27

III. METODE PENELITIAN

A. Materi dan Bahan

1. Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus

putih (Rattus norvegicus) jantan, galur Wistar.

Tikus harus memenuhi kriteria inklusi :

1. Umur 3 bulan

2. Berat badan (200-250 gram)

3. Sehat

Kriteria ekslusi :

1. Mati selama penelitian berlangsung

Hewan coba didapatkan dari Laboratorium Penelitian dan

Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada. Jumlah hewan

coba disesuaikan denga banyaknya ulangan yang dilakukan. Jumlah

ulangan ditentukan berdasarkan rumus Federel sebagai berikut (Kemas,

2003):

t = jumlah perlakuan; r = jumlah ulangan

Pada penelitian ini terdapat empat kelompok perlakuan (t = 4),

maka dengan menggunakan rumus tersebut didapatkan jumlah ulangan 6

ekor hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) jantan tiap kelompok.

Jumlah tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah 8 ekor per

kelompok karena ditambah 20% nya sebagai faktor drop out. Hewan

(t-1)(r-1) ≥ 15

28

coba dipelihara dalam lingkungan dengan suhu, kelembaban,

pencahayaan alami yang sama, pemeliharaan tikus menggunakan

kandang dengan bahan, bentuk dan ukuran yang sama serta mendapat

makanan dan minuman dengan jenis, jumlah dan komposisi yang sama.

2. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penilitian ini adalah sebagai berikut :

a. Kandang tikus ukuran 20 x 12 x 10 cm dengan tempat pakan dan

minum

b. Timbangan untuk hewan coba

c. Timbangan dengan skala mikrogram

d. Sonde lambung

e. Mikropipet hematokrit

f. Tabung eppendorf

g. Kapas

h. Perangkat pemeriksaan serum oleh Laboratorium yang terdiri dari :

mikropipet, yellow tip, blue tip, kuvet plastik dan kaca

i. Tabung vakum

j. Spektrofotometer dan Sentrifugator

3. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini, diantaranya

adalah:

a. Ekstrak etanol 70% daun salam (Eugenia polyantha) dengan dosis

0,72 gram/200grBB/hari. Ekstrak dibuat dengan metode maserasi di

Pusat Studi Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

29

Bahan ekstrak diperoleh dari daun salam segar yang berasal dari

Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Daun

salam segar sebanyak 1 kg dihaluskan, kemudian direndam dengan

menggunakan etanol 70% selama 24 jam. Setalah 24 jam, kemudian

disaring untuk memisahkan cairan dengan ampas rendaman. Ampas

rendaman tersebut direndam kembali selama 3 x 24 jam dengan

menggunakan etanol 70% kemudaian disaring kembali. Cairan hasil

penyaringan tersebut kemudian diuapkan dengan menggunakan air

rotavapor untuk menghilangkan pelarut berupa etanol 70%. Setelah

diuapkan akan didapatkan ekstrak kental daun salam segar.

Kemudian ekstrak kental tersebut dimasukkan kedalam oven dengan

suhu 80ºC untuk menghilangkan kadar air. Setelah itu, akan

didapatkan ekstrak etanol 70% daun salam segar dalam sediaan

kering dan siap digunakan dalam penelitian (Studiawan dan Santosa,

2005).

b. Simvastatin

Simvastatin yang digunakan dalam penelitian ini adalah simvastatin

bentuk sediaan tablet 10 mg produksi OGB dexa (Puruhito, 2008).

Dosis yang digunakan pada hewan coba adalah 0,18

mg/200grBB/hari berdasarkan dosis konversi manusia kedalam dosis

tikus putih.

c. Aquadestilata

d. Alkohol 70%

30

e. Pakan standar tikus menggunakan pakan dengan merk Pakan Ayam

Aduan Finisher (AD II) (komposisi air (12%), protein kasar (15%),

lemak kasar (6%), abu (7%), kalsium (1,1%), fosfor (1%),

antibiotika +, coccidiostat +) dan minuman air bersih. Pemberian

makanan dan minuman secara ad libitum (Juniarto, 2004).

f. Pakan tinggi lemak hewan coba

Pakan tinggi lemak yang diberikan berasal dari lemak babi sediaan

cair yang didapatkan dari Pasar Kranggan, Yogyakarta. Pakan tinggi

lemak dibuat dengan mencampurkan lemak sebanyak 10% dari total

pakan yang diberikan perhari pada masing-masing tikus.

Perbandingan komposisi pakan standar AD II dan lemak yang akan

dicampurkan adalah 9:1. Pemberian pakan tinggi lemak 10% secara

ad libitum

g. Reagen pemeriksaan LDL serum dengan metode precipitation

reagent for in vitro determination of LDL Cholesterol with the

CHOD-PAP method by photometric system

B. Metode Penelitian

Metode penelitian yang digunakan adalah metode penelitian analitik

eksperimental menggunakan pre and post test with kontrol group design

terhadap 4 kelompok. Data mengenai kadar LDL serum diambil sebelum

pemberian pakan tinggi lemak, setelah pemberian pakan tinggi lemak dan

setelah pemberian ekstrak daun salam dan simvastatin.

31

C. Rancangan Penelitian

Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Completed

Randomized Design (CRD) dengan menggunakan 4 macam perlakuan

terhadap hewan coba (Sastroasmoro dan Sofyan, 2002). Perlakuan tersebut

adalah sebagai berikut:

1. Kelompok I, kelompok kontrol negatif. Tikus putih sehat tanpa

perlakuan pemberian pakan tinggi lemak 10%, tanpa pemberian

simvastatin dan ekstrak daun salam.

2. Kelompok II, kelompok kontrol positif. Tikus putih yang diberi induksi

hiperlipidemia berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7 hari, tanpa

pemberian simvastatin dan ekstrak daun salam.

3. Kelompok III, kelompok tikus putih yang diberi induksi hiperlipidemia

berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7 hari, kemudian diberikan

simvastatin secara peroral dosis 0,18 mg/200grBB/hari selama 15 hari

berturut-turut (menggunakan sonde lambung).

4. Kelompok IV, kelompok tikus putih yang diberi induksi hiperlipidemia

berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7 hari, kemudian diberikan ektrak

daun salam (Eugenia polyantha) peroral dosis 0,72 gram/200grBB/hari

selama 15 hari berturut-turut (menggunakan sonde lambung).

D. Variabel penelitian

Variabel dalam penelitian ini adalah :

1. Variabel bebas (Independent)

32

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian ekstrak daun salam

dan simvastatin.

2. Variabel terikat (Dependent)

Variabel terikat dalam pebelitian ini adalah kadar LDL serum tikus putih

(Rattus norvegicus).

E. Definisi Operasional Variabel

Tabel 3.1 Definisi Operasional VariabelVariabel Definisi operasional Jenis data Skala

dataIndependen Pemberian

ekstrak daun salam

Pemberian ekstrak daun salam dilakukan sekali dalam sehari selama 15 hari berturut-turut. Pemberian dilakukan peroral dengan bantuan sonde lambung. Ekstrak daun salam adalah ekstrak daun salam yang diperoleh dari daun salam segar yang diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan etanol 70% di Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Ekstrak etanol daun salam dibuat dalam dosis 0,72 gr/200grBB/hari dan diberikan kepada kelompok perlakuan ekstrak daun salam segar yaitu kelompok IV

Kategorik Nominal

Pemberian simvastatin

Pemberian simvastatin dilakukan sekali dalam sehari selama 15 hari berturut-turut. Pemberian dilakukan peroral dengan bantuan sonde lambung dengan dosis 0,18 mg/200grBB/hari. Sediaan Simvastatin yang digunakan adalah kaplet 10 mg produksi OGB dexa

Kategorik Nominal

33

Dependen Kadar LDL serum

Kadar LDL serum adalah kadar LDL dalam serum tikus putih yang diperiksa dengan metode precipitation reagent for in vitro determination of LDL Cholesterol with the CHOD-PAP method by photometric system dengan satuan mg/dl

Numerik Rasio

F. Cara Mengukur Variabel

1. Pemberian ekstrak daun salam

Pemberian ekstrak etanol daun salam dilakukan per oral dengan

bantuan sonde lambung. Pemberian ekstrak etanol daun salam ini

dilakukan pada satu kelompok (kelompok IV) dengan dosis 0,72

gr/200grBB/hari. Kelompok I dan II diberikan plasebo yaitu

aquadestilata dengan volume 2 ml. Pemberian ekstrak daun salam dan

plasebo dilakukan sekali dalam sehari selama 15 hari berturut-turut.

2. Pemberian simvastatin

Pemberian simvastatin dilakukan sekali dalam sehari selama 15

hari berturut-turut. Pemberian dilakukan peroral dengan bantuan sonde

lambung dengan dosis 0,18 mg/200grBB/hari. Sediaan simvastatin yang

digunakan adalah tablet 10 mg produksi OGB dexa.

3. Kadar LDL serum

Kadar LDL serum diukur sebanyak tiga kali, yaitu :

1. Setelah masa adaptasi (LDL hari ke-0)

2. Setelah pemberian pakan tinggi lemak 10% (LDL hari ke-8)

3. Setelah pemberian ekstrak daun salam (Eugenia polyantha) dan

simvastatin (LDL hari ke-22)

34

Tikus dipuasakan dari pakannya selama 8-12 jam pada malam hari

sejak pukul 22.00 WIB. Sampel darah diambil dari vena orbita tikus

dengan menggunakan pipet kapiler sebanyak 3 cc pada pagi hari sekitar

pukul 08.00-09.00 WIB. Sampel darah ini kemudian akan diperiksa oleh

tenaga ahli laboratorium di Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta.

Pengukuran kadar kolesterol LDL menggunakan metode

precipitation reagent for in vitro determination of LDL Cholesterol with

the CHOD-PAP method by photometric system.

Cara pemeriksaan LDL serum di laboratorium :

Tahap presipitasi:

a. Tabung presipitasi diisi dengan 100 µl plasma dan 1000 µl reagen

presipitasi, kemudian diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 ºC.

b. Setelah inkubasi 10 menit pada 37ºC, kemudian disentrifugasi

selama 10 menit pada kecepatan 4000 rpm, supernatan diambil 0,1

ml untuk determinasi.

Tahap determinasi:

c. Disiapkan tabung standard dan sampel, diberi label yang sesuai,

kemudian diisi dengan 100 µl supernatan untuk sampel; dan 100 µl

standard kolesterol untuk standard dan ditambahkan 1000 µl reagen

kolesterol kepada setiap tabung. Diinkubasi selama 10 menit pada

suhu 20-25ºC.

d. Setelah inkubasi 10 menit pada suhu 20-25ºC kemudian dilakukan

pembacaan absorbansi pada panjang gelombang 546 nm

35

menggunkan spektrofotometer dengan blangko sebagai acuan.

Kemudian dilakukan penghitungan hasil dengan rumus:

Kadar LDL serum = {(Absorbansi sampel–Absorbansi blangko) /

(Absorbansi standard–Absorbansi blangko)} x konsentrasi standard

Konsentrasi standard = 200 mg/dl

G. Tata Urutan Kerja

1. Tahap persiapan

a. Hewan coba ditimbang berat badannya dan dipilih 32 ekor hewan

coba. Hewan coba yang terpilih dikelompokan secara acak menjadi

empat kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 8 ekor

hewan coba dan diberi nomor urut 1-8 dan tanda cat pada tubuhnya.

Masing-masing hewan coba ditempatkan pada kandang yang

berbeda.

b. Melakukan observasi selama tiga hari untuk melihat proses adaptasi

dari hewan coba tersebut sebelum penelitian.

c. Setelah proses adaptasi hewan coba selama tiga hari, diambil sampel

darah dari vena orbital tanpa dekapitasi dari delapan ekor tikus per

kelompok, kemudian dilakukan pemeriksaan kadar LDL serum oleh

tenaga ahli laboratorium di Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta.

2. Tahap perlakuan

a. Induksi Hiperlipidemia

36

Kelompok II, III dan IV dibuat hiperlipidemia dengan diberikan

pakan standar AD II ditambah pakan tinggi lemak 10%. Pakan

tinggi lemak yang diberikan berasal dari lemak babi sediaan cair.

Pakan tinggi lemak dibuat dengan mencampurkan lemak sebanyak

10% dari total pakan yang diberikan perhari pada masing-masing

tikus. Perbandingan komposisi pakan standar AD II dan lemak yang

akan dicampurkan adalah 9:1. Pakan tinggi lemak 10% diberikan

secara ad libitum selama 7 hari.

d. Pada hari ke 8 penelitian, diambil sampel darah dari vena orbital

tanpa dekapitasi dari delapan ekor tikus per kelompok, kemudian

dilakukan pemeriksaan kadar LDL serum oleh tenaga ahli

laboratorium di Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta.

b. Setelah dilakukan induksi hiperlipidemia dengan pemberian pakan

tinggi lemak 10% selama 7 hari, kemudian masing-masing kelompok

mendapatkan perlakuan sebagai berikut:

1. Kelompok I, kelompok kontrol negatif. Tikus putih sehat tanpa

perlakuan pemberian pakan tinggi lemak 10%, tanpa pemberian

simvastatin dan ekstrak daun salam, diberikan aquadestilata 2

ml/hari sebagai plasebo, peroral dengan sonde lambung selama

15 hari sejak hari ke-8 penelitian

2. Kelompok II, kelompok kontrol positif. Tikus putih yang diberi

induksi hiperlipidemia berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7

hari, tanpa pemberian simvastatin dan ekstrak daun salam,

37

diberikan aquadestilata 2 ml/hari sebagai plasebo, peroral dengan

sonde lambung selama 15 hari sejak hari ke-8 penelitian

3. Kelompok III, kelompok tikus putih yang diberi induksi

hiperlipidemia berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7 hari,

kemudian diberikan simvastatin secara peroral dosis 0,18

mg/200grBB/hari yang dilarutkan dalam aquadestilata 2 ml

menggunakan sonde lambung selama 15 hari berturut-turut mulai

dari hari ke-8 penelitian

4. Kelompok IV, kelompok tikus putih yang diberi induksi

hiperlipidemia berupa pakan tinggi lemak 10% selama 7 hari,

kemudian diberikan ekstrak daun salam (Eugenia polyantha)

peroral dosis 0,72 gr/200grBB/hari yang dilarutkan dalam

aquadestilata 2 ml menggunakan sonde lambung selama 15 hari

berturut-turut mulai dari hari ke-8 penelitian

e. Setelah diberikan perlakuan kepada masing-masing kelompok

selama 15 hari berturut-turut sejak hari ke -8 penelitian, pada hari

ke-22 penelitian diambil sampel darah dari vena orbital tanpa

dekapitasi dari delapan ekor tikus per kelompok, kemudian

dilakukan pemeriksaan kadar LDL serum oleh tenaga ahli

laboratorium di Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas Gadjah

Mada, Yogyakarta.

3. Tahap dokumentasi data

Hasil penghitungan kadar LDL serum didokumentasikan.

38

Gambar 3.1 Skema Tata Urutan Kerja

Keterangan :

1. K(-) : Kelompok Kontrol Negatif (-)

2. K(+) : Kelompok Kontrol Positif (+)

32 Ekor Tikus Wistar Jantan

Aklimatisasi selama 3 hari

Pakan standar AD II + Pakan tinggi lemak 10%

Penimbangan dan pengelompokan secara acak

Kelompok III8 ekor

Kelompok II K(+)

Aquadestilata

Pakan Standar AD II ad libitum

Kelompok I8 ekor

Kelompok IV8 ekor

Kelompok II8 ekor

Kelompok IIISonde Simvastatin

0,18 mg/200grBB/hari

Kelompok IK(-)

Aquadestilata

Kelompok IVSonde ekstrak daun

salam 0,72 gr/200grBB/hari

LDL I

LDL II

LDL III

!7 hari

!15 hari

Pakan standar AD II

39

3. LDL I : Kadar LDL serum yang diukur setelah masa adaptasi

(LDL hari ke-0)

4. LDL II : Kadar LDL serum yang diukur setelah pemmberian pakan

tinggi lemak (LDL hari ke-8)

5. LDL III : Kadar LDL serum yang diukur Setelah pemberian ekstrak

daun salam segar dan simvastatin (LDL hari ke-22)

H. Analisis Data

Pengolahan dan analisis data akan dilakukan dengan bantuan program

komputer (SPSS) versi 17. Analisis univariat dilakukan untuk memperoleh

distribusi variabel yang diukur. Analisis univariat ditampilkan dalam tabel

yang mencantumkan rerata dan standar deviasi. Analisis bivariat dilakukan

untuk mengetahui beda antara kelompok perlakuan dan kontrol dari variabel

yang diukur. Uji normalitas data dilakukan dengan uji Saphiro-Wilk karena

sampel kurang dari sama dengan 50 (Dahlan, 2008).

Jika data terdistribusi normal, maka analisis bivariat yang akan

digunakan adalah ANOVA (Analysis of Variance) 1 jalan dengan taraf

kepercayaan 95% (α = 0,05) untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan

bermakna kadar LDL serum antar kelompok perlakuan, kemudian

dilanjutkan analisis posthoc Tukey HSD untuk mengetahui letak kelompok

yang memiliki perbedaan yang paling signifikan. Jika data tidak terdistribusi

normal, maka akan dilakukan analisis bivariat dengan uji non parametrik

Kruskall-Wallis yang dilanjutkan dengan analisis Man Whitney (Dahlan,

2008).

40

I. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dan pengambilan data sampel akan dilakukan selama 2 bulan

yaitu pada bulan Februari – Maret 2012. Penelitian dilakukan di

Laboratorium Gizi, Pusat Studi Pangan dan Gizi, Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta.

J. Jadwal Penelitian

Tabel 3.2.Jadwal Penelitian

No Rencana KegiatanWaktu (Bulan)

Februari Maret

1 Persiapan Proposal Penelitian V

2 Seminar Proposal Penelitian

3 Pelaksanaan Penelitian V

4 Pengolahan dan Analisis Hasil Penelitian

5 Penyusunan Laporan Akhir Penelitian

6 Seminar Hasil Penelitian