LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGIPenentuan Potensi Antibiotika

Kelompok 10 (Selasa Pagi)Farmasi Reguler 2012

Defira Metha Diandra (1206257746)Michael Prajanto (1206257733)Zahra Adiyati (1206257670)

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS INDONESIA2013

POTENSI ANTIBIOTIKHari, tanggal praktikum : Selasa, 22 Oktober 2013Waktu : Pukul 09.00-11.50 WIBTempat : Laboratorium Mikrobiologi lantai 3 Fakultas Farmasi Universitas IndonesiaI. Dasar TeoriAntibiotika adalah zat yang dihasilkan oleh suatu mikroorganisme terutama fungi, yang dapat menghambat atau mematikan mikroba jenis lain. Banyak antibiotika sekarang ini yang dibuat secara semisintetik atau sintetik. Namun, dalam penggunaan kesehariannya banyak ditemukan antibiotika yang tidak diturunkan dari produk mikroba juga digolongkan sebagai antibiotika, contohnya sulfonamid dan kuinolon.Antibiotika juga biasa disebut antimikroba, yaitu obat pembasmi mikroba, khususnya mikroba yang merugikan manusia. Obat yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif setinggi mungkin. Artinya obat tersebut haruslah bersifat sangat toksik untuk mikroba tetapi relatif tidak toksik untuk hospes, yaitu manusia. Namun, sifat toksisitas selektif yang absolut belum atau mungkin juga tidak akan diperoleh.Berdasarkan sifat toksisitas selektif, ada antimikroba yang bersifat menghambat pertumbuhan mikroba yang dikenal sebagai aktivitas bakteriostatik dan ada juga yang bersifat membunuh mikroba yang dikenal sebagai aktivitas bakterisid. Dalam percobaan ini antibiotik berupa amoxicilin diuji potensinya apakah memenuhi standar dalam kegunaannya untuk membunuh mikroba. Bila perhitungan potensi antibiotik berada pada kisaran 90% -120% berarti antibiotik amoxicillin yang diujikan dapat menghambat pertumbuhan kuman dengan baik.II. Tujuan1. Mengetahui potensi antibiotika yang digunakan untuk membunuh mikroba.2. Mengetahui cara-cara perhitungan dalam penentuan potensi antibiotik.III. Alat1. Pipet ukur 10 ml2. Pipet ukur 5 ml 3. Pipet tetes4. Pipet 10 l5. Tabung reaksi ( 10 buah)6. Lampu spiritus7. Pematik api8. Vortex9. Ose10. Filter bakteri11. Labu takar 50 ml (2 buah)12. Labu takar 25 ml (2 buah)13. Inkubator14. Suntikan15. Rak tabung reaksi16. Stiker label17. Cawan Petri (7 buah)18. Pinset19. Spidol20. Cakram kertas21. Jangka sorong

IV. Bahan1. Kuman standar Staphylococcus aureus ATCC 259232. Bahan pembantu : - Buffer fosfat pH 8,0 - Larutan NaCl fisiologis (0,9%)3. Medium padat : - Nutrient agar (base layer) = medium 2 - Medium antibiotik (seed layer) = medium 11 - Agar miring4. Medium cair : - Kaldu tioglikolat - Kaldu B H I5. Antibiotika standar.6. Antibiotika uji (amoksisilin trihidrat).

V. Cara KerjaA. Teori Kerjaa) Pembuatan inokulum1. Disediakan biakan kuman standar dalam agar miring pada 370C selama 10-24 jam.2. Disiapkan 4 buah tabung reaksi secara berderet dan diberi label 109, 108, 107, dan 106.3. Diisi tabung dengan NaCl fisiologis, tabung 109 2 ml, tabung 108, 107, 106 masing-masing 9 ml.4. Diisi tabung 109 dengan suspensi kuman menggunakan ose sesuai dengan Mc Farland III, mengocoknya sampai homogen.5. Diambil 1 ml dari tabung 109 dan dimasukkan kedalam tabung 108, lalu dikocok (di vortex) sampai homogen.6. Diambil 1 mL dari tabung 108 dan dimasukkan kedalam tabung 107, lalu dikocok (di vortex) sampai homogen.7. Diambil 1 mL dari tabung 107 dan dimasukkan kedalam tabung 106, lalu dikocok ( di vortex) sampai homogen. Sehingga diperoleh pengenceran 10x, 100x, 1000x (setara dengan 106 kuman per mililiter).b) Pembuatan larutan stok amoksisilin standar1. Ditimbang 5,74 mg amoksisilin standar.2. Dilarutkan dengan larutan buffer fosfat pH 8,0 hingga volumenya 50 ml.3. Disediakan 1 labu ukur 50 ml dan 2 labu ukur 25 ml.4. Diambil 4,5 ml larutan kemudian diencerkan dengan larutan buffer pH 8,0 sampai volumnya 50 ml, sehingga didapat konsentrasi 9 g/ml (larutan S1)5. Larutan disaring dengan filter bakteri.6. Diambil 3 mL larutan kemudian diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 sampai volumnya 25 mL, sehingga didapat konsentrasi 12g/mL (larutan S2).7. Larutan disaring dengan filter bakteri.8. Diambil 4 mL larutan kemudian diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 sampai volumnya 25 mL, sehingga didapat konsentrasi 16 g/mL (larutan S3).9. Larutan disaring dengan filter bakteri.c) Pembuatan larutan stok amoksisilin uji1. Ditimbang sampel (antibiotik dalam kapsul) 5,0 mg amoksisilin yang akan diuji.2. Dilarutkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 hingga volumnya 50 mL3. Diambil 4,5 mL larutan kemudian diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 sampai volumnya 50 mL, sehingga didapat konsentrasi 9 g/mL (larutan U1).4. Larutan disaring dengan filter bakteri.5. Diambil 3 mL larutan kemudian diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 sampai volumnya 25 mL, sehingga didapat konsentrasi 12g/mL (larutan U2).6. Larutan disaring dengan filter bakteri.7. Diambil 4 mL larutan kemudian diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 8,0 sampai volumnya 25 mL, sehingga didapat konsentrasi 16 g/mL (larutan U3).8. Larutan disaring dengan filter bakterid) Pembuatan lapisan dasar (base layer).1. Disiapkan 6 cawan petri steril.2. Diisi setiap cawan dengan 10 ml lapisan dasar.3. Diratakan lapisan agar menutupi seluruh permukaan atas cawan petri dengan cara memutar-mutar cawan petri ke kanan dan ke kiri dengan hati-hati di atas bidang rata.4. Dibiarkan beberapa saat hingga membeku.e) Pembuatan lapisan perbenihan (seed layer).1. Disediakan 6 tabung reaksi steril.2. Diisi masing-masing tabung dengan 4 ml lapisan pembenihan (medium antibiotik) yang telah dicairkan.3. Setelah suhu mencapai 45-600C dimasukkan 1ml suspensi kuman yang setara dengan 106 kuman/ml.4. Divortex larutan hingga homogen, setelah itu dituangkan pada setiap cawan petri yang sudah berisi lapisan dasar.5. Diratakan pada seluruh permukaan lapisan dasar, dengan menggoyangkan cawan petri ke kanan dan ke kiri beberapa kali dengan hati-hati.6. Dibiarkan beberapa saat hingga membeku.f) Meneteskan antibiotika standar (S) dan antibiotika uji (U) pada cakram kertas.1. Diambil 6 buah cakram kertas secara aseptis.2. Disusun kedalam cawan petri.3. Diteteskan larutan U1 pada keenam cakram kertas, masing-masing sebanyak 20 l menggunakan pipet mikro (ependor).4. Dipindahkan cakram kertas ke dalam seed layer sesuai dengan pola yang telah dibuat.5. Diulangi langkah 1-3 untuk larutan U2, U3, S1, S2, dan S3.6. Dibiarkan beberapa saat sampai cawan kertas melekat sempurna pada seed layer.7. Dimasukkan keenam cawan petri tersebut dalam inkubator untuk diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 370C.

B. Skema Gambara) Pembuatan Inokulum

Pindahkan biakan kuman dengan ose

Larutan Mc Farland III (109 kuman/ml)

SetarakanKekeruhanBiakan S.aureus

2 mlNaCl 0.9%

1 ml1 ml1 ml1 ml

Larutan Mc Farland III109 kuman/ml9 ml lar NaCl 0,9%9 ml lar NaCl 0,9%9 ml lar NaCl 0,9%

setara dengan 106 kuman/mlKuman uji setara dengan 109 kuman/ml

b) Pembuatan AntibiotikEncerkan dengan buffer fosfat pH 8 hingga 50 mlTimbang 5,74 mg amoksisilin standar atau setara dengan 5,0 mg amoksisilin uji

Konsentrasi 100 g/ml Saring dengan filter bakteri

4,5 ml3 ml4 ml

9 g/mlU1=S150 mlU3=S316 g/ml25 mlU2=S212 g/ml25 ml

Pembuatan Seed Layer Base LayerSeed Layer4 ml Seed LayervortexBase Layer

1ml

Base LayerBase LayerSeed Layer4 ml Seed Layervortex1ml

Inokulum 106400-500

1ml

Base LayerBase LayerSeed Layer4 ml Seed Layervortex

1ml

Base LayerBase LayerSeed Layervortex4 ml Seed Layer

Base LayerBase LayerSeed Layervortex4 ml Seed Layer1ml

1mlBase LayerBase LayerSeed Layervortex4 ml Seed Layer

c) Penetesan Antibiotik pada Cakram KertasPipet Mikro

U1U1U1U1U1U1Teteskan 20 l U1 pada setiap cakram kertas

Pindahkan Cakram Kertas

dengan pinset

20l

Antibiotik U1 Cawan yang berisi Base Layer dan Seed Layer

Ulangi langkah di atas pada antibiotik U2, U3, S1, S2, S3. Letakan U2, U3, S1, S2, S3 seperti gambar di bawah ini :

321U1U3S3U2S1S2U1U3S3U2S1S2U1U3S3U2S1S2

U1U3S3U2S1S2U1U3S3U2S1S2U1U3S3U2S1S2

654

VI. Hasil Pengamatan

CawanS1S2S3U1U2U3

10,801,001,150,640,790,95

20,770,991,070,60,670,89

30,951,051,170,680,760,99

40,860,971,140,610,650,79

51,02 1,091,210,650,720,96

60,971,181,260,760,950,99

5,376.287,03,944,545,57

S = 2,95+2,83+3,17+2,97+3,32+3,41 = 18,65U = 2,38+2,16+2,43+2,05+2,33+2,7 = 14,05

Gambar 4. Cawan berisi larutan antibiotik uji (U) dan standar (s) yang siap dihitung.

VII. Hasil PerhitunganPerhitungan : Standar (S)Uji (U)

Jumlah zona kadar rendahS1 = 5,37U1 = 3,94

Jumlah zona kadar tengahS2 = 6,28U2 = 4,54

Jumlah zona kadar tinggiS3 = 7,0U3 = 5,57

Jumlah sediaanS = (S1+S2+S3) = 18,65U = (U1+U2+U3) = 14,05

Kontras linierLs = S3 - S1 = 1,63Lu = U3 - U1 = 1,63

= log 5,37 log 6,28 = log 6,28 log 7,0= -0,06798= -0,04714(diambil harga yang terbesar)

= 1,63 + 1,63 ( 3 1 ) x ( - 0,04714 ) x 6 x 2

= - 2,881

= 18,65 18= 1,036

= 14,0518= 0,781

= 0,781 1,036- 2,881= 0,0885Rasio Potensi Ru = antilog Mu= antilog 0,0885= 1,226Potensi Ru x 100 % = 1,226 x 100% = 122,6%

Keterangan :B = slope regresi zona log kons. Semua sediaanD = banyaknya ragam konsentrasi setiap sediaan = 3H = banyaknya sediaan termasuk standar = 2N = banyaknya penggandaan tiap perlakuan = 6I = interval log konsentrasi berdampinganDari hasil perhitungan didapat bahwa potensi antibiotik adalah 122,6%.

VIII. PembahasanCakram kertas S1 berisi antibiotika standar yang memiliki konsentrasi paling kecil diantara S2 dan S3, yaitu : 9g/ml. Dari data tampak bahwa zona yang terbentuk oleh S1 rata-rata lebih kecil dari S2 dan S3. Begitu pula yang terjadi pada antibiotik uji U1 yang memiliki konsentrasi paling kecil diantara U2 dan U3 menghasilkan zona yang lebih kecil. Setelah zona yang dihasilkan diukur diameternya, maka dapat dicari persentase potensi antibiotik uji. Berdasarkan Farmakope 4, amoksisilin dikategorikan baik jika memiliki potensi menghambat pertumbuhan bakteri berada pada kisaran 90% - 120 %.Berdasarkan hasil perhitungan potensi antibiotik pada percobaan ini adalah 122,6% Jadi, antibiotik yang digunakan dalam percobaan ini dikategorikan baik dan layak digunakan karena berada dalam kisaran yang tertera sesuai pada Farmakope 4.

IX. KesimpulanDari hasil pengamatan dapat disimpulkan bahwa antibiotik yang diuji memiliki potensi yang baik dalam menghambat pertumbuhan kuman Staphylococcus aureus karena memiliki potensi 122,6%

X. Daftar PustakaRadji, Dr. Maksum, M.Biomed. 2004. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Depok : Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia.

13