VALIDASI METODE BIOANALITIK

8.1 Perkenalan

8.1.1 Definisi

Validasi Metode Bioanalitik merupakan prosedur kerja untuk mendemonstrasi bahwa

metode analisis yang digunakan untuk analisis kuantitatif dari analit pada matriks biologi dapat

dipercaya dan reproducible sehingga dapat mencapai tujuan; kuantitas dari analit dengan derajat

akurasi dan presisi yang tinggi. Metode kuantitatif yang digunakan termasuk metode kurva

standar dari standar internal. Konsentrasi analit dapat dilihat dari respon sampel yang disebut

standar kalibrasi. Blangko digunakan untuk mengetahui ada tidaknya interferen dalam matriks.

Akurasi dan presisi dari metode dapat dikalkulasi dengan mengkalkulasikan sampel yang telah

diketahui konsentrasinya atau disebut Quality Control samples (QCs).

Hal – hal tersebut di atas penting untuk jaminan kepercayaan dari selektifitas dan

sensitifitas metode bioanalitik sebelum digunakan untuk evaluasi kuantitatif dari obat dan

metabolismenya. Data yang dihasilkan dari metode ini harus reproducible dan terpercaya karena

digunakan untuk evaluasi dan interpretasi dari bioavailibilitas, bioequivalen, farmakokinetik dan

pre-clinical findings. Validasi yang dapat digunakan untuk metode bioanalitik dapat

menggunakan teknik analisis seperti: GC (Gas Chromatography); HPLC (High-Pressure Liquid

Chromatography); teknik mass spectrometric seperti: LC-MS, LC-MS/MS, GC-MS dan GC-

MS/MS; atau immunological dan prosedur mikrobiologi seperti radioimmunoassay (RIA) dan

enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) untuk pemisahan kuantitatif obat dan/atau

metabolit dalam matriks biologi seperti sampel darah, serum, plasma, urin, feses, saliva, septum

(dahak), CSF (cerebrospinal fluid), jaringan-jaringan dan kulit.

Meskipun terdapat banyak prosedur dalam validasi bioanalitik, proses pengujian yang

spesifik dikembangkan, divalidasi, dan digunakan dalam analisis sampel rutin dapat dibagi

dalam 4 tahap utama:

- Preparasi standar referensi (larutan stok, pelarut, spiked calibrators, dan QCs.

- Pengembangan metode bioanalitik dimana prosedur pengujian ditetapkan.

- Validasi metode bioanalitik dan definisi kriteria penerimaan untuk analisis.

- Aplikasi metode validasi untuk sampel rutin.

Parameter dasar dalam validasi bioanalitik termasuk akurasi, presisi, selektifitas, sensitifitas,

reproducible, stabilitas obat dalam matriks pada kondisi penyimpanan, range, recovery dan

fungsi respon. Bagaimanapun, pengujian memiliki karakteristik unik yang harus

dipertimbangkan dalam validasi metode seperti selektifitas dan hasil kuantifikasi.

8.1.2 Pedoman Peraturan Mengenai Validasi Metode Bioanalitik

Sejak tahun 1990 dalam Washington Conference dalam validasi metode analisis seperti:

bioavailabilitas, bioequivalen, studi farmakokinetik, merupakan parameter yang harus digunakan

untuk menggambarkan validasi metode. Hasil akhir dari konferensi ini adalah pertimbangan

dokumen yang paling komferhensif dalam validasi pada metode bioanalitik. Banyak perusahaan

farmasi yang berkontribusi didalamnya.

Bagaimanpun, pada akhir decade sudah ada kemajuan dalam teknik yang digunakan

untuk preparasi sampel dan analisis. Contohnya, medan massa spektrometri, alat penghubung

baru, ionisasi, dan teknik deteksi telah berkembang.

Sesuai dengan pedoman FDA, dapat dianggap sebagai persyaratan minimum untuk

menguji kinerja dari metode bioanalytical. Karena proses validasi harus mensimulasikan analisis

sampel, dimana pada tes akhir metode yang sudah 'divalidasi' akan selalu menjadi analisis

sampel itu sendiri. Ada kemungkinan bahkan jika semua kriteria validasi terpenuhi, metode

bioanalytical mungkin tidak dapat dipercaya untuk analisis sampel yang sebenarnya. situasi yang

tidak diinginkan ini bisa terjadi ketika sampel yang sebenarnya (sampel in vivo) mengandung

interferen baru tidak hadir dalam sampel (sampel in vitro) karena proses metabolisme dan/atau

biotransformations lainnya. Untuk alasan ini, laboratorium bioanalytical bisa memutuskan untuk

menggunakan kriteria dan prosedur yang lebih ketat dan/atau menggunakan sampel yang

sebenarnya selama pengembangan metode untuk lebih menjamin validitas metode divalidasi.

Maka kami merangkum rekomendasi umum saat praktek validasi metode bioanalitis

sesuai dengan pedoman FDA, dengan pendekatan alternatif lain yang akan dibahas kemudian.

8.2 PRAKTEK VALIDASI YANG BERLAKU

Prosedur validasi untuk metode bioanalitik dalam evolusi yang berkelanjutan sejak

metode bioanalitik terus mengalami perubahan perbaikan, dan dalam banyak kasus teknologi

canggih.

8.2.1 Definisi

Sebagai langkah awal, penting untuk memiliki jelas dalam definisi pikiran istilah analisis

yang digunakan antara lain :

Akurasi : tingkat keeratan nilai terdekat untuk nilai sebenarnya nominal atau dikenal

dengan kondisi yang ditentukan. Ini kadang-kadang disebut trueness.

Analit : suatu bagian kimia tertentu yang diukur, yang bisa menjadi obat utuh,

biomolekul, atau turunannya, metabolit, dan / atau produk degradasi dalam matriks

biologi.

Analitik (atau batch) : satu set lengkap sampel analitis dan studi dengan jumlah yang

sesuai standar dan QCs untuk validasi mereka. Beberapa berjalan (atau batch) dapat

diselesaikan dalam satu hari, atau satu run (atau batch) dapat memakan waktu beberapa

hari untuk menyelesaikan.

Matriks biologi : bahan diskrit asal biologis yang dapat dicicipi dan diproses dengan cara

yang direproduksi. Contohnya adalah darah, serum, plasma, urin, feses, air liur, dahak,

dan berbagai jaringan diskrit.

Larutan stok : Larutan yang disiapkan langsung oleh berat standar referensi analit dan

melarutkannya dalam pelarut yang sesuai. Biasanya, larutan stok yang disiapkan pada

konsentrasi 1 mg / mL dalam metanol dan terus didinginkan di -20◦C jika tidak ada

masalah stabilitas atau kelarutan.

Standar kalibrasi : matriks biologis yang jumlah dikenal analit telah ditambahkan atau

berduri. Standar kalibrasi yang digunakan untuk membangun kurva kalibrasi dari mana

konsentrasi analit dalam QCs dan dalam sampel penelitian diketahui ditentukan.

Standar internal : Uji senyawa (s) (misalnya, struktural analog yang sama, senyawa

berlabel stabil) ditambahkan ke kedua standar kalibrasi dan sampel pada konsentrasi yang

diketahui dan konstan untuk memfasilitasi kuantifikasi analit target (s).

Batas deteksi (LOD) : konsentrasi terendah suatu analit bahwa prosedur bioanalitis

dipercaya bisa membedakan dari latar belakang noise.

Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) : jumlah terendah dari analit sampel yang dapat

ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi cocok.

Efek Matrix : perubahan langsung atau tidak langsung atau gangguan dalam menanggapi

karena adanya analit yang tidak diinginkan (untuk analisis) atau zat mengganggu lainnya

dalam sampel.

Metode : deskripsi komprehensif dari semua prosedur yang digunakan dalam analisis

sampel.

Presisi : kedekatan perjanjian (derajat scatter) antara serangkaian pengukuran yang

diperoleh dari beberapa sampel dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang

ditentukan.

Olahan sampel : ekstrak akhir (sebelum analisis instrumental) dari sampel yang telah

mengalami berbagai manipulasi (misalnya, ekstraksi, pengenceran, konsentrasi).

Kisaran Kuantifikasi : kisaran konsentrasi, termasuk ULOQ dan LLOQ, yang dapat

diukur dengan andal dan reprodusibel dengan akurasi dan presisi melalui penggunaan

hubungan konsentrasi-respon.

Recovery : efisiensi ekstraksi dari proses analisis, dilaporkan sebagai persentase dari

jumlah dikenal dari suatu analit dilakukan melalui langkah-langkah ekstraksi sampel dan

pengolahan metode.

Reprodusibel : ketepatan antara dua laboratorium. Ini juga merupakan ketepatan metode

di bawah kondisi operasi yang sama selama periode waktu yang singkat.

Sampel : istilah umum meliputi kontrol, kosong, tidak diketahui, dan sampel diproses,

seperti yang dijelaskan di bawah ini:

o Kosong : sampel matriks biologi yang ada analit telah ditambahkan yang digunakan

untuk menilai spesifisitas metode bioanalisis.

o Sampel kontrol kualitas (QC) : Contoh yang digunakan untuk memantau kinerja

metode bioanalitis dan untuk menilai integritas dan validitas hasil sampel yang tidak

diketahui dianalisis dalam batch individu.

o Diketahui : sampel biologis yang merupakan subjek dari analisis.

Selektivitas : kemampuan metode bioanalitis untuk mengukur dan membedakan analit

dengan adanya komponen yang dapat diharapkan untuk ada. Ini dapat mencakup

metabolit, kotoran, degradants, atau komponen matriks.

Stabilitas : stabilitas kimia dari suatu analit dalam matriks yang diberikan dalam kondisi

tertentu untuk interval waktu tertentu.

Kurva standar : hubungan antara nilai respon eksperimental dan konsentrasi analitis (juga

disebut kurva kalibrasi).

Kesesuaian sistem : penentuan kinerja instrumen (misalnya, sensitivitas dan retensi

kromatografi) dengan analisis dari standar acuan sebelum menjalankan batch analitis.

Batas atas kuantifikasi (ULOQ) : jumlah tertinggi analit dalam sampel yang dapat

ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi.

Validasi

o Validasi penuh : pembentukan semua parameter validasi untuk menerapkan analisis

sampel untuk metode bioanalisis untuk setiap analit.

o Validasi parsial : modifikasi divalidasi metode bioanalitik yang belum tentu panggilan

untuk revalidasi penuh.

o Cross-validasi : perbandingan parameter validasi dari dua metode bioanalitik.

o Larutan bekerja : Larutan disiapkan dari larutan stok melalui pengenceran dalam

pelarut yang sesuai pada konsentrasi diminta untuk spiking matriks biologi.

8.2.2 Selektivitas

Untuk selektivitas, analisis sampel kosong dari matriks yang sesuai biologis (plasma,

urin, atau matriks lainnya) harus diperoleh dari sedikitnya enam sumber.

Potensi zat campur dalam matriks biologi mencakup komponen matriks endogen,

metabolit, produk dekomposisi, dan dalam studi yang sebenarnya, obat bersamaan. Metode

selektivitas harus dievaluasi selama pengembangan metode dan metode validasi serta dapat terus

selama analisis sampel penelitian yang sebenarnya.

Berikut rekomendasi untuk menangani dua isu selektivitas harus dipertimbangkan:

1. Gangguan spesifik dari sifat fisika-kimia zat yang mirip dengan analit:

a. Reaktivitas silang metabolit, obat bersamaan, atau senyawa endogen harus dievaluasi

secara individu dan dalam kombinasi dengan analit kepentingan.

b. Bila mungkin, immunoassay harus dibandingkan dengan metode referensi divalidasi

(seperti LC-MS) menggunakan sampel dikeluarkan dan kriteria yang telah ditentukan

untuk persetujuan akurasi immunoassay dan metode referensi.

c. The linearitas pengenceran dengan standar referensi harus dinilai dengan menggunakan

studi (dikeluarkan) sampel.

d. Selektivitas dapat ditingkatkan untuk beberapa analit dengan penggabungan langkah

pemisahan sebelum immunoassay.

2. Nonspesifik efek matriks:

a. Kurva standar dalam cairan biologis harus dibandingkan dengan standar dalam buffer

untuk mendeteksi efek matriks.

b. Paralelisme sampel penelitian diencerkan harus dievaluasi dengan standar diencerkan

untuk mendeteksi efek matriks.

c. Spesifik mengikat harus ditentukan.

8.2.3 Standar Referensi

Kemurnian standar referensi yang digunakan untuk menyiapkan sampel yang di spike dapat

memengaruhi data studi. Untuk alasan ini, sebuah standar referensi analitis harus diketahui

identitas dan kemurniannya untuk dapat digunakan dalam penyiapan larutan yang sudah

diketahui konsentrasinya. Ada 3 tipe standar referensi umum yang digunakan :

1. Standar referensi tersertifikasi ( USP compendial standards)

2. Standar referensi yang tersedia secara komersial yang diperoleh dari sumber komersial

bereputasi

3. Bahan lainnya dengan kemurnian yang terdokumentasi,disintesis oleh laboratorium

analitis atau buatan nonkomersial lainnya.

Tiap standar referensi harus dilengkapi dengan sumber dan jumlah, tanggal kadaluarsa, sertfikat

analisis, dan/atau bukti identitas dan kemurnian.

8.2.4 Kurva Standar

Kurva kalibrasi harus dihasilkan dari tiap analit dalam sampel. Jumlah standar yang digunakan

harus cukup menegaskan hubungan antara konsentrasi dan respon. Kurva kalibrasi harus

disiapkan dalam matriks biologis yang sama seperti sampel dalam studi dengan mengadisi

(spike) matriks dengan analit yang konsentrasinya sudah diketahui. Jumlah standar akan menjadi

fungsi range yang diantisipasi pada nilai analitis dan hubungan analit-respon (sensitivitas

detektor dan range linier detektor). Konsentrasi standar dipilih berdasarkan range konsentrasi

yang diharapkan pada studi tertentu. Kurva kalibrasi harus mengandung sampel blanko (matriks

sampel di proses tanpa standar internal), zero matriks sampel yang diproses dengan standar

internal, dan enam sampai delapan nonzero sampel dengan range yang diharapkan, termasuk

LLOQ.

Lower Limit of Quantification. Standar terendah pada kurva kalibrasi yang diterima sebagai

batas kuantifikasi jika ditemui kondisi berikut :

1. Respon analit pada LLOQ harus setidaknya lima kali respon blanko.

2. Puncak analit (respon) haris dapat diidentifikasi, memiliki ciri khas, dan reprodusibel, dengan

presisi CV kurang dari 20% dan akurasi 80-120%.

Hubungan Konsentrasi-Respon

Kondisi berikut dapat ditemui dalam mengembangkan kurva kalibrasi :

1. Deviasi LLOQ kurang dari 20% dari nominal konsentrasi.

2. Deviasi 15% dari standar selain LLOQ dari nominal konsentrasi.

Setidaknya pada 4-6 nonzero standar harus ditemukan kriteria di atas, termasuk LLOQ dan

standar kalibrasi pada konsentrasi tertinggi. Dalam penambahan, kecuali standar yang tidak

ditemukan kriteria di atas tidak boleh mengubah model respon konsentrasi yang digunakan.

Microbiological and Immunoassay. Kurva standar microbiologi dan immunoassay nonlinear,

dan umumnya, lebih banyak titik konsentrasi mungkin di rekomendasikan untuk menetapkan

range kurva standar daripada pengujian kadar senyawa kimia. Terkait karakteristik nonlinear,

hubungan respon-kesalahan untuk kurva standar immunoassay merupakan fungsi varibel dari

respon (heteroscedisticity).

Untuk alasan ini, sebuah jumlah paling kecil dari 6 nonzero konsentrasi kalibrator di

rekomendasikan untuk diduplikasi. Penggunaan titik penjangkaran yang sejajar dengan

konsentrasi tinggi dan rendah yang mengakhiri kurva standar dapat memberikan peningkatan

pada kurva secara keseluruhan. Umumnya, titik penjangkaran ini akan ada pada konsentrasi

dibawah LLOQ dan di atas ULOQ. Sampel replikasi harus diukur selama validasi untuk

meningkatkan akurasi, prosedur sama harus diikuti untuk sampel yang tidak diketahui.

8.2.5 Precision and Accuracy

Akurasi ditetapkan mereplikasi analisis sampel yang mengandung jumlah analit yang diketahui.

Akurasi diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Nilai rata-rata harus

kurang dari 15% dari nilai sebenarnya kecuali pada LLOQ, dimana itu tidak boleh menyimpang

lebih dari 20%. Deviasi pada rata-rata dari nilai sebenarnya dijadikan sebagai akurasi.

Presisi harus diukur menggunakan minimal lima kali penetapan per konsentrasi. Presisi

ditetapkan pada tiap level konsentrasi tidak melebihi 15% dari CV kecuali untuk LLOQ, dimana

itu tidak melebihi 20% dari CV

Presisi dibagi menjadi :

Presisi intrabatch atau repeatability, dimana menilai presisi selama analisis tunggal

berlangsung

Presisi interbatch atau presisi intermediate, dimana penilaian presisi dengan waktu dan

melibatkan analisis, peralatan, reagen, dan laboratorium yang berbeda

Pada nilai terendah, tiga konsentrasi yang mewakili keseluruhan range dari kurva standar harus

dipelajari : satu dalam tiga kali LLOQ (sampel QC rendah), satu dekat pusat (pertengahan QC)

dan satu dekat batas teratas dari kurva standar (QC tinggi). Perhitungan akurasi dan presisi, tidak

termasuk nilai-nilai yang secara statistik ditetapkan sebagai penyimpangan, dapat juga di

laporkan pada data validasi metode.

8.2.6 Pengenceran

Kemampuan untuk mengencerkan sampel asli di atas batas tertinggi pada kurva standar harus di

demonstrasikan dengan parameter akurasi dan presisi pada validasi.

8.2.7 Recovery

Recovery dari analit tidak perlu 100%, tapi tingkat recovery analit dan dari standar internal harus

konsisten, presisi, dan reprodusibel. Recovery percobaan harus dilakukan dengan

membandingkan hasil analisis untuk sampel yang diekstraksi pada 3 konsentrasi (rendah, sedang,

tinggi) dengan standar yang tidak diekstraksi mewakili recovery 100%.

Untuk Microbiological dan immunoassay, jika pemisahan dilakukan sampai pengujian kadar

dalam studi sampel tapi tidak untuk standar, penting untuk menetapkan recovery dan

menggunakannya dalam menentukan hasil. Pendekatan yang dapat dilakukan untuk menilai

efisiensi dan reprodusibilitas dari recovery :

Penggunaan trace analit (jumlah terlalu sedikit untuk berpengaruh pada pengujian kadar)

Peningkatan dalam penentuan recovery yang reprodusibel

Penggunaan standar internal yang tidak dikenali oleh antibodi tapi dapat ditentukan

dengan teknik lainnya

8.2.8 Stabilitas

Stabilitas dari analit yang ada dalam matrix dan sistem tidak boleh diektrapolasi ke dalam

matrix dan sistem lainnya. Prosedur untuk menentukan stabilitas harus dapat mengevaluasi

stabilitas dari analit selama pengumpulan sampel dan handling sampel setelah mengalami

beberapa perlakuan.

Kondisi yang digunakan adalah kondisi yang menggambarkan keadaan yang sama seperti

keadaan sampel yang sebenarnya di dalam proses handling dan analisis. Prosedur uji stabilitas

harus dilakukan juga untuk evaluasi dari stabilitas larutan stok dan sampel yang digunakan

disiapkan dari larutan stok yang dibuat.

Ada beberapa macam uji stabilitas, yaitu :

a. Freeze and Thaw Stability

Stabilitas analit dapat diketahui jika sudah dilakukan siklus 3 kali. Setiap bagian dengan

konsentrasi berbeda disimpan di suhu penyimpanan selama 24 jam dan dilelehkan di

temperatur ruangan, setelah leleh dibekukan kembali 12 sampai 24 jam dalam kondisi

yang sama dan diulangi sampai 3 siklus

b. Short-Term Temperature Stability

3 bagian dengan berbagai konsentrasi rendah dan tinggi dilelehkan dalam suhu ruangan

dan suhu dijaga selama 4 sampai 24 jam kemudian dilakukan analisis.

c. Long term stability

waktu penyimpanan untuk evaluasi stabilitas jangka panjang harus melewati waktu antara

tanggal pertama kali pengumpulan sampel dan tanggal terakhir kali sampel dianalisis.

Stabilitas jangka panjang dapat ditentukan dengan menyimpan setidaknya tiga bagian

dari setiap konsentrasi rendah dan tinggi pada kondisi yang sama dan dilihat

konsentrasinya dari awal pengujian hingga hari terakhir.

d. Stock Solution Stability

Stabilitas larutan stok dari suatu obat atau standar internal harus dievaluasi pada suhu

ruangan sedikitnya 6 jam. Kalau stok pernah dibekukan maka stabilitas harus dicatat dan

setelah waktu penyimpanan, stabilitasnya harus dites dengan membandingkan dengan

larutan yang baru

e. Postpreparative Stability

Stabilitas sampel harus dideterminasi dan reprodusibilitas dari penginjekan ulang harus

dievaluasi sehingga jika terjadi kesalahan dalam instrumen dapat dianalisis ulang.

8.2.9 Verifikasi tambahan

Ada berbagai macam verifikasi tambahan:

a. Full Validation

Hal ini penting dilakukan ketika mengembangkan dan menerapkan metode baru maupun

menggunakan zat uji yang baru.

b. Partial Validation.

Partial Validation ini dapat menjangkau penentuan nilai akurasi dan presisi yang kecil dan

dilakukan untuk modifikasi dari metode yang sudah divalidasi. Partial validation dapat

meliputi:

Metode bioanalytical transfer antara laboratorium atau analis

Perubahan metode analisis

Perubahan matriks pada spesies yang sama

Perubahan spesies dengan matriks yang sama

Perubahan pada prosedur pengolahan sampel

Perubahan instrument

Keterbatasan volume sampel

Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya senyawa lain secara bersamaan

Selektivitas untuk memisahkan analit dengan adanya metabolit yang spesifik

c. Cross-Validation

Merupakan perbandingan ketika dua atau lebih metode bioanalytical digunakan untuk

mengolah data dengan studi yang sama atau antar studi yang berbeda. Contohnya metode

yang sudah divalidasi dijadikan referensi dan metode lain dijadikan pembandingnya.

8.2.10 Dokumentasi

Detail dari metode bioanalytical harus ditulis. Tulisan ini bisa dijadikan lembar protokol,

lembar perencanaan pembelajaran, laporan, dan/atau SOP

8.3 MASALAH DAN SOLUSI

8.3.1 Definisi (Perbandingan definisi dari berbagai sumber)

Lower Limit of Quantification (LLOQ)

2000 Conference: Jumlah terendah dari analit didalam sample yang dapat ditentukan secara

kuantitatif dengan presisi dan akurasi. Ini berhubungan dengan definisi dari sensitivity suatu

metode dimana konsentrasi terendah standar memiliki koefisien variasi (CV) ≤20%.

1990 Conference: Konsentrasi terendah dari analit yang dapat diukur dengan tingkat

kepercayaan.

IUPAC: Konsentrasi yang memberikan signal 10 kalli dari standar deviasi blanko.

Upper Limit of Quantification

2000 Conference:Jumlah teritinggi dari analit dalam sample yang dapat ditentukan secara

kuantitatif dengan presisi dan akurasi.

Accuracy

2000 Confernece: Derajat kedekatan untuk mengetahui nilai sebenaranya dibawah suatu kondisi.

Uraian:

dapat dinyatakan sebagai persen relative error (&RE)

RE bisa positif, negatif atau nol

%RE = [(nilai sebenarnya/nilai teoritis) – 1] x 100

konsentrasi yang diukur dari sampel yang diketahui dibandingkan dengan konsentrasi

teoritis, kisaran konsentrasi yang tepat dianggap sebagai indikasi akurasi

intraassay accuracy: RE dari mean replikasi analisis dari validasi sample selama validasi

satu batch.

Interassay accuracy: RE dari mean replikasi analisis dari validasi sample selama validasi

semua batch.

1990 Conference: kedekatan nilai untuk mengetahui nilai sebenarnya. umumnya, recovery dari

penambahan analit untuk kisaran konsentrasi yang tepat dari sebagai indikasi akurasi.

ISO: Pernyataan kedekatan antara hasil tes dengan nilai referensi yang diterima.

8.3.2. Selektivitas / spesifisitas

Selektivitas merupakan suatu kemampuan pengukuran dari metode bioanalytical dan

membedakan kehadiran dari analit di komponen tersebut, sedangkan spesifisitas adalah

kemampuan untuk mengukur dengan tepat kehadiran analit yang diharapkan pada komponen

tersebut. Pada umumnya, metode analitis sudah selektif, hanya dibeberapa kasus juga sudah

spesifik (misalnya LC-MS/MS sebuah metode bioanalytical termasuk metode dengan

selektivitas yang tinggi tapi tidak selalu spesifik dikarenakan adanya kemungkinan untuk

munculnya matriks kompleks biologis sebagai pengganggu dengan waktu retensi, berat molekul,

dan struktur utama yang sama dengan analit).

Selektivitas (spesifisitas) dari metode ini untuk memverifikasi bahwa:

Respon dari puncak pengganggu pada waktu retensi analit kurang dari 20% dari respon

LLOQ standar, atau respon pada konsentrasi LLOQ lima kali lebih besar dari

pengganggu yang ada di blangko pada waktu retensi analit.

Respon dari puncak pengganggu pada waktu retensi internal standar ≤ 5% dari respon

konsentrasi standar internal yang dipakai.

8.3.3. Standar Referensi

Standar referensi digunakan sebagai standar utama dalam determinasi dengan karakteristik yang

sudah terdokumentasi yang meliputi (1) kemurnian tertinggi yang bisa didapat, (2) karakteristik

diantaranya identitas, kekuatan atau potensi, dan kemurnian yang sudah ditetapkan, (3) bentuk

yang paling stabil, dan (4) penyimpanannya ditempat dan kondisi yang sesuai. Informasi tersebut

harus terdapat pada certificate of analysis (CoA), test article characterization (TAC), dan

reference standard profile.

8.3.4. Kurva Standar

Ketika kurva standar telah ditetapkan dan nilai dari LLOD dan ULOQ telah

tervalidasi, maka analisis dari konsentrasi yang tidak diketahui dengan ekstrapolasi tidak

boleh melebihi range dari validasi. Akurasi dan presisi yang paling baik diperkirakan

dengan konsentrasi yang berada pada porsi kurva linier.

Untuk kriteria penerimaan, 2000 Washington conference guidelines tidak memakan

aturan r = 0.95 atau lebih, tetapi menggunakan kriteria 20/15 sebagai contoh akurasi dari

standar kalibrasi harus diantara 20/15. Model regresi harus ditetapkan selama

pengembangan metode berlangsung yaitu ketika mengaplikasikan standar kalibrasi dan

metode yang telah ditetapkan tidak boleh diganti selama proses validasi, atau bahkan

selama analisis sample.

Dalam model regresi, fungsi polynominal yang dipertimbangkan adalah y = b0 + b1x +

b2x2 + b3x3 + ...., untuk model linier kondisi x2 atau lebih dari itu diabaikan, sedangkan

untuk model kuadratik term lebih besar dari x2 tidak dipertimbangkan. Meskipun model

kuadratik diperbolehkan di beberapa laboratorium bioanalisis, namun penggunaan model

linier harus dilakukan atau dicoba terlebih dahulu. Hasil yang tidak linier tergantung pada :

a. Teknik injeksi

b. Kehilangan sample karena adanya kontak dengan peralatan kaca

c. Cross-talk di MS/MS

d. Adanya interferensi

e. Range konsentrasi yang terlalu besar

Pada tahun 2000, Washington conference guideline menyebutkan bahwa pemilihan

penimbangan harus dilakuakan dengan benar. Fungsi penimbangan yakni adalah untuk

mengurangi pengaruh hasil yang didapatkan untuk konsentrasi tinggi di slope dan

intercept. Berdasarkan pertimbangan statistik, fungsi penimbangan yang paling umum

digunakan untuk LC-MS dan LC-MS/MS-berbasis penetapan kadar harus 1/x, karena fakta

bahwa variansi di y meningkan di proporsi konsentrasi. Di HPLC-UV-berbasis penetapan

kadar, penggunaan 1/x2 dalam analisis regresi linear secara signifikan dapat mengurangi

nilai LLOQ yang didapatkan. Keuntungan dalam kasus ini untuk studi farmakologi dan

farrmakokinetik adalah ketika nilai konsentrasi yang diukur mendekati nilai LLOQ.

Penolakan Standar Kalibrasi Standar kalibrasi harus dieliminasi atau dihilangkan

dalam perhitungan jika : (a) Suatu masalah ditemukan dan di dokumentasi selama

pemrosesan sampel, (b) Suatu masalah kromatografi atau malfungsi sistem ditemukan dan

didokumentasikan.

Jika nilai % recovery > 20 % lebih tinggi atau lebih rendah dari pada nilai teoritis atau

>15 % lebih tinggi atau lebih rendah dari nilai teoritis untuk semua standar lainnya. Dua

pendekatan berbeda yang dapat diambil :

1. Pendekatan yang paling sederhana dan tepat, digunakan di banyak laboratorium, yakni

untuk mengeliminasi semua standar kalibrasi yang tidak termasuk kurang lebih 15%

nilai teorical, atau kurang lebih 20% teori untuk LLOQ.

2. Pendekatan yang kedua untuk mendefinisikan apakah standar kalibrasi berada diluar

atau masuk kedalam kriteria yang dapat diterima. Semua standar kalibrasi yang

diidentifikasi secara statistik dinyatakan ditolak karena diluar kriteria yang dapat

diterima, maka tidak dapat dimasukkan dalam kurva regresi.

Q-test digunakan untuk menemukan outlier (deviasi rata-rata). Jika Q observed > Q

teori artinya data tidak diterima. Q-test yang bagus lebih dari 5 dengan batas kepercayaan

teori 95%.

Pendekatan lain yakni menggunakan table distribusi T dengan probabilitas 95%. Jika

rasio relative error dan SD lebih dari nilai t95 pada derajat keadaan (nilai kalibrasi -1).

RE/SD lebih besar t95, tidak diterima. RE beda dengan % akurasi dan rata-rata. Deviasi rata-

rata ditolak saat keluar dari limit 95%.

8.3.5. Presisi dan Akurasi

Besar dari ketidakpastian dihubungkan dengan pengukuran yang seharusnya selalu

dievalusi hingga diperoleh hasil terbaik, yakni bebas kesalahan kurva standar dan bebas dari

kesalahan konsentrasi . Presisi dan akurasi penting untuk standar metode bioanalitical.

Sistematik error dan random error Hasil dari suatu analisis dapat dipengaruhi oleh

suatu kombinasi dari dua macam experimental error yakni sistematik error dan random

error. Sistematik error berhubungan dengan akurasi dari suatu metode analisis dan

merupakan perbedaan antara rata-rata nilai yang didapat dengan nilai sebenarnya.

Random error berhubungan dengan presisi dari metode analisa. Menurut definisi ICH,

presisi dibedakan menjadi tiga yakni :

a. Repeatibility didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent dengan

metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada laboratorium,

operator, dan peralatan yang sama serta interval waktu yang pendek).

b. Reproducibility didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent

dengan metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada laboratorium,

operator, dan peralatan yang berbeda, tidak harus interval waktu yang pendek).

c. Intermediet pressicion didefinisikan sebagai kedekatan hasil percobaan independent

dengan metode yang sama pada uji identifikasi material tertentu (pada satu

laboratorium, namun operator, peralatan dan waktu berbeda.

Analisis varians (ANOVA) dilakukan untuk mengetahui presisi intrabatch dan interatch

sebagai bagian dari proses validasi yang disarankan oleh 2000 Washington conference

guideline. Presisi intrabatch dilihat sama dengan repeatabilitas dan presisi interbatch dilihat

sama dengan intermediate presisi dan reprodusibilitas. Perhitungan interbacth dipengaruhi

oleh operator, instrument dan laboratorium. Umumnya dikarenakan banyak nya langkah

percobaan membuat nilai intrabacth kurang dari interbatch.

Penggolongan 2 jenis error ini dimaksudkan untuk mengetahui langkah mana yang

salah dalam analisis sehingga bisa diperbaiki. Presisis dapat ditingkatkan dengan

meningkatkan jumlah replikasi tetapi apabila metode sudah bias tidak berpengaruh.

Dibutuhkan investigasi metode untuk mengetahui biasnya. Sumber bias penting diketahui

dengan cara membandingkan dengan metode standar, kesetimbangan kalibrasi, kemurnian,

kalibrasi alat gelas, kalibrasi pipet dan analit bebas matrix. Kalibrasi yang tidak sempurna

dikarenakan kurangnya persiapan standar, adanya interaksi analit dan wadah. Pengatasannya

yaitu dengan menurunkan sampel QC dalam jumlah besar terpisah dari kalibrator dan

sampel dibuat pada sebelum analisis (fresh).

± 15/20% Kriteria. Konferensi Washington Tahun 1990 dan 2002 menggunakan %

kriteria ± 15/20 untuk akurasi dan presisi. Kesimpulan dari perhitungan menyatakan bahwa

kriteria : ± 15% mengharuskan bias dan presisi yang ≤8% pada 5 kali replikasi. Ketika bias

menjadi lebih besar, presisi harus ditingkatkan untuk memenuhi batas penerimaan dengan

probabilitas yang cukup, dan sebaliknya. Ketika kedua presisi dan bias yang > 8% (n = 5),

ukuran sampel harus ditingkatkan (yaitu, lebih dari lima replikasi harus dianalisis sehingga

keputusan dapat dibuat untuk menerima atau menolak metode analisis). Konferensi

Washington Tahun 1990 dan 2002 mengharuskan presisi harus lebih baik dari 15/20% untuk

intra dan interbatch. Namun, dalam praktiknya penerimaan metode ketika presisi intrabatch

dekat 15/20% dapat menyebabkan metode gagal divalidasi lebih lanjut.

Syarat persetujuan

Dua pendekatan digunakan untuk mendefinisikan syarat persetujuan: (1) dengan mematuhi

standar deviasi data yang didapatkan ketika validasi dan (2) dengan referensi dengan syarat

eksternal yang ditentukan. Aspek dari pengujian yang dapat atau boleh diberikan di Syarat

persetujuan meliputi:

Akurasi

Presisi

Jumlah standar yang bisa menggagalkan syarat persetujuan

Jumlah QC yang dapat menggagalkan syarat persetujuan

Kontaminasi dari blangko dari asalnya

Variasi maksimal dalam intensitas standar internal

Persetujuan minimum intensitas standar internal

Jika golongan kurva belajar sampel

Bagaimana QC dapat didistribusikan dalam suatu batch

Perbedaan yang luas

Hasil dari kesesuaian system sampel

Standar Internal

Penggunaan standar internal sangat penting dalam metode bioanalytical untuk memperbaiki

presisi dan akurasi. Peran dari standar internal adalah untuk meniru kepentingan analit. Standar

internal harus ditambahkan sebelum preparasi sampel/ekstraksi sebagai pencegahan kehilangan

atau kesalahan yang terjadi selama proses. Semakin banyak langkah-langkah penanganan

sampel, maka semakin besar kesalahan terjadi. Pada kasus ini, penggunaan standar internal

adalah untuk meminimalisir kesalahan yang signifikan.

Standar internal yang benar harus memiliki sifat fisika dan kimia yang mirip dengan analit.

Dalam pengujian LC-MS dan LC-MS/MS, coelution standar internal merepresentasikan situasi

yang ideal. Maka dari itu, kedua struktur analog dan bentuk labeled isotop yang stabil dapat

digunakan. Standar internal labeled isotope yang stabil adalah pilihan yang ideal untuk pengujian

menggunakan mass spektrofotometer karena mereka menawarkan tingkat ketelitian yang tinggi.

Tetapi bagaimanapun juga, tidak semua bentuk labeled isotope yang stabil dari analit memiliki

sifat yang sama ketika digunakan sebagai standar internal. Sebenarnya, komponen analog dapat

berkelakuan lebih baik daripada standar internal labeled isotope yang salah.

Karena itu, labeled isotope stabil yang “sempurna” harus memenuhi persyaratan berikut ini:

1. Dia harus bisa bergabung dengan C,N, dan O daripada deuterium (H) sebagai pilihan

pertama untuk meminimalisis efek isotop dan kemungkinan untuk berubah. Atom

deuterium yang banyak dapat menghasilkan efek isotop yang signifikan.

2. Labeled isotope harus memiliki lebih dari dua atom labeled, untuk menghindari

kontribusi isotop ke dalam analit.

3. Labeled isotope harus memiliki kemurnian isotopic yang tinggi untuk mencegah

beberapa puncak berjarak hanya 1 amu karena bentuk labeled yang hanya sebagian.

4. Isotop yang tidak labeled harus dihilangkan karena dapat memengaruhi kuantifikasi analit

dan menghasilkan hasil yang bias.

5. Atom labeled harus tidak mengalami pertukaran pada tahap-tahap analisis manapun.

Kerugian dari standar internal labeled isotop yang stabil adalah harganya tidak murah dan

ketersediaannya terbatas. Standar internal labeled isotop sangat mahal karena mereka

membutuhkan sintesis yang dimodifikasi.

Sejumlah standar internal yang ditambahkan harus mendekati dengan jumlah analit yang terdapat

dalam sampel. Pada kenyataannya, kesalahan dapat diminimalisisr ketika respon relative untuk

analit dan standar internal adalah sebanding.

Seperti peraturan pada umumnya, dengan 6 ringkatan kurva kalibrasi, konsentrasi standar

internal harus berada diantara tingkatan kedua dan ketiga dari konsentrasi standar kalibrasi

tergantung dari respon alat relative untuk analit dan standar internal dan presisi pada saat level

LLOQ.

8.3.6 Pengenceran

Validasi dari pengenceran pada matriks biological dapat dibutuhkan ketika validasi

metode atau setelah validasi initial apabila konsentrasi sampel diharapkan lebih tinggi dari

ULOQ dan/atau apabila volume sampel untuk bebrapa sampel itu sedikit yang digunakan untuk

poengujian. Biasanya, pengenceran harus divalidasi menggunakan 5 replikasi dalam 3 batch

analisis yang berbeda. Sampel harus diencerkan dengan tipe matrix blanko yang sama yang

digunakan dalam validasi dan analisis sampel, memberikan hasil konsentrasi pada upper half dari

kisaran kurva standard. Akurasi dan Presisi untuk pengenceran harus kurang dari sama dengan

15%.

8.3.7 Recovery, Carryover dan Tes Kesesuaian Sistem

Recovery/ persen kesalahan. Persen kesalahan yang dihitung pada setiap langkah

preparasi sampel dan analisis adalah alat diagnosis yang kuat untuk memperbaiki metode apabila

diperlukan. Persen kesalahan sangat penting untuk memverifikasi apakah standar internal benar-

benar cocok dengan analit. Penemuan dari perbedaan yang signifikan dan perbedaan yang tidak

tetap dalam persen kesalahan antara analit dan standar internal pada langkah-langkah cleanup

sampel yang berbeda dan analisis dapat mengindikasikan kegagalan metode yang mungkin

terjadi ketika validasi.

Persen kesalahan dapat dibagi menjadi beberapat tipe dan dapat dihitung sendiri-sendiri:

- Persen kesalahan total

- Perbandingan dari tinggi puncak dan area dari standar sampel dengan ketinggian

atau puncak yang didapatkan ketika larutan standar diinjeksikan dengan

konsentrasi yang sama dengan sampel yang terkestraksi.

- Efisiensi Ekstraksi persen kesalahan dari analit yang berasal dari matrix biological

setelah sample pretreatment (co: LLE, SPE, pengendapan protein, dll) untuk menghilangkan

zat-zat endogen

- Perbandingan dari tinggi puncak atau area dari sampel standard yang terekstraksi

dengan tinggi puncak atau area yang didapatkan ketika blangko yang terekstraksi

di-spike dengan analit yang diinjeksikan dengan konsentrasi yang sama dengan

sampel terekstraksi.

- Efek Matrix (peningkatan atau penekanan) efek dari matrix biological dalam respon

instrument dengan analit

- Perbandingan dari tinggi puncak atau area dari blangko yang di-spike dengan

analit dengan tinggi puncak atau area yang didapatkan ketika larutan standar

disuntukkan dengan konsentrasi yang sama dengan sampel blangko yang di-spike

- Derivatisasi atau hasil reaksi (apabila ada). Derivatisasi digunakan ketika analit tidak

stabil atau tidak terlalu sensitive dalam bentuk struktur kimia aslinya untuk teknik yang

nanti digunakan.

Carryover: Peak kromatografi pada waktu retensi dari analit atau standar internal dapat

dideteksi dengan salah satu kondisi tertentu, yaitu :

1. Blank (kosong)

2. Pada STD0 ( matrik sampel yang sudah diekstraksi tidak mengandung analit, akan tetapi

mengandung standar internal pada level yang spesifik dalam assay)

3. Rekonstitusi pelarut kosong yang disebabkan karena terdapat sisa analit ( atau standar

internal ) dari penginjekkan sampel sebelumnya

Carryover harus dievaluasi dengan cara menginjeksikan rekonstitusi pelarut kosong

secepatnya setelah didapatkan ULOQ dari kurva standar. Kriteria umum yang biasa digunakan

dapat dilihat di 2000 Washington conference, yaitu ULOQ ≤ 20% dari LLOQ.

Kecocokan sistem

Tes kecocokan sistem dilakukan pada sistem yang spesifik secara periodik (biasanya

harian) atau pada setiap batch selama validasi dan analisi sampel untuk mendeterminasi kinerja

dari sistem.

Tes kecocokan sistem meliputi :

1. Reprodusibilitas waktu retensi

2. Sensitifitas yang adekuat untuk mengkuantifikasi LLOQ (minimum respon detektor)

3. Ketepatan sensitifitas pada perhitungan ULOQ (masuk rentang dari detetor)

4. Pemisahan kromatografi

Pengujian menggunakan LC-MS/MS-based assay sangat mungkin untuk tes

kecocokan sistem dengan penggunaan paling tidak 5 kali replikasi dari konsentrasi

larutan dibandingkan dengan kalibrasi yang paling mendekati LLOQ.

Untuk memenuhi kriteria larutan ini harus mempunyai presisi untuk 5

replikasinya, yaitu ≤ 5% (dalam keadaan sistem seluruhnya sudah setimbang /

terekuilibrasi ).

Sensitifitas tidak boleh kerang dari sama dengan 40% karena sensitifitas ≤ 40%

belum cukup adekuat untuk mengkuantifikasi LLOQ.

8.3.8 Stabilitas

Stabilitas analit akan memburuk apabila:

Penguapan dari analit yang bersifat volatil

Reaksi dengan udara dapat mengakibatkan oksidasi

Interaksi dengan permukaan wadah seperti:

1. Adsobsi selektif dari analit

2. Menempel pada kaca atau plastik (contoh: protein), khususnya jika konsentrasi

analit rendah

3. Pencucian untuk mengeluarkan kontaminan: Kaca mungkin meninggalkan sisa

unsur (Analisis natrium clustering MS); plastik dapat melepaskan plasticizer,

yang akan terdeteksi pada MS.

Dekomposisi photolitik

Dekomposisi thermal

Aktivitas katalitik dan enzimatik

Reaksi fisika kimia dengan komponen sampel lainnya ( contohnya: ikatan protein)

Hal-hal diatas dapat dicegah atau diminimalisir dengan langkah-langkah berikut:

1. menurunkan temperatur untuk menghambat reaksi degradatif atau kimia atau enzimatik: 

• Bekerja dengan es

• Dinginkan autosampler

• Sebelum digunakan vial, tabung, dan wadah lainnya di dingin kan terlebih dahulu

• Jaga larutan dan sampel pada suhu -70oC

2. Lindungi analit dari cahaya (botol amber atau alumunium foil)

3. Tambahkan stabilizing agent ( antioksidan atau antikoagulan)

4. Mengatur pH untuk meminimalisir hidrolisis analit

5. Degradasi minimum sampel dapat di kontrol dengan penambahan standar internal isotop

yang stabil pada waktu pengambilan sampel.

6. Menggunakan derivatisasi kimia untuk menstabilkan analit

7. Menambahkan inaktiaktor enzim atau inhibitor enzim

Pengukuran metabolit

Eliminasi dari obat biasanya terjadi pada metabolit yang lebih polar dibandingkan dengan obat

itu sendiri untuk meningkatkan ekskresinya lewat urin atau empedu. Beberapa keadaan tertentu

bioavailabilitas/bioequivalen membutuhkan determinasi metabolit:

a. Saat zat aktif obat tidak dapat di ukur pada sampel biologis and hanya metabolit yang

dapat di deteksi

b. saat zat aktif bersama dengan metabolit aktif dan atau metabolit inaktif dapat terukur

c. Saat lebih dari satu metabolit yang ada

d. Saat akumulasi metabolit teraugmentasi

Semua metode yang digunakan untuk menentukan metabolit ataupun zat aktif dan level

metabolit harus divalidasi dengan parameter umum dan kriteria-kriteria yang telah ditentukan.

Pengujian stereoisomer

Banyak obat yang terdaftar merupakan campuran rasemat. Obat itu mungkin akan

melewati stereoselektif metabolisme atau eliminasi dan satu isomer dapat menjadi lebih aktif

dibandingkan dengan isomer lainnya. 

8.3.9 Dokumentasi

Metode melaporkan harus mencakup:

a. Daftar yang lengkap dari perlengkapan, kondisi, reagen, dan deskripsi preparasi dari

reagen yang digunakan.

b. Prosedur kurva standar, validasi, dan quality control preparasi sampel.

c. Prosedur ekstraksi sampel atau perlakuan sampel untuk analisis.

d. Deskripsi dari sistem ketepatan uji untuk digunakan pada analisis sampel, apakah kriteria

diterima atau ditolak.

e. Limit dari batas quantifikasi.

f. Pengujian spesifik yang diterima dan kriteria penolakan untuk kurva standar dan kontrol

kualitas.

g. Rangkuman dari validasi data, termasuk hasil akurasi dan presisi.

h. Rangkuman dari perhitungan untuk memperoleh nilai kurva standar saat validasi.

i. Kromatogram representative dari blanko plasma, standar internal ditambah plasma,

kecocokan sistem larutan, LLOQ dan ULOQ.

j. Kurva represetatif standar.

k. Catatan referensi.

l. Informasi stabilitas pendukung.

m. Catatan metode khusus.

8.3.10 Teori Metode Bioanalitik Universal

Tahun 1990 dan 2000 hasil final konferensi Washington dan pedoman FDA untuk

industri mewajibkan bahwa validasi parsial diwajibkan dengan mengubah spesies dengan

matriknya dan bahwa kalibrasi standart, QCs, dan pengenceran QCs pada metode validasi harus

dalam matrik yang sama dari sampel yang sebenarnya. Kewajiban ini didasari dari analit yang

digunakan, ketika dalam matrik yang sama dari spesies yang berbeda, walaupun selektivitas

sudah ditetapkan, masih bisa memiliki stabilitas yang berbeda atau efek matriks yang berbeda.

Teori metode bioanalitik universal, didasarkan pada perkembangan dan validasi dari metode

plasma matrik independent, berikut adalah kualitas baiknya:

- Dapat digunakan tanpa ada perubahan keduanya baik sampel hewan dan manusia

- Hanya membutuhkan satu validasi untuk semua matriks plasma

- Memungkinkan penggunaan kalibrator, QCs, dan sampel yang sebenarnya pada matriks

yang berbeda pada batch yang sama

- Memungkinkan penggunaan disolusi dari matrik biologis di dalam air

Kemungkinan mengganti matriks plasma pelarut dengan air akan berguna pada uji

praklinis dimana range kuantifikasinya sangat luas yang digunakan untuk mengakomodasi

variabel konsentrasi dari analit pada sample. Dalam metode bioanalitical menggunakan:

LC-MS/MS-based assay

Garis linear untuk akurasi yang tinggi rasio luas vs konsentrasi

Template perkembangan metode standart sistematik mudah diaplikasikan pada bahan

apapun

Range template dapat mengcover hampir semua permintaan scientist ADME

- 0.5 sampai 500 ng/mL

- x 10 pengenceran sampai 5000 ng/mL

- x 100 pengenceran sampai 50000 ng/mL

Inhibitor enzim universal untuk semua tipe plasma

Kelebihan dari metode ini adalah:

- Mudah dan prosedurnya standar untuk pengembangan metode, validasi, dan analisis

sampel:

Analisis sampel lebih sederhana dan lebih cepat jika sampel dari matriks berbeda

dapat diuji bersama pada single batch menggunakan standar yang disiapkan pada

1 tipe saja dari matriks plasma

Penyederhanaan dari preparasi sampel otomatis dan mengurangi kemungkinan dari

penyumbatan sistem penyelidikan tips karena plasma

- Troughput tinggi (sampel dari matriks berbeda pada batch yang sama)

- Mengurangi biaya:

Pengenceran di air menurunkan biaya pembelian matriks kosong

Matriks yang paling murah dapat digunakan sebagai kalibrator dan preparasi QC

- Mengurangi dan menyederhanakan pekerjaan

Pengembangan dan validasi dari 1 metode analitik diperlukan dalam kasus ini untuk

mendukung semua penelitian pada spesies berbeda

Kelayakan pengembangan dan validasi plasma matriks-independen metode bioanalytical

pada lingkungan GLP harus mempromosikan produksi baru, SOP upgrade mengenai validasi

metode dan analisis sampel, dan bisa menjadi masukan bagi lembaga regulator untuk meninjau

kembali pedoman pada bidang bioanalytical.

Metode. Metode matrix-independen plasma sudah diperoleh dengan menambahkan

inhibitor enzim spesifik untuk semua matriks plasma, dan efek matriks yang tidak signifikan

sudah diperoleh dengan menggunakan kriteria sebagai berikut:

Standar Kalibrasi, QCs, dan sampel harus diencerkan dalam air 5 × atau 10 × (tergantung

pada respon LLOQ) sebelum pengolahan sampel untuk membuat matriks yang berbeda

seragam

Sumber APCI harus digunakan dalam LC-MS / MS. Sumber APCI memiliki efek matriks

lebih sedikit dari sumber ESI atau bukan efek matriks

Isotop standar internal berlabel stabil harus digunakan untuk mengkompensasi perbedaan

antara matriks. Kromatografi fase-normal (tradisional atau dengan air sebagai eluan kuat)

harus digunakan sebagai pengganti kromatografi fase terbalik. Hal ini sudah disadari

bahwa dalam kromatografi fase-normal, efek matriks diminimalkan. Nilai k’ dalam

kromatografi harus dinaikkan dari 2 sampai 4 sampai 8. Pemisahan kromatografi yang

diterima, diperlukan (waktu retensi, 3 sampai 5 menit) untuk memisahkan analit dari

gangguan endogen. Bahan pra dan postpeak harus dialihkan. Prosedur ini mengurangi

efek memori pada sumber ion.

Hasil. Kemungkinan mengembangkan dan memvalidasi "universal" metode bioanalytical

sudah didemonstrasikan menggunakan kedua obat komersial dan entitas kimia baru.

Pengembangan metode dan validasi untuk Gemcitabine (cytidine analog nukleosida digunakan

dalam pengobatan beberapa jenis tumor) dan metabolit yang dideaminasi akan digunakan

sebagai contoh untuk menunjukkan penerapan dari teori universal metode bioanalitis. Metode

gemcitabine memenuhi keenam kriteria di atas. Oleh karena itu metode ini memiliki efek matriks

signifikan. Kelebihan besar tetrahydrouridine (THU) sudah ditambahkan ke sampel actual dan

sampel validasi untuk mencegah konversi enzimatik dari Gemcitabine menjadi bentuk

metabolitnya. Selain validasi plasma manusia, metode ini crossvalidated pada anjing, tikus,

minipig, dan tikus kecil menggunakan kalibrator plasma manusia.

Validasi Metode Bioanalitikal

Tentukan fase gerak menggunakan sumber APCI

80/20

MeOH/5 mM CH3COONH4

80/20

ACN/5 mM CH3COONH4

80/20

ACN/1%/CH3COOH

80/20

MeOH/1%/CH3COOH

Sensitivitas tinggi

60/40

MeOH/5 mM/CH3COONH4

Sensitivitas rendah

Sensitivitas rendahSensitivitas medium

95/5

MeOH/5 mM/CH3COONH4

60/40

ACN/5 mM/CH3COONH4

95/5

ACN/5 mM/CH3COONH4

Sensitivitas medium Sensitivitas rendah Sensitivitas rendah Sensitivitas tinggi

40/50

MeOH/5 mM/CH3COONH4

100%

ACN

Sensitivitas tinggi Sensitivitas bagus

Bagan diatas ini merupakan bentuk decision tree (pohon keputusan) dengan tahap-tahap

dalam pengembangan metode sistematik untuk memilih suatu senyawa sebagai fase gerak

dengan melihat sensitifitas yang terbaik di LC-MS/MS menggunakan sumber APCI (sumber

Atmospheric pressure chemical ionization) dan mengurangi efek matriks. Contoh Fase gerak

yang diuji sensitivitas pada bagan di atas adalah MeOH/5mM, MeOH/1%, ACN (Asetonitril)

/5mM dan ACN/1%. Keempat fase gerak tersebut diuji sensitivitasnya masing-masing dengan

fase diam (pelarutnya) yang sama yaitu CH2COONH4 dengan masing-masing perbandingan

MeOH/5mM CH2COONH4 (80/20); ACN/5mM CH2COONH4 (80/20), MeOH/1% CH2COONH4

(80/20) dan ACN/1% CH2COONH4 (80/20). Hasilnya MeOH/5mM CH2COONH4 (80/20)

dengan sensitivitas medium ; ACN/5mM CH2COONH4 (80/20) dengan sensitivitas tinggi ; dan

MeOH/1% CH2COONH4 (80/20) dan ACN/1% CH2COONH4 (80/20) dengan sensitivitas

rendah. Kemudian yang diambil adalah sensitivitas medium dan sensitivitas tinggi untuk diuji

lagi.

Sensitivitas medium dibuat 2 perbandingan yaitu MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dan

MeOH/5mM CH2COONH4 (95/5) sedangkan sensitivitas tinggi dibuat juga dua perbandingan

ACN/5mM CH2COONH4 (60/40) dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5). Hasilnya diperoleh

MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan sensitivitas medium, dan MeOH/5mM CH2COONH4

(95/5) dengan sensitivitas rendah sedangkan ACN/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan

sensitivitas rendah dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) dengan sensitivitas tinggi. Maka

dilanjutkan lagi uji sensitivisitasnya yaitu dengan MeOH/5mM CH2COONH4 (60/40) dengan

sensitivitas medium dan ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) dengan sensitivitas tinggi. Kedua

perbandingan ini akan diubah konsentrasinya untuk MeOH/5mM CH2COONH4 (40/60) dan

ACN/5mM CH2COONH4 (95/5) menjadi ACN 100%. Hasilnya MeOH/5mM CH2COONH4

(40/60) dengan sensitivitas tinggi dan ACN 100% dengan sensitivitas paling bagus.

Gambar 8.2 dan 8.3 merupakan pengembangan metode sistematik fase gerak menggunakan

eksperimen infusi (percobaan fase gerak dengan infus). Tujuan infus untuk melihat sensitifisitas

fase gerak di LC-MS/MS menggunakan sumber APCI ( sumber Atmospheric pressure

chemical ionization) dan mengurangi efek matriks. Fase geraknya pada gambar 8.2 yaitu ACN

100%, 95%, 60%, dan 100% sedangkan untuk gambar 8.3 fase geraknya MeOH 100%, 60%, dan

40%. Hasilnya menunjukkan ACN dengan konsentrasinya paling tinggi 100% memiliki

sensitifitas yang tinggi sedangkan MeOH dengan konsentrasi 40% (rendah) memiliki

sensitifisitas yang tinggi. Namun antara ACN 100% dan MeOH 40% yang memiliki sensitifitas

yang lebih tinggi adalah ACN 100% yang dapat dilihat panjang pick masing-masing konsentrasi

yaitu pick metabolit dan parent (senyawa induk) dari ACN dibandingkan dengan Pick metabolit

dan parent dari MeOH

Run time adalah 3,5 menit menggunakan 96,5: 3,5 asetonitril/1mM amonium acetateas sebagai

fase gerak. Hanya puncak yang tinggi (meningkat-ningkat) yang dikumpulkan; dan sisanya

dialihkan untuk limbah (diverted to waste).

Tabel (8.1) diatas menunjukan tentang akurasi dan presisi Interbatch dari Gemcitabine

dan metabolit yang terdeaminasi yang terdapat dalam sampel-sampel plasma manusia yang

dilutionkan (pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan) dengan larutan plasma dan air.

Pada parent dan metabolit,interbatch % RE untuk Gemcitabine adalah 2,67 untuk 10 ×

pengenceran dan 0,68 untuk 100 × dilusi dalam plasma dan 2,97 untuk 10 × pengenceran dan

1,34 untuk 100 × pengenceran dalam air.

Total recorvery, efisiensi ekstraksi dan efek matriks untuk (a) gemcitabine dan (b)

metabolit yang terdeaminasi (reaksi kimiawi pada metabolisme yang melepaskan gugus amina

dari molekul senyawa asam amino) dari plasma manusia.

Dievaluasi pada 0,5, 250, dan 500 ng/mL menggunakan kalibrator dalam plasma manusia

dan standar QC pada manusia, anjing, tikus, minipig, dan plasma tikus. Plasma manusia

dilakukan enam replikasi pada setiap tingkat diukur dalam empat batch; plasma hewan dilakukan

enam replikasi pada setiap tingkat diukur dalam satu batch untuk setiap spesies (anjing, tikus,

minipig, mouse). Batas atas maksimum semua tingkat konsentrasi dilaporkan.

(Gambar 8.5) Efek matriks pada recovery itu diminimalkan hanya 5-8,2 % (Tabel 8.2).

Kesimpulan

Metode analisis otomatis ekstraksi fase padat LC-MS / MS telah dikembangkan untuk mengukur

Gemcitabine dan metabolit dideaminasi pada sampel plasma manusia dan hewan. Sejak validasi

bersilang pada anjing, tikus, minipig, dan sampel plasma tikus menggunakan kalibrator plasma

manusia yang berhasil untuk kedua obat induk dan metabolit, kemungkinan menggunakan

kalibrator plasma manusia untuk mengukur analit dalam matriks hewan yang telah ditunjukkan

bersama-sama dengan kemungkinan menggunakan air bukan matriks kosong sebagai pengencer

atau diluen.