FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA

PROGRAM STUDI MAGISTER KEDOKTERAN HEWAN UNIVERSITAS UDAYANA

APLIKASI TEKNOLOGI MOLEKULER DALAM PENINGKATANPRODUKTIVITAS DAN KESEHATAN HEWAN

Penyunting:

I Ketut Berata

I Ketut Puja

I Nengah Wandia

I Gde Soma

Ida Bagus Made Oka

Penerbit : Udayana University PressKampus Sudirrnan Denpasar-Bali

Cetakan pertama : Oktober 2014

Buku ini diterbitkan sebagai Prosiding Seminar Nasional yangdiselenggarakan kerjasama oleh Fakultas Kedokteran Hewan dan Program Studi MagisterKedokteran Hervan Universitas Udayana, tanggal 19 September 2014

ISBN : 978-602-294-021-0

DAFTAR ISI

Kata pengantar .............Daftar isi .............

Investigating the genetic starus of Balr cattle end Banteng in Indonesia using large scalegenotyping and sequencing (Emma Sr.ensson ).'.......'.....'

Peran Teknologi Molekuler dalam \lenunra.ng Epidemiologi Parasitosis pada Ternak

(l Made Damriyasa)

Microsatelitte Markers and Their.\pplicaiion in \nimal Improvement (l Ketut Puja) ..'.

Penentuan Patotipe Virulen dan Avirulen Vrrus .\'evcastle Disease yang Diisolasidari Ayam Broiler dengan Metode RT-PCR R-E \ r.\ris Haryanto, Silvana DerivatifKristoferin, Wahyu Flaryanto. Yuni Punrzurti. \ledania Punvaningrum, Verawati

Diagnosis Penyakit Rabies pada Anjrng \lenge'.makan Antibodi MonoklonalAntivirus Rabies Isolat Bali (lda Bagus Kade Suldana dan Nyoman Mantik Astawa) ....

Respon Antibodi Ayam Broiler Komersial da:i .\r am Specific antibody Negative (SAN)terhadap Vaksin Newcastle Disease Aktif lGu-.ii r.,,..t Yuniati Kencana,Arini Nurhandayani)

Perbandingan Vaksin Hog Cholera terhadap Prt-tek'.ri it:-. Titer Antibodi Anak Babi(Putu Devi Jayanti. I Nyoman Suartha. Kerut Buii:sa r ' . . .. .

Perkembangan Deteksi Penyakit Autoimun Dahu,u. Se kra:rs dan lUasa Datang(Aulanni'am) .............

Pengaruh Suplementasi Natrium Iodida (l\Ial) sebagar B.:::r lridiiksi ,-lutoimmune'lhyroiditis (AITD) pada Hewan Model Tikus /.Rrrliii * r;,- r-, . -g; jL'-ti(Dyah Kinasih Wuragil, Aulanni'ari, dan Agung P:..:'.':. 'I'::rn \larhendra) . .. . .....

Pengaruh Pemberian Yoghurt Susu Kambing sebag:i T.:1"

KARAKTERISASI SECARA IMUNOHISTOKIMIA TERHADAP LII]\IFOSITSAPI BALI HASIL KULTUR YANG DIINFEKSIKAN VIRUS JE}IBRANA.

Oleh:lI Ketut Berata, llda Bagus Oka Winaya, lI Made Kardena,

2I Nyoman Mantik Astawallaboratorium Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana2laboratorium Virologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana

JI.PB. Sudirman Denpasar BaliE-mail : iketutberata@yahoo.com

AbstrakVirus Jembrana hanya tumbuh dalam limfosit sapi bali, Unruk memperoleh limfosit

sapi bali dalam jumlah banyak dan berkelanjutan, maka dikembangkan teknik kulrur. Tujuzurpenelitian adalah mengkarakterisasi limfosit sapi bali hasil kulrur 1'ang diinfeksi virusJembrana.

Limfosit darah tepi diisolasi dengan teknik Ficoll-paque gradient dai bu-ffi, coat darahyang diambil dari vena jugularis. Limfosit dikultur dalam media RP\'{l-16-10 }'angmengandung 20% newborn calf serum (NBCS), 100 IU/ml penisilin. 100 pg mlstreptomycin, 20 Vgl ml polybreen dan 5 pgl ml Con A. Selanjutnl'a hmfbsit 1'ang rumbuhdiinfeksikan virus Jembrana dengan teknik ko-infeksi isolat Tabanani 87. Untukmengkarakterisasi limfosit sapi bali yang dikultur dan diinfeksi virus Jembrana- dilaliukanpewarnaan imunohistokimia dengan teknik indirect imunoperoksidase. Variabel )angdiperiksa adalah karakteristik limfosit yang terinfeksi virus Jembrana meliputi ukuran limfositdan kualitas infeksi.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel-sel terinfeksi virus Jembrana sebagian besarlimfosit berukuran besar dan sebagian kecil limfosit berukuran kecil. Kualitas infeksiberdasarkan tingkat warna coklat diperoleh hasil yang merata. Dapat disimpuikan bah*'aiimfosit besar terinfeksi virus Jembrana lebih banyak pada kultur adalah akibat limlbsitsedang aktif tumbuh.

Kata-kata kunci : Limfosit hrltur, Virus Jembrana, Imunohistokimia

PENDAHULUAI{

Penyakit Jembrana merupakan penyakit infeksi yang dikenal hanya menyerang sapibali. Penyebab penyakit Jembrana adalah Lentivirus yang termasuk famili Retroviridae(Kertayadnya, et al, 1993; Wilcox, et al. 1993). Infeksi virus penyakit Jembrana atauJembrana disease virus (JDY) bersifat akut, merupakan sifat yang berbeda dengan infeksiLentivirus urnumnya yzmg bersifat kronis, digolongkan sebagai Lentivirus jenis baru pada sapi(Wilcox, et a|.,1995).

Sel target utama virus Jembrana adalah limfosit sapi bali (Chadwick et aI.,1998; Astari'aet a1.,2A06). Secara lebih detail dilaporkan bahu'a sel target utamanya adalah limfosit T sapibali yang bermarka CD4+ (Berata dan Astawa,2011). Dilain pihak Tenaya (201I) melaporkanbahwa sel target virus Jembrana adalah limfosit B. Hasil identifikasi sel target utama virusJembrana ini sangat mendukung bahwa limfosit sapi bali yang berasal dari darah tepi ciapatditumbuhkan dengan teknik kultur (Astawa et al., 2005). Belum ada laporan bahrva

Seminar Nasio nal " T eknologi M olekulet'' FKH Unu d -2014 Page 71.

I

bagaimana karakteristik limfosit darah tepi dibandingkan dengan limfosit kultur yang berasaldari darah tepi ?Mempelajari karakteristik sel limfosit sapi baii hasil kultur sangat penting untuk tujuan

mendukung pembuatan vaksin kultur terhadap penl.akit Jembrana. Sehingga vaksin kulturyang akan dikembangkan dapat diantisipasi kelebihan dan kekurangannya.

METODE PENELITIAN

Isolasi Sel Limfosit Normal Sapi Bali untuk KulturDarah tepi diambil secara aseptis dari vena jugularis dan ditampung dalam tabung

steril yang telah diisi antikoagulan EDTA 5%. Penghirungan total sel leukosit dan sel limfositdilakukan dengan haemositometer. Darah ini disentrifus 2500 rpm selama l0 menit. Lapisanputrh (buffy coa) di antara sel darah merah dan plasma diambil dan disuspensikan denganmedia DMEM tanpa serum. Limfosit dipisahkan dur bufy coat dengan cara Ficoll-poquegradient yaitu disentrifus 3.000 rpm selama 30 menit. Lapisan limfosit diambil dan dicuci 3kali dengan media DMEM tanpa serum. Limfosit yang diperoleh, selanjutnya dikultur sesuaimetode Astawa et al., (2005)

Limfosit sapi yang diisolasi dari darah tepi, disuspensikan dalam media RPMI-1640yang mengandung 20Yo newborn calf serum (NBCS), 100 IU/ml penisilin, 100 pgl mlstreptomycin,20 pgl ml polybreen dan 5 pgl ml Con A. Setelah jumlah selnya dihitungdengan hemositometer, limfosit ditumbuhkan dengan kepadatan 106 sel/ml pada suhu 37oCdengan kandungan COz di udara sebesar 5%. Setelah inkubasi selama 3 hari, limfosit tersebutdiko-infeksikan dengan limfosit sapi bali yang terinfeksi virus Jembrana dari isolatTabanan/87. Kemudian ditumbuhkan dalam media RPMI-1640 yat g mengandung 20%NBCS (MultiSer), 100 IU/ml penisilin, 100 pglml streptomisin, 20 pg/ml polybreen dan 5Vg/ml Con A serta 20 IU/ml rekombinan human interleukin-2 (hIL-2). Kultur limfosit inikemudian diinkubasikan kernbali pada suhu 37oC dan setiap minggu ditambahkan limfositsapi bali normal yang dirangsang dengan Con A. Lektin Con A berfungsi untuk merangsangmitosis, sedangkan IL-2 berfungsi untuk mempertahankan pertumbuhan dari limfosit. Tigaminggu setelah ko-infeksi, lirnfosit kultur diperiksa dan diuji westernitnmunoblotting, untukrnengetahui keberhasilan ko-infeksi, yang ditandai dengan aclanya antigen virus Jembranapada kultur. Kultur yang positif mengalami ko-infeksi diproses untuk pemeriksaan sel-selterinfeksi virus Jembrana.

Pemeriksaan Limfosit Terinfeksi VirusSampel limfosit dari kultur diambil dan disentrifus 2500 rpm selama 5 menit. Setelah

cairan supernatannya dibuang, limfosit dibuat sediaan ulas pada gelas objek, yarrg dilapisipoly-L-lysine. KerrngSan pada suhu kamar, kemudian difiksasi dengan aseton dingin yangmengandungHzOz3Y, selama 30 menit. Setelah dikeringkan pada suhu kamar, selanjutnyasediaan diwarnai dengan teknik imunohistokimia untuk pemeriksaan limfosit terinfeksi virussesuai metode Dharma (2002). Sediaan dalam suasana lembab, kernudian digenangi dengansefl.rm kambing normal 109'o dalam PBS. Selanjutnya tambahkan antibodi monoklonal(AbMo) primer berupa AbMo anti-virus Jernbrana, dengan pengenceran 1:200 dalam BSA19lo. Setelah diinkubasi selama 1 jarn pada suhu kamar. dilalcukan pencucian 3x5 menitdengan PBS pH 7,4. Seianjutnya sediaan ulas digenangi dengan mouse IgG-IIRP (ICN'USA),dengan pengenceran 1:100. Setelah pencucian 3x5 menit dengan PBS, preparat digenangidengan mouse peroxidase-anti-peroxidase complex (PAP) (Sigma), dengan pengenceran1:800. lnkubasi selama 40 menit pada suhu kamar, dan kemudian dicuci 3x5 menit denganPBS. Sediaan ditambahkan substrat DAB (Sigma) 0,0lYo dalam PBS yang mengandung 2%

li

Seminar Nasional "Tel

HzOz Setelah inkubasi 6 menit pada suhu kamar, reaksi substrat dihentikan dengan caradicuci pada air mengalir selama 15 menit. Selanjutnya dicounterstain dengan May.r'shematoksilin selama 5 menit pada suhu kamar. Mayer's haematoksilin mewarnai inti sel,sehingga tampak berwama biru/ungu. Limfosit yang terinfeksi virus tampak coklat pa{asitoplasmanya dengan inti berwarna biru. Sisa warna dibersihkan dengan air kran mengalirselama 5 menit. Berikutnya didehidrasi dengan alkohol absolut 2x5 menit, dan dibersihkandengan mencelupkan ke xylol 2x5 menit. Setelah dikeringkan, preparat diisi permount danditutup dengan coverslip.Variabel yang Diperiksa

Karakteristik yang diperiksa didasarkan pada tingkat warna dan perbandingan ukuranantara limfosit terinfeksi dengan limfosit tidak terinfeksi virus penyakit Jembrana. Data hasilpemeriksaan dianali sis secara deskripti f kualitatif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari pemeriksaan imunohistokimia diperoleh hasil identifikasi limfosit yang terintbksivirus Jembrana seperti tersaji pada Gambar 1A. Sebagai pembanding dapat dilihatpada hasilpemeriksaan imunohistokimia limfosit darah tepi yang tidak dikultur (Astawa et el(2006).(Gambar 1B).

Pengamatan berdasarkan ukurannya tampak limfosit yang terinfeksi virus Jembranaberukuran lebih besar dibandingkan limfosit yang tidak terinfeksi. Hal ini tampak nyatapadalimfosit yang dikultur (Gambar 1A) dibandingkan limfosit tidak dikultur

-lcambar in;.

Berdasarkan ukuran ini banyak peneliti menduga bahwa limfosit terinfeksi tersebutmerupakan limfosit B dan bukan limfosit T. Hal ini dilaporkan oleh Tenaya eAlD bahwa seltarget virus penyakit Jembrana adalah limfosit B. Laporan ini diperkuat dengan hasilpemeriksaan sel-sel terinfeksi di bawah mikroskop flouresent dan berdasarkan faktarendahnya antibodi selama 2-3 bulan pasca infeksi virus Jembrana. Tetapi hasil berbedadilaporkan oleh Dharma et al.(1991) bahwa sel target virus Jembruna adalah limfosit T,berdasarkan pemeriksaan imunohistokimia maupun lokasi limfosit terinfeksi di parafolikeilimpa. Demikian pula identifikasi sel target virus Jembrana dengan teknik imunohistokimia

Gambar l. Limfosit terinfeksi virus penyakit Jembran ayangberwarna coklat.A).Limfosit darah tepi yang dikultur. B).Limfosit darah tepi yang tidak dikultur

(Astawa, et a1.,2006)

Seminar Nasional "Teknologi Molekulef' FKH Unud -20L4 Page 73

ganda diperoleh kesimpulan bahrva sel target virus jembrana adalah limfosit T bermarka Cd4*

(Berata dan Astawu, j.011). Menurut Ablas., oi. IZOO0) dijelaskan bahwa limfosit dalam

sirkulasi dapat beruiuran tervariasi karena terdiri dari limfosit yang aktif dan tidak aktif'

Limfosit berukuran besar merupakan ciri dari limfosit sedang aktif, sedangkan yang tidak

aktif (naive cell) dan sel n1.*o.i beruliuran kecil. Berkaitan dengan karakteristik limfosit

kultur yang terinf-eksi virus Jembrana. malta ada kemungkinan limfosit terinfeksi karena

sedang aktif tumbuh. Hal ini juga dapat menl'ebabkzur lebih tingginya persentase limfosit

terinfJksi pada kultur dibandingkan.vang tidali dikultur (Berata, 2009)'

SIMPI]LAFI

Berdasarkan pengamatan karakleristik yq maka dapat disimpulkan bahwa limfosit

besar lebih banyak teiinfeksi virus Jembrana dibandingkan limfosit kecil' Hal ini

kemungkinan akibat limfosit besar merupakan limfosit sedang aktif dalam pertumbuhan'

sehingga lebih mudah diinfeksi virus Jembrana'

DAFTAR PUSTAKA

Abbas,A.K., Lichtman,A.H., and Pober, J.s. 2000.cellular and Molecular Immunology'

4e.Ed. Saunders Co.P.l 6l -269'

Astawa,N.M.,Hartaningsih,N',Dharrra,D'M'N''Tenaya'W'M:Budiantono'danEkaana,W. ZOOS. {eplikasi Virus Jembrana pada Kultur Limfosit Darah

Tepi asal Sapi

Bali. J.Vet .6$) -P -13 5 -l 42.Astawa, NM., Hartaningsih, N., Agustini, LP', Tenaya' WM" Berata' IK" Widiyanti'

LPM'

2a06. Detection of Jembrana Diseases viral Antigen in PeriPheral BloodLymphocyt"; bt Monoclonal Antibodies. Media Kedokteran Hewan Yol'22(3)

Berata, IK. 2009. percentage of Jembrana Virus Infected Cells in Lymphocytes Culture and

Spleen f.y*pt o"1i" of Bali Cattle. Ve; Med. J.(UNAIR) Vol'25(3):161-l66Akreditasi Dikti

Berata, IK., NM.Astawa. 2Oll.klentifikasi sel-sei Target virus Penyakit Jembrana dengan

Teknik Imunositokimia Ganda. tsiota vol.l6(2):i36-241Juni 2011. Alireditasi Dikti

Chadwick, B.J., Desport, M., Brownlie, J', Wilcox, G'E'' and Dharma' D'M'N' 1998'

Detection of Jembrana Disease Vi*t in Spleen, Lymphnodes, Bone Marrow andOther Tissues by In Situ Hybridization of Paraffrn-gmmUeded Sections. J'of General

Virol. 79:101-106Dharma, D.M.N., Budiantono,A., Campbell, R.SJ.,__Td Ladds, P.w. l99l' studies on

Experimental Jembrana Disease i" gdi cattle. III. Pathology. J.of.comp'Pathol' 105 :

397-414Dharma, D.M.N. 2002. Teknik Imrurohisokimia. In : Hartaningsih, N'

Diagnosa Laboratorik Penyakit Jembrana. Materi kursus peningkatan:

p"tt!*it .1 "mbrana.

ACIAR-BPPV VI Denpasar' p'7 6-98'

Tenaya, IWM. iAn. Beberapa Penyakit yang Dapat Mengancam Produksi' Sapi Baii. Lokakarya Nasional Strategi Peningkatan Produktivitas

Mendukung Sr)'asembada Daging Nasional 2014' Universitas

Nopember 20ll-

Editor. Manualmetode diagnosa

dan KonservasiSapi Bali untukUdayana 25-26

S.-i*. Nrsional "Teknologi Molelailet'' FKH Unud-2074 Page74