardi, 2014).

    b. Persiapan Separating dan Stacking Gel

    Menurut Widyarti (2011), pembuat separating gel 12,5%

    dilakukan dengan cara memasukkan 3,125 mL stok akrilamidan dan

    2,75 mL 1 M Tris pH 8,8 ke dalam tabung polipropilen 50 mL,

    kemudian tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan.

    Selanjutnya, dimasukkan aquabides 1,505 mL ke dalam tabung,

    tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan. Kemudian, masukkan

    75 μL SDS 10% ke dalam tabung, tabung ditutup, lalu digoyang

    secara perlahan. Selanjutnya, dimasukkan 75% μL APS 10% ke

  • 48

    dalam tabung, tabung ditutup, lalu digoyang secara perlahan. Setelah

    itu, dimasukkan 6,25 μL TAMED ke dalam tabung, tabung ditutup,

    lalu digoyang secara perlahan. Segera tuang larutan ke dalam plate

    pembentuk gel menggunakan mikropipet 1mL (jaga jangan sampai

    terbentuk gelembung udara) sampai batas yang terdapat pada plate;

    secara perlahan, tambahkan aquades di atas larutan gel dalam plate

    agar permukaan gel tidak bergelombang. Biarkan gel memadat

    selama kurang lebih 30 menit (ditandai dengan terbentuknya garis

    transparan di antara batas air dan gel yang terbentuk). Setelah itu,

    buang air yang menutup separating gel. Sesudah separating gel

    memadat, siapkan stacking gel 3% dengan cara yang sama seperti

    pembuatan separating gel dengan volume larutan Bis-akliramida

    30% 0,45 mL; 1 M Tris pH 6,8 0,38mL; Aquabides 2,11 mL; SDS

    10% 30 μL; TEMED 5 μL; APS 10% 30 μL

    c. Injeksi Sampel dan Running

    Masukkan plate yang sudah berisi gel ke dalam chamber

    elektroforesis. Tuang running buffer sampai bagian atas dan bawah

    gel ter