Penentuan Potensi Antibiotika (Kloramfenikol)

Uji Potensi Tiga Dosis

I. TUJUAN

Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika kloramfenikol di pasaran terhadap

antibiotika standar.

II. PRINSIP

1. Membandingkan respon yaitu derajat hambatan pertumbuhan dari jasad renik

yang peka dan sesuai dalam kondisi pertumbuhan yang sama dari dosis sediaan

yang diperiksa (control) terhadap dosis sediaan baku.

2. Metode lempeng silinder atau metode difusi, dimana zat yang diperiksa akan

berdifusi dari reservoir ke dalam media agaryang telah diinokulasikan dengan

bakteri, diameter zona bening diukur dan dibandingkan dengan larutan standar

baku.

3. Pengenceran bertingkat

Memperoleh konsentrasi yang lebih kecil dengan cara menambahkan

pelarutnya.

V1.M1 = V2.M2

III. TEORI

Antibiotika adalah zat-zat yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri , yang

memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman. Turunan zat

tersebut yang dibuat secara semisintetik, termasuk dalam kelompok ini, begitu pula

senyawa sintesis dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotika (Tjay &

Rahardja, 2002).

Antibiotik memiliki cara kerja sebagai bakterisidal (membunuh bakteri secara

langsung) atau bakteriostatik (menghambat pertumbuhan bakteri). Pada kondisi

bakteriostasis, mekanisme pertahanan tubuh inang seperti fagositosis dan produksi

antibodi biasanya akan merusak mikroorganisme. Ada beberapa cara kerja

antibiotik terhadap bakteri sebagai targetnya, yaitu menghambat sintesis dinding

sel, menghambat sintesis protein, merusak membran plasma, menghambat sintesis

asam nukleat, dan menghambat sintesis metabolit esensial (Naim, 2003).

Lazimnya antibiotika dibuat secara mikrobiologi, yaitu fungi yang dibiakkan

dalam tangki-tangki besar bersama zat-zat gizi khusus. Oksigen atau udara steril

disalurkan ke dalam cairan pembiakan guna mempercepat pertumbuhan fungi dan

meningkatkan produksi antibiotikumnya. Setelah diisolasi, antibiotikum

dimurnikan dan aktivitasnya ditentukan. Cara pembuatan antibiotika dibedakan

menjadi dua:

a. Antibiotika semisintesis, yaitu apabila ada persemaian dibubuhi zat-zat

pelopor tertentu, maka zat-zat ini diinkoperasi ke dalam antibiotikum dasarnya,

misalnya Penisilin-V.

b. Antibiotika sintesis, yaitu dibuat dengan sintesa kimiawi, bukan lagi dengan

jalan biosintesis, contohnya kloramfenikol

Beberapa antibiotika bekerja pada dinding sel atau membran sel. Namun

antibiotika tidak aktif terhadap kebanyakan virus kecil, mungkin karena virus tidak

memiliki proses metabolisme sesungguhnya, tetapi seluruhnya tergantung pada

proses tuan rumah ( Tjay & Rahardja, 2002).

Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah ini berarti

bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit, tetapi tidak membahayakan inang.

Seringkali, toksisitas selektif lebih bersifat relative dan bukan absolut; ini berarti

bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu dapt ditoleransi oleh inang, dapat

merusak parasit (Jawetz, et. al., 1987).

Toksisitas selektif dapat berupa fungsi dari suatu reseptor khusus yang

dibutuhkan untuk pelekatan obat, atau dapat bergantung pada penghambatan proses

biokimia yang penting untuk parasit, tetapi tidak untuk inang. Mekanisme kerja

sebagian besar obat antimikroba belum dimengerti secara jelas. Namun, untuk

mudahnya dapat dibagi menjadi empat cara:

1. Penghambatan sintesis dinding sel.

2. Penghambatan fungsi selaput sel.

3. Penghambatan sintesis protein (yaitu hambatan translasi dan transkripsi bahan

genetik).

4. Penghambatan sintesis asam nukleat (Jawetz et. al., 1987).

Pada keadaan awal kekuatan antibiotik bisa ditentukan karena kadarnya

ekuivalen dengan konsentrasinya. Tetapi uji yang paling tepat adalah uji secara

mikrobiologi untuk mengetahui efeknya secara langsung terhadap mikroba (in

vitro) dan berapa MIC-nya. Bila diuji secara in vitro perlu dilihat waktu pemberian

obat sehingga didapatkan potensi maksimumnya yang mempunyai daya kerja yang

optimal jangan sampai pada pemberian berikutnya diberikan pada saat konsentrasi

obat dalam darah habis., karena itu konsentrasi obat dalam darah diusahakan selalu

tetap stabil dengan menggunakan aturan pakai obat antibiotik. Farmakope

menentukan potensi antibiotik standar antara 85 %-105 %.

Potensi suatu antibiotik lama-lama dapat menurun, hal ini disebabkan oleh:

1. Waktu kadaluwarsa telah dicapai

2. Penyimpanan yangtidak baik

3. Terjadi penguraian obat yang menghasilkan zat lain sehingga tidak

memiliki efek lagi.

Ada dua cara yang diguakan dalam penetapan potensi antibiotik, yaitu:

1. Cara Lempeng/Difusi

Zat yang diperiksa berdifusi dari resevoir ke dalam media agar yang telah

diinokulasi dengan bakteri setelah itu diinkubasi, hambatan pertumbuhan mikroba

diukur dan dibandingkan dengan baku.

2. Cara Turbidimetri

Menggunakan media cair, kekeruhan disebabkan oleh pertumbuhan bakteri

diukur dengan menggunakan instrumen yang cocok yaitu spektofotometer atau

neferometer (Melnick & Aldelberg, 1996).

Rifampisin merupakan antibiotik semisintetik derivat dari Rivamycin SV

yang ditemukan pada tahun 1957. Rivamycin SV ini diisolasi dari Streptomyces

mediteranei dan menunjukkan efek antituberkulosis dan antikusta. Opramolla pada

tahun 1963 menggunakan Rivamycin SV secara parenteral.

Rifampisin dapat mengurangi efektifitas beberapa obat bila diberikan

bersama-sama, obat-obat ini adalah : antikoagulan oral, antidiabetik oral, dan

kontrasepsi oral. Bilamana diberikan bersama PAS, maka obat ini dapat

mempertambah absorpsi Rifampisin dan karenanya harus diselang 4-8 jam dalam

pemakaian kedua obat tersebut. Pemakaian bersama-sama dengan Isoniazid dapat

menambah resiko gangguan fungsi hati.

Rifampisin mengandung tidak kurang dari 95,0 % dan tidak lebih dari

103,0 % C43H58N4O12 per mg, dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan, rifampisin

memiliki berat molekul 822,95. Rifampisin memiliki serbuk hablur berwarna coklat

merah. Rifampisin sangat sukar larut dalam air; mudah larut dalam kloroform; larut

dalam etil asetat dan dalam methanol.

Rifampisin merupakan salah satu obat yang banyak digunakan sebagai

anti-tuberkulosis (TBC) yang sangat sukar larut dalam air, sehingga absorbsinya

kurang baik (Melnick & Aldelberg, 1996).

Escherichia coli

Bakteri Escheria Coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif,

berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang

lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang

bergandeng seperti rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula,

berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm, dapat bertahan hidup di medium sederhana

dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam.

Media Nutrient Agar

Penyiapan media pertumbuhan mikroorganisme harus mengandung nutrisi

yang dibutuhkan bakteri supaya dapat tumbuh membentuk koloni dan harus steril

sehingga tidak ada kontaminan dari lingkungan. Media pertumbuhan dasar untuk

bakteri adalah Nutrient Broth (NB), Nutrient Agar (NA), Tryptic Soy Broth (TSB),

dan Tryptic Soy Agar (TSA) ( Anonymous, 2007).

Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati penampilan atau

morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni. Untuk membuat medium padat,

dapat ditambahkan agar-agar, gelatin, atau gel silika ke dalam medium kaldu. Agar-

agar menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu hampir 1000 C dan tetap

berbentuk cair bila didinginkan sampai kurang lebih 430 C. Hal ini berbeda dengan

gelatin, sekali menjadi padat maka tidak dapat dicairkan lagi. Oleh karena itu yang

paling umum digunakan adalah agar-agar namun tidak dianjurkan untuk mencairkan

kembali medium padat agar lebih dari dua kali karena dapat memberikan hasil yang

kurang baik (Anonymous, 2007).

IV. ALAT DAN BAHAN

Alat:

1. Cawan petri.

2. Corong saring.

3. Inkubator.

4. Jangka sorong.

5. Labu ukur 100 mL dan 25 mL.

6. Mikropipet.

7. Mortir dan stamper.

8. Pembakar spiritus.

9. Perforator.

10. Pinset.

11. Rak tabung.

12. Spatel.

13. Tabung reaksi.

Bahan :

1. Aquadest steril.

2. Larutan desinfektan.

3. Media nutrient agar.

4. Metanol.

5. Sediaan antibiotika kloramfenikol standar dan sampel kloramfenikol.

6. Suspensi bakteri Escherichia coli.

V. PROSEDUR

Pertama-tama disiapkan suspensi bakteri dalam Nutrien Broth yang berumur

18-24 jam, bakteri ini harus homogen. Setelah itu disiapkan perbenihan nutrient

agar dengan cara melarutkan sejumlah tertentu nutrient agar dalam aquadest

kemudian disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada 121oC selama 15 menit.

Sediaan uji digerus dulu dalam mortar, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur

dan dilarutkan sedikit dengan pelarutnya, lalu ditambahkan air suling sampai tanda

batas. Kemudian dibuat pengenceran bertingkat untuk tiga seri dosis yaitu 12,5

µg/mL, 25 µg/mL, dan 50 µg/mL. Setelah itu dibuat larutan inokulum dengan cara

memasukkan suspensi biakan bakteri ke dalam NA yang telah disterilisasi. Dalam

keadaan masih cair, NA yang telah disterilisasi dituangkan ke dalam cawan Petri

sebanyak 20 mL dan dibiarkan sampai membeku. Permukaan dasar cawan Petri

dibagi menjadi 6 bagian sama besar dan diberi label tergantung variasi seri dosis

yang diberikan. Kemudian dibuat 6 cetakan reservoir pada masing-masing cawan

Petri dengan menggunakan perforator secara aseptis. Agar yang ada dalam cetakan

reservoir dibuang dengan menggunakan spatel, dan hasil buangan dimasukkan ke

dalam desinfektan. Larutan sampel dan baku dimasukkan ke dalam reservoir

sebanyak 50 µg/mL dengan menggunakan mikropipet secara aseptis. Cawan Petri

diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam, kemudian diukur dan dicatat

diameter daerah bening/zona lisis yang terjadi di sekeliling reservoir yang telah

mengandung antibiotika tersebut dengan menggunakan jangka sorong, dan dihitung

potensi antibiotiknya.

VI. DATA PENGAMATAN DAN PERHITUNGAN

Data hasil pengamatan

- Tabel pengamatan.

CawanBaku (cm) Sampel (cm)

BT BM BR ST SM SR

1 1,86 1,78 1,24 1,71 1,62 1,04

2 1,81 1,63 1,29 1,74 1,6 1,22

Jumlah 3,67 3,41 2.53 3,45 3,22 2,26

Rata-rata 1,835 1,705 1,265 1,725 1,61 1,13

Keterangan:

BT : Baku dengan dosis tinggi.

BM : Baku dengan dosis sedang.

BR : Baku dengan dosis rendah.

ST : Sampel dengan dosis tinggi.

SM : Sampel dengan dosis sedang.

SR : Sampel dengan dosis rendah.

Perhitungan

- Pengenceran antibiotika.

KonsentrasiKloramfenikol = 2500 µg/mL

Dosis Tinggi

10 µg/mL x 20 = 200 µg/mL

M1.V1 = M2.V2

2500 µg/mL . 1 = 200 µg/mL . X

V1 = 12,5 mL

Volume antibiotik = 1 mL

Volume aquadest yang ditambahkan = 11,5 mL

Dosis Menengah

5 µg/mL x 20 = 100 µg/mL

M1.V1 = M2.V2

200 µg/mL . 1 = 100 µg/mL . X

V1 = 2 ml

Volume antibiotik = 1 mL

Volume aquadest yang ditambahkan = 1 mL

Dosis Rendah

2,5 µg/mL x 20 = 50 µg/mL

M1.V1 = M2.V2

200 µg/mL . 1 = 50 µg/mL . X

V2 = 4 mL

Volume antibiotik = 1 mL

Volume aquadest yang ditambahkan = 3 mL

I=logDTDM

=¿ logDMDR

¿

¿ log105

=log5

2,5=log 2=0,301

E=14 ( ( S3−S1 )+ (B3−B1 ))

¿ 14

(0,595+0,5 7 )

¿0,29125

b=EI=0,29125

0,301=0,9676

F=13 (( S1+S2+S3 )−( B1+B2+B3 ) )

¿ 13

( ( 4,465 )−( 4,805 ) )

¿−0,1133

M= Fb=−0,1133

0,9676=−0 ,1171

Potensi = Antilog M x 100% = 0,76366 x 100% = 76,366%

Jadi, potensi dari sediaan yang diperiksa = 76,366% terhadap potensi baku.

VII. PEMBAHASAN

Pada percobaan kali ini, metode yang digunakan dalam penentuan potensi

antibiotika adalah metode penetapan dengan lempeng silinder yaitu menggunakan

perforator untuk menguji antibiotik pada media nutrien agar yang berisi inokulum

bakteri pada cawan petri Potensi dapat ditentukan dengan mengukur zona bening

yang dihasilkan dan membandingkannya dengan diameter zona bening dari

antibiotika standar.

Percobaan yang dilakukan kali ini memakai dua cawan Petri yang bertujuan

untuk mengurangi tingkat kesalahan pada saat perhitungan. Pada percobaan ini

dilakukan pengenceran untuk menentukan dosis tinggi, dosis menengah dan dosis

rendah yang akan digunakan dalam percobaan uji potensi antibiotika tiga dosis. Pada

percobaan ini diambil dosis tinggi 10 µg/ml dengan penambahan dosis antibiotik 1

mL dan aquadest steril 11,5 ml, dosis tengah 5 μg/ml dengan penambahan dosis

antibiotik 1 ml dan aquadest steril 1 ml, dan dosis rendah 2,5 μg/ml dengan volume

antibiotik 1 ml dan penambahan aquadest steril 3 ml. Pengenceran untuk dosis tengah

dan dosis rendah diambil dari larutan kloramfenikol pada dosis tinggi. Hal ini

dikarenakan jika pengenceran diambil dari larutan stock kloramfenikol, maka

dibutuhkan penambahan aquadest steril yang banyak.

Hal pertama yang dilakukan adalah menyiapkan suspensi bakteri dalam

nutrient broth yang berumur 18-24 jam dan dihomogenkan. Hal ini agar bakteri yang

dibiakkan terdapat dalam jumlah yang cukup. Syarat penggunaan biakan bakteri yang

dipakai adalah harus biakan murni (pure strained). Maksud dari biakan murni adalah

bakteri yang diambil dari alam secara langsung kemudian dibiakkan, bukan dari

bakteri yang diisolasi dari laboratorium klinis. Bakteri yang dipakai pada percobaan

kali ini adalah Escherichia coli dan sampel dan baku standar antibiotika yang kita

pakai adalah Kloramfenikol.

Kemudian menyiapkan perbenihan nutrient agar dan sediaan antibiotik

Kloramfenikol dengan cara digerus terlebih dahulu kemudian dilarutkan dengan

etanol hingga larut dalan labu ukur 100 mL. Setelah itu ditambahkan aquadest steril

sampai tanda batas, larutan tersebut dihomogenkan. Hal ini harus dilakukan dengan

cara kuantitatif agar tidak mempengaruhi kadar dan agar pengujian potensi antibiotik

dapat tepat.

Setelah itu perencanaan pengenceran terhadap sampel dan standar hingga

didapat variasi dosis yang diinginkan (dosis tinggi, dosis tengah, dan dosis rendah)

dilakukan. Sampel dan standar diberi perlakuan yang sama agar dapat dibandingkan

dan diketahui kadarnya. Kemudian dibuat larutan inokulum dengan cara suspensi

bakteri dimasukkan ke dalam cawan petri menggunakan mikropipet, kemudian

ditambahkan nutrient agar dengan suhu yang sesuai, homogenkan dan biarkan sampai

membeku. Harus sampai membeku semua dikarenakan jika tidak beku semua bagian,

pada saat di lubangi dengan perforator, akan membuat bentuk yang tidak bulat,

karena bagian dalam nutrient agar yang belum beku akan membuat lubang menjadi

berbentuk tidak bulat sempurna.

Setelah itu, permukaan dasar cawan petri dibagi menjadi enam area sama

besar. Masing-masing area tersebut diberi label tergantung variasi seri dosis yang

digunakan, yaitu BT; BM; BR; ST; SM; dan SR. Area tersebut dibuat bersilangan

agar zona yang terbentuk tidak menumpuk. Pada masing-masing area tersebut dibuat

enam cetakan reservoir (lubang) dengan menggunakan perforator secara aseptis, yaitu

dekat dengan api. Maksud dari dekat dengan api adalah agar tidak terjadi kontaminan

dari bakteri lain yang berada disekitarnya.

Kemudian larutan antibiotik standar dan sampel sebanyak 50 μL

dimasukkan pada masing-masing reservoir sesuai dengan dosis yang ditentukan

dengan menggunakan mikropipet. Keuntungan menggunakan mikropipet adalah

mencegah tertelannya antibiotika tersebut dan mampu mengambil zat dengan jumlah

yang sangat kecil dan akurat. Mikropipet yang digunakan haruslah bersih, setelah

digunakan harus dicuci dengan desinfektan. Setelah itu diinkubasi dalam inkubator

pada suhu ± 37oC selama 18-24 jam. Penginkubasian ini bertujuan agar bakteri dapat

tumbuh dan berkembang.

Setelah diinkubasi, diperoleh zona hambat dengan diameter yang beragam,

antibiotik dengan dosis tinggi memiliki diameter yang lebih besar daripada antibiotik

dengan dosis rendah. Hal ini menunjukkan bahwa kemampuan antibiotik untuk

menghambat aktivitas bakteri berbanding lurus dengan konsentrasinya.

Melalui perhitungan potensi antibiotika, didapatkan potensi antibiotika

sampel kloramfenikol terhadap standard kloramfenikol ialah 76,366%.

VIII. KESIMPULAN

Besarnya potensi sampel antibiotika Kloramfenikol terhadap antibiotika

kloramfenikol standar adalah 76,366%.

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous. 2009. Nutrient Agar and Nutrient Broth Preparation.

http://www.austin.cc.tx.us./microbugz/01mediaprep.html

Jawetz, E., J. L. Melnick, & L. N. Ornston. 1987. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20,

alih bahasa: Edi Nugroho & RF Maulany. EGC. Jakarta.

Melnick, J & Aldelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh: Edi

Nugroho, R. F. Maulany. Edisi 20. EGC. Jakarta.

Naim, Rochman. 2003. Antibiotik.

http://www2.kompas.com/kompas-cetak/0312/11/ilpeng/734094.htm

Tjay, T.H & K. Rahardja. 2002. Obat-Obat Penting, Khasiat, Penggunaan dan Efek-

efek Sampingnya. PT Elex Media Komputindo Gramedia . Jakarta.