PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KEDELAI HITAM (Glycine

max (L.) Merr.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA

(MDA) DAN HISTOPATOLOGI HEPAR TIKUS DIABETES

MELLITUS TIPE I DENGAN INDUKSI

STREPTOZOTOCIN (STZ)

SKRIPSI

Oleh :

PARAMITA WISNU WARDANI

105130101111010

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

ii

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KEDELAI HITAM (Glycine

max (L.) Merr.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA

(MDA) DAN HISTOPATOLOGI HEPAR TIKUS DIABETES

MELLITUS TIPE I DENGAN INDUKSI

STREPTOZOTOCIN (STZ)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh :

PARAMITA WISNU WARDANI

105130101111010

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK KEDELAI HITAM (Glycine

max (L.) Merr.) TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA

(MDA) DAN HISTOPATOLOGI HEPAR TIKUS DIABETES

MELLITUS TIPE I DENGAN INDUKSI

STREPTOZOTOCIN (STZ)

Oleh :

PARAMITA WISNU WARDANI

1051301011110010

Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji

pada tanggal ………

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Pembimbing I

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

NIP. 196009031988022001

Pembimbing II

Dyah Kinasih Wuragil,S.Si.,MP.,M.Sc

NIP. 198209142009122004

Mengetahui,

Dekan Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Brawijaya

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES

NIP. 196009031988022001

iv

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama : ParamitaWisnu Wardani

NIM : 105130101111010

Program Studi : Program Kedokteran Hewan

Penulis Skripsi berjudul :

Pengaruh pemberian ekstrak kedelai hitam (Glycine max(L.) Merr) terhadap kadar

Malondialdehida (MDA) Diabetes Mellitus Tipe I dan gambaran histopatologi

hepar tikus dengan induksi Streptozotocin (STZ).

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak

menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan

tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil

jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya

terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, Mei 2017

Yang menyatakan,

(Paramita Wisnu Wardani)

NIM. 105130101111010

v

The Effect of Black Soybean (Glycine max (L). Merr.) Extract to

Malondialdehide (MDA) Level and Liver Hitopathology of

Rats Model Diabetus Mellitus Streptozotocin

(STZ) induced

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a hyperglycemic chronic metabolic disease due to insulin

secretion abnormalities. Excessive level of blood glucose disturbs the liver

performance which acts as the center of the body's metabolism. Black soybean

(Glycine max (L) Merr) contains isoflavones and anthocyanins which act as

antioxidants for the body. The purpose of this study is to determine the therapeutic

effect of water extract of black soybean (Glycine max (L) Merr) towards

malondialdehide levels (MDA) and hepatic histopathology of rat model of

streptozotocyn-induced type 1 diabetes mellitus. Intraperitoneal injection of

streptozotocyn was done with a dose of 20mg / kg for 5 days. This study used

male rats (Rattus norvegicus) age of 2 months, weight 100-150gr which were

divided into 5 groups including the control group, DM group and DM group

therapeutic dose of 500 mg / kg, dose of 750 mg / kg, and dose of 1000mg / kg.

MDA levels were analyzed using Thiobarbaturic Acid (TBA) methods and

hepatic organ histopathology were observed using Hematoxylin Eosin staining

(HE) method. The results indicated that the therapy of black soybean extract can

reduce levels of MDA in DM rats induced by MLD-STZ significantly (p <0.05).

Therapeutically effective dose is 1000 mg / kg which lowers the levels of MDA

by 54%. The observation of liver histopathology showed an improvement of

sinusoid and a decrease in tissue necrosis. An effective therapeutic dose is 1000

mg / KgBW.

Keywords: Diabetes Mellitus (DM), Black Soybeans, MDA, liver, Streptozotocyn

vi

Pengaruh Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam (Glycine

max (L.) Merr.) Terhadap Kadar Malondyaldehida

(MDA) dan Histopatologi Hepar Tikus Diabetes

Melitus Tipe I Dengan Induksi

Streptozotocin (STZ)

ABSTRAK

Diabetes mellitus adalah penyakit metabolik kronis bersifat hiperglikemia

dan berefek pada kelainan sekresi insulin. Kadar glukosa darah yang melebihi

normal mengganggu kinerja hepar yang berperan sebagai pusat metabolisme

dalam tubuh. Kedelai hitam (Glycine max (L) Merr) mengandung isoflavon dan

antosianin yang berfungsi sebagai antioksidan bagi tubuh. Tujuan dari penelitian

ini adalah mengetahui pengaruh terapi ekstrak air kedelai hitam (Glycine max (L)

Merr) terhadap kadar malondialdehida (MDA) dan gambaran histopatologi hepar

tikus model diabetes mellitus tipe 1 hasil induksi streptozotocin. Injeksi

streptozotocin dilakukan secara intraperitonial dengan dosis 20mg/kgBB selama 5

hari. Penelitian ini menggunakan tikus jantan (Rattus norvegicus) umur 2 bulan

dengan berat badan 100-150g yang dibagi dalam 5 kelompok antara lain

kelompok kontrol, kelompok DM, serta kelompok DM terapi dosis 500 mg/kg

BB, dosis 750 mg/kg BB, dan dosis 1000mg/kg BB. Kadar MDA dianalisis

menggunakan metode Thiobarbaturic Acid (TBA) dan histopatologi organ hepar

secara mikroskopis. Pemberian terapi ekstrak kedelai hitam (Glycine max(L.)

Merr.) dengan dosis 500 mg/KgBB, 750 mg/KgBB, dan 1000 mg/KgBB pada

hepar tikus yang diinduksi MLD-STZ. Dosis efektif terapi adalah dosis 1000

mg/KgBB karena mampu menurunkan kadar MDA dengan maksimal sebesar

57%. Pemberian terapi ekstrak kedelai hitam yang mengandung senyawa

antosianin dan flavonoid yang mampu memperbaiki histopatologi tikus jantan

(Rattus norvegicus) model diabetes mellitus tipe 1 yang ditunjukkan dengan

adanya perbaikan pada sel hepatosit. Kata Kunci : Diabetes Mellitus (DM), Kedelai hitam, MDA, hepar, Streptozotocyn

vii

KATA PENGANTAR

Puji Syukur dihaturkan kepada Allah S.W.T. yang telah melimpahkan

rahmat-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan Tugas Sarjana ini dengan

baik.

Tugas sarjana ini merupakan persyaratan terakhir bagi mahasiswa Program

Studi Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Malang untuk dapat meraih gelar

sarjana strata satu. Penelitian ini adalah bagian dari penelitian tentang Pengaruh

Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam (Glycine max (L.) merr.) Terhadap Kadar

Malondialdehida (MDA) Diabetes Melitus Tipe I dan Gambaran Histopatologi

Hepar Tikus dengan Induksi Streptozotocin (STZ). Penelitian ini diketuai oleh

Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES. Dalam kesempatan ini penulis mengucapkan

terima kasih yang tak terhingga kepada :

1. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES. sebagai Pembimbing I tugas Sarjana ini

atas segala bantuan, kesempatan, nasihat, dan arahan yang diberikan tiada

hentinya kepada penulis.

2. Dyah Kinasih Wuragil, S.Si.,MP.,M.Sc. sebagai Pembimbing II tugas

Sarjana ini atas segala bantuan, kesempatan, nasihat, dan arahan yang

diberikan tiada hentinya kepada penulis.

3. drh. Herlina Pratiwi sebagai dosen penguji atas masukan-masukan yang

telah diberikan.

4. drh. Fajar Shodiq Permata, M.Biotech. sebagai dosen penguji atas masukan-

masukan yang telah diberikan.

5. Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES sebagai Dekan Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Brawijaya atas nasihat dan arahan yang telah diberikan.

6. Mbak Nita, Mbak Vivi, Mbak Ninik, Pak Har dan seluruh Asisten

Laboratorium Taksonomi, Laboratorium Fisiologi Reproduksi,

Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Biologi Molekul dan Seluler

FMIPA Universitas Brawijaya atas segala bantuan yang telah diberikan

kepada penulis.

viii

7. Bapak Suwito, Almarhumah Ibu Herlin Kuswardani, kakak saya tercinta Aji

Wisnu Murti dan Borhan Wisnu Murti yang selalu menyemangati dan

menyayangi serta begitu sabar menanti, mendorong, membantu penulis

selama belajar di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya

Malang

8. Luh Putu Gina, Nur Abyda Erniaji, Anne Herli selaku teman seperjuangan

dalam menyelesaikan penelitian ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan,

maka kritik dan dan saran yang konstruktif dari semua pihak sangat diharapkan

demi penyempurnaan selanjutnya.

Malang, Mei 2017

ix

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL……………………………..……..........……………….............. ii

HALAMAN PENGESAHAN………………….....…………………………..............

HALAMAN PERNYATAAN………………………………………………..............

iii

iv

ABSTRAK...................………………………………………………………...............

KATA PENGANTAR………………………………………………….......................

v

vi

DAFTAR ISI………………………………………………………………….............. viii

DAFTAR GAMBAR …………………………………………………….................... x

DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………………................. xi

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG……………………............... xii

BAB 1 PENDAHULUAN……………………………………………………............. 1

1.1 Latar Belakang……………………………………………………................. 1

1.2 Rumusan Masalah…………………………………………………................ 4

1.3 Batasan Masalah…………………………………………….......................... 4

1.4 Tujuan……………………………………………..………………................ 5

1.5 Manfaat……………………………………………..……………….............. 5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA……………………………………………................ 6

2.1 Diabetes Mellitus............................................................................................. 6

2.2 Histologi Hepar Tikus...................................................................................... 8

2.3 Kedelai Hitam.................................................................................................. 9

2.4 Induksi Diabetes Mellitus................................................................................ 10

2.4.1 Tikus Putih.................................................................................................. 10

2.4.2 Mekanisme STZ.......................................................................................

2.5 Malondialdehida (MDA) ……………………………………………………

11

13

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN......................... 14

3.1 Kerangka Konseptual……………………………………………................... 14

3.2 Hipotesis Penelitian……………………………………………..…................ 17

BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN...................................................................... 18

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian.......................................................................... 18

4.2 Alat dan Bahan Penelitian................................................................................

4.2.1 Alat ………………………………………………………………………

4.2.2 Bahan……………………………………………………………………..

18

18

18

4.3 Tahapan Penelitian....................................................... ................................... 19

4.4 Prosedur Kerja....................................................... .......................................... 19

4.4.1 Rancagan Penelitian dan Persiapan hewan coba …..………................

4.4.2 Pembuatan Ekstrak Kedelai Hitam .......................................................

19

20

4.4.3 Pembuatan Larutan STZ dan Injeksi Intraperitonial.........…................ 21

4.4.4 Pengukuran Glukosa Darah................................................................... 21

4.4.5 Terapi Ekstrak Kedelai Hitam............................................................... 22

4.4.6 Pengambilan Organ Hepar..................................................................... 22

4.4.7 Pembuatan Preparat Histologi Hepar.....................................................

22

x

4.4.8 Pengukuran Kadar Malondialdehida dengan Uji TBA.......................... 24

4.4.9 Analisis Data ........................................................................................

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN………………………………………………

5.1 Pengaruh Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam Terhadap Penurunan Kadar

MDA pada Organ Hepar Tikus dengan Induksi STZ…………………………………

5.2 Pengaruh Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam Terhadap Gambaran

Histopatologi Organ Hepar Tikus dengan Induksi STZ……………………………

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN………………………………………………

6.1 Kesimpulan.............................................................................. ........... ..........

6.2 Saran.............................................................................. ........... ..........

24

25

25

30

35

35

35

DAFTAR PUSTAKA................................ ................................ .................................. 36

LAMPIRAN................................ ................................ ................................................. 40

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian .................................................... 16

Gambar 5.1 Kadar MDA dari organ hepar tikus…………………………… 25

Gambar 5.2 Histopatologi organ hepar tikus……………………………… 30

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Sertifikat Laik Etik..................................................................................... 40

2. Determinasi Kedelai Hitam......................................................................... 41

3. Diagram Alir Penelitian ............................................................................. 42

4. Pembuatan Ekstrak Kedelai Hitam ............................................................. 43

5. Diagram Kerja Penelitian ............................................................................ 44

5.1 Pembedahan Hewan Coba ................................................................. 44

5.2 Pengukuran Kadar MDA Jaringan Hepar ..........................................44

5.2.1 Pembuatan Kurva Baku MDA........................................................44

5.2.2 Skema Prosedur Pengukuran Kadar Malondialdehida (MDA)

dengan Uji TBA.......................................................................... 44

5.3 Prosedur Pembuatan Preparat Histopatologi Organ Hepar

dengan Metode Pewarnaan HE ............................................................44

6. Perhitungan Dosis........................................................................................45

7. Perhitungan kadar MDA…………………………………………………..50

xiii

DAFTAR SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG

Simbol/singkatan Keterangan

ANOVA analysis of variant

BNJ beda nyata jujur

DM diabetes mellitus

HE hematoksilin eosin

MDA malondialdehida

PBSA phospat buffer salin azida

PFA paraformaldehid

RAL rancangan acak lengkap

ROS reactive oxygen species

TBA thiobarbituric acid

TCA tri chloro acetic

T1DM type 1 diabetes mellitus

T2DM type 2 diabetes mellitus

STZ streptozotocyn

NO Radikal nitrit oxide

Kg Kilogram

mg Miligram

mL Mililiter

MLD-STZ Multiple Low Dose Streptozotocin

NaCl Natrium Clorida

NaOH Natrium Hidroksida

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes mellitus (DM) adalah penyakit metabolik kronis yang mempunyai

beberapa karakteristik diantaranya bersifat hiperglikemia, efek tersebut terjadi

karena kelainan sekresi insulin (ADA, 2012). Diabetes mellitus (DM) ditandai

dengan kadar glukosa darah yang melebihi normal akibat tubuh kekurangan insulin,

baik absolut maupun relatif. Keadaan hiperglikemia yang berlangsung lama dalam

tubuh dapat menimbulkan komplikasi seperti stroke, jantung, dan dapat pula

menimbulkan kerusakan pada ginjal serta terjadi perlemakan pada hepar. Diabetes

mellitus dibagi menjadi 2 kategori utama berdasarkan sekresi insulin endogen untuk

mencegah munculnya ketoasidosis, yaitu diabetes mellitus tergantung insulin atau

tipe I, dan diabetes mellitus tidak tergantung insulin atau tipe II (Nugroho, 2006).

Di Amerika, kejadian diabetes mellitus pada anjing dan kucing bervariasi,

pada anjing mulai dari rasio 1:400 dan pada kucing 1:800. Kasus diabetes mellitus

pada anjing rentan pada usia 7-10 tahun, jenis anjing yang sering terkena diabetes

mellitus adalah anjing poodle, terrier, dachshunds, dan spaniel (Wardhana, 2010).

Beberapa faktor yang dapat memicu terjadinya diabetes mellitus pada hewan antara

lain umur, ras, jenis kelamin, dan lingkungan (Fall et al., 2007). Indonesia sebagai

salah satu negara berkembang merupakan negara dengan populasi ke empat

terbesar di dunia mempunyai potensi mengalami peningkatan jumlah penderita

diabetus melitus dengan gaya hidup modern yang cenderung tidak sehat. Menurut

data yang dicantumkan oleh WHO pada tahun 2012, prosentase penderita penyakit

ini sebesar 8,6% (Prabawati, 2012) .

2

Hepar adalah salah satu organ yang merupakan pusat metabolisme dalam

tubuh. Hepar memiliki fungsi dalam proses detoksifikasi dan sebagai pusat

biosintesis. Hepar adalah organ yang rentan dengan suatu yang bersifat toksik yang

masuk dalam tubuh, karena hal itu hepar bisa dipakai sebagai bahan pengamatan

histopatologi dalam suatu penyakit (Hudgson, 2004). Efek yang dapat ditimbulkan

oleh diabetus mellitus adalah terjadinya perlemakan dalam hepar. Perlemakan yang

terjadi menyebabkan hepar menyimpan lemak. Sedangkan kerja hepar adalah

membakar lemak dan membuang lemak dari tubuh. Perlemakan hepar merupakan

akumulasi trigliserida dan jenis lemak lain pada sel hepar. Jika sel hepar dipenuhi

lemak, maka hepar tidak mampu menyaring dan membersihkan aliran darah secara

efisien sehingga menyebabkan aliran darah dipenuhi lemak dan racun (Lauralee,

2001).

Keadaan hiperglikemia yang terjadi pada diabetes mellitus dapat

mengakibatkan peningkatan jumlah radikal bebas didalam sel. Terjadinya

ketidakseimbangan antara antioksidan protektif dengan jumlah radikal bebas dapat

memicu terjadinya kerusakan oksidatif atau stress oksidatif (Desminarti et al.,

2012). Stress oksidatif dapat berpengaruh pada resistensi insulin yang dapat

memperburuk kondisi diabetes dan berdampak pada penurunan aktifitas katalase

dalam tubuh (Arifin et al., 2007). Banyak substansi biologi yang digunakan dalam

proses penghitungan radikal bebas, salah satunya dengan melakukan pengukuran

Malondialdehyde (MDA). Kerusakan pada organ hepar juga dapat dilihat dengan

melakukan pengamatan histopatologi dari organ hepar tersebut. Gambaran

3

histopatolgi jaringan hepar dilakukan untuk memperlihatkan keadaan patologik

jaringan hepar yang mengalami perlemakan (Setiawan & Suhartono, 2005).

Pengobatan diabetes mellitus adalah pengobatan menahun dan seumur

hidup. Penggunaan insulin untuk pengobatan diabetes mellitus dan obat

antidiabetes harganya relatif mahal karena penggunaannya dalam jangka waktu

lama dan dapat menimbulkan efek samping. Penggunaan obat herbal menjadi

pilihan untuk mengurangi terjadinya efek samping yang ditimbulkan oleh

penggunaan obat kimia, dimana obat herbal memiliki efek samping yang relatif

rendah dengan harga yang murah (Dalimartha, 2012). Penelitian ini menggunakan

ekstrak air rebusan Kedelai hitam (Glycine max I merr) untuk penanganan terapi

penyakit diabetes mellitus tipe 1.

Kedelai hitam mengandung isoflavon dan antosianin yang berfungsi sebagai

antioksidan bagi tubuh. Antosianin pada kedelai dapat menghambat beberapa

penyakit karena aktivitas radikal bebas dan menghambat penuaan dini.

(Utaminingrum, 2011). Sedangkan isoflavon dalam kedelai hitam baik untuk

kesehatan kulit tubuh untuk menekan tekanan darah dan dapat pula menurunkan

kadar kolesterol dalam darah (Astuti, 2008).

Penelitian kali ini dilakukan untuk mengetahui manfaat pemberian ekstrak

air rebusan kedelai hitam terhadap penurunan terjadinya stress oksidatif pada tikus

model diabetes mellitus yang dipapar Streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-

STZ) dilihat dari aktivitas katalase, kadar Malondialdehida (MDA) dan

histopatologi jaringan hepar tikus.

4

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini dapat

dirumuskan beberapa permasalahan, yaitu :

1. Apakah pemberian terapi air rebusan kedelai hitam dapat menurunkan

kadar malondialdehida (MDA) pada jaringan hepar tikus model diabetes

melitus akibat paparan streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-STZ) ?

2. Apakah pemberian terapi air rebusan kedelai hitam menunjukkan perbedaan

gambaran histopatologi jaringan hepar tikus model diabetes melitus akibat

paparan streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-STZ) ?

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan rumusan masalah diatas, dapat diambil beberapa batasan

masalah, antara lain:

1. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih jantan (Rattus norvegicus)

strain Wistar usia 2 bulan, berat badan 100-200 g sebanyak 30 ekor

diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM

Yogyakarta yang telah mendapatkan persetujuan laik etik dari Komisi Etik

Penelitian Universitas Brawijaya No:196-KEP-UB. ( Lampiran 1.)

2. Pembuatan hewan model diabetes melitus tipe 1 dilakukan dengan

pemberian streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-STZ) yang

diberikan adalah 20mg/kg BB yang dilakukan 5 kali berturut-turut selama 5

hari. Tikus dinyatakan dibetes mellitus apabila gula darah lebih atau sama

dengan 200 mg/dL (Gina, 2014).

5

3. Ekstrak kedelai hitam (Glycine max (L.) merr) menggunakan pelarut air

dengan konsentrasi 25% ( 25 g kedelai hitam dalam 100mL air) kemudian

dipanaskan (Gina, 2014). Kedelai hitam (Glycine max (L.) merr) didapatkan

di Lombok, Nusa Tenggara Timur dengan determinasi di Laboraturium

Taksonomi, Struktur dan Perkembangan Tumbuhan, Jurusan Biologi,

Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya. (Lampiran 2.)

4. Dosis terapi pada hewan model diabetes melitus yang digunakan dengan air

rebusan kedelai hitam yaitu dosis 500mg/kg BB, 750mg/kg BB, dan

1000mg/kg BB. Terapi dilakukan selama dua minggu dengan melakukan

sonde pada tikus di pagi hari (Yu et al., 2004).

5. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar MDA diukur

menggunakan metode Thiobarbituric Acid serta gambaran histologi dengan

menggunakan Hematoxylin-Eosin (HE) .

1.4 Tujuan Penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah :

1. Mengetahui efek terapi air rebusan kedelai hitam terhadap penurunan kadar

malondialdehida (MDA) organ hepar tikus (Rattus novergicus) diabetes

mellitus akibat paparan Streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-STZ).

2. Mengetahui efek terapi air rebusan kedelai hitam terhadap perbedaan

gambaran histopatologi organ hepar tikus (Rattus novergicus) diabetes

akibat paparan Streptozotocin dosis rendah berulang (MLD-STZ).

6

1.5 Manfaat Penelitian

Adapun manfaat yang diharapkan dari penelitian kali ini yaitu, dapat

digunakan sebagai kajian ilmiah mengenai manfaat dari ekstrak kedelai hitam pada

pengobatan penderita diabetes mellitus tipe 1.

6

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Diabetus Melitus

Diabetes melitus (DM) merupakan salah satu dari beberapa penyakit kronis

yang ada di dunia. Dikenal sebagai penyakit gula karena jumlah atau konsentrasi

glukosa di dalam darah melebihi keadaan normal. Penyakit Diabetes mellitus

adalah kasus gangguan endokrin yang paling banyak ditemui. Gejala-gejala akut

diabetes mellitus disebabkan oleh efek insulin yang tidak maksimal karena insulin

adalah satu-satunya hormon yang dapat menurunkan kadar glukosa darah. Salah

satu gambaran diabetes melitus yang paling menonjol adalah peningkatan kadar

glukosa darah atau hiperglikemia (Sidartawan, 2007).

Keadaan kadar glukosa dalam darah meningkat, pankreas mengeluarkan

hormon yang disebut insulin. Insulin tersebut memungkinkan sel tubuh menyerap

glukosa untuk digunakan sebagai sumber tenaga. Hiperglikemia, terjadi akibat

penurunan penyerapan glukosa oleh sel-sel, disertai oleh peningkatan pengeluaran

glukosa oleh hepar. Pengeluaran glukosa oleh hati meningkat karena proses-proses

yang menghasilkan glukosa, yaitu glikogenolisis dan glukoneogenesis, berlangsung

tanpa hambatan karena insulin tidak ada. Sebagian besar sel tubuh tidak dapat

menggunakan glukosa tanpa bantuan insulin sehingga pada keadaan kronis akan

terjadi kelebihan glukosa ekstrasel sementara terjadi defisiensi glukosa intrasel (

Lauralee, 2001).

Menurut WHO, diabetes mellitus merupakan penyakit kronis yang

disebabkan oleh keadaan dimana pankreas mengalami penurunan produksi insulin

yang menyebabkan kadar glukosa dalam darah meningkat sehingga dapat

7

menyebabkan berbagai komplikasi kerusakan jaringan tubuh, khususnya pembuluh

darah dan syaraf. Hasil data penelitian terbaru menunjukkan bahwa kurang lebih

150 juta orang di seluruh dunia menderita penyakit ini,di prediksi akan terjadi

peningkatan dua kali lipat pada tahun 2025. Besarnya angka kenaikan ini

diperkirakan karena akan banyak bermunculan negara berkembang dengan tingkat

pertumbuhan penduduk yang cenderung tinggi, serta diikuti dengan gaya hidup

modern yang cenderung tidak sehat (Prabawati, 2012).

Peningkatan kadar gula dapat mengakibatkan naiknya osmolalitas cairan

ekstra selular. Peningkatan osmolalitas cairan ekstra selular yang melebihi ambang

batas ginjal akan menyebabkan glukosa dikeluarkan melalui urin. Glukosa yang ada

akan menarik air dan elektrolit lain sehingga orang yang menderita penyakit

diabetes mellitus akan sering kencing atau mengalami poliurinaria. Dengan

keadaan seperti itu, tubuh akan selalu dalam keadaan haus yang mengharuskan

penderita DM banyak minum.

Keadaan hiperglikemia dapat dijumpai hampir diseluruh pasien diabetes

mellitus tipe1. Dengan kadar glukosa darah 300-500 mg/dl pada 21 ( 51,2%) kasus,

lebih dari 500 mg/dl pada 15 (36,5%) kasus dan antara 200-300 mg/dl pada 5

(12,3%) kasus. Diagnosis bahwa pasien menderita DM sudah ditegakkan apabila

kadar glukosa darah menunjukkan salah satu kriteria tersebut. Dengan gejala klinis

poliurua, polifagia, berat badan menurun, dan kadar glukosa darah lebih dari 200

mg/dl atau bila asimptomatis, maka kadar glukosa darah harus lebih dari 200 mg/dl

atau kadar gula puasa darah lebih tinggi dari normal atau dengan tes tolernasi

glukosa kadar glukosa darah puasa >140mg/dl ( Nugroho, 2006).

7

2.2 Histologi Hepar tikus

Hepar adalah salah satu organ yang merupakan pusat metabolisme dalam

tubuh. Hepar memiliki fungsi dalam proses detoksifikasi dan sebagai pusat

biosintesis. Hepar adalah organ yang rentan dengan suatu yang bersifat toksik yang

masuk dalam tubuh, karena hal itu hepar bisa dipakai sebagai bahan pengamatan

histopatologi dalam suatu penyakit (Hudgson, 2004).

Hepar merupakan kelenjar terbesar dalam tubuh. Hepar terdiri atas sel-sel

hati (hepatosit) yang tersusun radial ke arah luar vena sentralis. Sel hati berbentuk

polihedral dengan inti bulat dan terletak di tengah. Pada beberapa sinusoid akan

ditemukan sel Kuppfer, yang merupakan sel makrofag normal yang ditemukan di hati.

Permukaaan hati diliputi oleh lapisan jaringan ikat padat, dan ditutupi oleh peritoneum.

Hati tersusun dalam lobulus yang didalamnya mengalir darah melewati sel-sel hati

melalui sinusoid dari cabang vena porta hepatika ke dalam vena sentralis tiap lobulus.

Setiap lobulus hati terbangun dari berbagai komponen, yaitu sel-sel parenkim hati

(hepatosit), vena sentralis, sinusoid, cabang-cabang vena porta, cabang-cabang arteri

hepatika, sel Kupffer dan kanalikuli billiaris. Sel-sel Kupffer yang berada dalam lumen

sinusoid bertindak sebagai makrofag yang memiliki fungsi fagositik (Ganong, 2003).

2.3 Kedelai Hitam

Kedelai hitam merupakan tanaman asli Asia tropis di Asia Tenggara.

Kedelai hitam banyak ditemukan di Jepang, Korea, Asia Tenggara dan juga

Indonesia. Di Indonesia sendiri, kedelai hitam menjadi salah satu budaya kuliner

Indonesia. Prosentase protein dalam kedelai hitam sebesar 38%, membuat tanaman

ini tergolong dalam tanaman yang berprotein tinggi. Selain mempunyai prosentase

7

protein yang cukup tinggi, kedelai hitam juga mempunyai antioksidan yang dapat

mencegah penyakit tertentu (Joe, 2011).

Namun di Indonesia, pemanfaatan kedelai hitam tidak setenar seperti pada

kedelai kuning. Pemanfaatan kedelai hitam selama ini hanya sebatas bahan pokok

pembuatan kecap. Banyak yang tidak mengetahui bahwa kandungan di dalam

kedelai hitam mempunyai efek positif. Kedelai hitam mengandung isoflavon dan

antosianin yang berfungsi sebagai antioksidan bagi tubuh. Antosianin merupakan

sejenis flavonoid yang merupakan komponen utama warna hitam pada kedelai.

Antosianin pada kedelai dapat menghambat beberapa penyakit karena aktivitas

radikal bebas dan menghambat penuaan dini (Utaminingrum, 2011). Sedangkan

isoflavon dalam kedelai hitam baik untuk kesehatan kulit tubuh untuk menekan

tekanan darah dan dapat pula menurunkan kadar kolesterol dalam darah (Astuti,

2008).

Kedelai hitam dapat digunakan sebagai sumber antosianin prima karena

kandungan C-3-G dan D-3-G yang tinggi. Kandungan antosianin pada kedelai

hitam adalah Delphinidin-3-Glukosida (0 – 3,71 mg/g), Cyanidin-3-Glukosida

(0,94 – 15,98 mg/g), Petunidin-3-Glukosida (0 – 1,41 mg/g), sehingga diperoleh

antosianin total 1,58 – 20,18 mg/g (Muclish, 2012).

Taksonomi kedelai hitam sebagai berikut (Sharma, 2001) :

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Sub-divisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledonae

7

Ordo : Polypetales

Famili : Legumenosae (Papilionaceae)

Sub-famili : Papilionoideae

Genus : Glycine

Species : Glycine max (L.) merr

2.4.1 Induksi Diabetes Mellitus

2.4.1.1 Tikus Putih (Rattus novergicus)

Klasifikasi tikus putih menurut Sirois (2005) yaitu :

Kingdom : Animalia

Fikum : Chordota

Kelas : Mamalia

Ordo : Rodentia

Sub Ordo : Myomorpha

Famili : Muridae

Sub famili : Murinae

Genus : Rattus

Spesies : Rattus novergicus

Hewan laboraturium merupakan hewan yang sengaja dipelihara dan

diternakan untuk dipakai sebagai penelitian atau pengamatan laboratoris. Pemilihan

tikus putih untuk percobaan disebabkan oleh beberapa hal, antara lain : ekonomis,

mudah berkembangbiak, mudah disimpan karena ukuran tubuh kecil, memiliki

perilaku (biologis) tubuh menyerupai manusia, dan mudah beradaptasi dengan

lingkungan yang baru (Sirois, 2005).

7

Ciri-ciri Rattus novergicus antara lain : bertubuh panjang dengan kepala

lebih sempit, telinga tebal namun pendek dengan rambut halus, mata berwarna

merah, dan ekornya yang panjang. Sedangkan beratnya mencapai 240 g untuk tikus

putih jantan berumur 12 minggu. Namun untuk betina hanya mencapai 200 g. Tikus

putih memiliki lama hidup berkisar 4-5 tahun.

2.4.2 Mekanisme Streptozotocin

Streptozotocin dapat digunakan untuk menginduksi baik DM tipe 1 maupun

tipe 2 pada hewan uji. Dua macam dosis STZ yang biasa digunakan untuk

menaikkan gula darah pada hewan coba yakni pertama dosis tinggi tunggal > 40

mg/kgBB, kedua dosis rendah (MLD-STZ, Multiple Low Dose Streptozotocin) <

40 mg/kgBB yang diberikan 5 hari berturut-turut (Yu et all., 2004). Dosis yang

digunakan pada penelitian ini adalah 20 mg/kgBB sebanyak lima kali berturut-turut

selama 5 hari. Streptozotocin menginduksi terjadinya diabetes mellitus pada tikus

melalui perusakan DNA sel β pankreas. Di dalam sel β pankreas, STZ merusak

DNA melalui pembentukan NO, radikal hidroksil dan hydrogen peroksida.

Perusakan DNA ini menstimulasi ribosilasi poli ADP yang selanjutnya

menyebabkan deplesi NAD+ dan ATP di dalam sel. Akibatnya produksi insulin

terganggu dan jumlah yang dihasilkan berkurang atau bahkan dapat menyebabkan

apoptosis sel. Peningkatan defosforilasi ATP akan memacu peningkatan substrat

untuk enzim xantin oksidase (sel β pankreas mempunyai aktivitas tinggi terhadap

enzim ini), lebih lanjut meningkatkan produksi asam urat xantin oksidase

mengkatalisis reaksi pembentukan anion superoksida aktif. Dari pembangkitan

anion superoksida, terbentuk hidrogen peroksida dan radikal superoksida. NO dan

7

oksigen reaktif tersebut adalah penyebab utama kerusakan sel β pankreas

(Szukudelsi, 2001)

Paparan STZ pada hewan coba akan menyebabkan perkembangan

hiperglikemia. Perubahan sel β pankreas mulai terjadi setelah 6 jam injeksi STZ,

dimana pada tahap ini menunjukkan kadar glukosa darah (80-150 mg/dL).

Selanjutnya akan terjadi kenaikan glukosa darah setelah 12-24 jam berkisar (> 300

mg/dL) (Qiu et al., 2007).

2.5 Malondialdehida (MDA)

Malondialdehida merupakan produk utama hasil oksidasi Poly Unsaturated

Fatty Acid (PUFA) dan MDA merupakan salah satu yang paling sering digunakan

sebagai indikator peroksidasi lipid. MDA juga digunakan secara luas sebagai

petanda biologik stress oksidatif, sensitif, dan bisa digunakan pada penelitian dalam

jumlah besar. MDA merupakan produk peroksidasi lipid yang relatif konstan

terhadap proporsi peroksidasi lipid, oleh karena itu merupakan indikator yang tepat

untuk mengetahui kecepatan (rate) proses peroksidasi lipid in vivo (Siswonoto,

2008).

Malondialdehida merupakan satu dari beberapa substansi dengan berat

molekul ringan yang dihasilkan pada proses peroksidasi lipid. Polimerasi MDA

dapat terhidrolisa dalam medium asam dan labil dalam pemanasan. Metode TBARS

menggunakan teknik kolorimetri dengan melihat perubahan warna, tetapi

mempunyai hasil yang tidak spesifik, oleh karena juga terukur aldehid yang lain.

Hasil TBA-MDA mempunyai hasil yang lebih baik dengan menggunakan teknik

fluorometri. Pemeriksaan yang lebih spesifik menggunakan metode High

7

Performance Liquid Chromatography (HPLC) dan memenuhi kriteria akurasi,

spesifisitas dan sensitivitas dan metode ini sebagai pilihan untuk evaluasi status

stres oksidatif (Siswonoto, 2008).

14

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konseptual

Streptozotocin (STZ) merupakan agen diabetogenik hewan model tikus

yang dapat membangkitkan oksigen reaktif sehingga menyebabkan peningkatan

Reactive Oxygen Species (ROS) dan merupakan donor Nitrite Oxide (NO).

Peningkatan ROS akan terjadi apabila tikus model diinduksi STZ sehingga dapat

menyebabkan kerusakan sel β pankreas. Kerusakan sel β pankreas dapat

mengakibatkan penghambatan sintesis dan sekresi insulin yang menyebabkan tikus

model menderita DM 1. Diabetes mellitus tipe 1 menyebabkan stres oksidatif,

dimana produksi radikal bebas (oksidan) melebihi kemampuan antioksidan tubuh.

Sumber stres oksidasi pada diabetes disebabkan perpindahan keseimbangan reaksi

redoks karena perubahan metabolisme karbohidrat dan lipid dalam hati yang dapat

meningkatkan pembentukan ROS dari reaksi glikasi dan oksidasi lipid sehingga

menurunkan sistem pertahanan antioksidan. Penurunan insulin mengakibatkan

kerja Hormone Sensitive Lipase (HSL) meningkat sehingga terjadi peningkatan

pemecahan trigliserida (TG) menjadi Free Fatty Acid (FFA) dan gliserol. Free

Fatty Acid (FFA) akan meningkat jumlahnya dalam darah yang kemudian akan

masuk ke hepar untuk diesterifikasi menjadi TG. Kerja enzim lipoprotein lipase

(LPL) dalam menghidrolisa VLDL juga akan terganggu apabila terjadi penurunan

insulin yang mengakibatkan TG terakumulasi di dalam sel hepar sehingga terjadi

kerusakan pada sel hepar berupa degenerasi lemak. Di sisi lain, keadaan insulin

yang meningkat dapat mengakibatkan kenaikan ROS dan berefek pada

15

pengurangan atom hidrogen pada poly-unsurated fatty acid (PUFA) di membran sel

dan menginisiasi proses peroksidasi lipid yang ditandai dengan adanya peningkatan

kadar malondialdehida (MDA).

Bahan terapi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak kedelai

hitam yang mengandung antioksidan berupa isoflavon dan antosianin yang dapat

mengurangi terbentuknya ROS dan terjadinya peroksidasi lipid. Penurunan

pembentukan ROS dan terjadinya peroksidasi lipid diharapkan akan meningkatkan

aktivitas katalase dan menurunnya kadar MDA serta dapat memperbaiki keadaan

sel hepar.

16

Gambar 3.1 Kerangka Konseptual Penelitian

Keterangan :

: Efek pemberian streptozotocin

: Efek pemberian terapi ekstrak kedelai hitam

: variabel bebas

: variabel tergantung

: variabel kendali

TIKUS Streptozotocin

Nitrite oxide

Peroxinitrite

Kerusakan sel β pankreas

DM 1 Terapi ekstrak

air kedelai hitam

Insulin

HSL

Insulin

Hidrolisis TG

Esterifikasi FFA

Hidrolisis Hepar

Histopatologi hepar

ROS

Berikatan dengan PUFA

Peroksidasi lipid

MDA

17

3.2 Hipotesis Penelitian

Hipotesis pada penelitian ini antara lain :

1. Efek terapi air rebusan kedelai hitam dapat menurunkan kadar

malondialdehida (MDA) pada tikus (Rattus nirvegicus) model diabetes

mellitus tipe 1 hasil induksi streptozotocin.

2. Efek terapi air rebusan kedelai hitam dapat memperbaiki gambarn

histopatologi jaringan hepar tikus (Rattus novergicus) model diabetes

mellitus tipe 1 hasil induksi streptozotocin.

18

BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2013 sampai Maret 2014 di

Labotarium Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Brawijaya Malang.

4.2 Alat dan Bahan Penelitian

4.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi,

spectofotometer UV-Vis, vortex, kandang tikus, tempat air minum dan pakan tikus,

gunting, pinset, pipet tetes, gelas objek, spatula, pisau mitikrom, neraca analitik,

glucometer digital, scalpel, alat bedah, penjepit (block holder) mitokrom, inkubator,

hot plate, penangas air, sarung tangan, mikroskop cahaya, alat sentrifugasi, kuvet,

mortar.

4.2.2. Bahan

Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus Ratttus norvegicus strain wistar

jantan dengan berat badan berkisar 100-200 gram yang dipelihara dalam kotak

kandang berukuran 20x30x40 cm, kedelai hitam, Streptozotocin (STZ), Buffer

Sitrat pH 4,5, alkohol 70%, 80% dan 90%, NaCl 0,9%, Phosphat Buffer Saline

(PBS), Paraformaldehid (PFA) 4%, formalin, etanol bertingkat (95%, 80%, 70%),

parafin, pewarna hemaktosilin-eosin (HE), xilol, aquades, entellan, HCL 1 N dan

µL Na-Thio 1 %, Na2HPO4, KH2PO4, H2O2.

19

4.3 Tahapan Penelitian

Tahapan penelitian yang dilakukan antara lain:

1. Rancangan penelitian dan persiapan hewan coba

2. Pembuatan ekstrak kedelai hitam(Glycine max (L.) merr.

3. Pembuatan larutan Streptozotocin kemudian di injeksikan ke hewan model

melalui intraperitoneal.

4. Pengukuran glukosa darah dengan menggunakan glukometer

5. Terapi ekstrak kedelai hitam pada tikus DM

6. Pengambilan organ hepar

7. Pembuatan preparat histopatologi organ hepar

8. Pengukuran kadar malondialdehyde (MDA) menggunakan uji TBA

9. Analisa data

4.4 Prosedur Kerja

4.4.1 Rancangan Penelitian dan Persiapan Hewan Coba

Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak

Lengkap (RAL). Hewan coba dibagi menjadi lima kelompok perlakuan, yaitu

kelompok kontrol hewan coba sehat (-), kelompok kontrol hewan coba sakit (+),

kelompok terapi 1, kelompok terapi 2, dan kelompok terapi 3.

Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus (Kusriningrum, 2008)

t (n-1) ≥ 15

5 (n-1) ≥ 15

20

5n-5 ≥15 Keterangan :

5n ≥20 t = jumlah kelompok perlakuan

n ≥ 4 n = jumlah ulangan yang diperlukan

Berdasarkan perhitungan di atas, maka untuk 5 perlakuan jumlah sampel atau

ulangan paling sedikit 4 kali dalam setiap kelompok, sehingga penelitian ini

menggunakan 4 ulangan.

Penelitian ini menggunakan hewan coba (Rattus norvegicus) jantan strain

Wistar berumur antara 8-12 minggu dan memiliki berat badan rata-rata 200 gram.

Tikus yang digunakan untuk penelitian diadaptasikan terhadap lingkungan selama

tujuh hari. Tikus ditempatkan pada bak plastik berukuran 20x30x40cm yang

dilengkapi penutup kawat, lantai kandang yang mudah dibersihkan, berlokasi pada

tempat yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari polutan dengan pemberian pakan

berupa ransum basal yang mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral,

vitamin, dan air.

Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah

Variabel bebas : STZ dan pemberian terapi ekstrak kedelai hitam

Variabel terikat : kadar MDA dan gambaran histopatologi hepar

tikus.

Variabel kontrol : Jenis kelamin, umur, berat badan, strain.

4.4.2 Pembuatan Ekstrak Kedelai Hitam

Kedelai hitam yang didapatkan dibersihkan dengan air dan dikeringkan,

kemudian di masukkan kedalam tabung dan ditambah air 100mL akuades.

Kemudian dipanaskan 70oC dan disaring dengan menggunakan kain. Kemudian

21

ekstrak air kedelai hitam yang dihasilkan di analisis fitokimia dengan liquid

chromatography–mass spectrometry (LC-MS) untuk mengetahui kandungan

antosianin pada kedelai hitam.

4.4.3 Pembuatan Larutan Streptozotocin dan Injeksi Intraperitonial

Streptozotocin 100 mg dilarutkan pada buffer sitrat 3mL dengan pH 4,5

kemudian divortex agar homogen, larutan yang sudah dihomogenkan disesuaikan

dengan berat badan tikus. Pengambilan larutan STZ untuk injeksi tikus disesuaikan

dengan jumlah berat badan tikus selanjutnya disimpan pada suhu 4°C. Besarnya

dosis yang digunakan sebanyak 20mg/kg BB per hari selama 5 hari berturut turut.

Hewan coba diposisikan menghadap ke arah ventral hingga terlihat bagian

abdomen, disemprotkan alkohol 70% bagian abdomen, kulit abdomen dicubit,

selanjutnya spuit insulin yang berisi STZ di injeksikan pada bagian intraperitoneal.

Tikus DM ditandai dengan kadar glukosa ≥200 mg/dL (Rosalina, 2011)

4.4.4 Pengukuran Glukosa Darah

Pengambilan darah untuk pengujian kadar glukosa darah dilakukan sebelum

injeksi MLD-STZ sebagai data kadar glukosa darah awal. Pengecekan kadar

glukosa darah dengan menggunakan glukometer digital. Untuk glucotest awal,

disiapkan stick glucometer dan glukometer digital (one touch lifescan) sesuai

dengan petunjuk penggunaan. Darah dari ekor diteteskan pada stick glukometer dan

ditunggu hasil yang tertera pada layar glukometer digital. Proses pengecekan kadar

glukosa ini dilakukan setiap kali pemerikasaan glukosa, yaitu setelah peyuntikkan

MLD-STZ (kadar glukosa darah melebihi 135 mg/dL tikus dinyatakan DMT 1),

dan setelah terapi dengan air rebusan kedelai hitam (Rosalina, 2011).

22

4.4.5 Terapi Ekstrak Kedelai Hitam pada Tikus DM

Hewan terapi dibagi menjadi 5 kelompok yaitu kelompok 1 sebagai kontrol

negatif, kelompok 2 sebagai kontrol positif, kelompok 3 sebagai kelompok terapi

dosis 500mg/kg BB, kelompok 4 sebagai kelompok terapi dosis 750mg/kg BB dan

kelompok 5 sebagai kelompok terapi dosis 1000mg/kg BB. Masing-masing

kelompok (kelompok 3,4,5) diterapi melalui oral (sonde) sebanyak 2mL per tikus

per hari selama 2 minggu kemudian dibedah.

4.4.6 Pengambilan Organ Hepar

Pengambilan organ hepar tikus (Rattus norvegicus) dilakukan dengan

melakukan pembedahan. Sebelum dilakukan pembedahan, tikus di eutanasi

dengan cara dislokasi leher. Alat bedah disiapkan untuk pengambilan organ hepar.

Setelah tikus mati, tikus diletakkan pada nampan bedah dan diletakkan pada posisi

ventro dorsal. Selanjutya dibuka pada bagian abdomen dan diambil organ hepar

dan dicuci dengan NaCl fisiologis lalu direndam dalam Phospat Buffer Saline

(PBS).

4.4.7 Pembuatan Preparat Histologi Organ Hepar (Muntiha, 2001)

Pada pembuatan preparat hepar yaitu dengan memasukkan organ hepar

pada blok paraffin hasil penanaman sebelumnya pada penjepit (block holder)

mitokrom yang diatur sejajar dengan mata pisau mitokrom. Pemotongan ini

diawali dengan mengatur ketebalan irisan diatas 10nm untuk mempercepat

pencapaian bidang potongan jaringan. hepar dipotong dengan ukuran 5nm. Irisan

diambil dengan kuas dan dimasukkan dalam air pada suhu ruang membuka lipatan

yang mungkin terjadi pada preparat. Hasil irisan dipindahkan dengan mengunakan

23

kuas ke dalam air hangat pada suhu 38-40°C untuk meluruskan kerutan halus yang

ada. Irisan yang sempurna, diambil dengan gelas obyek dan dikeringkan,

kemudian diletakkan pada hot plate 38-40°C sampai kering, selanjutnya preparat

disimpan dalam inkubator pada suhu 38-40°C selama 24 jam. Gambaran histologi

digunakan untuk membedakan derajat insulin dengan gambaran pada struktur

jaringan.

Pertama dilakukan tahap deparafinisasi yaitu preparat dimasukkan

kedalam xilol bertingkat 1-3 masing-masing selama 5 menit. Kemudian

dilanjutkan tahap rehidrasi, preparat dimasukkan dalam etanol bertingkat yang

dimulai dari etanol absolut 1-3, etanol 95% , 80% ,dan 70% masing-masing

selama 5 menit dan direndam dalam aquades 5 menit dan dilanjutkan dengan tahap

pewarnaan,yaitu preparat dimasukkan dalam pewarna hemotoxylen sampai

didapatkan hasil warna yang terbaik kurang lebih 10 menit, kemudian dibilas

dengan aquades sebelum dilanjutkan dengan pewarnaan eosin. Setelah dilakukan

pembilasan, dilanjutkan dengan pewarnaan menggunakan eosin dengan

memasukkan preparat dalam pewarnaan eosin alcohol selama 5 menit, kemudian

preparat direndam dalam aquades agar dapat menghilangkan kelebihan eosin.

Tahap selanjutnya adalah dehidrasi,yaitu memasukkan preparat dalam etanol

bertingkat 80%, 90%, dan 95% hingga etanol absolut 1-3. Selanjutnya clearing,

pada proses clearing dilakukan dengan memasukkan preparat pada xilol 1,2, dan

kemudian dikering anginkan. Selanjutkan dilakukan mounting (perekatan) dengan

ettelan.

24

4.4.8 Pengukuran Kadar MDA

4.4.8.1 Pembuatan Kurva Standar MDA

Konsentrasi kurva standar MDA yaitu 0,1,2,3,4,5,6,7 dan 8 µg/mL masing

masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi berbeda dan diambil dengan 100 µL

ditambahkan aquades 550 µL. Masing-masing tabung berisi 650 µL larutan standart

100 µL TCA 100%, 250 µL HCL 1N dan 100 µL Na-Thio 1%. Divortex supaya

homogen dan setiap tabung ditutup dengan plastik warp dan diberi lubang.

Diinkubasi dengan waterbath selama 30 menit suhu 1000C. Kemudian didinginkan

pada ice waterbath. Dengan spektrofotometri UV-Vis pada λmaks diukur

absorbansinya pada range panjang gelombang 530 nm bertujuan untuk mengetahui

panjang gelombang MDA. Selanjutnya dibuat standar kurva MDA pada variasi

konsentrasi panjang gelombang maksimum (1;2;3;4;5;6;7;8 µg/mL) (Sofia, 2013).

4.4.8.2 Pengukuran Kadar MDA dengan Uji Thiobarbituric Acid (TBA)

Organ ginjal diambil 1,8 gram dipotong kecil-kecil lalu dihancurkan dalam

mortar dingin diletakkan di blok es. Ditambahkan 1 mL NaCL 0.9%, dipindah

dalam tabung mikro dan disentrifugasi 8000 rpm selama 20 menit diambil

supernatannya. 100µL diambil supernatan ginjal ditambah 550µL aquades.

Kemudian ditambahkan 100µL TCA 250 µL HCL 1N dan 100µL Na-Thio. Larutan

dihomogenkan dengan vortex setiap penambahan reagen. Disentrifugasi dengan

kecepatan 500rpm selama 10 menit, supernatan diambil dan pindah pada tabung

reaksi yang baru. Larutan diinkubasi pada water bath dengan suhu 1000C selama

30 menit dibiarkan pada suhu ruang. Panjang gelombang maksimum diukur

25

menurut absorbansi dalam uji TBA, diplotkan pada kurva standar yang sudah

dihitung nilai konsentrasi setiap sampel (Sofia, 2013)

4.4.9 Analisa Data

Data yang diperoleh berupa kuantitatif dari hasil pengukuran kadar MDA

dan kualitatif hasil pengamatan histopatologi. Data selanjutnya dianalisis

menggunakan SPSS rev.16.0 dengan analisis ragam ANOVA ( Analysis of

Variance ) . Apabila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan uji Tukey α = 5%.

25

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Pengaruh Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam (Glycine max(L.) Merr.)

Terhadap Penurunan Kadar Malondialdehida (MDA) pada Organ Hepar

Tikus dengan Induksi Streptozotocin (STZ)

Analisis kadar radikal bebas dalam penelitian ini dilakukan dengan mengukur

kadar malondialdehida (MDA) organ hepar MDA digunakan secara luas sebagai

indikator keberadaan radikal bebas dalam tubuh dan kerusakan oksidatif, terutama

dari Polyunsuturated fatty acid (PUFA). MDA merupakan dialdehid tiga karbon

yang sangat reaktif yang juga dapat diperoleh dari hidrolisis pentosa, deoksiribosa,

heksosa, beberapa asam amino dan DNA. MDA sebagai hasil akhir dari proses

peroksidasi lipid yang dipicu oleh stress oksidatif. Stress okdsidatif adalah keadaan

bilamana kapasitas antioksidan tidak cukup untuk melawan ROS (Yustika, 2013).

Tabel 5.1 Kadar MDA dari organ hepar tikus

Kelompok Rata-rata Kadar

MDA (mg/mL)

Kadar MDA(%)

Peningkatan Penurunan

Kontrol negatif (P1) 0,217 ± 0,032a - -

Kontrol positif (P2) 0,688 ± 0,033c 69 -

Terapi 1 (500 mg/kgBB) (P3) 0,612 ± 0,054c - 11

Terapi 2 (750 mg/kgBB) (P4) 0,457 ± 0,030b - 34

Terapi 3 (1000 mg/kgBB) (P5) 0,298 ± 0,048a - 57 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05).

Perbedaan kadar MDA antara kelompok P1 (kontrol – ) dengan kelompok P2

(kontrol +) menunjukkan perbedaan hasil yang signifikan (p<0,05). Pada kelompok

26

P2 (kontrol +) tidak berbeda nyata dengan kelompok P3 (500 mg/kg BB). Hal ini

menunjukkan bahwa efek ROS yang terdapat pada perlakuan ini sama dan belum

menunjukkan perbaikan yang signifikan setelah diberikan terapi namun sudah

terdapat penurunan dari nilai kadar MDA. P4 (750 mg/kg BB) dan P5 (1000 mg/kg

BB) berbeda tapi sedikit signifikan. Hal ini diketahui bahwa P5 dapat menurunkan

kadar MDA. Data pada (Tabel 5.1) menunjukkan bahwa kelompok tikus DM terjadi

penurunan kadar MDA sebesar 57 % dibandingkan dengan P2 (kontrol +) sebesar

69%. MDA meningkat dikarenakan ketidak seimbangan antara produksi ROS dan

antioksidan dalam tubuh suatu organisme. Meningkatnya produksi ROS pada tikus

yang diinduksi STZ tidak hanya disebabkan oleh hiperglikemia, namun juga

disebabkan oleh faktor yang lain. Sumber utama ROS pada DM adalah : (1)

autooksidasi glukosa; (2) produksi ROS yang berlebih pada mitokondria; (3) glikasi

non-enzimatik dan; (4) jalur poliol (Lemos et al., 2012).

Perbedaan yang tidak signifikan (p>0,05) antara kelompok P5 (terapi 1000

mg/kg BB) dengan P1 (kontrol –) menunjukkan respon penurunan kadar MDA

kelompok P5 sama dengan kelompok P1 (kontrol –) (Lampiran 12), maka pada

penelitian ini P5 (terapi 1000 mg/kg BB) merupakan hasil terbaik untuk terapi DM

pada tikus hasil induksi Streptozotocin (STZ). Penurunan kadar MDA organ hepar

ini menunjukkan bahwa di dalam ekstrak kedelai hitam kulit mengandung senyawa

antosianin yang berperan sebagai antioksidan. Antosianin di dalam ekstrak kedelai

hitam akan menghambat kerusakan pada membran sel dengan cara mengikat dan

menstabilkan radikal bebas pada organ hepar. Streptozotocin yang diinjeksikan

27

berpotensi untuk meningkatkan radikal bebas di dalam tubuh. Radikal bebas tersebut

diedarkan ke seluruh tubuh yang kemudian mencapai organ hepar. Radikal bebas

secara alami akan dinetralisir oleh antioksidan yang diproduksi oleh tubuh. Pengaruh

negatif radikal bebas terjadi ketika jumlahnya melebihi kemampuan sistem

pertahanan antioksidan tubuh sehingga menimbulkan kondisi stres oksidatif pada

hepar.

Hasil perhitungan kadar MDA menunjukkan terapi yang paling tinggi dapat

menurunkan kadar MDA, senyawa antioksidan terbukti dapat menurunkan

kandungan radikal bebas di dalam organ hati. Radikal bebas yang tidak stabil akan

bebas berikatan dengan makromolekul terdekat untuk mencari pasangan elektron.

Protein, karbohidrat, asam nukleat dan lipid menjadi sasaran utama dari radikal

bebas. Apabila makromolekul yang teroksidasi dan terdegradasi tersebut merupakan

bagian dari sel, maka dapat mengakibatkan kerusakan pada sel. Murray et al., (2003),

menjelaskan bahwa pada keadaan tertentu dapat terjadi ketidakseimbangan antara

oksidan dan antioksidan yang disebut dengan stres oksidatif. Keadaan ini dipicu oleh

peningkatan produksi ROS di dalam tubuh. Kerusakan akan menyebabkan perubahan

terhadap struktur biologis dari membran, serta dapat menonaktifkan ikatan membran

dengan reseptor atau enzim yang dapat mengganggu fungsi normal sel.

Peningkatan kadar MDA menunjukkan bahwa induksi STZ dapat

menyebabkan terjadinya stres oksidatif yang akan mengakibatkan gangguan pada

organ hati. Stres oksidatif memicu terjadinya peroksidasi lipid pada hati yang dapat

merusak organel sel. Terjadinya peroksidasi lipid akan meningkatkan produksi

28

malondialdehyde (MDA). Menurut Grotto et al., (2009), peroksidasi lipid terjadi

ketika Polyunsuturated fatty acid (PUFA) sebagai komponen penyusun membran sel

diserang oleh radikal bebas. PUFA memiliki ikatan ganda karbon-karbon yang

menjadi target utama dari radikal bebas. Radikal bebas akan melemahkan ikatan

karbon hidrogen, sehingga pemindahan hidrogen dapat terjadi dengan mudah. Atom

hidrogen yang terlepas akan membentuk radikal lipid dan menghasilkan suatu radikal

lipid peroksil ketika mengalami oksidasi. Radikal peroksil selanjutnya mengalami

reaksi dengan PUFA lain, pemindahan elektron, hingga dihasilkan lipid

hidroperoksida dan radikal lipid lain. Reaksi tersebut terjadi secara berantai. Salah

satu produk akhir dan sebagai biomarker biologis peroksidasi lipid untuk menilai

stres oksidatif adalah malondialdehyde (MDA).

Tubuh secara biologis memiliki pertahanan antioksidan enzimatis terhadap

inaktivasi radikal bebas. Antioksidan bereaksi dengan radikal bebas dengan cara

mengurangi konsentrasi oksigen, mencegah pembentukan singlet oksigen yang

reaktif, mencegah inisiasi rantai pertama dengan menangkap radikal primer seperti

radikal hidroksil, mengikat katalis ion logam, mendekomposisi produk produk primer

radikal menjadi senyawa non-radikal, dan memutus rantai hidroperoksida.

Antioksidan tersebut memberikan pertahanan yang sangat efektif terhadap

peroksidasi lipid, tetapi stres oksidatif yang berat dapat berakibat pada tidak

mencukupinya antioksidan yang tersedia. Hal ini menyebabkan tubuh membutuhkan

antioksidan eksogen untuk mengurangi kapasitas radikal bebas berlebihan yang dapat

menimbulkan kerusakan. Kedelai hitam merupakan salah satu yang berpeluang

29

dimanfaatkan sebagai antioksidan eksogen karena mengandung senyawa

antosianinyang tinggi. Muchlis (2012) menunjukkan bahwa kedelai hitam

mengandung senyawa antosianin yang dapat berperan sebagai antioksidan dan

penangkal radikal bebas.

Aktivitas antosianin yang terkandung dalam ekstrak kedelai hitam pada

penelitian ini mampu menurunkan kadar MDA organ hepar kelompok P3, P4, dan P5.

Penurunan kadar MDA kelompok P5 sebesar 57% menunjukkan bahwa antosianin

yang terkandung dalam dosis 1000 mg/kg BB merupakan dosis efektif serta dapat

berperan optimal sebagai antioksidan untuk menstabilkan radikal bebas yang reaktif

sehingga reaksi berantai yang terjadi akibat stres oksidatif dapat terhambat dan MDA

sebagai produk hasil peroksidasi lipid juga menurun. Hal ini menunjukkan bahwa

semakin tinggi pemberian dosis terapi maka penurunan kadar MDA sama dengan

kelompok kontrol sehat.

30

5.2 Pengaruh Pemberian Ekstrak Kedelai Hitam (Glycine max(L.) Merr.)

Terhadap Gambaran Histopatologi Organ Hepar Tikus dengan Induksi

Streptozotocin (STZ)

Gambaran histopatologi hepar diabetus melitus yang diterapi dengan ekstrak

kedelai hitam (Glycine max (L.) Merr.)

Gambar 5.2 Histopatologi organ hepar tikus dengan (HE, 400x) Keterangan : A = Kontrol negatif (normal); B = Kontrol positif (DM1) ; C =

Perlakuan terapi ekstrak kedelai hitam dosis 500 mg/KgBB ; D =

Perlakuan terapi ekstrak kedelai hitam dosis 750 mg/KgBB ; E=

Perlakuan terapi ekstrak kedelai hitam dosis 1000 mg/KgBB; VS = vena sentralis.

31

Perbandingan hasil pengamatan preparat organ hepar tikus pada kelompok

kontrol negatif, kelompok kontrol positif, dan kelompok terapi ekstrak kedelai

hitamdosis 500 mg/kgBB, 750 mg/kgBB, 1000 mg/kg BB pada penelitian ini

memperlihatkan adanya perbedaan pada bagian sinusoid dan terjadinya nekrosis sel

hepatosit

Gambaran histopatologi organ hepar pada penelitian ini menunjukkan bahwa

pada keadaan normal (kelompok kontrol negatif) sel hepatosit tersusun rapi secara

radier dalam lobulus hepar, inti yang teramati berbentuk bulat, sinusoid terlihat

memancar secara sentrifungal dari vena sentralis dan tidak mengalami penyempitan

maupun dilatasi, beberapa sel hepatosit terlihat dekat dengan vena sentralis dan tidak

ada sel-sel inflamasi atau peradangan (Gambar 5.2-A). Gambaran ini sesuai dengan

Robbin, (2007), dimana gambaran normal sel pada organ hati tikus yang sudah

diwarnai dengan HE menunjukkan sel hepatosit berbentuk kuboid, tersusun radier,

inti sel bulat letaknya sentral. Sinusoid berbentuk irregular, ukurannya lebih besar

dari kapiler, mempunyai dinding seluler yaitu kapiler yang diskontinu, tidak

akumulasi lemak, tidak terdapat sel yang mengalami nekrosis dan sel hati berwarna

basofilik, sedangkan bagian sitoplasma mengambil warna asidofilik.

Gambaran histopatologi hepar tikus DM1 (kontrol positif) menunjukkan

perubahan berupa sel hepatosit tersusun tidak teratur, batas tidak jelas, pelebaran

sinusoid dan bentuk yang tidak teratur apabila dibandingkan dengan kelompok

kontrol negatif. Pada beberapa bagian sel hepatosit juga terlihat mengalami nekrosis

(Gambar 5.2-B). Hal ini disebabkan karena pada kondisi hiperglikemia dapat

32

memicu tingginya produksi ROS pada hepar, sehingga terjadi peroksidasi lipid dan

stres oksidatif di dalam sel maupun membran sel yang akan merusak jaringan hati.

Kadar antioksidan alami di dalam tubuh yang tidak dapat menetralisir ROS yang

terlalu tinggi kemudian menyebabkan kerusakan dan kematian sel berupa nekrosis

pada sel hepatosit (Agnieszka et al., 2011).

Penderita penyakit hati yang lemaknya tinggi juga cenderung mengidap

diabetes. Selain itu gula dan lemak bisa menyebabkan komplikasi pada jantung, otak,

dan pembuluh darah. Penderita diabetes sering mempunyai trigliserida yang tinggi

dan biasaanya disertai dengan kolesterol HDL yang rendah. Patogenesis kelainan

pada sel hati ini muncul karena adanya resistensi insulin yang dihasilkan oleh

lipolisis. Lipolisis ini akan meningkatkan sirkulasi asam lemak bebas yang kemudian

diambil oleh hati. Asam lemak dihati ini akan menyebabkan pembentukan radikal

bebas akibat peroksidasi lipid (Groop et al., 2007 dan Tolman et al., 2006).

Radikal bebas (prooksidan) di dalam tubuh dapat diinaktivasi oleh zat

antioksidan. Antioksidan dapat diproduksi oleh tubuh secara fisiologis (endogen)

maupun diperoleh melalui diet (eksogen). Kebanyakan sumber alami antioksidan

eksogen berasal dari tumbuh-tumbuhan(Handajani, 2008). Salah satu tumbuhan yang

mengandung antioksidan adalah kedelai hitam (Glycine max(L.) Merr.). Kedelai

hitam mengandung isoflavon dan antosianin yang berfungsi sebagai antioksidan bagi

tubuh (Utaminingrum, 2011).

Gambaran histopatologi hepar tikus DM1 dan mendapat terapi ekstrak kedelai

hitam dosis 500 mg/kgBB menunjukkan gambaran histopatologi yang lebih baik dari

33

pada kelompok tikus kontrol positif yaitu penurunan tingkatan nekrosis, namun

sinusoid belum terlihat jelas dan masih tidak beraturan, serta belum terlihat memancar

dari vena sentralis apabila dibandingkan dengan kelompok kontroljelas, lebih teratur,

dan terlihat memancar dari vena sentralis apabila dibandingkan dengan kelompok

kontrol negatif (Gambar 5.2-C). Gambaran histopatologi hepar tikus DM1 dan

mendapat terapi ekstrak kedelai hitam dosis 750 mg/KgBB menunjukkan gambaran

histopatologi yang semakin baik daripada kelompok tikus terapi dosis 500 mg/KgBB

yaitu penurunan tingkatan nekrosis, sinusoid sudah mulai terlihat jelas meskipun

belum begitu beraturan serta belum terlihat memancar dari vena sentralis apabila

dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (Gambar 5.2-D). Perbaikan

gambaran histopatologi hepar tikus DM1 yang mendapat terapi ekstrak kedelai hitam

1000 mg/KgBB sangat terlihat jelas, ditandai dengan penurunan tingkatan nekrosis,

sinusoid sudah terlihat jelas, terlihat beraturan, serta terlihat memancar dari vena

sentralis apabila dibandingkan dengan kelompok tikus kontrol negatif (Gambar 5.2-

E). Perbaikan gambaran histopatologi organ hati terjadi karena adanya senyawa aktif

antosianin yang berperan sebagai antioksidan dan antiinflamasi dari ekstrak kedelai

hitam dosis 500 mg/kg BB, 750 mg/Kg BB, 1000 mg/Kg BB. Antosianin dapat

menghambat Reactive Oxygen Species (ROS) didalam vena sentralis hati.

Antosianin merupakan senyawa flavonoid yang memiliki kemampuan sebagai

antioksidan. Umumnya senyawa flavonoid berfungsi sebagai antioksidan primer,

chelator dan scavenger terhadap superoksida anion. Antosianin dalam bentuk aglikon

lebih aktif dari pada bentuk glikosidanya (Santoso, 2006). Selain itu, antosianin juga

34

memiliki kemampuan sebagai antimutagenik dan antikarsinogenik, mencegah

gangguan fungsi hati, antihipertensi, dan menurunkan kadar gula darah (Jusuf dkk.,

2008). Antosianin bekerja sebagai antioksidan sekunder seperti halnya dengan β

karoten, yakni memecah rantai oksidasi lipid peroksida. Antosianin berperan sebagai

anti diabetik dengan melindungi organ hati dari stres oksidatif. Antosianin dari

ekstrak kedelai hitam mampu menurunkan kadar glukosa darah dengan meningkatkan

kerja reseptor insulin, memperbaiki fungsi antioksidan dengan menekan

malondialdehida (MDA).

36

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

Hasil penelitian dan pembahasan yang telah disampaikan dapat diambil

kesimpulan bahwa :

1. Pemberian terapi ekstrak kedelai hitam (Glycine max(L.) Merr.) dengan dosis

500 mg/KgBB, 750 mg/KgBB, dan 1000 mg/KgBB berpengaruh secara nyata

serta dapat menurunkan kadar Malondialdehida (MDA) pada hepar tikus.

Dosis efektif terapi adalah dosis 1000 mg/KgBB karena mampu menurunkan

kadar MDA dengan maksimal sebesar 57%.

2. Pemberian terapi ekstrak kedelai hitam (Glycine max(L.) Merr.) yang

mengandung senyawa antosianin dan flavonoid yang mampu memperbaiki

histopatologi tikus (Rattus norvegicus) model diabetes mellitus tipe 1 yang

ditunjukkan dengan adanya perbaikan pada sel hepatosit.

6.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengaplikasikan terapi ekstrak

kedelai hitam sebagai terapi suportif pada penyakit metabolik lainnya.

Diharapkan penelitian ini dapat digunakan sebagai terapi suportif pada hewan

kesayangan dengan kondisi diabetes mellitus tipe 1.

37

DAFTAR PUSTAKA

Albert B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P. 2002,

Molecular Biology of The Cell 4th Edition, Garland Science, New York

Amin, M.H.F., A.P.W. Marhendra, dan Aulanni’am. 2009. Pengaruh

PaparanLipopolisakarida pada Rongga Mulut dan Assisted Drainage

Therapy(Adt) terhadap Kadar S-Ige dan Profil Radikal Bebas Pada

Tikus Asma.Seminar Nasional Biologi XX Dan Kongres PBI XIV Uin

Maliki Malang24-25 Juli 2009

American Diabetes Association., 2012. Diagnosis and Classification of Diabetes

Mellitus. Diabetes Care volume 35 Supplement 1 : 64-71.

Astuti, M., 2008. Mengupas Keunggulan Kedelai Hitam. Jakarta

Astuti, M., 2012. Petunjuk Praktis Kedelai Hitam. Jakarta : Yayasan Unilever

Indonesia. Penebar Swadaya Informasi Dunia Pertanian.

Aulanni’am, D.W. Soeatmadji, F. Fatchiyah, dan B.S. Sumitro. 2005. Detection of

GAD 65 auto antibodies of type diabetes using GAD 65-abs reagen

produce from bovine brain tissue. Medical Journal of Indonesia, 14:197-

205.

Aulanni’am, R.Anna, and N.L.Rahmah. 2012. The Potency of Sargassum

duplicatum Bory Extract on Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus,

Journal of Life Sciences 6, pp.144-154

Budiani, L.P.G 2014. The Influence Water Extract of Black Soybean ( Glycine

max (L.) Merr) on Reducing of Blood Glucose Level and The Super

Oxide Dismutase (SOD) Activity on Diabetes Mellitus rats Induced with

Multiple Low Dose of Streptozotocin (STZ). Pp. 131-137

Clark A. 2004. International Textbook of Diabetes Mellitus. 3th Ed. John Willey

and Sons, Ltd. Uk

Cnop M,N. Wels, J.C. Jonas, S. Lenzen, and D.L.Eizirik. 2005. Mechanism of

Pancreatic Cell Death in Type 1 and Type 2 Diabetes. Diabetes Vol.54

(Supl.2).

Dalimartha, S. 2012. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Diabetes Mellitus.

Jakarta. Penebar Swadaya.

38

Dewi, S. 2005. Stress Oksidatif Antioksidan dan Vitamin dan Kesehatan Ilmu

Kesehatan dan Kedokteran. Kel J. Santika Med. Vol.2:238-58.

Devasagayam TPA, J.C. Tilak, K,K. Boloor, K.S. Sane, S.S. Ghaskadbi and R.D.

Lele.2004. Free Radical and Antioxidant in Human Health: Current

Status and Future Prospect. JAPI. 52 (10): 794-804

Duc Son, K. Kusama, N.T.K. Hung ;36. Chuyen. 2004, Prevalence and risk

factors for diabetes in Ho Chi Minh City, Vietnam, Diabetic Medicine,

21, 371-376

Elsener M, B., Guldbakke, M. Tiedge, R. Munday, and S. Lenzen. 2000. Relative

Importance of Transport and Alkylation for Pancreatic Beta-cell Toxicity

of Streptozotocin. Diabetalogia 43:1528-33

Evans, M.D.,M. Dizdaroglu and M.S. Cooke. 2004. Oxidative DNA Damage and

Disease: Induction, Repair and Sinificance. Mutat. Res. 567:1-61.

Fall, T., H.H. Hamlin, A. Hedhammar, O. Kampe and A. Egenvall. 2007.

Diabetes Mellitus in a Population of 180.000 Insured Dogs: Incidence,

Survival, and Breed Distribution. J Vet Intern Med 21:1209-1216.

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknology Molekul. Bandung: FMIPA Kimia

Universitas Padjajaran

Guptill, L. 2003. Time Trends and Risk Factors for Diabetes Mellitus in Dogs :

Analysis of Veterinary Medical Data Base Reciord (1970-1999). Vet J.

Gustaviani, R. 2007. Diagnosis dan Klasifikasi Diabetes Mellitus. Dalam :

Sudoyo A.W., B. Setiyohadi, I. Alwi I, M.I. Simadibrata. (eds) Buku

Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jilid 3. Edisi 4. Jakarta: Pusat Penerbitan

Departemen Ilmu Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran Universitas

Indonesia, pp : 1867, 1857-9.

Halliwell, B. 2011. Free Radicals and Antioxidats-quo Vadis?. Trens Pharmacol

Sci. Vol.32 (3): 125-130.

Halliwel, B. And J.M.C Gutteridge,.2007. Free Radicals in Biology and Medicine.

4th edition. New York. Oxford University Press.

Hudgson BI, Hofman MA, Bucciarelli L. 2002. Glycation and diabetes: The

RAGE connection. Current Sci. Hal:83 (12): 1515-21

Hidayat, M. 2011. Aktivitas Ekstrak Protein Biji Kedelai (Glycine Max L. Merr)

Varietas Detam 1 Terhadap Pengendalian Berat Badan Dan

PeningkatanKadar Kolesistokinin Melalui Mekanisme Aktivitas Mitogen

39

Activated Protein Kinase (MAPK) pada Tikus Wistar Jantan. Universitas

Padjadjaran Bandung : Disertasi.

Joe, W., 2011. 101++ Keajaiban Khasiat Kedelai. Edisi Pertama. Penerbit Andi.

Yogyakarta : 4-7.

Jones, DP. 2008. Radical-free biology of oxidative stress. Am. J. Physiol. Cell

Physiol. 295 (4): C 849-868.

Jusuf, M., Rahayuningsih, St. A. dan Ginting, E. 2008. Ubi jalar ungu. Warta

Penelitian dan Pengembangan Pertanian 30: 13-14.

Katzung BG. 2002, Basic And Clinical Pharmacology (Farmakologi Dasar Dan

Klinik), Edisi III, 585-587, Diterjemahkan Oleh Andrianto. P, Jakarta:

Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Larner, J.K.P. Minneman, and H.C. Neu. (Ed), Human Pharmacology, 2nd Ed.,

523-539, Mosby, London.

Lauralee, Sherwood .2001,FisiologiManusiadariSelkeSistem (Human Physiology:

From cells to systems) ,Edisi II, 377 – 380. EGC, Jakarta.

Lemos, E.T., Nunes, S., Texiera, F., Reis, F. 2011. Regular physical exercise

training assist in preventing type 2 diabetes development : focus on

antioxidant and anti-infl amatory properties. Cardiovascular

Diabetology. 10 (12): 1- 15.

Lenzen, S. 2008. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Induced

Diabetes. Diabetalogia 51:216-26.

Levy AP, R. Asleh, S. Blum, N.S. Levy and R. Miller-lotan. 2010. Haptoglobin:

Basic and clinical aspects. Antioxidants & Redox signalling 12(2): 293-

304

Mahajan, A and V.R. Tandon. 2004. Antioxidant and Rheumatoid Arthritis. J.

Indian Rheumatol Assoc. 12: 139-42.

Myers, P. and D. Armitage. 2004. Rattus norvegicus.

http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/informations/Rattu

s_norvegicus.html. Diakses pada tanggal 19 September 2013.

Nugroho, A.E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Mellitus : Patologi dan

Mekanisme Aksi Diabetogenik. Biodiversitas, 7(4) : 378-382.

O’Neill, D.G. 2013. Chronic Kidney Disease IN Dogs in UK Veterinary Practices

: Prevalence, Risk Factor, and Survival. J Vet Intern Med.

40

Pathak, S.H.C. Dorfmuller, V.S. Borodkin, and M.F. Aalten. 2008. Chemical

Dissection of the Link between Streptozotocin, O-GlcNAc, and

Pancreatic Cell Death Pubmed Central J. August 25; 15 (8): 799-807.

Potter, W.P. 2007 Rats and Mice: Introduction and In Researh. Health Sciences

Center for Educational Resources University of Washington.

Raharjo, M. 2005. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta : Penebar Swadaya

Rahardjo, S.D. 1985. Diabetes Mellitus pada Anjing. Skripsi. Institut Pertanian

Bogor.

Rosalina, R. 2011. Efek Rumput Laut Eucheuma sp terhadap Kadar Glukosa

Darah dan Jumlah Monosit pada Tikus Wistar yang Diinduksi Aloksan.

Laporan Akhir Penelitian Karya Tulis Ilmiah. Fakultas Kedokteran,

Universitas Diponegoro. Semarang.

Santoso, B.I. (ed). 2001. Fisiologi Manusia: dari Sel ke Sistem. Jakarta: EGC, PP:

663-676.

Santoso, U. 2006. Antioksidan. Sekolah Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

Soudamini, K.K ; Unnikrishnan, M.C ; Soni, K.B.; Kuttan, R. 1992.Departement

of Animal Physiology and Biochemistry. J.Physiol. Pharmacol. 365,

239-243.

Szkudelski, T. 2001. The Mechanism of Alloxan and Streptozotocin Action in B

Cells of the Rat Pancreas, Physiol Res 50: 536-46.

Timberlake, C. F., and P. Bridle. 1991. Distribution of Antocyanins In Food

Plants dalam Anthocyanins as Food Colors. Academic Press inc. New

York.

Unger, R.H. and D.W, Foster. 1992. Diabetes Mellitus, In Wilson. J.D. and D.W.

Foster. Endocrinology, 1255-1317, W.B Sunders Company, A Division

of Harcourt Brace and Company, London.

Utaminingrum, F., 2011. Pengaruh Pemberian Yoghurt Kedelai Hitam (Black

Soyghurt) Terhadap Kadar Kolesterol LDL Serum Pada Tikus

Dislipidemia, Semarang : Universitas Diponegoro.

Wardhana, A., 2010. Pemberian Jintan Hitam (Nigella Saliva) sebagai Tindakan

Prefentif Meningkatnya Kadar Glukosa Darah Tikus Putih (Rattus

Norvegicus) yang Diinjeksi Aloksan. Artikel Ilmiah. FKH Universitas

Airlangga: Surabaya.

41

Yustika, A. R. Aulanni'am dan Prasetyawan, S. 2013. Kadar Malondialdehid

(Mda) Dan Gambaran Histologi Pada Ginjal Tikus Putih (Rattus

Norvegicus) Pasca Induksi Cylosporine-A. Kimia Student Journal. 1 (2):

222-228.

Zaias J., M. Mineau., C. Cray., D. Yoon., and N.H Altman. 2009. Refrence

Values for Serum Proteins of Commons Laboratory Rodent Strains.

Journal of the American Association for Laboratory Animal Science.

Vol 48 (4) : 387-390).