nuzzulaawwalulrizki

HIDROLISIS SUKROSA DENGAN ENZIM INVERTASE UNTUK PRODUKSI ETANOL MENGGUNAKAN Zymomonas mobilis

Nuzula Awwalurrizki*, Surya Rosa Putra 1

Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Teknologi Sepuluh Nopember

ABSTRAKProduksi etanol langsung dari substrat sukrosa oleh bakteri Zymomonas mobilis , menunjukkankonversi etanol yang lebih rendah daripada menggunakan campuran glukosa dan fruktosa.Pembentukan hasil samping (sorbitol dan levan) dapat turun secara signifikan ketikamenggunakan sumber karbon campuran antara glukosa dan fruktosa. Untuk itu perludilakukan hidrolisa terhadap substrat sukrosa menggunakan enzim invertase sebelumfermentasi. Enzim invertase didapatkan dari ekstrak kasar ragi roti (Saccharomycer cerevisiae )yang di inkubasi selama 24 jam pada suhu 40 oC. Proses hidrolisis dengan enzim invertasedilakukan pada keadaan dimana aktivitas enzim mencapai maksimum, yaitu pada pH 4,5dengan inkubasi pada suhu 30 oC dan waktu inkubasi selama 5 jam. Besarnya gula reduksi hasilhidrolisis sebanyak 10,22 gram. Sumber karbon hasil hidrolisis inilah yang akan digunakandalam fermentasi etanol pada pH 5,5. Fermentasi berjalan efektif selama 120 jam denganjumlah sel bakteri awal sebanyak 2,6 x 10 10.. Pada kondisi tersebut, kadar etanol maksimumyang dihasilkan adalah sebanyak 4,87 gram /100 mL dengan yield etanol sebesar 92,89% jikadibandingkan dengan hasil teoritis.

Kata kunci : Zymomonas mobilis , enzim invertase , yield etanol, fermentasi etanol

ABSTRACTEthanol production from sucrose by Zymomonas mobilis shows lower conversion into ethanolthan from glucose and fructose. By- product formation (sorbitol and levan) was greatly reducedwhen an equimolar mixture of glucose and fructose was used as carbon source in culture.Cause of that sucrose needs to be hydrolized using invertase before fermentation. Invertaseenzymes obtained from yeast (Saccaromyces cerevisiae ) with incubation at temperature 30 oCfor about 24 hours. Hydrolysis process using invertase were be done when the enzyme activityreached maximum at pH 4,5 with temperature incubation at 30 oC and incubation time for 5hours. The amount of reduction sugar fron hydrolysis is 10,22 grams. This fraction will beused as carbon source in ethanol fermentation at pH 5,5. Fermentation runs effefctively for120 hours with initial bacterial cell as 2,6 x 10 10(cell / mL). In this case, highest value of ethanolis 4,87 g/100 mL with 92,89% ethanol yield when compared in theoretical.

Keywords : Zymomonas mobilis , invertase , ethanol yield, etanol fermentation.

PENDAHULUAN Akses masyarakat Indonesia

terhadap energi masih terbatas. Meskipunvariasi sumberdaya energi dalam negeriberagam dan cadangan minyakdiperkirakan hanya mampu mensuplai 18tahun lagi, namun kenyataannya, pangsakonsumsi bahan bakar minyak mencapaiproporsi tertinggi sekitar 63%. Tingkatkonsumsi yang tidak sebanding dengantingkat pembentukan menyebabkankelangkaan terhadap bahan bakar tersebut.

Sumber bahan bakar merupakan produkyang renewable sehingga tingkat recoverynya membutuhkan waktu yang sangat lama(Mukhtasor, 2009).

Selain itu pembakaran bahan bakarfosil telah memberikan dampak negatifterhadap lingkungan. Kualitas udara yang

Prosiding KIMIA FMIPA - ITS

Prosiding Skripsi Semester Genap 2008/2009 SK - 34

semakin menurun ditambah adanya efekgas rumah kaca, indikasi ini sebagaipenyebab perubahan iklim di muka bumi(Sri Utami, 2007). Sumber energi terbarukanyang berpotensi besar untuk dikembangkanadalah sumber daya hayati atau biofuel .Salah satu teknologi yang dilakukan untukmendukung pengadaan energi ini yaituproduksi bietanol .

Bakteri Zymomonas mobilis diyakinisebagai mikroorganisme paling idealpenghasil etanol karena memproduksietanol terbanyak, toleran terhadap etanolkonsentrasi tinggi dan pH rendah.Zymomonas mobilis merupakan bakterianaerob fakultatif yang memanfaatkanglukosa, sukrosa dan fruktosa untukmenghasilkan etanol dengan jalurmetabolisme Enter - deudoroff Pathway(Tano dan Bozato, 2003).

Selama ini, penggunaan substratgula yang sering digunakan untukfermentasi yaitu glukosa atau sukrosa.Sukrosa lebih mudah didapatkan daripadaglukosa karena sukrosa merupakan gulameja yang dikonsumsi sehari - hari.Berdasarkan penelitian yang dilakukan olehHani, 2009, produksi etanol dengansubstrat sukrosa menghasilkan produketanol sebanyak 61,18%. Rendahnya nilai inidisebabkan akibat adanya produk sampingyang ikut dihasilkan selama prosesfermentasi, contohnya levan dan sorbitol(Swing and Deley, 1977). Pembentukanlevan dan sorbitol, dapat menurunkanethanol yield sampai 80% dari teoritisnya(E. Favela, 1987). Berangkat dari masalahini, sukrosa perlu dipecah terlebih dahulumenjadi gula sederhana sebelumdifermentasikan.

Enzim invertase merupakan enzimyang memiliki efisiensi tinggi yang spesifikdalam mengubah sukrosa menjadi glukosadan fruktosa (dikenal dengan gula invert).Enzim invertase dapat diambil dari ekstrakkasar ragi roti (Saccharomyces cerevisiae ).Khamir ini memiliki aktivitas invertase yangtinggi sehingga sukrosa dengan cepatdiubah menjadi glukosa dan fruktosa untukkeperluan metabolismenya. Dengan adanyaenzim invertase, penggunaan sukrosa akanlebih efektif dan diharapkan mampumenurunkan produk samping yangterbentuk sehingga dapat meningkatkankadar etanolnya.

METODOLOGI PENELITIANAlat dan Bahan

Alat Peralatan yang digunakan dalam

penelitian ini adalah fermentor sistembatch yaitu menggunakan erlenmeyeruntuk fermentasi, ultrasonikator, cawanpetri, tabung reaksi, laminary air flow ,autoclave , inkubator, rotary shaker ,centrifuge Thermo IEC CL40R, kromatografigas Shimadzu GC- 14B, spektronik Genesys20, termometer, neraca analitik mettler AE200, pH meter 510, homogenizer, penangasserta peralatan gelas lain.

BahanMikroorganisme yang digunakan

dalam penelitian ini adalah biakanZymomonas mobilis dari Jepang.

Media Zymomonas mobilis yangdigunakan untuk regenerasi danpenumbuhan (agar miring) adalah NutrientAgar (NA) 5%. Media untuk starter terdiriatas KH2PO4 1,0 g/L, (NH4)2SO4 1,0 g/L,

MgSO4.7H 2O 0,5 g/L, yeast extract 5g/L, dan

glukosa 100g/L.Media untuk fermentasi terdiri atas

sukrosa 100g /L, yeast extract 5g/L, KH2PO4

1,0g/L, (NH4)2SO4 1,0g /L, MgSO4.7H 2O 0,5

g/L.Crude invertase dibuat dari ragi roti

(Saccharomyces cereviciae ). Reagen lainyang dibutuhkan diantaranya ; NaHCO 3,

asam sitrat dan na- sitrat untuk buffersitrat, reagen bradfod, BSA, reagenSomogy- nelson A dan B, reagen arseno-molybdad.

PROSEDUR KERJAIsolasi Ekstrak Kasar Invertase dari RagiRoti (Saccharomyces cerevisiae)

Ragi roti sebanyak 55 gramditimbang, dimasukkan kedalam beakergelas kemudian ditambahkan 150 mlNaHCO 3 dan diaduk sampai menjadi bubur.

Bubur ragi yang didapat dimasukkan kedalam homogenizer dan diputar pada 7500rms selama 5 menit. Bubur yang telah dihomogenizer dituang ke dalam erlenmeyer.Mulut erlenmeyer ditutup dengan kapasyang sudah dibalut kasa - aluminium foil.Selanjutnya diinkubasi pada suhu 40 oCselama 24 jam. Hasil inkubasi diautolisisdengan menggunakan ultrasonifikator pada16 rms selama 20 menit. Setelah prosesautolisa ini, campuran disentrifuge selama15 menit pada suhu 10 oC dengan kecepatan3500 rms. Proses ini terbentuk filtrate danresidu, filtrat yang terbentuk didekantasidan diperoleh supernatannya. Supernatan


yang diperoleh merupakan preparat enziminvertase.

Penentuan Kurva Standar Gula Invertsecara Spektrofotometri

Penentuan gula invert secaraspektrofotometri dilakukan denganpembuatan kurva standart gula invert yangmenghubungkan antara konsentrasi denganabsorbansi. Standart gula invert dibuatdengan cara: Larutan gula invert 0,0025Mdibuat variasi konsentrasi yaitu 1; 1,25; 1,5;1,75; 2; 2,25 dan 2,5 (x10 - 3M) denganpelarut aquades. Selanjutnya masing -masing dimasukkan dalam tabung reaksisebanyak 0,5 ml. Kadar gula reduksinyaditentukan dengan menggunakan metodeSomogy- Nelson. Pengukuran secaraspektrofotometri dilakukan pada panjanggelombang 540 nm.

Penentuan Kandungan Protein InvertasePenentuan Panjang GelombangMaksimum Bradford

Panjang gelombang maksimum( maks) λ ditentukan dengan menggunakanlarutan standart Bovine Serum Albumine(BSA) yang ditambah dengan reagenBradford kemudian ditentukan serapannyamenggunakan spektrofotometer. LarutanBradfod dibuat dengan cara: 25 mg coomisebrilliant blue G- 250 dilarutkan dalam 12,5ml etanol 95% (v/v dan ditambahkandengan 25 ml asam fosfat 85%(w/v).Larutan yang di dapat diencerkan denganaquadest sampai 250 ml. Larutan stok BSA2000 ppm (dibuat dari 100 mg BSA dalam25 ml aquades, diaduk perlahan - lahan,setelah itu diencerkan sampai 50 ml).Selanjutnya diambil sebanyak 5 ml danditambahkan 3 ml reagen Bradford dandiencerkan sampai 10 ml. Larutan inidiaduk dan diinkubasi selama 5 menit padatemperatur 37 0C. Larutan standart BSAdiukur absorbansinya menggunakanspektrofotometer pada panjang gelombang560- 620 nm dengan interval 5 nmsebanyak tiga kali untuk masing - masingpanjang gelombang, kurva dibuat antarapanjang gelomb ang ( ) terhadap absorbansiλ(A) sehingga diperoleh maksλ .

Pembuatan Kurva Standar BSAKurva standart BSA dibuat dengan

membuat beberapa konsentrasi yaitu: 100ppm, 200 ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500ppm, 600 ppm, 700 ppm. Variasikonsentrasi larutan tersebut dibuat denganmenggunakan larutan standart BSA 2000

ppm dengan cara diambil sebanyak 0,5; 1;1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 ml lalu diencerkan denganaquadest sampai 10 ml. Selanjutnyadiambil 7 ml dan ditambahkan 3 ml reagenbradfod. Larutan diaduk dan diinkubasiselama 5 menit pada suhu 37 0C.Pengukuran absorbansi dilakukan denganmenggunakan spektrofotometer padapanjang gelombang maksimum yang telahdidapatkan pada prosedur sebelumnya.Blanko dibuat dengan 7 ml aquades yangditambah 3 ml reagen Bradford.

Penentuan Kandungan Protein InvertasePenentuan kandungan protein pada

crude invertase dilakukan denganmengencerkan 1 ml enzim invertasedengan aquadet sampai 10 ml. Hasilpengenceran diambil 7 ml danditambahkan 3 ml reagen Bradfod, laludiinkubasi selama 5 menit. Setelah waktuinkubasi, adsorbansi larutan enziminvertase ditentukan pada panjanggelombeng maksimum dan diukur secaraduplo. Hasil adsorbansi yang diperolehdikonversikan pada persamaan garis darikurva standar t BSA yang telah dibuatsehingga didapatkan konsentrasi enziminvertase.

Penentuan Kondisi Optimum InvertaseKondisi optimum reaksi enzim

meliputi suhu, pH dan lama inkubasi.Kondisi ini di tentukan melalui serangkaianpercobaan yang kondisinya divariasikan.

Penentuan suhu optimum dilakukandengan cara sebagai berikut : Larutansukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dengan pH4,5 dimasukkan kedalam 6 tabung reaksi.Masing- masing tabung diatur suhunya(20 oC, 25 oC, 37 oC, 60 oC, 80 oC, 100 oC).Selanjutnya ditambahkan 1 mL enziminvertase pada tiap tabung dan diinkubasiselama 20 menit (selama inkubasi suhutetap dalam keadaan terjaga). Tabung-tabung tersebut dipanaskan dalam airmendidih selama 10 menit. Setelah dingin,gula reduksi yang terbentuk diukurmenggunakan metode Somogy- Nelson.Sebelum diukur perlu dilakukanpengenceran agar serapannya dapatterbaca.

Penentuan pH optimum dilakukandengan cara sebagai berikut : larutansukrosa 0,25 M sebanyak 2 mL dalamtabung reaksi dibuat dengan variasi pH (3;4; 4,5; 5; 5,5; 6 dan 7). Masing- masingfraksi ditambahkan 1 mL enzim invertasedan diinkubasi selama 20 menit pada suhu


ruang. Kemudian dipanaskan dalam airmendidih selama 10 menit. Selanjutnyadidinginkan. Gula reduksi yang terbentukdiukur menggunakan metode Somogy-Nelson. Sebelum diukur perlu dilakukanpengenceran agar serapannya dapatterbaca.

Lama inkubasi reaksi enzimatisditentukan dengan cara sebagai berikut :disediakan beberapa labu erlenmeyer.Masing- masing diisi dengan larutansukrosa 10% sebanyak 100 mL dalam buffersitrat dengan pH 4,5. Ke dalam masing -masing erlenmeyer ditambahkan 5 mLenzim. Perbandingan enzim dengansubstrat sukrosa 10 % adalah 1:20.Kemudian diinkubasi pada suhu optimumselama beberapa jam dengan kecepatan 60rpm. Setiap interval waktu 1 jam reaksidihentikan dengan pemanasan dalam airmendidih selama 10 menit. Kadar gulareduksi ditentukan dengan metodeSomogy- Nelson. Sebelum diukur perludilakukan pengenceran agar serapannyadapat terbaca.

Regenerasi Zymomonas mobilisBiakan murni Zymomonas mobilis

diremajakan pada agar miring (media NA)pH 5,5 yang telah disterilisasi pada suhu121 oC dan tekanan 1 atm selama 30 menit,selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 oCselama 24 jam. Zymomonas mobilis padaagar miring (media NA) ini menjadi stokkultur yang diregenerasi pada media NAyang baru sebelum digunakan.

Kultur baru diinokulasikan pada 10ml media kompleks pH 5,5 sebagai starterawal dan diinkubasi dengan shaker selama20 jam suhu 30 oC yang selanjutnya akanditransfer ke media yang lebih besar yaitu90 ml media kompleks dengan perlakuandan inkubasi yang sama setelah mediamenunjukkan keadaan yang keruhmenandakan bakteri memperbanyak diri.Sebanyak 100 ml starter selanjutnyaditransfer dengan perlakuan yang samasampai volume 1000 ml.

Penentuan Kurva PetumbuhanZymomonas mobilis. Sebanyak satu ose Zymomonasmobilis dari media padat (NA) agar miringdiinokulasi pada 10 mL media dandiinkubasi pada suhu 30 oC selama 20 jamdengan di shaker 120 rpm. Setelah 20 jam,starter ini ditransfer ke 90 mL mediakompleks dan diinkubasi pada kondisi yangsama. 100 mL starter ini selanjutnya

ditransfer lagi ke dalam 900 mediakompleks dan diinkubasi pada suhu 30 oCdan di shaker 120 rpm. Selama inkubasi,pertambahan biomassa setiap jamdimonitor dengan pengukuran turbiditasmenggunakan Spektronik Genesys 20 pada540 nm.

Pembuatan Media Fermentasi (Hidrolisat)Media Fermentasi dibuat sebanyak

800 mL untuk 8 proses fermentasi. Enziminvertase yang ditambahkan denganperbandingan 20 : 1. Sukrosa 10 %dilarutkan dalam larutan buffer dengan pHoptimum yang akan dicari. Kemudianditambahkan 5 mL enzim dalam 100 mLlarutan substrat. Selanjutnya diinkubasiberdasarkan waktu optimum. Enzim yangada dimatikan dengan cara dipanaskanpada air mendidih selama 10 menit.Larutan yang terbentuk disentrifuse. Filtratyang didapat diuji kadar gula invertnyamenggunakan metode Somogy- Nelson.Filtrat ini yang akan digunakan sebagaimedia fermentasi.

Penentuan Pola FermentasiFermentasi menggunakan bakteri

Zymomonas mobilis dilakukan dalam 8labu erlenmeyer yang diisi dengan 100 mLmedia fermentasi yang telah dihidrolisisoleh enzim invertase dalam kondisi suhu,pH dan lama inkubasi optimum (hidrolisat)ditambah biomassa hasil sentrifuse 200 mLinokulum. Fermentasi ini dilakukan padainkubator shaker 50 rpm. Hasil fermentasidiambil setiap 15 jam sekali sampai 120jam untuk disentrifuse (memisahkan filtratdengan biomassa) sehingga filtratnya dapatdiuji kualitatif etanol, residu glukosa dankadar etanolnya.

HASIL DAN DISKUSIIsolasi Ekstrak Kasar Invertase dari RagiRoti (Saccharom yces cerevisiae )

Ragi roti sebanyak 55 gramdilarutkan kedalam larutan NaHCO 3 0,1 M

sebanyak 150 mL. NaHCO 3 ini berfungsi

untuk melarutkan sel ragi sehingga padaakhirnya enzim invertase akan berada padafiltratnya. Selanjutnya larutan ini diaduksampai menjadi bubur. Buburan ragidimasukkan ke dalam homogenizer pada7500 rpm selama 5 menit. Homogenizerberfungsi untuk menghomogenkan larutandengan ragi. Bubur yang didapat dituangdalam 3 erlenmeyer 250 mL. Penutuperlenmeyer dibuat dari kapas yang dibalutkasa - aluminium foil. Pada penutup ini


diberi beberapa lubang kecil yang berfungsiuntuk mengurangi tekanan udaradidalamnya apabila adonan mulaimengembang. Bubur ragi dalam erlenmeyerdiinkubasi pada suhu 40 oC selama 24 jam.Inkubasi ini diperlukan untukmengeluarkan enzim dari ragi. Setelahinkubasi, pada bubur dilakukan pemecahansel menggunakan ultrasonifikator padakecepatan 16 rms selama 20 menit. Larutanhasil autolisa selanjutnya disentrifuge padasuhu 10 oC dengan kecepatan 3500 rpm.Filtrat yang terbentuk didekantasi dandiperoleh supernatannya. Supernatan inilahyang disebut sebagai “crude invertase”yang berwarna kuning. Ekstrak kasarinvertase dapat dilihat pada gambarberikut:

Penentuan Kurva Standar Gula InvertSecara Spektrofotometri

Penentuan kurva standart gulainvert ini bertujuan untuk menentukanpersamaan yang nantinya akan digunakanuntuk menghitung konsentrasi gula reduksi(gula invert) yang terbentuk dari hasilhidrolisis sukrosa oleh enzim invertase.Standart gula invert dibuat dengan caramembuat larutan gula invert 0,0025 M yangkemudian diencerkan dalam pelarutaquades sehingga didapatkan beberapavariasi konsentrasi 1; 1,25; 1,5; 2; 2,25 dan2,5 (x 10 - 3 M). Masing- masing larutandimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak0,5 mL. Karena fruktosa dan glukosamerupakan gula reduksi sehingga analisagula invert dilakukan dengan menggunakanmetode Somogy- Nelson.

Kurva standar guls invert dibuatdengan mengalurkan nilai absorbansiterhadap konsentrasi larutan. Darihubungan keduanya, didapatkan grafiksebagai berikut:

Gambar 1 Kurva standart gulainvert

Dari grafik diatas dapat dilihat

bahwa nilai absorbansi mengalamikenaikan sejalan dengan semakin besarnyakonsentrasi gula invert dalam larutan,sehingga didapatkan persamaan kurva yangmemenuhi hukum Lambert - Beer

y = 977.231 x

Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0,998, halini menunjukkan bahwa kelinearan kurvastandart baik karena hampir mendekati +1,yang mana titik- titik pada kurva standartmelewati garis lerengnya.

Penentuan Kandungan Protein EkstrakKasar InvertasePenentuan Panjang GelombangMaksimum Bradford

Larutan stok BSA 2000 ppm dapatdibuat dengan cara: 100 mg BSA dilarutkandalam 25 mL aquades kemudian diadukperlahan sampai larut setelah itudiencerkan dengan aquades sampai 50 mL.Larutan ini diambil sebanyak 5 mL danditambahkan 3 mL reagen Bradford laludiencerkan dengan aquades sampai volume10 mL. Larutan ini dibiarkan selama 5menit pada suhu ruang untukmenyempurnakan reaksi antara Bradforddengan protein pada enzim. ReagenBradford dibuat dengan cara : coomisebrilliant blue G- 250 sebanyak 25 mgdilarutkan dalam 1,5 mL etanol 95 % (v/v)dan ditambahkan asam fosfat 85 % (w/v).Larutan ini diencerkan sampai volume 250mL. Setelah dicampur dengan reagenBradford, larutan diukur absorbansinyamenggunakan spektrofotometer padakisaran panjang gelombang 560- 620 nmkarena warna yang diserap oleh larutanadalah biru sedangkan warna biru memilikipanjang gelombang antara 580- 595(Khopkar, 1995). Untuk larutan blanko yangdigunakan dibuat dengan menambahkan 3mL reagen Bradford dan 7 mL aquades.Dari nilai pengukuran absorbansididapatkan grafik sebagai berikut.

Gambar 2 Kurva Absorbansi dalam Variasi


Panjang Gelombang ( )λGambar 2 menunjukkan bahwa

puncak absorbansi tertinggi dicapai padapanjang gelombang 595 nm. Setelah ituturun seiring menjauhnya puncak serapan.Serapan ini dihasilkan karena terjadiabsorbsi sinar tampak oleh komplekscommassie brilliant blue- kasein padapanjang gelombang maksimumnya akandiperoleh kepekaan analitis yang tinggi.Hasil yang didapat ini didukung olehpenelitian yang dilakukan AA. Bradford(1976), yaitu serapan maksimum terletakpada 595 nm.

4.1.1 Pembuatan Kurva Standar BSAKurva standart BSA dibuat dengan

membuat beberapa pengenceran darilarutan induk BSA 2000 ppm menjadibeberapa konsentrasi yaitu: 100 ppm, 200ppm, 300 ppm, 400 ppm, 500 ppm, 600ppm, 700 ppm. Variasi konsentrasi larutantersebut dibuat dengan menggunakanlarutan standart BSA 2000 ppm, larutantersebut diambil sebanyak 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5;3; 3,5 mL lalu diencerkan dengan aquadessampai 10 ml. Selanjutnya diambil 7 ml danditambahkan 3 ml reagen bradfod. Masing-masing larutan diaduk dan diinkubasiselama 5 menit pada suhu ruang. Kemudianpengukuran absorbansi dilakukan denganmenggunakan spektrofotometer padapanjang gelombang maksimum yang telahditentukan sebelumnya yaitu pada = 595λnm . Blanko yang digunakan adalah 7 mlaquades yang ditambah dengan 3 mlreagen Bradfod.

Kurva standar dibuat denganmengalurkan absorbansi sebagai ordinat(sumbu y) dan konsentrasi sebagai absis(sumbu x).

Gambar 3 Kurva Standart LarutanBSA

Nilai absorbansi mengalami kenaikanseiring bertambahnya konsentrasi BSA

hingga diperoleh persamaan garis antarakonsentrasi BSA dan absorbansi yaitu:

y = 0,001339x

Koefisien korelasi dari kurva hasilpengamatan adalah R2 = 0,998

Penentuan Kandungan Protein Ekstrakkasar Invertase

Crude diambil sebanyak 1 mLkemudian diencerkan menjadi 10 mL,setelah itu hasil pengenceran tersebutdiambil sebanyak 7 mL dan ditambahkan 3mL reagen Bradford. Larutan ini dibiarkanselama 5 menit untuk menyempurnakanreaksi yang terjadi. Larutan yang telahdiinkubasi diukur serapannyamenggunakan spektrofotometer padapanjang gelombang maksimum yangdidapat, yaitu 595 nm. Absorbansi yangdihasilkan adalah sebesar 1,112 dan 1,114sehingga diambil rata - ratanya sebesar1,113. Hasil absorbansi ini dimasukkankedalam persamaan reaksi y= 0,001339 x.Dari perhitungan diperoleh konsentrasicrude invertase yang terukur sebesar831,217 ppm sedangkan konsentrasi crudeinvertase sebenarnya yaitu sebesar11.874,533 ppm didapatkan dengan caramengalikan konsentrasi terukur denganfaktor kali 100/7 (10/1 x 10/7), dimanapengenceran dengan aquades (10/1) danpengenceran akibat penambahan reagenBradford (10/7). Hasil ini kemudiandikonversikan dalam mg sehinggadiketahui dalam 1 mL crude invertasemengandung 11,87 mg protein.

Penentuan Kondisi Optimum EkstrakKasar Enzim Invertase

Perbedaan pH berpengaruhterhadap 2 jenis, yaitu struktur enzim dangugus fungsional enzim. Suatu enzim dapatmenghasilkan produk yang maksimal padapH optimumnya. Dari hasil penentuan pHoptimum crude invertase diperoleh gambar4. 7


Gambar 4 Pengaruh pH terhadap AktivitasEnzim Invertase

Gambar diatas menunjukkanaktivitas maksimum crude invertase yaitupada pH 4,5 dengan aktivitas sebesar 49,63unit. Unit aktivitas enzim didefinisikansebagai, sebanyak 49,63 μmol guladihasilkan oleh setiap mL enzim permenitnya. Hasil pH optimum ini sesuaidengan penelitian yang dilakukan oleh(Bergamasco et al, 2000; Akgol et al., 2001;Bayramolu et al., 2003), yang melaporkanbahwa aktifitas enzim terjadi pada rangepH 3,0 - 5,0 dengan aktivitas maksimumterjadi disekitar pH 4,5. Diatas skalatersebut aktivitas enzim mengalamipenurunan. Semakin basa kondisi hidrolisismenyebabkan semakin rendahnya hargaaktivitas enzim crude invertase. PerubahanpH dapat menyebabkan turunnya aktivitasenzim akibat perubahan ionisasi gugus -gugus fungsionilnya karena gugus ionikberperan penting dalam menjagakonformasi sisi aktif enzim untuk mengikatdan mengubah substrat menjadi produk.Perubahan pH juga dapat menyebabkanenzim terdenaturasi sehinggamenyebabkan penurunan katalitik enzim.Denaturasi enzim dakibatkan karenaterjadinya pemutusan ikatan penstabilstruktur (seperti ikatan ionik, hidrogen,hidrofobik) yang menghubungkan antarpolimer protein. Pemutusan tersebut dapatterjadi pada protein kwartener, tersierataupun sekunder. Pada protein kwartenerterjadi pemutusan ikatan penstabil strukturkarena bentuknya yang merupakangabungan antara globular satu denganglobular lainyya sehingga dapat terjadipemutusan ikatan tersebut pada proteintersier satu dengan protein tersier lainnyadan terjadi seterusnya, pada protein tersiermembentuk protein sekunder.

Penentuan suhu optimum jugaditentukan berdasarkan data yang telahdidapatkan. Variasi suhu yang dibuat yaitu20 oC, 25 oC, 30 oC, 60 oC, 80 oC dan 100 o C.Pengaturan ini dengan cara dipanaskandalam air mendidih ataupun di inkubasidalam penangas es. Ketiga optimasi baikpH, suhu serta lama inkubasi, kadar gulareduksinya dianalisa menggunakan metodeSomogy- Nelson. Metode tersebut khususuntuk penentuan gula reduksi. Dariperhitungan diperoleh gambar 5

Gambar 5 Pengaruh Suhu TerhadapAktivitas Enzim Invertase

Enzim memiliki temperaturoptimum dalam melakukan fungsinya,sehingga diperoleh aktivitas enzimmaksimum. Gambar 4.8 menunjukkanbahwa aktivitas optimum crude invertasedicapai pada suhu 30 oC dengan aktivitassebesar 46,66 unit. Hasil suhu optimum inisedikit berbeda dengan hasil penelitianyang dilakukan oleh (Bergamasco et al,2000; Akgol et al., 2001; Bayramolu et al.,2003), yang menyatakan suhu optimumenzim invertase dicapai pada 40- 60 oC.Perbedaan ini kemungkinan disebabkanketidakmurnian enzim invertase sehinggalebih tidak tahan terhadap panas.Meningkatnya suhu menyebabkan aktivitasenzim meningkat. Hal ini disebabkankarena ketika suhu naik, energi kinetik jugameningkat sehingga menambah intensitastumbukan antara substrat dan enzim.Tumbukan yang sering terjadi akanmempermudah pembentukan kompleksenzim- substrat, sehingga produk yangterbentuk makin banyak. Sedangkan suhuyang terlalu tinggi akan mempengaruhiperubahan konformasi substrat sehinggasisi reaktif substrat mengalami hambatanuntuk memasuki sisi aktif enzim dan hal inimenyebabkan aktivitas enzim akan rendah.Selain itu, tingginya suhu akanmenyebabkan rusaknya interaksinonkovalen (ikatan hidrogen, vander waals,hidrofobik dan elektrostatik) yang menjagastruktur tiga dimensi enzim sehinggaenzim akan terdenaturasi. Dari datatersebut, hidrolisis sukrosa dilakukandalam pH 4,5 dan pada suhu 30 oC.

Untuk mengetahui waktu inkubasiatau hidrolisis yang optimum dapat dilihatdari gambar berikut :


Gambar 4.9 Pengaruh Waktu HidrolisisTerhadap Kadar Gula Reduksi

Waktu inkubasi merupakan waktuyang dibutuhkan oleh enzim untukberikatan dengan substratnya. Penentuanwaktu inkubasi optimum pada crudeinvertase dilakukan pada pH optimumnyayaitu 4,5 dan suhu optimum 30 oC. Darigambar diatas, menunjukkan bahwapenambahan waktu inkubasi akanmeningkatkan jumlah produk yangterbentuk. Dengan kata lain aktivitasnyajuga meningkat sampai ia mencapai waktuoptimum yaitu pada jam ke 5 setelahinkubasi.Saat inkubasi optimum ini, sisiaktif enzim akan terikat secara optimal.Apabila waktu yang dikondisikan padaenzim dan substrat kurang dari cukup,maka sisi aktif enzim belum optimal dalammengikat substrat sehingga menyebabkanproduk yang terbentuk masih sedikit ketikareaksi dihentikan. Pada jam ke 5 sampai 7,tidak terlihat adanya perbedaan yang besar,ini menandakan bahwa kemungkinan sisiaktif enzim telah jenuh oleh substratsehingga produk yang dihasilkan hanyamengalami peningkatan ataupunpenurunan yang relatif kecil.

Penentuan Kurva PertumbuhanZymomonas mobilis

Pengukuran jumlah bakteri dapatditentukan secara tidak langsung denganmengukur turbiditas cairan mediumtumbuh menggunakan spektrofotometer(Optical Density atau absorbansi). Unit ODini akan proporsional atau sebandingdengan massa sel dan jumlah bakteri.Meningkatnya turbidimetri dalam mediaadalah indeks lain dari pertumbu hanbakteri serta jumlah biomassa bakteri.Apabila sinar yang ditransmisikan atauditeruskan itu menurun artinya terjadipeningkatan populasi pada media tersebut.Dengan kata lain absorbansi yang tebacadari sinar yang dihamburkan oleh partikel -partikel bakteri akan memberikan nilaiyang besar.

Gambar 6 Kurva pertumbuhan Zymomonasmobilis dalam media pH 5,5

Dari kurva pertumbuhanZymomonas mobilis dalam media denganpH 5,5 diatas, dapat dilihat bahwa bakteriZymomonas mobilis melakukan adaptasipada fasa lag selama ± 4 jam pertama.Pada fase ini, bakteri tidak mengalamipertumbuhan yang signifikan, jumlahnyacenderung tetap karena belum mengalamipembelahan. Bakteri memerlukan waktuuntuk beradaptasi, selnya akan mengalamiperubahan komposisi kimiawi dan ukuranserta bertambahnya substansi intraselulersehingga siap untuk membelah diri. Waktuadaptasi ini tergolong singkat. Hal inidikarenakan sebelumnya telah dilakukantransfer dari starter 20 mL ke starter 200mL dengan waktu inkubasi yang sama. Faselog berakhir setelah 18 jam inkubasi.Jumlah sel yang hidup pada fase inimerupakan jumlah sel yang hidup optimaldan memiliki aktivitas yang sangat aktifdalam mengkonversi substrat menjadietanol. Oleh karena itu pemanenan bakteridilakukan sekitar waktu tersebut. Diatas 20jam, bakteri sudah masuk fase stasioner.Berdasarkan teori, jumlah sel yang matipada fase stasioner sama dengan jumlahsel hidup yang membelah sehingga seolah-olah pertumbuhannya adalah nol. Apabilawaktu pengamatan diperpanjang akandidapatkan penurunan jumlah bakteri yangdapat mencapai maksimal disebabkanberkurangnya nutrisi yang tersediasehingga jumlah sel yang mati lebihbanyak. Pada waktu ini disebut sebagai fasekematian.

Penentuan Pola FermentasiDari 100 mL larutan sukrosa 10%

yang dihidrolisis dengan 5 mL enziminvertase selama 5 jam pada pH 4,5 dansuhu inkubasi 30 oC menghasilkan gulainvert dengan konsentrasi 0,2906 M atausebanyak 10,46 gram. Sebelum dilakukan


hidrolisis, sukrosa memiliki absorbansiawal sebesar 0,067, artinya dalam larutansukrosa tersebut terdapat 0,247 gram gulareduksi (gula invert). Hal ini menandakanbahwa sukrosa yang digunakan tidakmurni. Dengan melakukan pengurangan,didapatkan massa gula hasil hidrolisissebesar 10,22 gram. Apabila hasil tersebutdikonversikan dengan sejumlah sukrosamelalui persamaan stoikiometrinya dapatdiketahui banyaknya sukrosa yangterhidrolisis, yaitu sekitar 9,712 gram.Enzim yang digunakan mengandung 11,87mg protein / mL dan menghasilkan aktivitassebesar 18,91 unit.

Hidrolisat yang didapatkan darihasil hidrolisis akan digunakan sebagaimedia fermentasi, dimana gula reduksinyaakan diubah menjadi etanol olehZymomonas mobilis melalui jalur Entner -Doudoroff.

Data dari penelitian sebelumnya,hasil etanol optimum terjadi padafermentasi dengan pH 5,5 sehinggafermentasi kali ini dilakukan pada pHtersebut dan dalam kondisi anaerob yangdiletakkan pada shaker dengan kecepatan50 rpm. Karena semakin anaerob keadaanfermentasi maka semakin maksimal pulaglukosa atau fruktosa yang dapatterfermentasi.

Pola produksi etanol serta konsumsigula selama fermentasi oleh sel bebasZymomonas mobilis diperoleh denganmelakukan monitoring terhadap kadaretanol dan kadar gula invert sisa terhadapfungsi waktu selama 120 jam setiap 15 jamsekali. Jumlah awal sel Zymomonas mobilisyang digunakan sebesar 2,6 x 10 10 sel /mL.Zymomonas mobilis mempunyai lajupertumbuhan yang tinggi dan tahanterhadap konsentrasi etanol sekitar 10%.Bakteri ini dapat memfermentasikan gulamenjadi etanol dan CO2 melalui jalur

glikolitik Entner- Doudoroff, dimanaoksigen tidak ikut serta dalam prosesfermentasi. Oksigen akan menekanfermentasi dan menguntungkan respirasi(Schlegel, 1994). Dibawah ini disajikangrafik pola produksi etanol besertakonsumsi gula selama 120 jam.

Gambar 7 Pola Produksi Etanol dan GulaResidu pada pH 5,5

Dari gambar diatas, dapat dilihatbahwa semakin lama jumlah etanolmengalami peningkatan sedangkan jumlahgula residu semakin berkurang dari gulaawalnya, ini menandakan adanya konsumsigula oleh bakteri. Jumlah etanol dankonsumsi gula mengalami perubahan yangsignifikan setelah fermentasi selama 75jam. Hal ini dimungkinkan karena sudahtidak ada pertumbuhan bakteriZymomonas mobilis sehingga kondisinyadioptimalkan untuk berlangsungnyapembentukan etanol. Menurut Mc Gill(1965) , Zymomonas mobilis lebih menyukaiglukosa daripada fruktosa. Sehingga bakteriini akan memakai glukosa sebagai substratuntuk fermentasi pertama kali. Setelahglukosa habis, maka bakteri ini akanmemakai fruktosa. Indikasi terjadinyafermentasi adalah terdapatnya gelembungbusa pada permukaan media. Jumlah etanolterbesar dihasilkan pada 120 jam sebesar6,17 % (v/v) atau 4,87 gram etanol denganyield etanol 92,89%. Nilai ini lebih besarapabila dibandingkan dengan hasilpenelitian yang dilakukan Hani (2009) yaitumengenai fermentasi menggunakansubstrat sukrosa yang hanya menghasilkanetanol sebesar 0,412 gram, yield etanolyang dicapai 61,18%. Nilai yield yangrendah ini, diakibatkan karena denganmenggunakan substrat sukrosa akanterbentuk 2 jenis hasil samping yang utamayaitu levan dan sorbitol. Levan terbentukakibat adanya enzim levan sukrase yangdihasilkan oleh bakteri Zymomonas mobilishanya pada substrat sukrosa sedangkansorbitol terbentuk akibat adanya reduksioleh enzim glukose - fructoseoxidareduktase. Dimana hasil sampingkeduanya dapat menurunkan jumlah etanolyang terbentuk sampai 80% secara teori (E,favela, 1987). Akan berbeda apabilasubstrat yang digunakan merupakan hasilhidrolisis sukrosa, kemungkinan produkmayor yang terbentuk hanya sorbitol.

Yield etanol yang terukur dihitungberdasarkan akumulasi etanol pada setiapwaktu pengukuran. Yield etanol dari hasilfermentasi dapat dilihat pada gambar 8


Gambar 8 Yield Etanol Terhadap WaktuPengukuran

Pada fermentasi selama 60 jamterlihat adanya penurunan yield etanolmenjadi 79,81%. Hal ini disebabkan karenasejumlah gula dipakai bakteri untukregenerasi sehingga etanol yang dihasilkantidak sebanding dengan banyaknya gulayang terkonsumsi.

KESIMPULANBerdasarkan hasil penelitian,

diperoleh kesimpulan bahwa aktifitasoptimum crude invertase dalammendegradasi sukrosa menjadi gula invertdidapatkan pada kondisi pH 4,5 dengantemperatur 30 oC dan waktu inkubasiselama 5 jam. Inkubasi selama 5 jam padakondisi optimum mampu mnghidrolisissukrosa sebanyak 9,712 gram danmenghasilkan campuran glukosa sertafruktosa sebanyak 10,22 gram. Aktivitasenzimnya sebesar 18,91 unit. Selain itu,pada fermentasi dengan pH 5,5,Zymomonas mobilis mampu menghasilkanetanol sebesar 4,87 g/100 mL dengan yieldetanol mencapai 92,89%.

UCAPAN TERIMA KASIH1. Bapak Surya Rosa Putra, selaku

dosen pembimbing atas segaladiskusi, bimbingan, arahan dansemua ilmu yang bermanfaat.

2. Bapak dan Ibu selaku orang tuaterbaik di dunia atas segala doa,dorongan materiil dan spiritualnya.

3. Rekan- rekan tugas akhir dan thesisS1 dan S2 Kimia ITS serta paraanalis khususnya di LaboratoriumBiokimia

4. Serta pihak- pihak lain yang tidakdapat disebutkan satu persatu.

DAFTAR PUSTAKA

Bergamasco, G., Akgol, S., Bulut, A., Denizli,A. And Yakub, A.M. (2003), “Covalentimmobilization of inverase onto a

reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate andglycidyl methacrylate”, BiochemicalEngineering Journal , 14:117- 126

Favela, E Torres, (1987), “ContinuousEthanol Production by Zymomonasmobilis from an Equimolar Mixture ofGlucose and Fructose”, France

Mukhtasor, (2009), “Agenda EnergiTerbarukan dalam Konteks KebijakanEnergi Berkelanjutan”, ITS Press,Surabaya

Swing, J. Dan De Ley, J.,(1977), “The Biologyof Zymomonas”, Laboratory ofMicrobiology and Microbial Genetic,Faculty of Science, USA

Tano, M. S. & Buzato, J. B., (2003), “Effect ofThe Presence of Initial Ethanol onEthanol Production in Sugar CaneJuice Fermented by Zymomonasmobilis”. Braz. J. Microbiol. 34: 242-244

Utami, Sri, (2007), “Pengelolaan EnergiNasional 2005- 2025”, Staf AhliMenteri Bidang Ekonomi danKeuangan, Departemen Energi danSumberdaya Mineral,Jakarta

BIOGRAFI PENULIS

Penulis dilahirkan di Surabaya pada tanggal 3Desember 1987, sebagai anak pertama dari duabersaudara. Penulis adalah alumnus dari TKAisyah, SD Muhammadiyah V, SLTP Negeri 1Porong dan SMA Negeri 3 Sidoarjo. Setelah lulusmenempuh Pendidikan Menengah atas, penulismelanjutkan Pendidikan Tinggi di JurusanKimia Fakultas MIPA Institut Teknologi SepuluhNopember (ITS) Surabaya melalui jalur SPMB(Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru) padabulan Agustus 2005. Selama menempuhpendidikan tinggi di ITS, penulis pernah aktifdan berpartisipasi dalam organisasi padaHIMKA- ITS. Penulis juga aktif mengikutibeberapa pelatihan, seminar dan StudyLapangan. Penulis sempat menempuh KerjaPraktek di PT. Nestle - Kejayan, Pasuruan.Penulis menamatkan studi S1 di Jurusan KimiaMIPA dengan mengambil Tugas Akhir padabidang Biokimia dan berhasil lulus denganpredikat yang Memuaskan.


nuzzulaawwalulrizki

Documents