LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PENENTUAN POTENSI ANTIBIOTIKA

UJI POTENSI TIGA DOSIS

Kamis , 7 Mei 2015

Kelompok XIII

Kamis, Pukul 10.00 – 13.00 WIB

Nama NPM Tugas

Farianti Eko Nur K. 260110130024 Teori dasar ,Data

Pengamtan dan Hasil

Perhitungan, dan Editor

Irma Rahayu L. 260110130025 Prinsip &Pembahasan

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2015

Nilai TTD

(Sani Asmi ) (Casuarina)

PENENTUAN POTENSI ANTIBIOTIKA

UJI POTENSI TIGA DOSIS

I. Tujuan

- Menentukan besarnya potensi sampel antibiotika di pasaran terhadap

antibiotika standar.

II. Prinsip

2.1. Potensi Antibiotika

Suatu teknik untuk menetapkan sutu potensi antibiotik dengan

mengukur efek senyawa tersebut terhadap pertumbuhan

mikroorganisme uji yang peka dan sesuai. Efek yang ditimbulkan dapat

berupa hambatan pertumbuhan (E. Jawetz,2001).

2.2. Metode lempeng

Berdasarkan difusi antibiotika dari silinder yang dipasang tegak

lurus pada bagian agar padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga

mikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah

berupa lingkaran atau zona disekeliling nya (Boyd, 2008).

2.3. Teknik Aseptis

Merupakan teknik yang digunakan untuk mrncegah kontaminan

masuk ke area kultur yang dibuat (Pratiwi, 2008).

2.4. Pengenceran Antibiotik

Merupakan suatu cara untuk mengurangi konsentrasi suatu

antibiotik dengan menggunakan suatu pengencer hingga di dapat

konsentrasi yang lebih kecil dari sebelumnya (Chaidir, 2004).

2.5. Zona Hambat/bening

Merupakan dasar penentuan tingkat resistensi bakteri terhadap

suatu antibiotik (Melnik , 1996).

III. Teori Dasar

Antibiotik adalah zat kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme

yang mempunyai kemampuan dalam larutan encer, untuk menghambat

pertumbuhan dan membunuh mikroorganisme. Salah satu jenis antibiotik

adalah kloramfenikol. Kloramfenikol adalah antibiotik spektrum luas yang

efektif terhadap beberapa jenis bakteri dan kuman anaerob (Dian, 2015).

Secara garis besar antimikroba dibagi menjadi dua jenis yaitu yang

membunuh kuman (bakterisid) dan yang hanya menghambat pertumbuhan

kuman (bakteriostatik). Antibiotik yang termasuk golongan bakterisid antara

lainpenisilin, sefalosporin, aminoglikosida (dosis besar), kotrimoksazol,

rifampisin, isoniazid danlain-lain. Sedangkan antibiotik yang memiliki sifat

bakteriostatik, dimana penggunaanya tergantung status imunologi pasien,

antara lain sulfonamida, tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin, trimetropim,

linkomisin, klindamisin, asam paraaminosalisilat, dan lain-lain (Utami,

2011).

Antibiotik adalah zat kimia yang dihasilkan oleh suatu mikroba yang

mempunyai khasiat antimikroba. Mekanisme kerja antibiotik antara lain

adalah menghambat sintesis dinding sel, merusak permeabilitas membran

sel, menghambat sintesis RNA (proses transkripsi), menghambat sintesis

protein (proses translasi), menghambat replikasi DNA (Immanudin, 2010).

Kemoterapeutika dapat melakukan aktivitasnya lewat beberapa

mekanisme, terutama dengan penghambatan sintesa materi penting dari

bakteri, misalnya dari (Tjay, 2002):

1. Dinding sel: sintesanya terganggu sehingga dinding menjadi kurang

sempurna dan tidak tahan terhadap tekanan osmotis dari plasma dengan

akibat pecah. Contohnya : kelompok penisilin dan sefalosporin.

2. Membran sel: molekul lipoprotein dari mambran plasma (di dalam

dinding sel) dikacaukan sintesanya, hingga menjadi lebih permeable.

Hasilnya, zat-zat penting dari isi sel dapat merembas keluar. Contohnya

: polipeptida dan polyen (nistatin, amfoterisin) dan imidazol (mikonazol,

ketokonazol, dan lain-lain).

3. Protein sel: sintesanya terganggu, misalnya kloramfenikol, tetrasiklin,

aminoglikosida, dan makrolida.

4. Asam-asam inti (DNA, RNA): rifampisin (RNA), asam nalidiksat dan

kinolon, IDU, dan asiklovir (DNA).

5. Antagonisme saingan. Obat menyaingi zat-zat yang penting

metabolisme kuman hingga pertukaran zatnya terhenti, antara lain

sulfonamida, trimetoprim, PAS, dan INH.

Suatu zat antimikroba yang ideal memiliki toksisitas selektif. Istilah

ini berarti bahwa suatu obat berbahaya bagi parasit tetapi tidak

membahayakan inang. Umumnya toksisitas selektif lebih bersifat relatif dan

bukan absolut, ini berarti bahwa suatu obat yang pada konsentrasi tertentu

dapat ditoleransi oleh inang namun dapat merusak parasit (Tjay, 2002).

Kadar merupakan jumlah per satuan berat per volume. Potensi

merupakan ukuran kekuatan per daya hambat atau daya bunuh zat aktif

terhadap mikroorganisme tertentu (Depkes RI, 1995).

Aktivitas atau potensi antibiotik dapat ditunjukan pada kondisi yang

sesuai dengan efek daya hambat terhadap mikroorganisme. Suatu

penuruanan aktivitas antimikroba dapat menunjukan perubahan kecil yang

tidak dapat ditujukan oleh metode kimia sehingga pengujian secara

mikrobiologi atau biologi biasanya merupakan stansar untuk mengatasi

keraguuan tentang kemungkinan hilangngnya aktivitas. Ada dua metode

umum yang dapat digunakan, yaitu penetapan dengan lempeng silinder atau

cara lempeng dan penetapan turbidimetri atau cara tabung. Metode pertama

beerdasarkan difusi antibiotik dari silinder yang dipasang tegak lurus pada

lapisan agar padat dalamcawan petri atau lempeng.. jadi, mikroorganisme

yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa

lingkarann atau zona di sekeliling silinder yang berisi larutan antibiotik.

Metode turbidimetri berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan

mikroorganisme dalam larutan antibiotik serba sama dalam media cair yang

dapat menumbuhkan mikroorganisme dengan cepat jika tidak terdapat

antibiotik (Harmita,2008).

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan

metode pengenceran. Metode difusi merupakan salah satu metode yang

sering digunakan. Metode difusi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu

metode parit, metode lubang dan metode Cakram kertas. Uji difusi

dilakukan dengan mengukur diameter clear zonei (zona bening yang tidak

memperlihatkan adanya pertumbuhan bakteri yang terbentuk di sekeliling

zat antimikroba pada masa inkubasi bakteri) yang merupakan petunjuk

adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri. Seakin besar zona

hambatan yang terbentuk, maka semakin besar pula kemampuan aktivitas

zat antimikroba. Syarat bakteri untuk uji kepekaan atau sensitivitas yaitu

105-10

8 CFU/ ml (Hermawan et all, 2007).

Adapun faktor-faktor teknis yang mempengaruhi ukuran daya hambat

pada metode difusi cakram, antara lain : kepekatan inokulum, waktu

pemasangan cakram, suhu inkubasi, waktu inkubasi, ukuran lempeng,

ketebalan media agar, dan pengaturan jarak cakram antimikroba, potensi

cakram antimikroba, komposisi media (Darsana,2012).

Rifampisin merupakan turunan semisintetik dari Streptomyces

mediterranei, yang bekerja sebagai bakterisid intraseluler maupun

ekstraseluler. Obat ini menghambat sintesis RNA dengan mengikat atau

menghambat secara khusus RNA polymerase yang tergantung DNA.

Rifampisin berperan aktif invitro pada kokus gram positif dan gram negatif,

mikobakterium, chlamydia, dan poxvirus (Riyanto, et al. 2006. Wallace, et

al. 2004).

Rifampisin merupakan obat yang aktif terhadap MTB yang tumbuh

dan juga aktif terhadap Mtb dalam fase stasioner. Daya antibakterial

rifampisin terjadi melalui hambatan sintesa RNA, yaitu dengan jalan

berikatan pada RNA polimerase kuman. RNA polimerase ini merupakan

oligomer yang tersusun dari empat ratai, yaitu 2 rantai alfa dan satu rantai

beta dan satu rantai beta nascen. Tiap rantai disandi oleh leh berbeda,

dengan rantai beta disandi oleh ben rpobeta (Sjahrurachman, 2010).

IV. Alat dan Bahan

4.1.Alat

a. Cawan petri

b. Inkubator

c. Jangka sorong

d. Labu ukur 100 ml

e. Mikropipet

f. Mortir dan stamper

g. Pembakar spiritus

h. Perforator

i. Pinset

j. Spatel

k. Tabung reaksi + rak tabung

l. Volum pipet 1 ml dan Volum pipet 10 ml

4.2.Bahan

a. Air suling steril

b. Larutan desinfektan

c. Media nutrien agar

d. Pelarut sediaan uji

e. Sediaan antibiotika baku dan sampel (Rimfampisin)

f. Suspensi bakteri Bacillus substilis FA

4.3.Gambar alat

Cawan petri

Inkubator

Jangka sorong

Labu ukur 100 ml

Mikropipet

Mortir dan stamper

Pembakar Spiritus

Perforator

Pinset

Spatel

Tabung reaksi besar +

rak tabung

Volume pipet 1 ml dan

10 ml

V. Prosedur

Suspensi bakteri Bacillus substilis yang berumur 18-24 jam disiapkan

dalam Nutrien broth dan dihomogenkan. Nutrien agar disiapkan dengan

cara melarutkan sejumlah tertentu nutrien agar dalam aquades kemudian

disterilkan dalam otoklaf selama 15 menit pada 1210C. Sediaan uji

dimasukan ke dalam labu ukur, larutkan dengan sedikit pelarutnya.

Kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas. Jika sediaan uji

berbentuk padat, gerus dahulu dalam mortir, sebelum dimasukkan dalam

labu ukur. Kemudian dilakukan pengeceran larutan sampel dan larutan baku

hingga didapat variasi tiga seri dosis yang diinginkan (dosis tinggi, dosis

sedang dan dosis rendah).Selanjutnya, larutan inoculum dibuat dengan cara

memasukkan suspensi biakan bakteri ke dalam nutrien agar yang telah

disterilisasi. Dalam keadaan masih cair, nutrien agar yang telah

mengandung suspensi bakteri tersebut dituangkan ke dalam cawan petri

secara aseptis sebanyak 20 ml, dan media didiamkan hingga memadat.

Kemudian permukaan dasar cawan dibagi menjadi enam area sama besar,

masing-masing area tersebut diberi label berdasarkan variasi seri dosis yang

akan digunakan. Selanjutnya, pada masing-masing area dibuat enam

reservoir (lubang) dengan menggunakan perforator secara aseptis. Bila agar

tidak berlubang dengan perforator maka untuk membuang agar yang ada

dalam cetakan reservoir tersebut digunakan spatel. Hasil buangan tersebut

dimasukan ke dalam larutan desinfektan yang telah disediakan. Selanjutnya,

larutan sampel dan baku dimasukan pada masing-masing reservoir sesuai

dosis yang ditentukan dengan menggunakan mikropipet secara aseptis.

Dinkubasikan dalam inkubator pada suhu 370C selama 18-24 jam.

Kemudian, diameter daerah bening (zone lisis) di sekeliling reservoir diukur

dengan jangka sorong dan dicatat. Selanjutnya dilakukan perhitungan

potensi antibiotik (Rifampisin).

VI. Data Pengamatan Dan Hasil Perhitungan

6.1.Data Pengamatan

No. Cawan

petri

Gambar Keterangan

1. Pertama

Bakteri :

Bacillus substilis

Antibiotik :

Rifampisin

Pada masing-

masing

konsentrasi

antibiotik

terdapat zona

hambat berupa

daerah bening di

seliling lubang

antibiotik.

2. Kedua

Bakteri :

Bacillus substilis

Antibiotik :

Rifampisin

Pada masing-

masing

konsentrasi

antibiotik

terdapat zona

hambat berupa

daerah bening di

seliling lubang

antibiotik.

3. Ketiga

Bakteri :

Bacillus substilis

Antibiotik :

Rifampisin

Pada masing-

masing

konsentrasi

antibiotik terdapat

zona hambat

berupa daerah

bening di seliling

lubang antibiotik.

4. Kontrol

Bakteri :

Bacillus substilis

Bakteri tumbuh

pada media.

Cawan

Petri

Diameter hambat (mm) Diameter hambat (mm)

BR BM BT SR SM ST

1 14,6 15,7 17,9 14,9 16,1 18,7

2 14,4 16,1 18,3 14,1 15,0 17,6

3 15,0 16,4 17,9 14,4 16,8 17,9

Jumlah 44,0 48,2 54,1 43,4 47,9 54,2

Rata-

rata

14,67 16,07 18,03 14,45 16 18,07

Keterangan :

BR = antibiotik Baku dengan konsentrasi Rendah

BM = antibiotik Baku dengan konsentrasi Medium

BR = antibiotik Baku dengan konsentrasi Tinggi

SR = antibiotik Sampel dengan konsentrasi Rendah

SM = antibiotik Sampel dengan konsentrasi Medium

ST = antibiotik Sampel dengan konsentrasi Tinggi

6.2.Hasil Perhitungan

a). Pengenceran Rifampisin

Larutan stock 1000 µg/mL

V1.N1 = V2.N2

V1.1000 = 5. 50

V1 = 0,25 µg/ml, add aquades steril 4,75 ml

Tabung ke II

V1.N1 = V2.N2

1. 50 = V2. 25

V2 = 2 ml, add aquades steril 1 ml

Tabung ke III

V1.N1 = V2.N2

1. 25 = V2. 12,5

V2 = 2 ml, add aquades steril 1 ml

b). Perhitungan Potensi

I [

] = log [

]

= [

] = log [

]

= 0,301

E =

) ))

=

) ))

=

)

=

= 1,745

b =

=

= 5,79

F =

) ))

=

) ))

=

)

=

)

= - 0,089

M =

=

= -0,01532

Potensi = antilog M x 100%

= antilog -0,01532 x 100%

=0,965 x100%

= 96,5 %

VII. Pembahasan

Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan besarnya potensi

sampel antibiotika di pasaran terhadap antibiotika standard.

Potensi adalah perbandingan dosis sediaan uji dengan dosis larutan

standar atau larutan pembanding yang menghasilkan derajat hambatan

pertumbuhan yang sama pada biakan jasad renik yang peka dan sesuai.

Aktivitas (potensi) antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi yang sesuai

dengan efek daya hambatannya pada mikroba. Suatu penurunan aktivitas

antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat

ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi

atau biologi biasanya merupakan suatu standar untuk mengatasi keraguan

tentang kemungkinan hilangnya aktivitas. Farmakope Indonesia

menentukan bahwa potensi antibiotika standar berkisar antara 95-105%.

Namun potensi tersebut dapat menurun karena kadaluwarsa, penyimpanan

yang tidak benar dan terjadinya penguraian obat yang menghasilkan zat lain

yang tidak memiliki efek lagi (Ditjen POM, 1995).

Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh organisme

hidup yang dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau membunuh

organisme lain (Zahner, 1972 dalam Hasim, 2003).

Antibiotik mempunyai nilai tinggi terutama di bidang kesehatan

karena berguna dalam mengobati berbagai penyakit infeksi. Selain

mempunyai arti penting dalam bidang kesehatan manusia, antibiotik juga

berguna dalam bidang kedokteran hewan untuk mengobati penyakit infeksi

dan untuk meningkatkan pertumbuhan hewan ternak. Antibiotik

diaplikasikan juga di bidang pertanian untuk meningkatkan hasil-hasil

pertanian (Rahayu, 2006).

Ada 2 metode yang digunakan untuk penentuan potensi antibiotika

ini yaitu metode penetapan dengan lempeng silinder dan metode penetapan

dengan turbidimetri. Pada praktikum kali ini digunakan metode penetapan

dengan lempeng silinder.

Uji aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan metode difusi dan

metode pengenceran. Disc diffusion testatau uji difusi disk dilakukan

dengan mengukur diameter zona bening (clear zone) yang merupakan

petunjuk adanya respon penghambatan pertumbuhan bakteri oleh suatu

senyawa antibakteri dalam ekstrak. Syarat jumlah bakteri untuk uji

kepekaan/sensitivitas yaitu 105-108 CFU/mL (Hermawan dkk., 2007).

Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan.

Metode difusi dapat dilakukan dengan 3 cara yaitu metode silinder, metode

lubang/sumuran dan metode cakram kertas. Metode lubang/sumuran yaitu

membuat lubang pada agar padat yang telah diinokulasi dengan bakteri.

Jumlah dan letak lubang disesuaikan dengan tujuan penelitian, kemudian

lubang diinjeksikan dengan ekstrak yang akan diuji. Setelah dilakukan

inkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya daerah

hambatan disekeliling lubang (Kusmayati dan Agustini, 2007).

Penentuan potensi antibiotika ini dilakukan dengan 3 dosis untuk

masing-masing sampel dan standard (baku). Yang masing-masing sampel

dan baku terdiri dari dosis tinggi, dosis tengan dan dosis rendah. Hal yang

pertama kali dilakukan adalah menyiapkan alat dan bahan. Alat-alat yang

digunakan harus dalam keadaan steril.

Sterilisasi alat dan bahan perlu dilakukan agar tidak terjadi

kontaminasi yang dapat merusak hasil uji. Alat-alat gelas (tabung reaksi,

petridisk, gelas ukur, spreader glass) dan tusuk sate disterilkan dengan oven

pada suhu 170oC selama 1 jam. Alat-alat tersebut harus dalam keadaan

kering dan tidak terdapat titik-titik air agar tidak timbul noda yang sulit

dihilangkan setelah disterilkan. Tabung reaksi disumbat dengan kapas

secukupnya, labu takar, tusuk sate dan alat-alat gelas lainnya dibungkus

kertas dengan rapat. Untuk media, akuades, blue tips dan yellow tips

disterilkan dengan autoklaf (pemanasan basah) pada suhu 121oC selama 15

menit. Alat yang telah disterilkan dapat langsung dipakai atau disimpan

untuk digunakan lain waktu tetapi harus dalam keadaan tertutup rapat

(Abdusyafi, 2013).

Selanjutnya menyiapkan suspense bakteri dalam Nutrient broth yang

berumur 18-24 jam, bakteri ini harus homogen.

Media adalah tempat untuk pertumbuhan mikroorganisme, yang

berupa kaldu nutrisi (Nutrient Broth). Komposisi kaldu nutrisi adalah 10 g

pepton, 5 g ekstrak daging, 5 g garam dapur (NaCl), 1,25 mL buffer fosfat

pH 6,8 dan akuades sampai volume akhir 1 L. Inokulum berupa biakan

bakteri bakteri Staphylococcus aureus diencerkan dengan larutan NaCl

fisiologis 0,9% hingga diperoleh kekeruhan 0,5 Mc Farland III. Selanjutnya

inokulum biakan yang telah diencerkan diisikan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 0,5 mL/tabung. Perlakuan yang sama dikenakan juga terhadap

inokulum berupa biakan bakteri (Setiawan, dkk, 2013).

Bakteri uji yang digunakan dalam percobaan kali ini berupa Bacillus

subtillis. Bacillus subtilis berbentuk basil (batang) dan merupakan bakteri

gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di tengah. Bacillus

subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif.

Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars

dan asam amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang

dikenal sebagai murein. Sel membentuk tembok penghalang antara

lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk mempertahankan bentuk sel

dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor.

Setelah itu, siapkan perbenihan nutrient agar dengan cara melarutkan

sejumlah tertentu nutrient agar dalam aquades kemudian disterilkan dalam

otoklaf selama 15 menit pada 1210C.

Lalu,memasukan sediaan uji kedalam labu ukur, larutkan dengan

sedikit pelarutnya, kemudian tambahkan air suling steril sampai tanda batas.

Sampel yang digunakan adalah antibiotik Rifampisin.

Rifampisin merupakan senyawa antimikroba yang sampai saat ini

masih menjadi pilihan sebagai obat anti TB (Tuberculosis). Dalam sediaan,

rifampisin sering dikombinasikan dengan INH dan etambutol untuk

mencapai efek farmakologi yang lebih baik. Bentuk sediaan yang banyak

ditemukan diperdagangan umumnya tablet, kapsul atau kaplet, baik tunggal

maupun kombinasi. Efek farmakologi rifampisin sebagai anti tuberkulotik

berlangsung melalui mekanisme kerja penghambatan polimerase RNA yang

bergantung pada DNA bakteri. Spektrum kerjanya luas, disamping terhadap

mikobakteri, juga efektif terhadap sejumlah bakteri gram positif dan negatif

(Mutschler, 1996). Rifampisin ini ialah Antimikroba yang menghambat

sintesis asam nukleat sel mikroba.Setelah itu, membuat pengenceran sampel

dan larutan baku hingga didapat variasi tiga seri dosis yang diinginkan.

Prinsip metode pengenceran adalah senyawa antibakteri diencerkan

hingga diperoleh beberapa macam konsentrasi, kemudian masing-masing

konsentrasi ditambahkan suspensibakteri uji dalam media cair. Perlakuan

tersebut akan diinkubasi dan diamati ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri,

yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan. Larutan uji senyawa antibakteri

pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpaadanya pertumbuhan bakteri

uji, ditetapkan sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) atau Minimal

Inhibitory Concentration (MIC). Larutan yang ditetapkan sebagai KHM

tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan

bakteri ujiataupun senyawa antibakteri, dan diinkubasi selama 18-24 jam.

Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai

Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Minimal Bactericidal

Concentration(MBC) (Pratiwi, 2008).

Variasi dosisnya yaitu 50µg/ml untuk dosis tinggi; 25µg/ml untuk

dosis tengah; dan 12.5 µg/ml untuk dosis rendah. Konsentrasi larutan stock

yang tersedia yaitu 1000 µg/ml. Setelah dilakukan perhitungan dengan

rumus V1 x N1 = V2 x N2, untuk dosis tinggi dimasukan 0.25 µg/ml larutan

sampel rifampisin dimasukan ke dalam tabung reaksi, kemudian add dengan

aquades sampai 5ml, homogenkan. Untuk dosis tengah, masukan 1 ml dari

tabung dosis tinggi, ke tabung dosis tengah kemudian add dengan aquades

sampai 2 ml, homogenkan. Untuk dosis rendah, masukan 1 ml larutan

sampel dari dosis tengah ke dalam tabung dosis rendah, add aquades hingga

2 ml. Lakukan hal yang sama untuk larutan antibiotik yang baku, dengan 3

variasi dosis.

Alat yang digunakan untuk memasukan larutan sampel ataupun baku

pada ukuran kecil, digunakan mikropipet. Sedangkan untuk memasukan

aquades dapat digunakan pipet biasa. Sebelumnya, harus disiapkan

pembakar spirtus untuk nyala apinya, karena pengerjaan yang dilakukan

harus tetap steril aseptis agar tidak ada kontaminan yang masuk dan

mengganggu pengamatan. Menurut Riana, Irna ( 2013 ) Aseptis adalah

segala upaya yang dilakukan untuk mencegah masuknya mikroorganisme ke

dalam tubuh yang kemungkinan besar akan mengakibatkan infeksi.

Tindakan asepsis ini bertujuan untuk mengurangi atau menghilangkan

mikroorganisme yang terdapat pada permukaan benda hidup atau benda

mati.

Steril artinya tidak didapatkan mikroba yang tidak diharapkan

kehadirannya, baik yang mengganggu atau merusak media maupun

mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Semua proses

baik fisika, kimia, dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan,

terutama mikroorganisme disebut dengan sterilisasi (Waluyo 2007).

Dibuat larutan inokulum dengan cara memasukan suspense biakan

bakteri ke dalam nutrient agar yang telah disterilisasi. Dalam keadaan masih

cair, tuangkan nutrient agar yang telah mengandung suspense bakteri

tersebut ke dalam cawan petri secara aseptic sebanyak 20 ml. Homogenkan

campuran tersebut dengan cara digoyang-goyangkan, Kemudian biarkan

hingga membeku.

Setelah itu membagi permukaan dasar cawan menjadi 6 area sama

besar dengan menggunakan spidol. Beri label masing-masing area tersebut

sesuai dengan variasi seri dosis yang digunakan. Penempatan label antara

dosis yang sama harus ditempatkan bersebrangan, tujuannya agar tidak

terjadi penyatuan daerah diameter zona bening antara dosis tinggi

khususnya, apabila ditempatkan bersebelahan.

Buat enam cetakan reservoir (lubang) pada masing-masing cawan

petri dengan menggunakan perforator secara aseptic. Pembuatan lubang

harus dilakukan tegak lurus agar bentuk lubang benar-benar bulat dan tidak

lonjong. Karena hal tersebut akan menyulitkan perhitungan diameter zona

bening. Buat reservoir tersebut dengan cara membuang agar yang ada dalam

cetakan reservoir tersebut dengan menggunakan spatel secara hati-hati.

Masukan hasil buangn tersebut ke dalam larutan desinfektan yang telah

disediakan. Setiap pembukaan cawan petri harus selalu difiksasi dengan

nyala api agar tidak ada kontaminan yang masuk ke dalam cawan dan

mempengaruhi pengamatan.

Masukan larutan sampel dan baku pada masing-masing reservoir

sesuai dosis yang ditentukan dengan menggunakan mikropipet secara

aseptic. Setelah semua terisi, inkubasikan dalam incubator pada suhu 37oC

selama 18-24 jam untuk pembetukan diameter zona bening. Setelah 24 jam,

ukur dan catat diameter zona bening (zona lisis) yang terjadi disekeliling

reservoir yang telah mengandung antibiotika tersebut dengan menggunakan

jangka sorong.

Pada pengamatan kelompok kami, terdapat beberapa zona bening

yang terkontaminasi, ditandai dengan adanya bercak-bercak disekitar zona

bening. Hal ini dapat disebabkan karena praktikan yang kurang baik dalam

melakukan fiksasi baik ketika pembukaan cawan ataupun tabung reaksi.

Dari data yang diperoleh terlihat bahwa dosis antibiotik yang tinggi baik

untuk baku maupun standard memiliki diameter zona bening yang lebih

besar dibandingkan dengan dosis rendah dan tengah. Menurut Pelczar (

1986 ) Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhambat

pertumbuhannya akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah

daerah untuk menghambat pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar

oleh antibiotik.

Setelah itu dihitung potensi antibiotika sampel dibandingkan dengan

standard (baku). Perhitungan dimulai dari menghitung log dosis, perbedaan

respon yang disebabkan oleh dosis rendah dan dosis tinggi (E), kelandaian

(b), perbedaan respon yang disebabkan oleh perbedaan sampel dan baku (F),

serta log dari perbandingan potensi sampel terhadap baku (M). Dari hasil

percobaan di dapatkan Aktivitas dari rifampisin terhadap bakteri Bacillus

subtilis dengan ukuran rata-rata zona hambat pada BT = 18.03 ; BM = 16.07

; BR = 14.67 dan ST = 18.07 ; SM = 16 ; SR = 14.45. Dari data yang

didapat maka ditentukan potensi antibiotik rifampisin sebesar 96.5 %.

VIII. Kesimpulan

- Berdasarkan dari perhitungan potensi antibiotika yang dilakukan

dengan metode lempeng difusi, diperoleh potensi antibiotika

rifampisin sampel sebesar 96,5 % terhadap antibiotika rifampisin

standar atau baku.

Daftar Pustaka

Boyd, Robert F., 2008. General Microbiology. Second Edition. Times

Mirror/Mosby College Publishing

Chaidir. 2004. Obat Antimikroba. Jakarta: EGC

Darsana, I Gede Oka, Besung, I Nengah Kerta dan Mahatmi, Hapsari.2012.

Potensi Daun Binahong (Anredera Cordifolia (Tenore) Steenis) dalam

Menghambat Pertumbuhan Bakteri Escherichia Coli secara In Vitro.

Indonesia Medicus Veterinus 2012 1(3) : 337 – 351.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi

IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

Dian, Fatimawali, Budiarso. 2015. Uji Resistensi Bakteri Escherichiacoli Yang

Diisolasi Dari Plak Gigi Terhadap Merkuri Danantibiotik

Kloramfenikol. Jurnal E-Biomedik (Ebm), Volume 3, Nomor 1,

Januari-April 2015.

Ditjen POM ( 1995). Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Departemen.

Kesehatan R.I

Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang : UMM Press.

E. Jawetz, George F. Brooks, Janet S. Butel, Stephen A. Morse. 2001. Jawetz,

Melnick and Adelberg's Medical Microbiology. Mc Graw-Hill ( Lange

Medical Books )

Harmita dan Radji, Maksum. 2008. Buku Ajar Analisi Hayati Edisi 3. Jakarta :

EGC.

Hermawan, A.,Hana, W., dan Wiwiek, T. 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Sirih

(Piper betle L.) Terhadap Pertumbuhan Staphylococcus aureus dan

Escherichia coli dengan Metode Difusi Disk. Skripsi : Unversitas

Erlangga..

Immanudin H. Pola Pertumbuhan Dan Toksisitas Bakteri Resisten Hgcl2. Jurnal

Ekosains. 2010;2(1).

Kusmayati dan Agustini, N. W. R. 2007. Uji Aktivitas Senyawa Antibakteri dari

Mikroalga (Porphyridium cruentum). Biodiversitas. 8(1) : 48-53.

M. Abdusyafi. 2013. Potensi Antibiotik Isolat Actinomycetes Dari Material

Vulkanik Gunung Merapi Erupsi Tahun 2010 Terhadap Bakteri

Staphylococcus aureus Multiresisten. Skripsi thesis, Universitas

Muhammadiyah Surakarta.

Mutschler E. 1996. Arzneimittelwirkungen, 7 neu bearbeitete Auflage,

Wissenschaftliche Verlagsgeselschaft mbH Stuttgart, 702-703.

Pratiwi, Sylvia. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Penerbit Erlangga, Jakarta.

Rahayu, Triastuti. 2006. Potensi Antibiotik Isolat Bakteri Rizosfer Terhadap

Bakteri Escherichia Coli Multiresisten. Jurnal Penelitian Sains &

Teknologi, Vol. 7, No. 2, 2006: 81 – 91

Riana, Irna. 2013. Teknik Aseptis. Tersedia di

http://bedahminor.com/index.php/main/page/tindakan-aseptik [Diakses

pada 12 Mei 2015]

Riyanto BS, Wilhan. Management of MDR TB Current and Future dalam Buku

Program dan Naskah Lengkap Konferensi Kerja Pertemuan Ilmiah

Berkala. PERPARI.Bandung. 2006.

Setiawan, Didik dkk. 2013. Perbandingan Efektifitas Disinfektan Kaporit,

Hidrogen Peroksida, Dan Pereaksi Fenton (H2o2/Fe2+). Indonesian E-

Journal of Applied Chemistr. Volume 1, No. 2, 2013

Sjahrurachman, Agus. 2010. Diagnosis “ Multi Drug Resistant Mycobacterium “

Tuberculosis. Jurnal Tuberkulosis Indonesia. Vol. 7 - Oktober 2010

ISSN 1829 - 5118

Tjay, T.H., Rahardja, K. 2002. Obat-obat Penting : Khasiat, Penggunaan, dan

Efek-Efek Sampingnya. Edisi VI. Jakarta: Penerbit PT. Elex Media

Komputindo

Utami, Eka Rahayu. 2011. Antibotika, Resistensi dan Rasionalitas Terapi. El-

Hayah Vol. 1, No.4 Maret 2011.

Wallace RJ, Griffith DE. 2004.Antimycrobial Agents in Kasper DL, Braunwald E

(eds), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 16th ed. New York :

Mc Graw Hill.

Zahner dan Mass.1972 Dalam Hasim (2003). Menanam Rumput, Memanen

Antibiotik. Kompas 2003. No. 127/tahun ke-39.