BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Perkembangan zaman membuat ilmu pengetahuan semakin berkembang,

begitu pula dengan ilmu kefarmasian. Banyak obat baru yang ditemukan dan

juga semakin banyak komposisi atau campuran obat yang digunakan untuk

membuat obat yang mempunyai efek yang lebih optimum.

Zat-zat aktif yang ada di dalam campuran obat ini dapat kita ketahui melalui

berbagai macam proses dan cara yang bervariasi diantaranya dapat diketahui

melalui percobaan kromatografi dimana zat – zat ini dipisahkan oleh perbedaan

pengikatan ( partisi, adsorpsi, dsb) pada fase diam dan fase gerak.

1.2 Tujuan Penelitian

1. Mengetahui pengertian dari kromatografi kertas.

2. Mengetahui peralatan yang diperlukan dalam identifikasi.

3. Mengetahui kegunaan kromatografi kertas dan cara analisa data.

1.3 Metode Penulisan

Metode penulisan yang digunakan dalam menyusun makalah ini adalah

metode pustaka dan studi literatur, yaitu dengan mencari dan mengumpulkan

informasi penting dari berbagai sumber seperti buku-buku perpustakaan dan

website atau situs-situs internet yang terkait.

1.4 Sistematika Penulisan

Sistematika penulisan makalah ini dibagi menjadi 3 bagian, meliputi:

Bab 1: Pendahuluan

1.1 Latar Belakang

1.2 Tujuan Penulisan

1

1.3 Metode Penulisan

1.4 Sistematika Penulisan

Bab 2: Isi

2.1 Sejarah Singkat

2.2 Prinsip Kromatografi Kertas

2.3 Eluen

2.4 Kertas Kromatografi

2.5 Alat dan Bahan

2.6 Jenis-jenis Kromatografi

2.7 Tehnik Elusi

2.8 Cara deteksi

2.9 Analisa Hasil Kromatografi

Bab 3: Penutup

3.1 Kesimpulan

3.2 Saran

2

BAB 2

ISI

2.1 Sejarah Singkat

Kromatografi kertas pertama kali diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan

Martin pada tahun 1994. Kromatografi kertas ini adalah salah satu bentuk cara

pemisahan zat secara sederhana, biasanya digunakan untuk uji identifikasi

secara kualitatif. Cara ini sangat khas dan mudah dilakukan untuk zat dengan

jumlah sedikit. Kromatografi kertas termasuk kromatografi cairan planar yang

menggunakan kertas sebagai penyangga fase diam dengan mekanisme

pemisahan partisi yang dominan dan terutama dimanfaatkan sebagai cara

mengidentifikasikan zat yang telah terpisahkan atau untuk mengevaluasi

kemurnian zat.

2.2 Prinsip Kromatografi Kertas

Prinsip dasar kromatografi kertas adalah Partisi Multiplikasi suatu senyawa

antara dua cairan yang saling tidak bercampur.

Kromatografi kertas berbeda dengan ekstraksi menggunakan corong

pemisah, dimana fase bawah berupa air (pelarut yang mengandung air) yang

terikat secara stationer pada selulosa kertas. Jadi, partisi suatu senyawa terjadi

antara selulosa air dan fase cair yang melewatinya yaitu berupa pelarut organic

yang sudah dijenuhkan dengan air atau fase pelarutnya. Jika kromatografi

kertas merupakan suatu kromatografi partisi, maka tidak deapat diabaikan

bahwa terjadinya proses absorpsi juga tergantung pada jenis pelarut yang

digunakan dan juga sifat kromatografi.

Kromatografi kertas tergolong kromatografi cairan dengan kertas sebagai zat

pendukung. Oleh karena kertas atau serat merupakan absorben lemah yang

hidrofil, absorpsi zat-zat oleh kertas tidak terlalu kuat dan akan terdesak oleh

air. Air atau bagian yang lebih polar dari suatu cairan yang bertindak sebagai

3

suatu eluen akan berlaku sebagai fase diam. Mekanisme pemisahan yang

dominan terjadi adalh partisi. Oleh karena gaya kapiler kertas, fase gerak dapat

bergerak naik, mendatar atau menurun. Yang berlaku sebagai fase gerak

sesungguhnya adalah bagian campuran yang kurang polar.

2.3 Eluen

Eluen disebut juga pelarut, cairan pengelusi, cairan pengembang atau cairan

penghantar. Agar dapar diperoleh hasil yang dapat diulang, komposisi pelarut

yang digunakan haruslah konstan. Dalam berbagai kasus, terutama dengan

pelarut yang dapat bercampur dengan air, variasi kecil dalam kadar air cukup

mempengaruhi efisiensi pemisahan. Dengan kata lain, semua pelarut yang

dipakai haruslah sangat murni. Di bawah ini adalah pelarut yang dapat

digunakan :

1. n-butil alkohol yang dijenuhi dengan asam klorida 3M.

2. Asetilaseton yang dijenuhi dengan air.

3. Asam asetat glacial yang mengandung 25% (v/v) metanol kering.

4. Aseton yang mengandung 5% (v/v) air dan 8% (v/v) asam klorida.

5. Piridina yang mengandung 20% (v/v) air dan 1% (b/v) kalium

tiosianat.

6. Metanol

7. Metil etil keton yang mengandung 30% (v/v) asam klorida.

8. Etil eter yang mengandung 2% (b/v) hidrogen klorida kering dan 7,5%

(v/v) metanol kering.

9. Metil asetat yang mengandung 3% (v/v) metanol dan 10% (v/v) air.

10. n-butil alkohol kering yang mengandung 40% (v/v) metanol kering.

Pada kromatografi kertas biasanya merupakan cempuran dua komponen

atau lebih. Yang berlaku sebagai fase gerak adalah bagian campuran yang

kurang polar. Pemilihan eluen diarahkan pada fase gerak dan diorientasikan

pada deretan eluotrop. Pelarut pengembang yang sesuai harus mempunyai

sifat fisikokimia, meliputi sifat akseptor donor, gaya dipole, gaya disperse,

4

gaya koordinasi serta mempunyai kemampuan mengikat ion cuplikan yang

hendak dipisahkan.

2.4 Kertas Kromatografi

Kertas kromatografi terdiri dari selulosa murni denhan serabut panjang yang

dalam keadaan menggelembung bersama-sama dengan air atau pelarut yang

mengandung air merupakan fase diam atau melampaui impregnasi dengan

senyawa ipofilik dapat bertindak sebagai bahan pengembang.

Untuk kromatografi menaik, dipakai kertas yang panjangnya sekitar 20 cm .

pada kromatografi menurun, panjang kertas dapat mencapai 50 cm atau lebih.

Di sisi lain, kromatografo mendatar sirkular memerlukan kertas dengan

diameter 12 – 20 cm. dalam kromatografi kertas. Harus digunakan kertas saring

yang dijual khusus untuk maksud ini. Biasanya berbentuk pita selebar 2-5 cm,

dimana kita dapat dengan mudah mengguntingnya sesuai dengan kebutuhan.

Jenis kertas kromatografi nerneda-neda tergantung pada susunan serat

selulosa dan ketebalannya. Dilihat dari sifat selulosanya, kemurnian,

kehomogenan, kemampuan menyerap dan mekanik ketangguhan merupakan

faktor yang berpengaruh. Kapasitas dan lamanya kromatografi tergantung dari

ketebalan dan kemampuan menyerap atau kemampuan menggelembung kertas.

Antara kecepatan migrasi dan ketajaman pemisahan terdapat hubungan. Kertas

yang melewatkan dengan cepat umumnya memisahkan dengan lebih baik.

Dalam perdagangan, terdapat berbagai macam kertas kromatografi dengan sifat

tertentu. Yang berbeda adalah kecepatan migrasi, kemampuan memisahkan, dan

mekanik ketangguhan. Yang dapat dipengaruhi oleh kertas kromatografi adalah

kecepatan alir eluen, nilai Rf dan bentuk bercak zat.

2.5 Alat dan Bahan

Alat :

Bejana kromatografi

Rak tahan korosi

Bak pelarut

5

Batang kaca antisifon

Mikropipet

Sprayer

Bahan:

Kertas kromatografi

Reagensia

Zat uji

Pelarut (eluen)

2.6 Jenis-jenis Kromatografi

Metode pemisahan kromatografi kertas dibagi menjadi :

a.Kromatografi menaik

b. Kromatografi menurun

c.Kromatografi mendatar

d. Kromatografi melingkar

Pada kromatografi menaik, pelarut bergerak ke atas sedangkan pada

kromatografi menurun pelarut bergerak ke bawah. Pada kromatografi mendatar ,

pelarut bergerak dalam dua arah yaitu arah rambatan pertama lalu diputar tegak

lurus setelah berelusi. Pada kromatografi melingkar, pelarut bergerak sesuai

dengan arah rambatannya dalam lingkaran.

2.6.1Kromatografi Menurun

Alat :

1. Bejana kromatografi

2. Bak pelarut

6

3. Gelas piala

4. Batang kaca antisifon

5. Kertas Kromatografi

Cara Kerja

1. Bejana dilengkapi lubang untuk memasukkan pelarut, bak pelarut,

dan batang penahan kertas

2. Zat yang diuji dilarutkan dengan pelarut yang sesuai

3. Larutan zat ditotolkan dengan jarak antar totolan minimal 1,5 cm.

Penotolan dilakukan setelah totolan sebelumnya telah kering

4. Kertas digantung dalam bejana menggunakan batang kaca antisifon

yang dapat menahan ujung kertas di dalam bak pelarut

5. Dasar bejana digenangi dengan selapis pelarut

6. Gelas piala diletakkan di dasar bejana dan diisi air, larutan garam

jenuh, atau asam dalam air

7. Bagian kertas yang tergantung di bawah batang kaca harus

tergantung bebas tanpa menyinggung gelas piala, dinding bejana,

atau cairan pada dasar bejana

8. Bejana ditutup, terjadi keseimbangan bejana dan kertas

9. Keseimbangan dapat dipercepat dengan melapis dinding bagian

dalam bejana dengan kertas saring

10. Fase gerak dibiarkan turun pada kertas hingga batas yang

dikehendaki

11. Setelah selesai, kertas diangkat dan dikeringkan. Kromatogram

dideteksi dengan menyemprotkan pereaksi yang cocok

Bejana kromatografi berisi gelas piala yang diletakkan di dasar

bejana, pelarut yang dituang ke dasar bejana, bak pelarut yang berisi pelarut

7

dan batang kaca untuk menopang kertas serta kertas kromatografi yang

digantung pada batang kaca. Bejana kromatografi ditutup dengan gabus atau

sumbat karet yang terhubung dengan batang kaca. Bak pelarut dipasang kira-

kira 2,5 cm dari bawah dasar sumbat. Kertas kromatografi dicelupkan ke

dalam pelarut dalam bak pelarut kemudian dibiarkan menggantung bebas. Di

dasar bejana terdapat selapis pelarut yang berfungsi untuk menjenuhkan

atmosfer di dalam bejana terhadap pelarutnya. Hal ini ditujukan untuk

mencegah penguapan tidak mengganggu kesetimbangan pelarut yang

bergerak ke bawah. Gelas piala yang berisi air, larutan garam jenuh, atau

asam dalam air yang dijenuhi dengan pelarut digunakan untuk

mengendalikan banyaknya uap air dalam atmosfer. Selain itu juga dapat

menjaga kondisi temperatur cukup konstan.

Kertas kromatografi berukuran 30-45 x 2,5 cm. Untuk membuat

garis nol, ditarik garis dengan pensil kira-kira 8cm dari ujung atas.

Campuran yang akan diuji diteteskan dengan menggunakan mikropipet.

Setelah pelarut kering, kertas digantung vertikal dalam bejana kromatografi

dan elusi dimulai.

Gambar Kromatografi Menurun

8

2.6.2 Kromatografi menaik

Cara Kerja :

1. Larutan zat ditotolkan pada kertas

2. Fase gerak dituang ke dalam bejana

3. Bejana pelarut kosong ditempatkan pada dasar bejana dan kertas

digantung hingga bagian kertas yang ditotolkan menggantung bebas

dalam bak pelarut kosong

4. Bak ditutup dan dijenuhkan

5. Pelarut dengan jumlah berlebih dari yang diperlukan dituang ke

dalam bak melalui lubang kemudian bejana ditutup kembali

6. Kertas tergantung tepat di atas pelarut, pada waktu memulai

pemisahan, kertas diturunkan hingga tercelup dalam pelarut

7. Pelarut dibiarkan merambat hingga batas yang dikehendaki. Laju

perambatan pelan namun dapat menghasilkan bercak yang jelas

8. Setelah selesai kertas dikeluarkan dan dikeringkan

Kertas kromatografi yang digunakan berukuran 30-45 x 2,5 cm.

Ujung bawah kertas tercelup ke dalam pelarut namun tidak melebihi titik

penotolan. Pelarut akan bergerak naik hingga batas yang ditentukan.

Gambar Kromatografi menaik

9

2.6.3 Kromatografi Mendatar

Penyempurnaan pemisahan dilakukan dengan eluasi berturut-turut

dalam dua arah yang tegak lurus

Cara Kerja :

1. Melakukan elusi dengan teknik menaik atau menurun hingga bercak

paling cepat mendekati tepian kertas

2. Kertas diangkat, dikeringkan, diputar 90o lalu eluasi dengan sistem

pelarut yang berbeda

3. Komponen yang tidak terpisah sempurna dalam pelarut satu dapat

sempurna dengan kombinasi tersebut

Pada kromatografi mendatar, dilakukan dua kali elusi dengan arah tegak

lurus satu sama lain. Setelah elusi pertama kering, kertas kromatografi

diputar 900 dan dilakukan kembali elusi kedua. Larutan campuran akan

terpisah setelah elusi kedua. Keuntungan dari teknik ini adalah peningkatan

resolusi dan kapasitas totolan yang lebih tinggi. Seluruh daerah pada kertas

kromatografi digunakan sehingga resolusi meningkat dan dapat menentukan

terjadinya penguraian pada proses kromatografi.

Gambar Kromatografi Mendatar

10

2.6.4 Kromatografi Melingkar

Cara Kerja :

1. Cawan petri tertutup digunakan untuk bawah pelarut

2. Kertas yang digunakan berbentuk lingkaran yang pada pusatnya

diberi sumbu untuk mengalirkan pelarut

3. Sampel diteteskan sekitar pusat kertas

4. Kertas diletakkan horisontal sehingga sumbu tercelup dalam pelarut

5. Pelarut bergerak ke arah tepi kertas sambil membawa komponen

campuran oleh aksi kapiler

6. Bercak berupa garis lengkung dengan diameter semakin panjang

semakin ke tepi

Pelarut pada kromatografi melingkar akan bergerak sesuai arah

rambatannya dalam lingkaran sehingga hasil yang didapat akan berbentuk

melingkar pula. Pertama pelarut akan merambat dari sumbu yang tercelup

kemudian akan merambat pada kertas kromatografi melingkar.

2.7 Teknik Elusi

1. Elusi (mini, orientasi )

a.Teteskan larutan uji pada titik yang telah disediakan pada kertas 3,75x9,5

cm. Biarkan pelarut menguap

b. Tempatkan kertas dalam wadah elusi yang telah mengandung eluen,

ujung kertas tercelup ke dalam eluen, zat uji tetap di atas permukaan

eluen

c.Elusi, biarkan eluen merambat setinggi 7cm

d. Setelah selesai, angkat kertas dan biarkan eluen menguap

11

e.Amati kromatogram dengan cara deteksi yang dipilih, hitung Rf

A. Larutan uji

1. Tartrazin 1%

2. Biru berlian 1%

3. Rodamin B 1%

4. Campuran ketiganya 1%

Eluen 1. NaCl 1% dalam air

2. Metil Etil Keton + Aseton + Air =7:3:3

B. Larutan Uji

1. Sulfadiazin 1% dalam etanol

2. Sulfamerazin 1% dalam etanol

3. Sulfadimidin 1% dalam etanol

4. Campuran ketiganya 1%

Eluen Botanol + amonia 25% + air = 4:1:5

2. Elusi (baku)

a. Teteskan larutan uji pada kertas 7,5x19 cm yang telah disiapkan. Biarkan

pelarut menguap

b. Tempatkan kertas dalam wadah elusi yang telah mengandung eluen,

ujung kertas tercelup ke dalam eluen, zat uji tetap di atas permukaan

eluen

c. Elusi dengan jarak 15 cm

d. Setelah selesai, angkat kertas dan biarkan eluen menguap

3. Elusi (dua dimensi)

12

a. Teteskan larutan uji pada kertas 10x10 cm pada salah satu sudut kertas

pada jarak 1,25 cm dari tepi bawah/samping

b. Elusi dengan eluen 1 sejauh 7,5 cm

c. Setelah diangkat dan eluennya menguap, elusi lagi dengan arah tegak

lurus elusi pertama dengan eluen 2 sejauh 7,5 cm

d. Setelah selesai, angkat kertas dan biarkan eluen menguap

4. Elusi sirkular

a. Siapkan kertas dengan ukuran 10x20 cm

b. Lubangi tepat di tengahnya, beri sumbu dari gulungan kertas 1x1 cm

c. Buat lingkaran berdiameter 1,5 cm dengan pensil di tengah kertas. Buat 6

titik pada jarak sama (60o ) pada lingkaran tersebut

d. Teteskan ke-6 larutan uji masing-masing pada titik di sekeliling

lingkaran pensil

e. Eluen sebanyak 2 ml ditempatkan di kaca arloji

f. Elusi secara mendatar dengan mencelupkan sumbu kertas ke dalam eluen

g. Pengamatan langsung untuk bercak yang berwarna

h. Bercak tidak berwarna dapat diamati di bawah lampu ultraviolet, yaitu

pada 254 nm untuk zat yang menyerap radiasi UV akan tampak gelap di

atas latar belakang ungu dan zat yang berfluoresensi diamati pada

panjang gelombang 365 nm

i. Disemprot dengan pereaksi tertentu

13

Gambar Kromatografi Melingkar

2.8 Cara Deteksi

Cara mendeteksi dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu :

1. Pengamatan langsung untuk bercak yang berwarna

2. Bercak tidak berwarna dapat diamati di bawah lampu ultraviolet, yaitu

pada 254 nm untuk zat yang menyerap radiasi UV akan tampak gelap di

atas latar belakang ungu dan zat yang berfluoresensi diamati pada

panjang gelombang 365 nm

3. Disemprot dengan pereaksi tertentu

Prosedur untuk mendeteksi kromatogram dapat dilakukan secara kualitatif

dan kuantitatif. Pada prosedur kualitatif, suatu produk obat yang dideteksi di

kertas kromatografi mempunyai harga Rf yang sama atau mendekati harga Rf

literatur. Pada prosedur kuantitatif dibutuhkan densitometri atau ekstrasi yang

diinginkan diikuti dengan pengukuran spektrofotometri. Beberapa reagensia

yang digunakan untuk mendeteksi antara lain: difeniltiokarbazon (ditizon), asam

rubeanat, difenilkarbazida, alizarin, salisilaldoksima, morin, kalium

heksasianoferat(II), kalium kromat, ammonium sulfida, hidrogen sulfida.

2.9 Analisa Hasil Kromatografi

Kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kualitatif. Analisis

kualitatif akan memberikan hasil berupa Rf (retardation factor) zat.

Kromatogram merupakan hasil pemisahan zat oleh eluen. Kromatogram

ditunjukkan oleh bercak yang menandakan letak zat. Pada proses kromatografi,

termasuk kromatografi kertas, bercak akan bergerak pada fraksi tertentu sesuai

dengan kecepatan pelarut dan hal ini didefinisikan sebagai Rf (retardation

factor = faktor retardasi).

Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik

awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.

14

Harga Rf adalah spesifik untuk suatu zat, karena ditentukan oleh harga

koefisien distribusi dari zat tersebut. Harga Rf dapat ditentukan dari persamaan:

Dengan k adalah koefisien distribusi. Namun begitu, harga Rf yang diperoleh

seringkali berbeda dengan yang termuat dalam literatur. Hal ini disebabkan oleh

faktor-faktor lain yang mempengaruhi kondisi percobaan. Faktor-faktor yang

mempengaruhi harga Rf ini yaitu:

a. Jenis dan mutu kertas, daya absorbsi, dan kelembaban. Jenis kertas yang ada

disesuaikan dengan kecepatan aliran pelarut yang diinginkan. Misalnya

untuk penggunaan umum dipakai kertas berjenis flow-rate medium, untuk

analisis asam amino dipakai kertas berjenis flow-rate lambat, dan untuk

elektroforesis dipakai kertas berjenis flow-rate cepat.

b. Susunan eluen, yang terdiri dari:

- Kemurnian pelarut, misalnya ada pengaruh 0,5 – 1% etanol dalam

kloroform.

- Stabilitas campuran pelarut. Susunan eluan akan berubah pada

pemakaian maupun penyimpanan, terutama pada komponen yang mudah

menguap dan kadarnya kecil; adanya alkohol dan asam dalam eluen

yang bisa menghasilkan ester.

- Temperatur dan kelembaban ruang

c. Kejenuhan yang akan berpengaruh pada uap eluen. Bila bejana tidak jenuh,

eluen akan menguap selama proses eluasi, sehingga waktu eluasi naik dan

nilai Rf naik.

d. Konsentrasi atau banyaknya zat yang akan dianalisis. Bila zat yang dianalisis

konsentrasinya terlalu kecil, maka hasil yang diperoleh seringkali tidak

akurat atau bahkan tidak dapat diidentifikasi.

e. Jarak bercak awal ke permukaan eluen.

15

f. Adanya zat lain dan konsentrasi dari zat lain tersebut yang dapat

mengontaminasi kondisi percobaan sehingga analisis yang diperoleh tidak

akurat. Zat lain ini antaranya dapat berupa ion-ion, seperti pada terdapatnya

klorida dalam pemisahan yang dilakukan dengan larutan-larutan nitrat.

g. Keasaman larutan aslinya; hal ini dapat disebabkan oleh kebutuhan akan

asam dalam kompleks yang dapat larut dalam pelarut organik, untuk

mencegah hidrolisis garam, dan lain sebagainya.

h. Waktu melakukan percobaan untuk sepotong kertas. Terkadang harga Rf

meningkat dengan bertambahnya waktu dan hal ini berbanding lurus dengan

berkurangnya laju gerak garis depan pelarut.

Karena dalam praktikum hampir semua luas harus dijaga konstan, dianjurkan

agar pada waktu melakukan kromatografi dikembangkan juga senyawa uji, dan

senyawa ini dianggap sebagai senyawa pembanding. Harga Rst adalah

perbandingan jarak tempuh senyawa yang hendak diperiksa terhadap jarak

tempuh senyawa pembanding.

Harga Rst tidak tergantung pada kondisi luar percobaan dan harganya dapat

lebih besar dari 1.

16

BAB 3

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

1. Kromatografi kertas merupakan tehnik pemisahan campuran zat menjadi

komponen-komponennya.

2. Terdapat 2 fase dalam kromatografi kertas, yakni fase diam dan fase gerak.

3. Fase diam merupakan kertas yang terbuat dari selulosa.

4. Fase gerak merupakan pelarut dan/atau campuran pelarut.

3.2 Saran

Prosedur yang telah dijabarkan di atas sebaiknya dilakukan ketika menguji

suatu zat di lab. Melalui percobaan yang dilakukan sendiri maka kita dapat

membuktikan sendiri bahwa campuran zat akan dipisahkan oleh kromatografi

kertas dan prosedur berjalan dengan sesuai.

17

DAFTAR PUSTAKA

G. Svehla.1985. Vogel Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro Dan

Semimikro Edisi Kelima. Jakarta: PT Kalman Media Pusaka.

Adamovics, John A.Chromatographic Analysis of Pharmaceutical: second

edition, Revised and Expanded. Princeton, New Jersey: Cytogen Corporation.

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok: Departemen Farmasi

FMIPA UI

18