penetapan kadar kapsaisin dan uji aktivitas · pdf filekepada penulis sehingga penulis dapat...

PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS

ANTIOKSIDAN FRAKSI TOLUEN-ETIL ASETAT BUAH CABAI RAWIT

(Capsicum frutescens L.) DENGAN METODE 2,2-DIFENIL-1-

PIKRILHIDRAZIL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Regina Hiacinta Eva Angelista

NIM : 138114096

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS



PIKRILHIDRAZIL (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Regina Hiacinta Eva Angelista

NIM : 138114096

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

- Anonim -

Kupersembahkan karya ini untuk :

Tuhan Yesus Kristus

Papi Agus, Mami Lelly dan Adikku Yosha

Sahabat-sahabatku dan Almamaterku


v


vi

PRAKATA

Puji Syukur kepada Tuhan atas segala rahmat, berkat dan penyertaan-Nya

kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“PENETAPAN KADAR KAPSAISIN DAN UJI AKTIVITAS



PIKRILHIDRAZIL (DPPH)” ini dengan baik sebagai syarat memperoleh gelar

Sarjana Strata 1 Program Studi Ilmu Farmasi (S.Farm.).

Dalam proses penyusunan hingga penyelesaian skripsi ini, penulis tidak

lepas dari bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini

dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-

besarnya kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah memberikan kesempatan

kepada penulis untuk melakukan penelitian ini.

2. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan bantuan dan bimbingan selama pembuatan proposal skripsi

hingga penulisan naskah skripsi dengan kesabaran dan penuh perhatian.

3. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan bimbingan, kritik dan saran sehingga skripsi ini dapat

terselesaikan.

4. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt. selaku Dosen Penguji yang telah memberikan

bimbingan, kritik dan saran sehingga skripsi ini dapat terselesaikan.

5. Ibu Dita Maria Virginia, S.Farm., M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing

Akademik yang telah memberikan bimbingan dan saran.

6. Seluruh staff laboran Universitas Sanata Dharma terutama Mas Yohanes

Wagiran yang telah banyak memberi bantuan selama pengerjaan skripsi.

7. Tim Skripsi Selalu Hepi (Kevin Giovedi, Asti Aprilia Putri dan Edwin

Tesalonika) atas kerjasama, dukungan dan semangatnya selama pengerjaan

skripsi.


https://www.usd.ac.id/profile_detail.php?id=01664



vii

8. Teman seperjuanganku (Cindy, Indri, Monita, Ronny) dan teman

sepermainanku (Ririn, Lia, Sara, Jessy dan Tika) atas saran, dukungan dan

semangatnya.

9. Teman-teman angkatan 2013 atas semua dukungannya dalam pengerjaan dan

penyelesaian skripsi

10. Semua pihak yang telah memberikan dukungan dan bantuan yang tidak dapat

disebutkan satu persatu

Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam

skripsi ini. Oleh karena itu, dengan segenap kerendahan hati, penulis mengharapkan

saran dan kritik yang membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi

ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan selanjutnya khususnya

dlam bidang farmasi dan kesehatan

Yogyakarta, 14 November 2016

Penulis


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI................................... v

PRAKATA ............................................................................................................. vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix

DAFTARTABEL ..................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xii

ABSTRAK ........................................................................................................... xiii

ABSTRACT ........................................................................................................... xiv

PENDAHULUAN ................................................................................................... 1

METODE PENELITAN .......................................................................................... 2

Alat dan Bahan ........................................................................................... 2

Determinasi Tanaman ................................................................................ 2

Pembuatan Simplisia .................................................................................. 2

Ekstraksi ..................................................................................................... 3

Pembuatan Larutan Standar Kapsaisin ...................................................... 3

Fraksinasi ................................................................................................... 3

Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar ............................................... 3

Penetapan Kadar Kapsaisin dalam Fraksi .................................................. 4

Uji Aktivitas Antioksidan .......................................................................... 4

Perhitungan Nilai IC50................................................................................ 5

HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................................ 5

KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 11

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 11

LAMPIRAN ........................................................................................................... 13

BIOGRAFI PENULIS ........................................................................................... 39


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil pengukuran akurasi dan presisi metode penetapan kadar .............. 8

Tabel II. Hasil penetapan kadar kapsaisin dalam fraksi ......................................... 9

Tabel III. Hasil perhitungan IC50 standar kapsaisin dan sampel fraksi ................ 10


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Hasil elusi ekstrak etanol cabai rawit dan standar kapsaisin ................ 7

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi dengan absorbansi standar kapsaisin ...... 8

Gambar 3. Mekanisme kapsaisin dengan radikal DPPH ...................................... 11

Gambar 4. Buah cabai rawit segar ........................................................................ 15

Gambar 5. Buah cabai rawit kering....................................................................... 15

Gambar 6. Serbuk simplisia buah cabai rawit ....................................................... 15

Gambar 7. Ekstrak etanol buah cabai rawit .......................................................... 15

Gambar 8. Hasil KLT preparatif ekstrak etanol cabai rawit dan standar

kapsaisin ............................................................................................. 15

Gambar 9. Sampel fraksi toluen- etil asetat ekstrak etanol buah cabai rawit

Replikasi 1, Replikasi 2 dan Replikasi 3 ............................................. 16

Gambar 10.Hasil elusi ekstrak etanol cabai rawit dan standar kapsaisin ............... 21

Gambar 11.Hasil uji aktivitas antioksidan etanol, standar kapsaisin, ekstrak

etanol cabai rawit dan fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol

cabai rawit ........................................................................................... 24


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman .................................. 13

Lampiran 2. Certificate of Analysis standar kapsaisin ........................................ 14

Lampiran 3. Gambar sampel penelitian .............................................................. 15

Lampiran 4. Penimbangan sampel dan perhitungan % rendemen ...................... 16

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan seri kapsaisin untuk kurva

baku penetapan kadar ..................................................................... 18

Lampiran 6. Hasil scanning pelarut kapsaisin (etanol) ....................................... 19

Lampiran 7. Hasil scanning optimasi λ maksimum kapsaisin ............................ 19

Lampiran 8. Pengukuran serapan larutan seri kapsaisin ..................................... 20

Lampiran 9. Perhitungan Rf ................................................................................ 20

Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi fraksi ....................................................... 21

Lampiran 11. Pengukuran serapan kapsaisin dan perhitungan konsentrasi

kapsaisindalam fraksi pengenceran 10x ......................................... 22

Lampiran 12. Perhitungan penetapan kadar .......................................................... 23

Lampiran 13. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan ......................................... 24

Lampiran 14. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan ..................................... 25

Lampiran 15. Uji aktivitas antioksidan standar kapsaisin..................................... 27

Lampiran 16. Uji aktivitas antioksidan sampel fraksi........................................... 29

Lampiran 17. Hasil dan perhitungan adisi sampel ................................................ 35


xiii

ABSTRAK

Paparan radikal bebas dalam kehidupan sehari-hari tidak dapat dihindari

sehingga diperlukan adanya senyawa antioksidan untuk menangkal dampak buruk

radikal bebas. Antioksidan sintetik dapat berdampak buruk bagi kesehatan sehingga

antioksidan alami merupakan alternatif yang lebih aman. Ekstrak etanol buah cabai

rawit (Capsicum frutescens L.) memiliki aktivitas antioksidan dimana kapsaisin

diduga merupakan salah satu senyawa yang berperan penting. Purifikasi ekstrak

etanol buah cabai rawit diperlukan untuk memastikan peran kapsaisin dalam

aktivitas antioksidan ekstrak etanol. Tujuan dari penelitian ini untuk mengetahui

adanya kandungan kapsaisin, kadar kapsaisin dan aktivitas antioksidan dari fraksi

toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai rawit. Manfaat penelitian ini adalah

memberi informasi pada masyarakat mengenai potensi antioksidan dari fraksi

toluen-etil asetat buah cabai rawit sehingga dapat dimanfaatkan untuk memelihara

kesehatan. Simplisia buah cabai rawit diekstrak menggunakan pelarut etanol

dengan metode sokhletasi, lalu difraksinasi menggunakan KLT preparatif dengan

fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v) dan fase diam menggunakan silika gel 60 F254.

Metode yang digunakan untuk penetapan kadar kapsaisin adalah spektrofotometri

UV dan untuk uji aktivitas antioksidan adalah metode DPPH dengan parameter

aktivitas antioksidan berupa nilai IC50. Hasil penelitian menunjukkan terdapat

kandungan kapsaisin dalam fraksi toluen-etil asetat buah cabai rawit dengan kadar

sebesar 331,036±24,433 μg/mL dan terdapat aktivitas antioksidan dengan IC50

sebesar 302,3±3,97 µg/mL.

Kata kunci: aktivitas antioksidan, buah cabai rawit, DPPH, fraksi toluen-etil asetat

ekstrak etanol buah cabai rawit, kapsaisin, spektrofotometri UV


xiv

ABSTRACT

Exposure of free radical in daily life is inevitable so as antioxidant is

required to prevent the bad effect of free radical. However synthetic antioxidant can

give bad effect for health so that natural antioxidant becomes an alternative choice.

Ethanol extract of rawit chilli fruit (Capsicum frutescens L.) has antioxidant activity

and capsaicin was expected as one of the compound that play an important role for

the activity. Purification of rawit chilli fruit ethanol extract is needed to ensure the

role of capsaicin in the antioxidant activity of the extract. The aims of this research

are to know about the presence of capsaicin, assign the antioxidant activity and

determine the level of capsaicin in toluene-ethyl acetate fraction of rawit chilli fruit

ethanol extract. The benefit of this research is to give public information about the

antioxidant potency from toluene-ethyl acetate fraction of rawit chilli fruit ethanol

extract so that it can be used for maintain our health. Rawit chilli fruit simplisia was

extracted using ethanol as the solvent with soxhletation method, and then

fractionation process was conducted with preparative TLC using toluen-ethyl

acetate (1:1 v/v) as the mobile phase and silica gel 60 F254 as the stationary phase.

Method that was used to determine the capsaicin level is UV spectrophotometry

and to assign the antioxidant activity was DPPH, with IC50 value as the antioxidant

activity parameter. The result of this research was that toluene-ethyl acetate fraction

of rawit chilli fruit ethanol extract had capsaicin compound which the level was

331,036±24,433 μg/mL and it had antioxidant activity which the IC50 value was

302,3±3,97 µg/mL.

Keywords: antioxidant activity, rawit chilli fruit, DPPH, toluene-ethyl acetate

fraction of rawit chilli fruit ethanol extract, capsaicin, UV spectrophotometry


1

PENDAHULUAN

Paparan radikal bebas dapat memicu terjadinya berbagai macam penyakit, terutama

penyakit degeneratif. Oleh karena itu dibutuhkan senyawa antioksidan sebagai penangkal

radikal bebas. Terdapat dua macam antioksidan berdasarkan sumbernya yaitu antioksidan

alami dan antioksidan sintetik. Berdasarkan penelitian Papas (1999), antioksidan sintetik

bersifat karsinogenik sehingga antioksidan alami dibutuhkan sebagai alternatif sumber

antioksidan yang relatif lebih aman dan mudah didapatkan.

Cabai rawit (Capsicum frutescens L.) merupakan salah satu buah yang dalam kehidupan

sehari-hari dimanfaatkan sebagai penyedap makanan. Menurut penelitian Nascimento et al.

(2013), ekstrak etanol buah cabai rawit memiliki aktivitas antioksidan ketika diuji

menggunakan metode DPPH dengan EC50 yang didapatkan sebesar 302,3±3,97 µg/mL.

Salah satu senyawa yang diduga berperan dalam aktivitas antioksidan adalah kapsaisin.

Cabai rawit mengandung senyawa kapsaisin dengan kadar sebesar 1,85% (b/b) (Musfiroh

dkk., 2013). Zimmer et al. (2012) menyatakan bahwa kapsaisin murni memiliki aktivitas

antioksidan dengan EC50 sebesar 17,62±1,84 µg/mL sehingga diduga bahwa kapsaisin

merupakan salah satu senyawa yang berperan penting dalam aktivitas antioksidan buah

cabai rawit.

Aktivitas antioksidan dari senyawa kapsaisin murni jauh lebih tinggi dibandingkan

dengan ekstrak etanol cabai rawit. Hal ini dikarenakan ekstrak etanol cabai rawit masih

mengandung berbagai senyawa yang bersifat kompleks. Oleh karena itu, untuk memastikan

aktivitas antioksidan kapsaisin dalam buah cabai rawit diperlukan purifikasi lebih lanjut.

Peneliti melakukan pengembangan dari penelitian sebelumnya oleh Nascimento et al. (2013)

dengan melakukan purifikasi berupa fraksinasi menggunakan KLT (kromatografi lapis tipis)

preparatif. Metode ini membutuhkan waktu yang singkat dalam memisahkan senyawa dan

memerlukan sampel dalam jumlah sedikit (Sarker and Nahar, 2012). Menurut Wagner dan

Bladt (2001), solven untuk kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan senyawa

kapsaisin dari buah cabai salah satunya adalah menggunakan pelarut campuran toluen dan

etil asetat, sehingga dalam penelitian ini digunakan solven campuran toluen-etil asetat untuk

melakukan fraksinasi. Metode DPPH dipilih untuk menguji aktivitas antioksidan karena

menurut Koleva, Beek, Linssen, Groot, dan Evstatieva (2002), metode ini sangat cepat,

sederhana, sensitif, dan reprodusibel.

Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui adanya kandungan kapsaisin, kadar

kapsaisin dan aktivitas antioksidan dari fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai


2

rawit. Diharapkan penelitian ini bermanfaat untuk memberi informasi pada masyarakat

mengenai potensi antioksidan dari fraksi toluen-etil asetat buah cabai rawit sehingga dapat

dimanfaatkan untuk memelihara kesehatan tubuh.

METODE PENELITIAN

Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa seperangkat alat sokhlet, alat-alat

gelas (Pyrex-Germany), mikropipet 10-100 µL dan 200-1000 µL (Socorex), blender

(Miyako), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P, max 60/120 g, min 0,001 g), waterbath

(Memmert), oven (Memmert), vacuum rotary evaporator (Butchi), bejana kromatografi

(Camag), lampu UV 254 nm, spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UV mini-1240) dan

vortex.

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah buah cabai rawit yang

berasal dari perkebunan cabai di daerah Kopeng, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan

adalah kapsaisin pro analysis (p.a.) (Sigma-Aldrich), etanol 96% teknis (CV Genera

Labora), toluen p.a. (Merck), etil asetat p.a. (Merck), DPPH p.a. (Sigma-Aldrich), metanol

p.a. (Merck), kertas saring, alumunium foil dan TLC silica gel 60 F254 for thin layer

chromatography (Merck).

Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman cabai rawit dilakukan di Laboratorium Sistematika

Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Determinasi dilakukan

pada seluruh bagian tanaman cabai rawit yang meliputi akar, batang, daun, bunga dan buah

cabai rawit.

Pembuatan Simplisia

Buah cabai rawit ditimbang sebanyak 1 kg, lalu dilakukan sortasi dan pencucian

untuk memisahkan buah dari pengotor dan bagian yang tidak terpakai. Kemudian buah

dipotong menjadi beberapa bagian dan dijemur secara tidak langsung di bawah sinar

matahari hingga kering yang ditandai dengan simplisia mudah hancur saat diremas

menggunakan tangan. Kemudian dilanjutkan pengeringannya menggunakan oven pada suhu

50o C hingga didapatkan bobot tetap. Buah cabai rawit kering dihaluskan dengan blender

sehingga didapatkan serbuk simplisia buah cabai rawit.


3

Ekstraksi

Ekstrasi dilakukan pada 25 g serbuk simplisia buah cabai rawit dengan metode

sokhletasi menggunakan cairan penyari berupa etanol 96% sebanyak 350 mL yang dilakukan

pada suhu 70°C. Sokhletasi dilakukan hingga larutan penyari pada tabung sokhlet tampak

jernih atau sekitar 26 jam. Ekstrak kemudian dipekatkan menggunakan vacuum rotary

evaporator hingga volume ekstrak kira-kira setengah dari volume awal. Kemudian

pemekatan dilanjutkan menggunakan waterbath hingga diperoleh ekstrak kental dengan

bobot tetap

Pembuatan Larutan Standar Kapsaisin

Sejumlah 10 mg standar kapsaisin dilarutkan dalam 10 mL labu takar menggunakan

etanol 96%, kemudian labu takar dikocok hingga larutan homogen. Diperoleh larutan standar

kapsaisin dengan konsentrasi 1000 µg/mL.

Fraksinasi

Metode untuk melakukan fraksinasi adalah KLT preparatif dengan fase diam silika

gel 60 F254 dan fase gerak campuran toluen dan etil asetat. Dilakukan optimasi fase gerak

terlebih dahulu dengan menotolkan ekstrak etanol buah cabai rawit dan standar kapsaisin

1000 µg/mL pada plat KLT yang kemudian dielusi menggunakan berbagai perbandingan

volume toluen dan etil asetat. Fase gerak optimum dipilih berdasarkan fase gerak yang

memberikan pemisahan bercak yang baik (tidak ada bercak yang saling menumpuk).

Fraksinasi dilakukan dengan melarutkan 0,2 g ekstrak etanol menggunakan 0,5 mL

etanol 96%, kemudian ditotolkan membentuk pita sepanjang plat KLT hingga larutan

ekstrak habis. Standar kapsaisin 1000 µg/mL juga ditotolkan di plat KLT di sebelah tempat

penotolan ekstrak. Plat KLT kemudian dielusi dengan fase gerak optimum. Pita bercak yang

memiliki nilai Rf sama dengan standar kapsaisin dikerok, lalu dilarutkan dengan etanol 96%

dan disaring dengan corong buchner. Fraksi dipekatkan di atas waterbath hingga diperoleh

bobot tetap, kemudian dilarutkan kembali hingga 10 mL menggunakan etanol 96%.

Validasi Metode Analisis Penetapan Kadar

Akurasi dan Presisi

Dimasukkan sampel fraksi masing-masing sebanyak 1 mL ke dalam tiga buah labu

takar 10 mL. Masing-masing kemudian ditambahkan dengan standar kapsaisin 100 µg/mL

sejumlah 1, 2 dan 3 mL, lalu dilarutkan menggunakan etanol 96%. Larutan tersebut

kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang


4

maksimum kapsaisin. Akurasi ditentukan dengan menghitung perolehan kembali (recovery)

dari kadar sampel fraksi yang diadisi masing-masing tiga kali replikasi. Presisi ditentukan

dengan menghitung CV kadar sampel yang diadisi menggunakan tiga konsentrasi maupun

yang tidak diadisi, masing-masing tiga kali replikasi.

Linearitas dan rentang

Standar kapsaisin dibuat dalam lima seri konsentrasi (20, 40, 60, 80 dan 100

µg/mL). Kemudian lima seri konsentrasi standar kapsaisin diukur pada panjang gelombang

maksimum sehingga diperoleh persamaan kurva baku. Linearitas ditentukan dengan

menganalisis koefisien korelasi (nilai r) dari kurva baku hubungan konsentrasi standar

kapsaisin terhadap absorbansinya. Rentang didapatkan dari konsentrasi terendah dan

tertinggi dari standar kapsaisin yang terdapat pada kurva baku tersebut.

Spesifisitas

Dilakukan penentuan panjang gelombang maksimum terlebih dahulu dengan

membuat tiga seri konsentrasi standar kapsaisin (20, 40 dan 60 µg/mL) yang diukur pada

rentang panjang gelombang 200-400 nm. Kemudian dilakukan scanning etanol 96% pada

panjang gelombang 200-800 nm. Spesifisitas dilihat dari ada tidaknya puncak spektra etanol

pada panjang gelombang maksimum kapsaisin.

Penetapan Kadar Kapsaisin Dalam Fraksi

Diambil 1 mL fraksi dan dipipet ke dalam labu takar 10 mL, lalu dilarutkan

menggunakan etanol 96%. Kemudian serapan sampel tersebut diukur pada panjang

gelombang maksimum kapsaisin. Hasil pengukuran fraksi dimasukkan ke dalam persamaan

yang didapat dari kurva baku sehingga didapatkan nilai kadar.

Uji Aktivitas Antioksidan

Uji kualitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara sebagai berikut: disiapkan

4 buah tabung reaksi dimana tabung A berisi 1 mL etanol, tabung B berisi 1 mL ekstrak 20

µg/mL, tabung C berisi 1 mL fraksi dan tabung D berisi standar kapsaisin 100 µg/mL.

Masing-masing tabung ditambah dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL lalu ditambah dengan 3

mL etanol. Semua tabung divortex dan ditunggu selama 30 menit, lalu diamati perubahan

warna yang terjadi.

Uji kuantitatif aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengukur serapan DPPH

dengan spektrofotometer UV-Vis. Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan

dengan mengukur serapan larutan DPPH 100 µg/mL pada rentang 400-800 nm. Penentuan


5

operating time (OT) dilakukan dengan mengukur 4 mL standar kapsaisin 80 µg/mL yang

ditambahkan dengan 1 mL DPPH 80 µg/mL pada panjang gelombang maksimum setiap 5

menit selama 1 jam. OT ditentukan pada waktu dimana serapan mulai stabil.

Blanko dibuat dengan 4 mL etanol dan 1 mL DPPH 100 µg/mL, lalu ditunggu

selama OT dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum. Standar kapsaisin

dibuat dalam lima seri konsentrasi (5, 10, 15, 20 dan 25 µg/mL), masing-masing konsentrasi

diambil sebanyak 4 mL dan ditambah dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL lalu ditunggu selama

OT dan diukur serapannya pada panjang gelombang maksimum. Fraksi dibuat dalam lima

seri konsentrasi, masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 4 mL dan ditambahkan

dengan 1 mL DPPH 100 µg/mL lalu ditunggu selama OT dan diukur serapannya pada

panjang gelombang maksimum.

Perhitungan Nilai IC50

Dibuat kurva hubungan antara seri larutan standar kapsaisin dengan % aktivitas

antioksidan dan kurva hubungan antara seri larutan fraksi dengan % aktivitas antioksidan.

Dari persamaan yang didapatkan, dihitung nilai IC50 standar kapsaisin dan fraksi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi bertujuan untuk memastikan kebenaran identitas tanaman yang

digunakan sehingga kesalahan sampel dalam penelitian dapat dihindari. Hasil determinasi

menyatakan bahwa tanaman yang dipakai dalam penelitian ini adalah benar tanaman cabai

rawit.

Sortasi basah dan pencucian buah berguna untuk memisahkan buah dari pengotor

dan bagian yang tidak terpakai. Kemudian dilakukan pengeringan buah di bawah sinar

matahari secara tidak langsung dengan tujuan untuk menghindarkan simplisia dari

pertumbuhan mikroba agar simplisia tidak cepat rusak. Pengeringan dilakukan di bawah

sinar matahari secara tidak langsung bertujuan agar simplisia tidak rusak karena sinar UV

dari matahari. Pengeringan yang telah selesai ditandai dengan simplisia mudah dipatahkan

dan mencapai bobot tetap. Pengeringan hingga bobot tetap bertujuan untuk memastikan

bahwa kandungan air dalam simplisia sudah seminimal mungkin. Kemudian buah kering

dihaluskan menggunakan blender hingga didapatkan serbuk simplisia buah cabai rawit.

Tujuan pembuatan serbuk ini adalah memperkecil ukuran partikel simplisia agar luas

permukaan simplisia lebih besar sehingga ketika proses ekstraksi, permukaan simplisia yang

mengalami kontak dengan larutan penyari lebih banyak dan proses ektraksi menjadi lebih


6

optimal. Setelah itu dilakukan perhitungan persentase rendemen untuk mengetahui

perbandingan perolehan sampel dengan jumlah bahan yang digunakan. Persentase rendemen

serbuk yang didapat sebesar 19,918% (b/b).

Ekstraksi serbuk simplisa buah cabai rawit menggunakan metode sokhletasi. Dalam

metode ini, solven ekstraksi dipanaskan pada labu alas bulat di bagian bawah, diuapkan, dan

mengalami kondensasi pada kondenser dan menetes ke bawah mengenai sampel hingga

terendam seihngga dapat menarik keluar zat aktif dari sampel. Ketika solven mencapai

lengan sifon, solven akan mengalami pengosongan karena mengalir ke dalam labu alas bulat

membawa zat aktif. Proses tersebut berlangsung secara kontinu. Metode ini memiliki

keuntungan yaitu memerlukan pelarut yang jumlahnya lebih sedikit dibandingkan maserasi,

namun hanya dapat digunakan untuk senyawa yang tahan panas (Azwanida, 2015).

Kapsaisin memiliki titik didih yang tinggi (210o C) sehingga dapat diekstraksi dengan

sokhletasi. Pelarut organik yang digunakan untuk ekstraksi adalah etanol 96%. Ekstraksi

dilakukan hingga warna larutan penyari dalam tabung sokhlet jernih, dengan asumsi bahwa

semua senyawa kapsaisin sudah terambil dari simplisia. Digunakan suhu 70o C karena

merupakan titik didih etanol. Pemekatan ekstrak dilakukan dengan menggunakan vaccuum

rotary evaporator lalu dilanjutkan diatas waterbath hingga didapatkan ekstrak kental dengan

bobot tetap. Hal ini bertujuan untuk menghilangkan pelarut pengekstraksi yang masih

tertinggal dalam ekstrak. Didapatkan persentase rendemen ekstrak sebesar 21,513±0,644%

(b/b).

Purifikasi senyawa kapsaisin dalam ekstrak dilakukan dengan fraksinasi. Tujuan

dari fraksinasi adalah untuk menghasilkan berbagai fraksi dimana di setiap fraksinya

mengandung senyawa-senyawa yang memiliki kesamaan polaritas atau ukuran molekul

(Sarker and Nahar, 2012). Fraksinasi dilakukan dengan metode KLT preparatif. Prinsipnya

sama dengan KLT biasa yaitu pemisahan senyawa berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi

analit melalui fase diam dengan fase gerak cair (Gandjar dan Rohman, 2007). Dari hasil

optimasi didapatkan fase gerak optimum berupa toluen-etil asetat (1:1 v/v) (Gambar 1).

Parameter bercak yang mengandung kapsaisin adalah berdasarkan adanya kesamaan nilai Rf

(Retardation factor) bercak ekstrak etanol buah cabai rawit dengan larutan standar kapsaisin.

Terdapat delapan bercak yang muncul dan bercak dengan nilai Rf yang sama


7

dengan standar kapsaisin adalah bercak kelima dengan nilai Rf sebesar 0,43. Namun bercak

pita fraksi tersebut memiliki warna yang berbeda dengan standar kapsaisin. Menurut Wagner

dan Bladt (2001), kapsaisin dapat dideteksi saat disinari dengan sinar UV jika konsentrasinya

cukup tinggi. Bercak dengan warna berbeda tersebut diduga karena kandungan kapsaisin

dalam fraksi rendah dan ada senyawa lain pada bercak tersebut yang berpendar sehingga

warna tersebut bukan berasal dari senyawa kapsaisin. Meskipun begitu, fraksinasi tetap

dilakukan dengan mengerok KLT preparatif pada pita bercak dengan Rf 0,43 dengan asumsi

pada pita tersebut terdapat senyawa kapsaisin yang sudah terpurifikasi. Persentase rendemen

fraksi yang didapat sebesar 27,573±0,894% (b/b).

Validasi metode analisis berguna untuk menilai parameter-parameter tertentu dan

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.

Akurasi dan Presisi

Akurasi adalah kedekatan hasil penetapan yang diperoleh dengan hasil sebenarnya

yang dinyatakan sebagai hasil perolehan kembali (recovery) dari analit yang ditambahkan

(Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Presisi adalah kedekatan dari suatu seri

pengukuran yang diperoleh dari sampel yang homogen yang dilihat dari nilai CV

(Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Menurut persyaratan akurasi dan presisi

oleh Gonzales dan Herrador (2007), Semua hasil data (Tabel I) telah memenuhi persyaratan

sehingga dapat dikatakan bahwa akurasi dan presisi metode sudah baik.

Gambar 1. Hasil elusi ekstrak etanol cabai rawit (A) dan standar kapsaisin (B) dengan fase

gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase diam silica gel 60 F254 dan detektor UV 254 nm.

Bercak dengan nilai Rf 0,43 ada di dalam kotak berwarna merah

10


8

Linearitas dan Rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis untuk memberikan respons yang

baik dan proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel yang dapat dilihat dari nilai r

(Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Semakin nilai r mendekati satu, semakin

proporsional hasil pengujian terhadap konsentrasi analit. Dari persamaan kurva baku

(Gambar 2), didapat nilai r sebesar 0,9998 sehingga dapat dikatakan bahwa linearitas data

sudah baik. Rentang berguna untuk menyatakan rentang tertinggi dan terendah dari kadar

analit dalam sampel yang dapat ditetapkan secara presisi, akurat dan linearitas yang dapat

diterima (Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014). Rentang dalam pengujian ini

adalah pada konsentrasi 20-100 μg/mL.

Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode untuk dapat mengukur suatu zat

tertentu secara akurat dan presisi dengan adanya kemungkinan komponen lain dalam

Tabel I. Hasil Pengukuran Akurasi dan Presisi Metode Penetapan Kadar

Gambar 2. Kurva hubungan konsentrasi dengan absorbansi standar kapsaisin

Konsentrasi

(µg/mL)

Recovery

(%)

Rata-rata

(µg/mL) SD CV

Tanpa

adisi

Replikasi 1 33,427 -

33,104 2,443 7,381% Replikasi 2 35,369 -

Replikasi 3 30,515 -

Adisi 10

µg/mL

Replikasi 1 43,71845 102,9127%

43,071 3,061 7,108% Replikasi 2 45,75728 103,8835%

Replikasi 3 39,73786 92,2330%

Adisi 20

µg/mL

Replikasi 1 54,49515 105,3398%

52,262 3,219 6,158% Replikasi 2 53,71845 91,7476%

Replikasi 3 48,57282 90,2913%

Adisi 30

µg/mL

Replikasi 1 65,27184 106,1489%

63,524 2,943 4,633% Replikasi 2 65,17476 99,3528%

Replikasi 3 60,12621 98,7055%

y = 0,0103x - 0,0003R² = 0,9997

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 50 100 150

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi (µg/mL)

Standarkapsaisin


9

Tabel II. Hasil Penetapan Kadar Kapsaisin Dalam Fraksi

sampel seperti pengotor atau produk degradasi (Pharmaceutical Convention Incorporation,

2014). Pengujian diawali dengan optimasi panjang gelombang maksimum kapsaisin terlebih

dahulu. Panjang gelombang maksimum kapsaisin yang didapat dari hasil pengujian adalah

280 nm. Dari hasil scanning etanol, tidak terdapat puncak pada panjang gelombang 280 nm.

Hasil ini sudah sesuai dengan penelitian oleh Koleva et al. (2013) yang menyatakan bahwa

panjang gelomang maksimum kapsaisin ketika dilarutkan dengan etanol adalah pada 280 nm

sehingga dapat dikatakan bahwa metode sudah spesifik.

Penetapan kadar kapsaisin menggunakan metode spektrofotometri. Prinsip metode

ini adalah mengukur absorbsi energi dari suatu senyawa pada panjang gelombang tertentu,

dimana absorbsi energi sebanding dengan konsentrasi dari senyawa tersebut. Didapatkan

hasil penetapan kadar kapsaisin dalam fraksi (Tabel II) sebesar 331,036±24,433 μg/mL

sehingga kadar kapsaisin dalam buah segar sebesar 708,325±67,556 mg/kg atau

0,071±0,007% (b/b). Hasil ini jauh lebih kecil dari hasil penelitian Musfiroh dkk. (2013)

yang menyatakan bahwa buah cabai rawit mengandung kapsaisin sebesar 1,85% (b/b). Hal

ini dimungkinkan karena terdapat sejumlah sampel yang hilang selama proses pengolahan

sampel hingga pada tahap fraksi.

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Prinsip dari metode ini

adalah berubahnya warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning pucat ketika dicampur

dengan substansi yang dapat mendonorkan atom hidrogen. Intensitas warna yang dihasilkan

diukur menggunakan spektrofotometer visibel. Uji aktivitas antioksidan diawali dengan uji

kualitatif. Adanya perubahan warna larutan dari ungu menjadi kuning pucat ketika senyawa

uji direaksikan dengan DPPH mengindikasikan bahwa terdapat aktivitas antioksidan.

Pengujian memberikan hasil positif untuk senyawa standar kapsaisin, ekstrak etanol dan

fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah cabai rawit, namun negatif untuk etanol. Hal ini

menunjukkan bahwa standar kapsaisin, ekstrak etanol dan fraksi toluen-etil asetat ekstrak

etanol buah cabai rawit memiliki aktivitas antioksidan, sedangkan etanol sebagai pelarut

tidak memiliki aktivitas antioksidan. Pada uji kuantitatif, dilakukan optimasi terlebih dahulu

untuk menentukan panjang gelombang maksimum dan OT (Operating Time). Optimasi

panjang gelombang maksimum bertujuan untuk menentukan panjang gelombang dimana

Kadar (μg/mL) Rata-rata (μg/mL) SD CV

Replikasi 1 334,2718

331,036 24,433 7,381% Replikasi 2 353,6893

Replikasi 3 305,1456


10

larutan DPPH menghasilkan serapan maksimum. Dari hasil pengujian, didapatkan panjang

gelombang maksimum DPPH adalah pada 516 nm. Menurut Molyneux (2004), panjang

gelombang maksimum untuk DPPH adalah pada kisaran 515-520 nm sehingga hasil

pengujian telah sesuai dengan teori. Optimasi OT bertujuan untuk menentukan waktu

dimana reaksi antara senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dan larutan DPPH sudah

berjalan sempurna yang ditunjukkan dengan absorbansi yang stabil. Dari hasil percobaan,

absorbansi terus mengalami penurunan sehingga OT ditentukan dari waktu di mana selisih

absorbansi larutan mendekati konstan yaitu pada menit ke-40.

Indikator uji aktivitas antioksidan ini adalah didapatkannya nilai IC50. Nilai IC50

(Inhibitory Concentration 50) atau sering disebut juga EC50 (Efficient Concentration 50)

didefinisikan sebagai konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan hilangnya aktivitas

DPPH sebesar 50% (Molyneux, 2004). Dari hasil perhitungan (Tabel III), didapatkan IC50

standar kapsaisin sebesar 14,417 μg/mL dan IC50 sampel sebesar 347,998±19,359 μg/mL.

Menurut klasifikasi kekuatan antioksidan oleh Blois (1958), nilai IC50 <50 μg/mL adalah

antioksidan sangat kuat, 50-100 μg/mL adalah antioksidan kuat, 101-150 μg/mL adalah

antioksidan sedang dan >150 μg/mL adalah antioksidan lemah. Berdasarkan kategori

tersebut, standar kapsaisin termasuk dalam antioksidan sangat kuat, sedangkan fraksi toluen

- etil asetat ekstrak etanol buah cabai rawit merupakan antioksidan lemah. Nilai IC50 standar

hasil pengujian lebih kecil dari hasil penelitian oleh Zimmer et al. (2012) yaitu sebesar

17,62±1,84 µg/mL. Sedangkan nilai IC50 sampel fraksi lebih besar dibandingkan dengan

IC50 ekstrak etanol buah cabai rawit yang diteliti Nascimento et al. (2013) yaitu sebesar

302,3±3,97 µg/mL, yang berarti bahwa ekstrak etanol buah cabai rawit lebih poten dalam

memberikan aktivitas antioksidan dibandingkan dengan sampel yang sudah dipurifikasi.

Dimungkinkan hal ini dikarenakan aktivitas antioksidan ekstrak etanol buah cabai rawit

tidak hanya berasal dari senyawa kapsaisin namun juga dari senyawa lainnya yang saling

bersinergi, sehingga ketika dipurifikasi, senyawa lain yang mempunyai aktivitas

antioksidan sudah dihilangkan dan aktivitas antioksidannya menjadi turun.

Tabel III. Hasil Perhitungan IC50 Standar Kapsaisin dan Sampel Fraksi

IC50 (μg/mL) Rata-rata (μg/mL) SD CV

Standar 14,417 - - -

Replikasi 1 347,760

347,998

19,359

5,563%

Replikasi 2 367,474

Replikasi 3 328,758


11

Gambar 3. Mekanisme kapsaisin dengan radikal DPPH

Namun aktivitas antioksidan standar kapsaisin jauh lebih tinggi dibandingkan dengan

sampel fraksi dikarenakan senyawa standar memiliki kemurnian tinggi, sedangkan sampel

fraksi kemungkinan masih mengandung senyawa selain kapsaisin. Menurut penelitian yang

dilakukan oleh Okada et al. (2010), senyawa kapsaisin bersifat sebagai antioksidan karena

pada strukturnya terdapat gugus OH fenolik yang dapat memberikan atom H kepada

senyawa radikal sehingga senyawa radikal akan bersifat netral. Penangkapan atom H ini

akan menimbulkan perubahan warna pada DPPH yang semula berwarna ungu akan berubah

menjadi kuning pucat karena senyawa DPPH tereduksi dan tidak lagi mengalami

delokalisasi elektron (Gambar 3).

KESIMPULAN DAN SARAN

Terdapat kandungan kapsaisin dalam fraksi toluen-etil asetat ekstrak etanol buah

cabai rawit dengan kadar sebesar 331,036±24,433 μg/mL. Fraksi toluen-etil asetat ekstrak

etanol buah cabai rawit memiliki aktivitas antioksidan dengan IC50 sebesar 347,998 ±19,359

µg/mL.

Saran untuk penelitian selanjutnya adalah mencari metode lain yang lebih selektif

dalam mendeteksi kapsaisin seperti menggunakan densitometri atau kromatografi cair

kinerja tinggi.

DAFTAR PUSTAKA

Azwanida, N.N., 2015. A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants,

Principle, Strength and Limitation. Medicinal & Aromatic Plants, 4, 196.

Blois, M.S., 1958. Antioxidant determination by the use of stable free radicals. Nature, 181,

1199-2000.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta,

7.

Kapsaisin DPPH


12

Gonzales, A.G. and Herrador, M.A., 2007. A Practical Guide to Analytical Method

Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles. Trends in

Analytical Chemistry, 26(3), 228-238.

Koleva, I. I., van Beek, T.A., Linssen, J.P., de Groot, A., and Evstatieva, L N., 2002.

Screening of Plant Extracts for Antioxidant Activity: A Comparative Study of

Three Testing Methods. Phytochemical Analysis, 13(1), 8-17.

Liljana, G.K., Viktorija, M., Marija, S.D., Rubin, G., and Emilija, I.J., 2013. The Effect of

Different Methods of Extractions of Capsaicin on Its Content in the Capsicum

Oleoresins. Food Science, Engineering and Technology, 917-922.

Molyneux, P., 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphenylpicryl-Hydrazyl (DPPH)

For Estimating Antioxidant Activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., 26(2), 211-

219.

Musfiroh, I., Mutakin, M., Angelina, T., and Muchtardi, M., 2013. Capsaicin Level of

Various Capsicum Fruits. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical

Science, 5(1), 248-251.

Nascimento, P.L.A., Nascimento, T.C.E.S., Ramos, N.S.M., Silva, G.R, Camara, C.A.,

Silva, T.M., et al., 2013. Antimicrobial and antioxidant activities of Pimenta

malagueta (Capsicum frutescens). Academic Journal, 7(27), 3526-3533.

Okada, Y., Tanaka, K., Sato, E. and Okajima,H., 2010. Kinetics and Antioxidative Sites of

Capsaicin in Homogeneous Solution. J Am Oil Chem Soc, 87, 1397–1405.

Papas, A.M., 1999. Diet and Antioxidant Status. Food and Chemical Toxicology, 37, 999-

1007.

Pharmaceutical Convention Incorporation, 2014. United States Pharmacopoeia XXXVII/ NF

XXXI, Twin Brook Parkway, 1225.

Sarker, S.D. and Nahar, L., 2012. Natural Products Isolation, 3rd ed. Humana Press, New

York, 9, 33, 118-120.

Wagner, H., and Bladt, S., 2001. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas,

2nd ed. Springer, Berlin, 291.

Zimmer, A.R., Leonardi, B., Miron, D., Schapoval, E., Oliveira, J.R. and Gosmann, G.,

2011. Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Capsicum Baccatum: from

Traditional Use to Scientific Approach. Journal of Ethnopharmacology, 139, 228–

233


13

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman


14

Lampiran 2. Certificate of Analysis standar kapsaisin


15

Lampiran 3. Gambar sampel penelitian

Gambar 4. Buah cabai rawit segar Gambar 5. Buah cabai rawit kering

Gambar 6. Serbuk simplisia buah

cabai rawit

Gambar 7. Ekstrak etanol buah

cabai rawit

Gambar 8. Hasil KLT preparatif ekstrak etanol cabai rawit

(A) dan standar kapsaisin (B)

A B


16

Lampiran 4. Penimbangan sampel dan perhitungan % rendemen

% rendemen = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑎ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑥 100%

a. Data penimbangan buah segar

b. Data penimbangan buah hasil pengeringan

c. Data penimbangan serbuk total

Berat wadah 80,011 g

Berat wadah + serbuk 284,450 g

Berat serbuk 204,439 g

Berat tampah 181,5 g

Berat tampah + buah 1208,5 g

Berat tampah sisa 182,1 g

Berat buah 1026,4 g

Berat tampah 181,5 g

Berat tampah + buah 392,7 g

Berat buah 211,2 g

Gambar 9. Sampel fraksi toluen - etil asetat ekstrak etanol

buah cabai rawit Replikasi 1 (A), Replikasi 2 (B) dan Replikasi

3 (C)

A B C

% rendemen = 204,439 𝑔

1026,4 𝑔 𝑥 100%

= 19,918% b/b


17

d. Data penimbangan serbuk untuk ekstraksi

Replikasi 1 (g) Replikasi 2 (g) Replikasi 3 (g)

Berat cawan 62,2314 62,3448 62,3145

Berat cawan + serbuk 89,2353 87,3786 87,3225

Berat cawan sisa 64,2315 62,3532 62,3145

Berat serbuk 25,0038 25,0254 25,0080

e. Data penimbangan ekstrak


Berat cawan 72,7131 56,5012 62,3025

Berat cawan + ekstrak 77,5633 62,0655 67,6310

Berat ekstrak 5,2502 5,5643 5,3285

Replikasi 1


25,0038 𝑔 𝑥 100%

= 20,998% b/b

Replikasi 2


25,0254 𝑔 𝑥 100%

= 22,235% b/b

f. Data penimbangan ekstrak untuk fraksinasi


Berat vial 6,3152 6,3149 6,8715

Berat vial + ekstrak 6,5155 6,5156 7,0718

Berat vial ekstrak 0,2003 0,2007 0,2003

g. Data penimbangan fraksi


Berat cawan 69,4061 55,1563 52,5538

Berat cawan + fraksi 69,4620 55,213 52,6070

Replikasi 3


25,0080 𝑔 𝑥 100%

= 21,307% b/b


18

Berat cawan fraksi 0,0559 0,0567 0,0532

Replikasi 1


0,2003 𝑔 𝑥 100%

= 27,908% b/b

Replikasi 2


0,2007 𝑔 𝑥 100% `

= 28,251% b/b

h. Data penimbangan standar kapsaisin

Kertas 0,2409 g

Kertas + serbuk 0,2511 g

Kertas sisa 0,2409 g

Serbuk 0,0102 g

i. Data penimbangan DPPH


Berat gelas beaker 62,5867 96,8635 96,8345

Berat gelas beaker +

DPPH 62,5975 96,8744 96,8447

Berat DPPH 0,0108 0,0109 0,0102

Lampiran 5. Perhitungan pembuatan larutan seri kapsaisin untuk kurva

baku penetapan kadar

Semua larutan seri dibuat dari larutan stok kapsaisin 1000 μg/mL dan diencerkan

dalam labu takar 10 mL.

C1 . V1 = C2. V2

100 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 100 μg/mL.10 mL

V1 = 1 mL

Replikasi 3


0,2003 𝑔 𝑥 100%

= 26,560% b/b

80 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 80 μg/mL.10 mL

V1 = 0,8 mL


19

60 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 60 μg/mL.10 mL

V1 = 0,6 mL

40 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 40 μg/mL.10 mL

V1 = 0,4 mL

Lampiran 6. Hasil scanning pelarut kapsaisin (etanol)

Lampiran 7. Hasil scanning optimasi λ maksimum kapsaisin

20 μg/mL

1000 μg/mL.V1 = 20 μg/mL.10 mL

V1 = 0,2 mL


20

Lampiran 8. Pengukuran serapan larutan seri kapsaisin

a. Hasil scanning larutan seri kapsaisin

b. Kurva baku dan persamaan regresi linier larutan seri kapsaisin

x = konsentrasi (μg/mL)

y = absorbansi

Persamaan regresi linier: y = 0,0103x - 0,0003

r = 0,9998

Lampiran 9. Perhitungan Rf

Ekstrak etanol cabai rawit dielusi dengan fase gerak optimum yaitu toluen : etil

asetat (1:1) v/v

y = 0,0103x - 0,0003R² = 0,9997

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 50 100 150

Ab

sorb

ansi

Konsentrasi (µg/mL)

Konsentrasi vs Absorbansi Kapsaisin

Seri konsentrasikapsaisin

Linear (Serikonsentrasi kapsaisin)

Konsentrasi

(μg/mL) Absorbansi

20 0,205

40 0,411

60 0,618

80 0,81

100 1,031


21

Lampiran 10. Perhitungan konsentrasi fraksi

Semua fraksi dilarutkan dalam labu takar 10 mL

a. Konsentrasi fraksi stok

C = 𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑓𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑚𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑘𝑎𝑛

Replikasi 1

C = 0,0559 𝑔

10 𝑚𝐿 = 5590 μg/mL

Replikasi 2

C = 0,0567 𝑔

10 𝑚𝐿 = 5670 μg/mL

b. Perhitungan konsentrasi pengenceran fraksi 10x

Replikasi 1

5590 μg/mL.1 mL = C2.10 mL

C2 = 559 μg/mL

Replikasi 2

5670 μg/mL.1 mL = C2.10 mL

Gambar 10. Hasil elusi ekstrak etanol cabai rawit (A) dan standar kapsaisin (B)

dengan fase gerak toluen-etil asetat (1:1 v/v), fase diam silica gel 60 F254 dan

detektor UV 254 nm. Bercak dengan nilai Rf 0,43 ada di dalam kotak berwarna

merah

A B

4,3 cm

10 cm

Jarak elusi bercak = 4,3 cm

Batas elusi pada plat = 10 cm

Rf = 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑏𝑒𝑟𝑐𝑎𝑘

𝑏𝑎𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑡

= 4,3 𝑐𝑚

10 𝑐𝑚

= 0,43

Replikasi 3

C = 0,0532 𝑔

10 𝑚𝐿 = 5320 μg/mL

Replikasi 3

5320 μg/mL.1 mL = C2 .10 mL

C2 = 532 μg/mL


22

C2 = 567 μg/mL

Lampiran 11. Pengukuran serapan kapsaisin dan perhitungan konsentrasi

kapsaisin dalam fraksi pengenceran 10x

a. Pengukuran serapan kapsaisin dalam fraksi pengenceran 10x

b. Perhitungan konsentrasi kapsaisin dalam fraksi pengenceran 10x

Perhitungan menggunakan persamaan regresi linier dari kurva baku konsentrasi

vs absorbansi kapsaisin

Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,344 = 0,0103x – 0,0003

x = 33,427 μg/mL

Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,364 = 0,0103x – 0,0003

x = 35,369 μg/mL

Replikasi Absorbansi

1 0,344

2 0,364

3 0,314

Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,314 = 0,0103x – 0,0003

x = 30,515 μg/mL

Rata-rata = C Replikasi 1+C Replikasi 2+C Replikasi 3

3

= 33,427+35,369+30,515

3 = 33,1036 μg/mL

SD = 2,4433

CV = SD

Rata−rata x 100%

= 2,4433

33,104 x 100%

= 7,3808 %


23

Lampiran 12. Perhitungan penetapan kadar

Kadar kapsaisin dalam fraksi = konsentrasi yang didapat x faktor pengenceran

Jumlah kapsaisin dalam 10 ml fraksi = kadar kapsaisin dalam fraksi x 10 mL

Kadar kapsaisin dalam ekstrak = jumlah kapsaisin dalam 10 ml fraksi

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑜𝑡𝑜𝑙𝑘𝑎𝑛

Kadar kapsaisin dalam simplisia = kadar kapsaisin dalam ekstrak

𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑢𝑛𝑡𝑢𝑘 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖

Kadar kapsaisin dalam buah segar = Kadar kapsaisin dalam simplisia

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑏𝑢𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑔𝑎𝑟 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Kadar

kapsaisin

dalam fraksi

33,427 μg/mL x

10

= 334,272 μg/mL

35,369 μg/mL x

10

= 353,689 μg/mL

30,515 μg/mL x

10

= 305,146 μg/mL

Jumlah

kapsaisin

dalam 10 ml

fraksi

334,272 μg/mL x

10 mL

= 3342,718 µg

353,689 μg/mL x

10 mL

= 3536,893 µg

305,146 μg/mL x

10 mL

= 3051,1456 µg

Kadar

kapsaisin

dalam ekstrak

3342,718

µg/0,2003 g

= 87,618

mg/5,2502 g

3536,893

µg/0,2007 g

= 98,058

mg/5,5643 g

3051,1456

µg/0,2003 g

= 81,177

mg/5,3285 g

Kadar

kapsaisin

dalam

simplisia

87,618

mg/25,0038 g

= 716,393

mg/204,439 g

98,058 mg

/25,0254 g

= 801,065

mg/204,439 g

81,177

mg/25,0080 g

= 663,615

mg/204,439 g

Kadar

kapsaisin

dalam buah

segar

716,393

mg/1026,4 g

= 697,968 mg/kg

= 0,070% b/b

801,065

mg/1026,4 g

= 780,461 mg/kg

= 0,078% b/b

716,393 mg

/1026,4 g

= 646,546 mg/kg

= 0,065% b/b


24

Rata-rata = 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 1+𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 2+𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 3

3

= 697,968+780,461+716,393

3

= 708,325 mg/kg

SD = 67,556

CV = 𝑆𝐷

𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 x 100%

= 67,556

708,325 x 100%

= 9,537%

Lampiran 13. Hasil uji kualitatif aktivitas antioksidan

A B C D

Gambar 11. Hasil uji aktivitas antioksidan etanol (A), standar

kapsaisin (B), ekstrak etanol cabai rawit (C) dan fraksi toluen-

etil asetat ekstrak etanol cabai rawit (D)


25

Lampiran 14. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan

a. Penentuan operating time

Hasil serapan standar kapsaisin setiap 5 menit

Waktu

(menit) Absorbansi

Selisih

absorbansi

Waktu

(menit) Absorbansi

Selisih

absorbansi

0 0,754 - 30 0,337 0,022

3 0,661 0,093 35 0,318 0,019

5 0,571 0,09 40 0,301 0,017

10 0,488 0,083 45 0,284 0,017

15 0,425 0,063 50 0,271 0,013

20 0,39 0,035 55 0,26 0,011

25 0,359 0,031 60 0,251 0,009

Kurva Operating Time

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 20 40 60 80

Ab

sorb

ansi

Waktu (menit)

Penentuan Operating Time Standar Kapsaisin

Standarkapsaisin 100µg/mL


26

b. Penentuan λ maksimum DPPH

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3


27

Rata-rata = 𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 1+𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 2+𝐴𝑏𝑠 𝑟𝑒𝑝𝑙𝑖𝑘𝑎𝑠𝑖 3

3

= 514+516+518

3

= 516 nm

Lampiran 15. Uji aktivitas antioksidan standar kapsaisin

a. Pembuatan seri konsentrasi standar kapsaisin

5 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 5 μg/mL . 10 mL

V1 = 0,5 mL

10 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 10 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL

15 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 15 μg/mL . 10 mL

V1 = 1,5 mL

a. Hasil serapan blanko dan seri konsentrasi standar kapsaisin

b. Perhitungan %S

%S = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 x 100%

Konsentrasi (µg/mL) Absorbansi

5 0,25

10 0,219

15 0,184

20 0,158

25 0,109

Blanko 0,376

20 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 20 μg/mL . 10 mL

V1 = 2 mL

25 μg/mL

100 μg/mL . V1 = 25 μg/mL . 10 mL

V1 = 2,5 mL


28

5 μg/mL

%S = 0,376−0,250

0,376 x 100%

= 33,511%

10 μg/mL

%S = 0,376−0,219

0,376 x 100%

= 41,755%

15 μg/mL

%S = 0,376−0,184

0,376 x 100%

= 51,064%

d. Kurva baku dan persamaan regresi linier

x = konsentrasi (µg/mL)

y = %S

Persamaan regresi linier: y = 1,8245x + 23,697

r = 0,9950

c. Perhitungan IC50 standar kapsaisin


vs %S kapsaisin

IC50 standar kapsaisin: y = 1,8245x + 23,697

50 = 1,8245x + 23,697

y = 1,8245x + 23,697R² = 0,9901

01020304050607080

0 10 20 30

%S

(%)

Konsentrasi (μg/mL)

Konsentrasi vs %S Kapsaisin

Seri konsentrasikapsaisin

Linear (Serikonsentrasikapsaisin)

20 μg/mL

%S = 0,376−0,158

0,376 x 100%

= 57,979%

25 μg/mL

%S = 0,376−0,109

0,376 x 100%

= 71,011%


29

x = 14,417 µg/mL

Lampiran 16. Uji aktivitas antioksidan sampel fraksi

a. Pembuatan seri konsentrasi sampel

Replikasi 1

- Pengenceran 20x (279,5 μg/mL)

5590 μg/mL.V1 = 279,5 μg/mL.10 mL

V1 = 0,5 mL


5590 μg/mL.V1 = 372,667 μg/mL.6 mL

V1 = 0,4 mL


5590 μg/mL.V1 = 465,833 μg/mL.6 mL

V1 = 0,5 mL

- Pengenceran 10x (559 μg/mL)

5590 μg/mL.V1 = 559 μg/mL.10 mL

V1 = 1 mL

- Pengenceran 8,572x (652,167 μg/mL)

5590 μg/mL.V1 = 652,167 μg/mL.6 mL

V1 = 0,7 mL

Replikasi 2


5670 μg/mL . V1 = 283,5 μg/mL . 10 mL

V1 = 0,5 mL


5670 μg/mL . V1 = 378 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,4 mL


5670 μg/mL . V1 = 472,5 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,5 mL



30

5670 μg/mL . V1 = 567 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL


5670 μg/mL . V1 = 661,5 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,7 mL

Replikasi 3


5320 μg/mL . V1 = 266 μg/mL . 10 mL

V1 = 0,5 mL


5320 μg/mL . V1 = 354,667 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,4 mL


5320 μg/mL . V1 = 443,333 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,5 mL


5320 μg/mL . V1 = 532 μg/mL . 10 mL

V1 = 1 mL


5320 μg/mL . V1 = 620,667 μg/mL . 6 mL

V1 = 0,7 mL

d. Hasil serapan blanko


31

Rata-rata = 𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜1+𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 2+𝐵𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜 3

3

= 0,394+0,416+0,394

3

= 0,306

e. Hasil serapan seri konsentrasi sampel fraksi

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

Konsentrasi

(μg/mL) Abs

279,500 0,231 283,500 0,238 266 0,229

372,667 0,189 378 0,196 354,667 0,189

Replikasi 3


32

465,833 0,145 472,500 0,152 443,333 0,151

559 0,119 567 0,121 532 0,114

652,167 0,074 661,500 0,09 620,667 0,083

g. Perhitungan %S

Replikasi 1

- 279,5 μg/mL

%S = 0,401−0,231

0,401 x 100%

= 42,442%

- 372,667 μg/mL

%S = 0,401−0,189

0,401 x 100%

= 52,907%

- 465,833 μg/mL

%S = 0,401−0,145

0,401 x 100%

= 63,870%

Replikasi 2

- 283,5 μg/mL

%S = 0,401−0,238

0,401 x 100%

= 40,698%

- 378 μg/mL

%S = 0,401−0,196

0,401 x 100%

= 51,163%

- 472,5 μg/mL

%S = 0,401−0,152

0,401 x 100%

= 62,126%

- 559 μg/mL

%S = 0,401−0,119

0,401 x 100%

= 70,348%

- 652,167 μg/mL

%S = 0,401−0,074

0,401 x 100%

= 81,561%

- 567 μg/mL

%S = 0,401−0,121

0,401 x 100%

= 69,851%

- 661,5 μg/mL

%S = 0,401−0,09

0,401 x 100%

= 77,575%


33

Replikasi 3

- 266 μg/mL

%S = 0,401−0,229

0,401 x 100%

= 42,940%

- 354,667 μg/mL

%S = 0,401−0,189

0,401 x 100%

= 52,907%

- 443,333 μg/mL

%S = 0,401−0,151

0,401 x 100%

= 62,375%

e. Kurva baku dan persamaan regresi linier

x = konsentrasi (µg/mL)

y = %S

Persamaan regresi linier:

Replikasi 1: y = 0,1027x + 14,385

r = 0,9971

Replikasi 2: y = 0,0978x + 14,061

r = 0,9964

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 200 400 600 800

%S

(%)

Konsentrasi µg/mL

Konsentrasi vs %S Sampel

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Linear(Replikasi 1)

Linear(Replikasi 2)

Linear(Replikasi 3)

- 532 μg/mL

%S = 0,401−0,114

0,401 x 100%

= 71,595%

- 620,666 μg/mL

%S = 0,401−0,083

0,401 x 100%

= 79,319%

Replikasi 3: y = 0,1031x + 16,105

r = 0,9989


34

f. Perhitungan IC50 sampel


vs %S sampel

IC50 Replikasi 1: y = 0,1027x + 14,385

50 = 0,1027x + 14,385

x = 347,760 µg/mL

IC50 Replikasi 2: y = 0,0978x + 14,061

50 = 0,0978x + 14,061

x = 367,474 µg/mL

IC50 Replikasi 3: y = 0,1031x + 16,105

50 = 0,1031x + 16,105

x = 328,758 µg/mL

Rata-rata = IC50 Replikasi 1+ IC50 Replikasi 2+ IC50 Replikasi 3

3

= 347,760+367,474+ 328,758

3

= 347,998 µg/mL

SD = 19,359

CV = 𝑆𝐷


= 19,359

347,998 x 100%

= 5,563%


35

Lampiran 17. Hasil dan perhitungan adisi sampel

a. Hasil serapan sampel

Replikasi 1

Replikasi 2

Konsentrasi adisi

10 µg/mL 20 µg/mL 30 µg/mL

Replikasi 1 0,450 0,561 0,672

Replikasi 2 0,471 0,553 0,671

Replikasi 3 0,409 0,500 0,619

b. Perhitungan konsentrasi sampel


vs absorbansi kapsaisin

Adisi 10 µg/mL

Replikasi 3


36

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,450 = 0,0103x – 0,0003

x = 43,718 μg/mL

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,471 = 0,0103x – 0,0003

x = 45,757 μg/mL

Rata-rata = C Replikasi 1+ C Replikasi 2+ C Replikasi 3

3

= 43,718+45,757 + 39,738

3

= 43,071 µg/mL

SD = 3,061

CV = 𝑆𝐷


= 3,061

43,071 x 100%

= 7,108%

Adisi 20 µg/mL

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,561 = 0,0103x – 0,0003

x = 54,495 μg/mL

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,553 = 0,0103x – 0,0003

x = 53,718 μg/mL

- Replikasi 3


3

= 54,495 +53,71 + 48,573

3

= 52,262 µg/mL

SD = 3,219

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,409 = 0,0103x – 0,0003

x = 39,738 μg/mL

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,500 = 0,0103x – 0,0003

x = 48,573 μg/mL


37

CV = 𝑆𝐷


= 3,219

52,262 x 100%

= 6,158%

Adisi 30 µg/mL

- Replikasi 1

y = 0,0103x - 0,0003

0,672 = 0,0103x – 0,0003

x = 65,272 μg/mL

- Replikasi 2

y = 0,0103x - 0,0003

0,671 = 0,0103x – 0,0003

x = 65,175 μg/mL


3

= 65,272+65,175 + 60,126

3

= 63,524 µg/mL

SD = 2,943

CV = 𝑆𝐷


= 2,943

63,524 x 100%

= 4,633%

c. Perhitungan % recovery

% recovery = Konsentrasi larutan n setelah adisi− Konsentrasi tanpa adisi

Konsentrasi (jumlah) adisi x100%

Adisi 10 µg/mL

- Replikasi 1

% recovery = 43,718−33,427

10 x 100%

= 102,913%

- Replikasi 2

% recovery = 45,757−35,369

10 x 100%

- Replikasi 3

y = 0,0103x - 0,0003

0,619 = 0,0103x – 0,0003

x = 60,126 μg/mL

- Replikasi 3

% recovery = 39,738−30,515

10 x 100%

= 92,233%


38

= 103,884%

Adisi 20 µg/mL

- Replikasi 1

% recovery = 54,495−33,427

20 x 100%

= 105,340%

- Replikasi 2

% recovery = 53,718−35,369

20 x 100%

= 91,748%

Adisi 30 µg/mL

- Replikasi 1

% recovery = 65,272−33,427

30 x 100%

= 106,149%

- Replikasi 2

% recovery = 65,175−35,369

30 x 100%

= 99,353%

- Replikasi 3

% recovery = 39,738−30,515

10 x 100%

= 92,233%

- Replikasi 3

% recovery = 60,126−30,515

30 x 100%

= 98,706%


39

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul Penetapan Kadar

Kapsaisin dan Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Toluen-

Etil Asetat Buah Cabai Rawit (Capsicum Frutescens L.)

dengan Metode 2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil (PPH)

memiliki nama lengkap Regina Hiacinta Eva Angelista.

Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 16 Juni

1995 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari

pasangan Agus Setiawan dan Lelly Puspa Dewi. Penulis

menempuh pendidikan formal di TK Santa Theresia Muntilan (2000-2001), SD

Marsudirini Muntilan (2001-2007), SMP Marganingsih Muntilan (2007-2010),

SMA Van Lith Muntilan (2010-2013), dan kemudian melanjutkan kuliah di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2013. Semasa

kuliah, penulis aktif dalam berbagai kegiatan baik kegiatan fakultas maupun

universitas, seperti menjadi seksi perlengkapan Donor Darah JMKI (2014), seksi

dekorasi dan dokumentasi Komisi Pemilihan Gubernur BEMF dan Ketua DPMF

Farmasi (2014), seksi dekorasi dan dokumentasi Pemilihan Presiden dan Wakil

Presiden BEM USD (2015), bendahara Student Exchange Programme Committee

(2015), divisi publikasi dan informasi Dewan Perwakilan Mahasiswa Farmasi

(2015/2016), asisten praktikum Farmakologi Toksikologi (2015 dan 2016) dan

asisten praktikum Mikrobiologi (2016).


penetapan kadar kapsaisin dan uji aktivitas · pdf filekepada penulis sehingga penulis dapat...

Documents