Download - metode.docx
VII. METODE PENELITIAN
7.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia untuk proses
penyiapan sampel dan Laboratorium Kimia Farmasi untuk penentuan nilai total saponin dan
aktivitas antioksidan sampel. Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan xxx sampai
dengan xxx tahun 2015
7.2 Alat dan Bahan Penelitian
7.2.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan adalah alat gelas, soxhlet, neraca analitik, rak tabung reaksi, cawan
porselin, waterbath, vacuum rotary evaporator, dan spektrofotometer UV-Vis.
7.2.2 Bahan Penelitian
Simplisia batang pakan banyu, pelarut etanol p.a, vanillin, asam sulfat, pereaksi DPPH
(2,2-difenil-1-pikrilhidrazin), aluminium foil, air, HCl dan kertas saring.
7.3 Variabel Penelitian
Variabel dari penelitian ini meliputi varibel terikat, variabel bebas, dan variabel terkendali.
7.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak batang pakan banyu (Oreocnide Sp.).
7.3.2 Variabel Terikat
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar saponin total dan aktivitas antioksidan
yang terkandung pada batang pakan banyu (Oreocnide Sp.).
7.3.3 Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini adalah cara mereaksikan sampel dengan larutan
DPPH ditempat yang gelap.
7.4 Prosedur Penelitian
7.4.1 Pengumpulan Sampel
Daun pakan banyu diperoleh dari desa Desa Riam adungan Kecamatan kintap
Kalimantan Selatan. Pengumpulan dilakukan pada pagi hari. Tanaman yang digunakan adalah
yang telah berusia diatas 5 tahun (cukup dewasa) agar didapatkan senyawa metabolit sekunder
yang maksimal dan seragam.
7.4.2 Penyiapan Sampel
Pakan banyu (Oreocnide sp.) yang digunakan adalah batang kayu yang berwarna coklat.
Batang kayu pakan banyu selanjutnya disortasi, dibersihkan dari pengotor kemudian dicuci di
bawah air mengalir hingga bersih. lalu kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan
pisau bersih. Kemudian dikeringkan di udara terbuka dan terlindung dari sinar matahari
langsung. Simplisia yang telah kering disortasi kembali untuk memisahkan dari benda-benda
asing seperti bagian-bagian tanaman yang tidak diinginkan dan pengotor lain yang tertinggal,
kemudian dibuat serbuk dengan menggunakan blender dan diayak dengan ayakan 40 mesh
(Febriyanti, 2012).
7.4.3 Pembuatan Ekstrak
Serbuk batang pakan banyu diekstraksi dengan menggunakan pelarut petroleum eter
dengan metode soxhletasi. Serbuk dimasukkan ke dalam alat soxhlet dan ditambah dengan
pelarut. Suhu ekstraksi dijaga antara 60°-80°C. Setelah diperoleh ekstrak cair, pelarut kemudian
diuapkan menggunakan vacum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak
kental dimasukkan ke dalam cawan porselin lalu diletakkan di atas waterbath hingga terbentuk
ekstrak dengan berat yang konstan (Yadav & Jain, 2013).
7.4.5 Pembuatan Kurva Larutan standar
Prosedur penentuan total saponin dilakukan dengan menggunakan metode vanillin-
sulfuric acid. Kalibrasi kurva baku dilakukan dengan cara melarutkan 10 mg standar saponin ke
dalam etanol 70% dalam labu ukur 100 mL hingga diperoleh kadar 100 ppm. Larutan baku
induk 100 ppm diencerkan lagi hingga menjadi beberapa seri kadar, yaitu 10, 20, 30, 40, dan 50
ppm dengan cara mengambil masing-masing sebanyak 1, 2, 3, 4, dan 5 mL dan melarutkannya
dengan etanol hingga 10 mL (Rohyami, 2008). Hasil setiap pengenceran larutan standar
masing-masing diambil 0,5 mL dimasukan dalam tabung 10 ml, kemudian ditambahkan 0,5 ml
larutan vanillin 8% dan 5 ml asam sulfat 77%. setelah dicampurkan, larutan diinkubasi selama
20 menit pada suhu 60C dan kemudian didinginkan didalam air es selama 10 menit. serapannya
diukur menggunakan Serapannya diukur pada Spektrofotometer UV-Vis pada panjang
gelombang maksimal. Kurva standar di peroleh dari hubungan antara konsentrasi (mg/L)
dengan absorbansi.
7.4.6 Penetapan kadar saponin total
25 mg Ekstrak batang pakan banyu dilarutkan dengan etanol 70% hingga volume
dimasukan dalam tabung 10 ml, kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan vanillin 8% dan 5 ml
asam sulfat 77%. setelah dicampurkan, larutan diinkubasi selama 20 menit pada suhu 60C dan
kemudian didinginkan didalam air es selama 10 menit. serapannya diukur menggunakan
Serapannya diukur pada Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimal.
Pengukuran dilakukan juga terhadap blangko yang terdiri atas semua pereaksi yang digunakan
akan tetapi tidak mengandung larutan standar atau sampel uji . Absorbansi ekstrak yang
mengandung saponin dikalibrasikan dengan kurva standar dengan persamaan regresi linier.
Hasil yang diperoleh diperhitungkan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi
flavonoid yang terdapat dalam ekstrak pakan banyu
Dari hasil pengukuran didapat data nilai absorbansi. Kemudian data ini diolah dengan
menggunakan rumusan berikut:
Menentukan kadar saponin
y = ax + b
Dimana :
y : nilai absorbansi
x : kadar saponin
a, b : konstanta
(Rohaeti et al, 2011)
7.4.7 Penentuan Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH
a. Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak kering batang pakan banyu sebanyak 10 mg dilarutkan dalam etanol p.a 100 mL
sehingga diperoleh konsentrasi 100 ppm. Kemudian dilakukan pengenceran dalam labu ukur 10
mL kemudian dibuat berbagai konsentrasi 10 ppm, 30 ppm, 50 ppm, 70 ppm dan 90 ppm.
Masing-masing dimasukkan ke dalam vial. Kontrol positif yang digunakan pada uji antioksidan
metode DPPH yaitu vitamin C. Vitamin C disiapkan dengan melarutkan 10 mg vitamin C dalam
100 mL aquadest hingga diperoleh konsentrasi 100 ppm. Larutan vitamin C 100 ppm kemudian
diencerkan hingga diperoleh konsentrasi sebesar 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm dengan cara mengambil
2, 4, 6, 8, dan 10 mL larutan vitamin C 100 ppm dan mengencerkannya hingga volume 10 mL.
Konsentrasi ekstrak pakan banyu yang digunakan pada setiap pengujian sebesar 10, 20, 30, 40,
dan 50 ppm (Huda et al, 2009).
b. Penentuan Panjang Gelombang Serapan Maksimum DPPH
Sebanyak 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM dan ditambahkan dengan 8,0 mL etanol p.a.
Setelah dibiarkan selama 30 menit ditempat gelap, serapan larutan diukur dengan
Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500-600 nm (Molyneux, 2004).
c. Penentuan Operating time Larutan Uji
Penentuan operating time dilakukan dengan cara 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM ditambah
dengan larutan uji 90 ppm sebanyak 8,0 mL. Larutan tersebut diukur absorbansinya pada
panjang gelombang maksimum yang telah diperoleh dengan interval pada waktu 5 menit sampai
diperoleh absorbansi yang stabil (Rastuti & Purwati, 2012).
d. Penentuan Aktivitas Antioksidan
Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara 2,0 mL larutan DPPH 0,4 mM
ditambah dengan masing-masing 8,0 mL larutan uji. Campuran didiamkan selama waktu
operating time yang diperoleh. Larutan ini kemudian diukur absorbansinya pada panjang
gelombang maksimum. Dilakukan juga pengukuran absorbansi blanko yaitu larutan DPPH dan
etanol. Sebagai pembanding digunakan 5 mg Asam askorbat p.a dilarutkan dalam etanol 70 %
100 ml sehingga diperoleh konsentrasi 50 ppm kemudian dibuat seri kadar dengan konsentrasi 1
ppm, 2 ppm, 3 ppm, 4 ppm, dan 5 ppm. Hasil penetapan antioksidan dibandingkan dengan asam
askorbat p.a sebagai kontrol positif (Sunardi, 2007).
Perhitungan potensi antioksidan dengan pereaksi DPPH dengan menghitung IC50 untuk
masing-masing sampel dengan menggunakan rumus persamaan garis regresi linier yang
diperoleh dari grafik hubungan antara konsentrasi dengan % peredaman DPPH ekstrak etanol.
Besarnya % peredaman DPPH dihitung dengan rumus :
% peredaman DPPH = [ Absorban kontrol−Absorbansampel ]
Absorbankontrolx100%
Persamaan garis regresi linier untuk menghitung IC50 dengan rumus :
y = bx+a
Keterangan : y = 50 % peredaman
x = nilai IC50 (ppm)
Tingkat kemampuan antioksidan dengan metode DPPH (Jun et al., 2003) dapat
dilihat pada tabel 1
Aktivitas Nilai IC50
Sangat aktif < 50 ppm
Aktif 50-100 ppm
Sedang 101-250 ppm
Lemah 250-500 ppm
Tidak Aktif > 500 ppm
Tabel 1. Tingkat kemampuan antioksidan (Jun et al., 2003)