KROMATOGRAFI BIDANG

MAKALAHUNTUK MEMENUHI TUGAS MATAKULIAH

Analisis Instrumen Iyang dibina oleh

Ibu Dr. Dra. Endang Budiasih, M.S

OlehKelompok 2

1. Ahmat Saifudin Zuhri (120331402687)2. Arina Diana Fatma (120331420950)3. Atika Qorina (120331420928)4. Indri Budi Fitriani (120331402679)5. Yeny Merinda (120331402682)

UNIVERSITAS NEGERI MALANGFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIANOPEMBER 2014

Bab 6

KROMATOGRAFI BIDANG6-1 Pendahuluan

Noda setetes cairan pada selembar kertas atau baju berada dalam pola

melingkar, dan jika cairan berisi zat pewarna, terbentuk cincin konsentris yang

lebih mudah diamati. Teknik analitik sederhana digunakan oleh bangsa Roma

kuno untuk melakukan uji pigmen dan pewarna. Kira-kira 100 tahun yang lalu,

seorang ahli kimia Jerman, Ringe Schoenbein dan Goppelsroeder melakukan hal

yang serupa namun dari hal yang sama dibuatkan sebuah metode sehingga dapat

diulang. Hanya dalam 30 tahun terakhir, kromatografi kertas telah diterima

sebagai metode yang dapat diandalkan. A.J.P Martin, yang juga merupakan

perintis dalam kromatografi cair dan gas, dan rekan kerjanya, Consden dan

Gordon, mendeskripsikan partisi dalam kromatografi kertas di mana kelembaban

pada kertas bertindak sebagai fase diam. Dalam beberapa tahun, skema analisis

sederhana ini membantu perkembangan penelitian dalam biokimia.

Baru-baru ini, kromatografi lapis tipis (TLC) yang diciptakan Stahl telah

digunakan secara luas. Selapis tipis dari adsorben yang diletakkan dalam pelat

kaca atau plastik, sehingga dapat digunakan seperti selembar kertas pada

kromatografi kertas. TLC lebih sering digunakan karena lebih berguna dan

reprodusibel. TLC menggantikan penggunaan PC di laboratorium.

Sebagai tambahan yang lebih jelas dan sederhana, PC dan TLC digunakan

hanya pada jumlah sampel yang sedikit. Kromatografi permukaan bidang dengan

kolom menawarkan keuntungan yang khusus dari operasi dua dimensi. Jadi sifat

selektif dari dua pelarut yang berbeda bisa digunakan dalam mengembangkan

kromatogram tunggal.

Prinsip Teoritis

Umumnya prinsip teoritis dalam menjelaskan kromatografi kolom dapat

juga digunakan untuk menjelaskan kromatografi bidang. Konsep “piring teoritis”

mungkin sulit untuk digambarkan pada selembar kertas, tapi itu jelas bahwa

pemisahan terjadi dengan kesetimbangan berkesinambungan (successive

equilibration) dari komponen sampel antara dua fase, yaitu fase diam dan fase

gerak. Demikian juga beberapa proses nonideal harus dapat mengakibatkan zona

pemisahan pada permukaan bidang seperti pada kolom.

Waktu retensi pada kromatografi bidang biasanya ditunjukkan sebagai

faktor retardasi, Rf :

R f=jarak pergerakan zat terlarut

jarak pergerakan pelarut

Pergerakan pelarut pada titik tertentu bisa diukur.Jarak pergerakan sampel diukur

dari pusat noda, atau titik dengan kerapatan maksimum. Kita mungkin juga

menetapkan koefisien distribusi, K, yang didefinisikan sebagai konsentrasi zat

terlarut pada fase gerak, CM dan di fase diam, CS :

K=CS

CM

Ada hubungan sederhana antara nilai K dan Rf . Jarak rata-rata pergerakan

molekul zat terlarut proporsional dengan kecepatannya; yang sebenarnya juga

sama dengan kecepatan pelarut bergerak dikalikan dengan waktu yang dihabiskan

senyawa zat terlarut berada di dalam fase gerak. Ekspresi dari jumlah molekul di

tiap fase, atau kesetimbangan distribusi zat terlarut antara dua fase:

Rf=¿

jumlah mol zat terlarut di fase gerakjumlahmol zar terlarut pada keduafase =

CM A M

C M A M+CS AS¿

dimana AM dan AS mewakili luas area melintang dari dua fase (tegak lurus dengan

bidang pada kertas).

R f=AM

A M+ AS CS/CM=

AM

AM+K AS

Luas area melintang dari lapisan tipis atau kertas sulit untuk ditentukan, sehingga

persamaan di atas jarang digunakan, tapi itu menunjukkan bahwa Rf dapat diubah

dalam sistem kesetimbangan konstan, dan nilai Rf dapat dianggap tergantung

pada beberapa jenis parameter seperti pengukuran waktu retensi lainnya yang

umumnya digunakan dalam metode kromatografi kolom. Nilai Rf dipengaruhi

oleh jenis kertas, metode, dan arah pengembangan, ukuran dan konsentrasi

sampel, dan jarak tempuh noda. Karena hal itu, lebih nyaman da akurat digunakan

nilai Rf relatif atau Rstd, , untuk senyawa standar ditambahkan pada sampel (atau

ukuran pemisahan dibawah kondisi ideal). Nilai Rstd adalah perbandingan jarak

pergerakan oleh dua noda pada pengembangan dalam waktu yang sama.

6-2 KROMATOGRAFI KERTAS

Sifat kertas

Kertas yang umum digunakan terdiri dari selulosa yang sangat murni.

Selulosa sebagai bahan dasar kertas merupakan polimer dari glukosa. Dengan

adanya banyak gugus hidroksil di permukaan maka selulosa mempunyai afinitas

sangat besar terhadap air dan pelarut-pelarut organik lainnya karena adanya ikatan

hidrogen. Pelarut dapat masuk ke dalam jaringan benang-benang selulosa dan

menyebabkan kertas sedikit mengembang. Dalam air, selulosa sangat polar dan

menjadi elektronegatif. Selain itu, kertas juga mempunyai sifat penukar ion

meskipun lemah.

   Banyak cara dilakukan untuk membuat kertas yang mampu memberikan

harga Rf berbeda dengan pelarut yang berbeda. Modifikasi bahan dasar kertas juga

telah dilakukan, antara lain dengan menambahkan sedikit gel silika atau gel

alumia bahkan resin penukar ion.

Peralatan

Peralatan yang diperlukan pada kromatografi kertas terdiri dari dukungan

untuk kertas, palung pelarut, dan bak udara-sempit di mana untuk

mengembangkan kromatogram. Penutup bak diperlukan untuk mencegah

penguapan pelarut yang mudah menguap. Ukuran bak mungkin berbeda dari

tabung biasa tergantung pada ukuran kertas. Jika banyak kromatografi kertas yang

harus dilakukan, akan lebih mudah untuk mengontrol suhu seluruh ruangan,

kurang lebih 18oC. Komponen dasar yang diilustrasikan pada Gambar 6-1 sudah

cukup untuk kromatografi kertas sederhana.

Development

Elusi kromatografi bidang dapat dilakukan di bak tertutup maupun

terbuka. Ada dua jenis elusi yang sering digunakan untuk kromatografi kertas,

yaitu ascending development dan descending development.

Ascending Development

Teknik ini adalah yang paling sederhana dan paling populer. Teknik naik,

disebut juga dengan pengembangan vertikal. Pelarut diletakkan di dasar sebuah

kamar gas, kertas atau kaca pembawa lapis tipis dicelupkan, dan pelarut dibiarkan

naik melalui fase diamnya sambil membawa komponen analit yang sudah

ditotolkan di garis awal. Pelarut akan naik lebih cepat dan komponen campuran

yang terpisahkan akan terserap di suatu daerah pada kertas semetara pelarutnya

akan naik sampai proses dihentikan.

Descending Development

Teknik turun juga sering digunakan di mana tempat pelarut diletakkan di

bagian atas kamar elusi dan kertas yang telah diberi sampel dielusi dari atas, arah

aliran ke bawah. Untuk mencegah penyedotan cepat, kertas dilipat menjadi bentuk

U dengan kenaikan awal pendek dari tangki pelarut. Meskipun alat ini lebih rumit,

metode ini jauh lebih cepat dari yang sebelumnya, potongan kertas dapat

digunakan lagi, dan sebagian besar pelarut dapat digunakan jika diperlukan.

Two-Dimensional Development

Teknik lain yang sangat menguntungkan pengguna kromatografi bidang

adalah teknik elusi dua dimensi. Dalam hal ini, elusi dilakukan dua kali dengan

dua buah pelarut pengembang atau campurannya dengan cara yang sama dan

singkat. Pengembangan dilakukan kembali dengan arah yang berbeda 90o. Hasil

yang didapat juga menguntungkan karena komponen-komponen yang belum

terlalu terpisah akan lebih terpisah dengan pengembang berbeda. Efek pemisahan

ganda dialami oleh kromatografi dua dimensi ini sehingga data analisisnya

mendukung satu sama lain. Gambar 2 menunjukkan kromatogram dua dimensi

untuk campuran dengan lima komponen. Pada elusi pertama dengan pengembang

Gambar 1. Peralatan dasar untuk kromatografi kertas: (a) teknik naik; (b) teknik turun

fenol ada bagian yang tidak terpisah dan akan terlihat jelas terpisah setelah elusi

kedua dengan pelarut pengembang collidine. Elusi kedua dilakukan setelah pelat

kromatogram dikeringkan. Pola yang berbeda untuk kedua elusi bisa saja terjadi

jika kepolaran kedua pengembang berbeda jauh.

Dalam teknik dua dimensi, komponen-komponen senyawa akan bergerak

dengan laju migrasi berbeda karena sifat dari eluen baru pasti tidk sama efeknya

terhadap tiap komponen. Dengan demikian, harga Rf akan berbeda satu sama lain.

Karen perbedaan ini pula metode dua dimensi akan memberikan kelebihan dalam

pemisahan maupun dalam analisis akhirnya.

Radial Development. Dalam metode ini sampel berupa noda yang berada

di pusat horizontal dan ditempatkan pada sumbu piringan untuk mensuplai pelarut

dari titik terendah ke pusat. Komponen bergerak keluar membentuk lingkaran

dengan peningkatan diameter. Pita besar atau kecil ketajamannya menyebabkan

pelarut bergerak lebih cepat di ujung daripada di tepi sehingga dapat dilakukan

dengan cara menutup cawan petri, atau kertas diapit dengan dua piring kaca dan

lubang di tengah untuk pengenalan pelarut.

Untuk pengembangan cepat, seseorang dapat memutar piringan dengan

kecepatan tinggi sehingga pelarut mengalir dengan gaya sentrifugal atau

kapilaritas.

Pemilihan sistem pelarut. Fase yang lebih polar, Air diserap oleh kertas

pada fasa diam, sedangkan fase yang kurang polar berada diatasnya. Beberapa

keadaan yang diiingkan untuk menghilangkan air dari kertas dilakukan dengan

cara pengeringan dan menggunakan pelarut yang lebih polar seperti alkohol,

Gambar 2. Elusi dua dimensi pada kromatografi kertas. A. Hanya fenol; B. Fenol diikuti collidine

glikol, formamida sebagai fase diam dan pelarut yang nonpolar akan mengalir

sebagai fasa gerak . Jika air yang tidak dibutuhkan digunakan sebagai fase diam,

maka pelarut yang bergerak tidak dapat bercampur karena air tertahan oleh

kertas . Jika dibutuhkan, fasa air menjadi penyangga. Fasa gerak terdiri dari

campuran antara pelarut, misalnya, asam alkohol, keton, ester, amina, fenol,

hidrokarbon, dll sehingga mencapai pemisahan maksimum komponen sampel.

Selain pemisahan optimum, ada faktor lain yang harus dipertimbangkan

dalam memilih sistem pelarut. Semakin banyak komponen sistem pelarut,

semakin sulit untuk mempertahankan atmosfer yang memenuhi ruangan.

Penguapan parsial mengubah komposisi pelarut, maka akan mempengaruhi nilai

Rf. Perubahan suhu juga akan lebih kritis dalam sistem campuran. Sistem pelarut

tidak boleh mengganggu tata cara deteksi (atau harus siap dan benar-benar

menguap sehingga dapat dihilangkan sebelum deteksi)

Pertimbangan sangat penting, tetapi mudah mengabaikan menit pengotor

nonvolatile menghasilkan pelarut yang membingungkan dalam sampel atau dapat

mengganggu dalam metode deteksi

Idealnya, kita harus memilih sistem pelarut sehingga dua tahap yang

bercampur dan di mana komponen sampel memiliki kelarutan yang tinggi, tetapi

berbeda dalam dua tahap. Situasi ini akan menyebabkan pemisahan maksimum

dengan minimum penyebar dalam waktu singkat.

Kromatografi fase terbalik. Jika kertas dilapisi dengan zat hidrofobik,

seperti lateks, minyak mineral, atau minyak silikon dan fase polar digunakan

untuk mengelusi, kebalikan dari distribusi normal yang diperoleh. sistem tersebut

dapat menguntungkan untuk pemisahan asam lemak dan senyawa nonpolar yang

mungkin bergerak cepat karena kelarutan yang rendah dengan fase diam polar.

Kelebihan dan kelemahan. Kromatografi kertas biasanya digunakan

untuk analisis yang sulit, memakan waktu banyak, mahal dan menggunakan

metode konvensional. Meskipun beberapa prosedur memerlukan beberapa jam,

waktu operasi sangat kecil sangat cocok untuk sampel di wilayah mikrogram dan

campuran zat yang sangat erat kaitannya kimia.

Kelemahan, sampel yang kecil menjadi kerugian deteksi yaitu

membutuhkan teknik tambahan. Variabilitas kertas merupakan masalah yang

serius. Sebagian besar prosedur dengan cara empiris dan hampir tidak dapat

disebut kuantitatif.

Aplikasi. Kromatografi kertas telah berhasil diterapkan untuk masalah

dalam kimia anorganik dan organik serta dalam biokimia. Penambang

menggunakan untuk menentukan logam dalam sampel bijih. Kompleks logam

isomer dapat diselesaikan. Logam dengan sifat kimia yang mirip mudah

diselesaikan. Hampir semua campuran bahan kimia organik dapat dipisahkan dan

ahli kimia organik sering menggunakan sebagai pemeriksaan kemurnian atau

sebagai metode perintis untuk menentukan kondisi optimum dalam pemisahan

kolom kromatografi skala besar.

Metode ini membuat dampak terbesar dalam biokimia, tetapi dalam kimia

analitik sulit karena dilakukan pada sampel yang kecil. Perkembangan literatur :

kontrol kemurnian obat-obatan dan produk makanan, studi tentang kematangan

dan fermentasi, deteksi narkoba dan dosis pada hewan dan manusia, analisis

kosmetik, deteksi pencampuran dan pencemar dalam makanan, minuman dan

analisis campuran pada reaksi kimia.

6-3 Kromatografi Lapis Tipis

Prinsip kerja kromatografi lapis tipis sama dengan prinsip kerja

kromatografi kertas. Sebagai pengganti selembar kertas, digunakan lapisan tipis

halus sebagai penyerap seperti gelas atau piring plastik.

Sifat dari Lapis Tipis. Adsorben (fase diam) yang paling sering digunakan

adalah silika gel, alumina, tanah diatom, dan bubuk selulosa, tetapi bahan lain

seperti Sephadex, resin pertukaran ion, atau Anorganik telah digunakan untuk

tujuan khusus. Gel silika bersifat asam dan memiliki kapasitas besar dan sering

digunakan untuk kromatografi partisi dan adsorpsi. Alumina merupakan

komponen dasar yang digunakan untuk kromatografi adsorpsi dan bersifat basa.

Tanah diatom bersifat hampir netral yang digunakan sebagai pendukung partisi

untuk menggabungkannya dengan pengikat (perekat) seperti plester dari Paris

untuk membuat lapisan yang lebih kohesif.

Pembuatan Lapisan. Biasanya digunakan pelat/lapisan kaca datar dan

halus, atau memiliki dasar yang ringan atau bergerigi. Ukuran dan bentuk dapat

ditentukan menggunakan alat. Dalam hal apapun, permukaan kaca dibersihkan

secara hati-hati/teliti dengan deterjen atau pelarut organik untuk menghilangkan

lemak apapun. Ketebalan lapisan akan menentukan kapasitas sistem. Lapisan

0,15-2,0 mm adalah ketebalan yang baik. Sangat dianjurkan membuat lapisan

dengan ketebalan yang sama, hal ini dapat dicapai dengan berbagai teknik. Dalam

industri, teknik pembuatan lapis tipis telah teruji dengan baik. Teknik pencelupan,

pelapisan, sampai penyemprotan sering digunakan untuk memastikan ketebalan

lapis tipis. Kebanyakan lapisan tipis diproduksi dengan menyebarkan lapisan yang

terbuat dari bubur berair di atas seluruh permukaan adsorben. Bubur tidak boleh

terlalu tebal (kental) atau terlalu tipis. Bubur dibuat dengan Gel silika G yang

berisi 10 sampai 15% kemudian dikalsinasi dengan kalsium sulfat, dan dicampur

dengan ± dua kali berat air.

Kita dapat menerapkan pita di sepanjang tepi yang berlawanan dari kaca

dan menggunakan batang kaca untuk mengambilnya, kemudian dihasilkan lapisan

pita yang tebal. Untuk penggunaan sesekali, sepasang slide mikroskop atau lentera

dapat dicelupkan ke bubur yang tidak berair yang mengandung 35 g Gel Silika G

dalam 100 mL kloroform, kemudian mengangkatnya perlahan, dan dibiarkan

mengalir dan kering. Setelah menyebar atau mengalir, dibutuhkan waktu 30 menit

untuk proses pengikatan. Untuk kromatografi adsorpsi, lapisan diaktifkan dengan

cara pemanasan pada 110oC selama beberapa jam. Untuk kromatografi partisi,

diperlukan pengeringan dan sisa air bertindak sebagai fase diam. Bagian tepi

harus dibersihkan dan pelat disimpan dalam desikator atau alat lain yang sesuai.

Ingat bahwa pengaktifan lapisan akan menyerap uap air dan uap-uap lainnya dari

udara, hal ini membuat kondisi kromatografi mengalami perubahan drastis. Pelat

lapis tipis banyak tersedia, tetapi biasanya digunakan untuk kepentingan

laboratorium yang dapat dipergunakan berkali-kali. Untuk penggunaan sesekali,

mereka jauh lebih nyaman dan lebih memilih untuk membuatnya sendiri.

Metode Penggunaan/Kerja dan Deteksi. Pemilihan pelarut tergantung

pada faktor-faktor yang sama seperti yang sudah dibahas dalam bentuk lain dari

kromatografi cair, dan metode elusi yang sama seperti kromatografi kertas.

Prosedur harus dilakukan dalam ruang tertutup untuk mencegah penguapan.

Dalam mendeteksi bercak, uap yodium digunakan secara luas sebagai pelarut

"universal" untuk reagen senyawa organik. Bercak yodium menghilang secara

cepat tetapi dapat dibuat lebih permanen dengan cara menyemprotkan larutan

benzidin 0,5% dalam etanol absolut. Biasanya pendeteksian reagen lain dilakukan

dengan cara penyemprotan asam sulfat setelah sampel dipanaskan, dan dihasilkan

bercak hitam. Ada sejumlah reagen yang lebih spesifik yang tersedia, tentu saja

bercak dapat terkikis, dielusi, dan diselidiki oleh metode yang tersedia.

Keuntungan dan Aplikasi. Dibandingkan dengan kromatografi kertas,

lapis tipis lebih serbaguna (lebih luas fasa diam dan pelarut), lebih cepat, dan lebih

mudah dibuat. Hal ini sering digunakan sebagai teknik percontohan untuk melihat

kompleksitas campuran secara cepat atau sebagai bantuan dalam menetapkan

kondisi yang baik untuk kromatografi kolom skala besar. Karena kecepatan dan

kesederhanaan itu, sering digunakan untuk mengikuti jalannya reaksi atau untuk

memantau teknik pemisahan yang lebih rumit dan kompleks. Kromatogram Lapis

tipis sering digunakan untuk mengidentifikasi obat, ekstrak tanaman, dan

persiapan biokimia, atau untuk mendeteksi kontaminan atau pencampuran.

6-4 Zona Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode

pemisahan partikel-partikel bermuatan

dalam medan listrik. Partikel-partikel

berupa ion, ion-ion makromolekul,

beberapa biokoloidal. Elektroforesis

bukaanlah sejenis kromatografi, namun

perbedaan kecepatan migrasi yang

menyediakan sarana yang baik untuk memisahkan biokoloidal berupa protein,

polisakarida, dan asam nukleat dengan baik sesuai karakterisasi senyawanya.

Meskipun elektroforesis dapat menempati media gas (alat pengukuran asap

elektrostatik), disini dibahas hanya perbedaan migrasi pada fase cair. Reaksi

elektrode harus terjadi untuk mempertahankan arus, tetapi reaksi per se tidak

penting untuk pemisahan dan tidak dibutuhkan pertimbangan.

Batas perpindahan elektroforesis. Pada fase cair sebuah larutan

berjumlah banyak dimasukkan kedalam tabung-U atau film yang tipis pada kertas.

Teknik sebelumnya telah dikenalkan oleh Anne Tiselius pada tahun 1937 untuk

analisis campuran protein. Dia meletakkan sampel di bagian tengah sebuah

Gambar 6-3

tabung-U yang tedapat elektrode diujungnya (Gambar 6-3). Pada bagian arus yang

memulai memindahkan spesies untuk bermigrasi menuju elektrode yang tepat.

Melengkapi pemisahan yang tidak terjadi, tetapi jika gangguan mekanik yang

terjadi perlahan dapat dihindari (tidak ada pencampuran), batas perpindahan dapat

diamati konsentrasinya tidak kontinyu

(perpindahan warna atau indeks refraksi).

Teknik ini membutuhkan cukup keahlian

percobaan dan lambat dan juga tidak sangat

sensitif, walaupun sangat penting pada

perkembangan awal kimia protein.

Zona elektroforesis. Dalam

elektroforesis, migrasi terdapat pada film tipis

cair yang dilapisi pada kertas atau bahan

berpori. Peralatannya terdiri dari filter strip

yang mendukung piring gelas horizontal

dengan diujungnya kertas yang

dicelupkan ke dalam penampung

larutan penyangga. Elektroda

ditempelkan pada dekat ujung kertas

dan sampel di totolkan dekat

pertengahan, yang ditunjukkan pada

gambar 6-4a. Pada aliran arus,

senyawa sampel berpindah dari satu

ke yang lain (Gambar 6-4b),

pembentukan totolan atau zona.

Membran selulosa asetat diganti kertas filter sebagai media pendukung.

Bermacam-macam bahan gel, resin, dan bubuk juga digunakan pada kasus

tertentu. Immunoelektroforesis ini dilakukan dengan lapisan gel agar ketebalan 1-

2 mm, dibentuk di sebuah slide mikroskopis. Setelah pemisahan elektroforesis

campuran protein, ‘trough’ dipotong sejajar dengan tepi piring (gambar 6-4c) dan

pengisian dengan sebuah antiserum yang cocok. Inkubasi 24-28 jam pada

atmosfer bumi memungkinkan untuk ‘trough’ agar berdifusi . ketika antiserum

Gambar 6-4

Gambar 6-5

diperoleh dengan totolan protein, tampak ‘arcs’ yang terbentuk sesuai pasangan

protein antigen-antibodi (Gambar 6-4d).

Aliran kontinyu elektroforesis.

Elektroforesis pada kertas (atau layar tipis) memungkinkan salah satu

bentuk kromatografi elusi yang kontinyu. Diagram alat ditunjukkan pada gambar

6-5. Sampel dimasukkan secara kontinyu dari sumbu di puncak kertas dan dielusi

ke arah bawah. Dengan tanpa arus listrik yang mengalir, sampel akan berjalan di

garis vertikal lurus dan muncul tak terpisah, meskipun masing-masing komponen

akan berjalan bergantung kecepatan yang berbeda pada koefisien distribusi.

Dengan arus listrik yang mengalir, meskipun partikel berubah akan berjalan ke

kanan atau ke kiri (horizontal) tergantung pada perubahan kecepatan. Arah

resultannya adalah jumlah vektor dari dua komponen tegak lurus. Sehingga

masing-masing komponen yang dibebankan harus muncul di tempat yang berbeda

di bagian bawah kertas, sementara yang bermuatan akan muncul langsung di

bawah titik aplikasi. Elektroforesis kontinyu memungkinkan peralatan yang relatif

jumlah banyak untuk zat yang dimurnikan pada waktu yang pendek.