VII. METODE PENELITIAN

7.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia untuk proses

penyiapan sampel dan Laboratorium Kimia Farmasi untuk penentuan nilai total saponin dan

aktivitas antioksidan sampel. Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan xxx sampai

dengan xxx tahun 2015

7.2 Alat dan Bahan Penelitian

7.2.1 Alat Penelitian

Alat yang digunakan adalah alat gelas, soxhlet, neraca analitik, rak tabung reaksi, cawan

porselin, waterbath, vacuum rotary evaporator, dan spektrofotometer UV-Vis.

7.2.2 Bahan Penelitian

Simplisia batang pakan banyu, pelarut etanol p.a, vanillin, asam sulfat, pereaksi DPPH

(2,2-difenil-1-pikrilhidrazin), aluminium foil, air, HCl dan kertas saring.

7.3 Variabel Penelitian

Variabel dari penelitian ini meliputi varibel terikat, variabel bebas, dan variabel terkendali.

7.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak batang pakan banyu (Oreocnide Sp.).

7.3.2 Variabel Terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar saponin total dan aktivitas antioksidan

yang terkandung pada batang pakan banyu (Oreocnide Sp.).

7.3.3 Variabel Terkendali

Variabel terkendali pada penelitian ini adalah cara mereaksikan sampel dengan larutan

DPPH ditempat yang gelap.

7.4 Prosedur Penelitian

7.4.1 Pengumpulan Sampel

Daun pakan banyu diperoleh dari desa Desa Riam adungan Kecamatan kintap

Kalimantan Selatan. Pengumpulan dilakukan pada pagi hari. Tanaman yang digunakan adalah

yang telah berusia diatas 5 tahun (cukup dewasa) agar didapatkan senyawa metabolit sekunder

yang maksimal dan seragam.

7.4.2 Penyiapan Sampel

Pakan banyu (Oreocnide sp.) yang digunakan adalah batang kayu yang berwarna coklat.

Batang kayu pakan banyu selanjutnya disortasi, dibersihkan dari pengotor kemudian dicuci di

bawah air mengalir hingga bersih. lalu kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan

pisau bersih. Kemudian dikeringkan di udara terbuka dan terlindung dari sinar matahari

langsung. Simplisia yang telah kering disortasi kembali untuk memisahkan dari benda-benda

asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor lain yang tertinggal,

kemudian dibuat serbuk dengan menggunakan blender dan diayak dengan ayakan 40 mesh

(Febriyanti, 2012).

7.4.3 Pembuatan Ekstrak

Serbuk batang pakan banyu diekstraksi dengan menggunakan pelarut petroleum eter

dengan metode soxhletasi. Serbuk dimasukkan ke dalam alat soxhlet dan ditambah dengan

pelarut. Suhu ekstraksi dijaga antara 60°-80°C. Setelah diperoleh ekstrak cair, pelarut kemudian

diuapkan menggunakan vacum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak

kental dimasukkan ke dalam cawan porselin lalu diletakkan di atas waterbath hingga terbentuk

ekstrak dengan berat yang konstan (Yadav & Jain, 2013).

7.4.5 Pembuatan Kurva Larutan standar

Prosedur penentuan total saponin dilakukan dengan menggunakan metode vanillin-

sulfuric acid. Kalibrasi kurva baku dilakukan dengan cara melarutkan 10 mg standar saponin ke

dalam etanol 70% dalam labu ukur 100 mL hingga diperoleh kadar 100 ppm. Larutan baku

induk 100 ppm diencerkan lagi hingga menjadi beberapa seri kadar, yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50

ppm dengan cara mengambil masing-masing sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 mL dan melarutkannya

dengan etanol hingga 10 mL (Rohyami, 2008). Hasil setiap pengenceran larutan standar

masing-masing diambil 0,5 mL dimasukan dalam tabung 10 ml, kemudian ditambahkan 0,5 ml

larutan vanillin 8% dan 5 ml asam sulfat 77%. setelah dicampurkan, larutan diinkubasi selama

20 menit pada suhu 60C dan kemudian didinginkan didalam air es selama 10 menit. serapannya

diukur menggunakan Serapannya diukur pada Spektrofotometer UV-Vis pada panjang

gelombang maksimal. Kurva standar di peroleh dari hubungan antara konsentrasi (mg/L)

dengan absorbansi.

7.4.6 Penetapan kadar saponin total

25 mg Ekstrak batang pakan banyu dilarutkan dengan etanol 70% hingga volume

dimasukan dalam tabung 10 ml, kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan vanillin 8% dan 5 ml

asam sulfat 77%. setelah dicampurkan, larutan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 60C dan

kemudian didinginkan didalam air es selama 10 menit. serapannya diukur menggunakan

Serapannya diukur pada Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimal.

Pengukuran dilakukan juga terhadap blangko yang terdiri atas semua pereaksi yang digunakan

akan tetapi tidak mengandung larutan standar atau sampel uji . Absorbansi ekstrak yang

mengandung saponin dikalibrasikan dengan kurva standar dengan persamaan regresi linier.

Hasil yang diperoleh diperhitungkan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi

flavonoid yang terdapat dalam ekstrak pakan banyu

Dari hasil pengukuran didapat data nilai absorbansi. Kemudian data ini diolah dengan

menggunakan rumusan berikut:

Menentukan kadar saponin

y = ax + b

Dimana :

y : nilai absorbansi

x : kadar saponin

a, b : konstanta

(Rohaeti et al, 2011)

7.4.7 Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH

a. Pembuatan Larutan Uji

Ekstrak kering batang pakan banyu sebanyak 10 mg dilarutkan dalam etanol p.a 100 mL

sehingga diperoleh konsentrasi 100 ppm. Kemudian dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10

mL kemudian dibuat berbagai konsentrasi 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm, 70 ppm dan 90 ppm.

Masing-masing dimasukkan ke dalam vial. Kontrol positif yang digunakan pada uji antioksidan

metode DPPH yaitu vitamin C. Vitamin C disiapkan dengan melarutkan 10 mg vitamin C dalam

100 mL aquadest hingga diperoleh konsentrasi 100 ppm. Larutan vitamin C 100 ppm kemudian

diencerkan hingga diperoleh konsentrasi sebesar 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm dengan cara mengambil

2, 4, 6, 8, dan 10 mL larutan vitamin C 100 ppm dan mengencerkannya hingga volume 10 mL.

Konsentrasi ekstrak pakan banyu yang digunakan pada setiap pengujian sebesar 10, 20, 30, 40,

dan 50 ppm (Huda et al, 2009).

b. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH

Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dan ditambahkan dengan 8,0 mL etanol p.a.

Setelah dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap, serapan larutan diukur dengan

Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500-600 nm (Molyneux, 2004).

c. Penentuan Operating time Larutan Uji

Penentuan operating time dilakukan dengan cara 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM ditambah

dengan larutan uji 90 ppm sebanyak 8,0 mL. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada

panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh dengan interval pada waktu 5 menit sampai

diperoleh absorbansi yang stabil (Rastuti & Purwati, 2012).

d. Penentuan Aktivitas Antioksidan

Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM

ditambah dengan masing-masing 8,0 mL larutan uji. Campuran didiamkan selama waktu

operating time yang diperoleh. Larutan ini kemudian diukur absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum. Dilakukan juga pengukuran absorbansi blanko yaitu larutan DPPH dan

etanol. Sebagai pembanding digunakan 5 mg Asam askorbat p.a dilarutkan dalam etanol 70 %

100 ml sehingga diperoleh konsentrasi 50 ppm kemudian dibuat seri kadar dengan konsentrasi 1

ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, dan 5 ppm. Hasil penetapan antioksidan dibandingkan dengan asam

askorbat p.a sebagai kontrol positif (Sunardi, 2007).

Perhitungan potensi antioksidan dengan pereaksi DPPH dengan menghitung IC50 untuk

masing-masing sampel dengan menggunakan rumus persamaan garis regresi linier yang

diperoleh dari grafik hubungan antara konsentrasi dengan % peredaman DPPH ekstrak etanol.

Besarnya % peredaman DPPH dihitung dengan rumus :

% peredaman DPPH = [ Absorban kontrol−Absorbansampel ]

Absorbankontrolx100%

Persamaan garis regresi linier untuk menghitung IC50 dengan rumus :

y = bx+a

Keterangan : y = 50 % peredaman

x = nilai IC50 (ppm)

Tingkat kemampuan antioksidan dengan metode DPPH (Jun et al., 2003) dapat

dilihat pada tabel 1

Aktivitas Nilai IC50

Sangat aktif < 50 ppm

Aktif 50-100 ppm

Sedang 101-250 ppm

Lemah 250-500 ppm

Tidak Aktif > 500 ppm

Tabel 1. Tingkat kemampuan antioksidan (Jun et al., 2003)