1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada perkembangan zaman ini, banyaknya metode yang digunakan untuk memisahkan

berbagai komponen dalam suatu senyawa campuran. Para peneliti juga semakin dipermudah

dengan adanya kemajuan teknologi yang digunakan pada tekhnik pemisahan ini.

Bukanhanya itu, selain alatnya yang sederhana untuk dirancang, metode yang ditemukan

juga bersifat ekonomis karena kesederhanaan dalam penggunaannya. Teknik pemisahan

yang dimaksud adalah kromatografi.

Teknik kromatografi ini sendiri telah dikembangkan dan telah digunakan untuk

memisahkan dan mengkuantifikasi berbagai macam komponen yang kompleks, baik

komponen organic maupun komponen anorganik. Kromatografi dapat dibedakan atas

berbagai macam tergantung pengelompokkannya. Berdasarkan pada mekanisme

pemisahannya, kromatografi dapat dibedakan menjadi kromatografi absorbs, kromatografi

partisi, kromatografi pasangan ion, kromatografi penukar ion, kromatografi size eksklusif,

serta kromatografi afinitas. (Gandjar, 2007)

Saat ini, kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umum dan paling sering

digunakan untuk bidang kimia analisis. Baik untuk melakukan analisis kuantitatif, analisis

kualitatif maupun analisis preparative dalam bidang farmasi, lingkungan, industry, dan

sebagainya. Dari berbagai metode yang digunakan, penulis tertarik untuk membahas tentang

kromatografi size eksklusi dimana pada dasarnya, pemisahan berbagai konstituen dengan

meninjau perbedaan ukuran dan geometri molekul. Adanya perbedaan ukuran tersebut,

menyebabkan beberapa partikel bergerak lebih cepat dari yang lainnya sehingga

1

2

menimbulkan perbedaan permukaa migrasi. Oleh karena itu, pada makalah ini akan dibahas

lebih dalam mengenai teknik kromatografi size eksklusi.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang masalah di atas, penulis merumuskan rumusan masalah

sebagai berikut.:

1. Apa yang dimaksud dengan kromatografi size eksklusi?

2. Bagaimana prinsip kerja dari kromatografi size eksklusi?

3. Bagaimana prosedur pengerjaan kromatografi size eksklusi?

4. Apa saja instrument penyusun kromatografi size eksklusi?

5. Senyawa apa saja yang dapat dimurnikan oleh kromatografi size eksklusi ?

6. Bagaimana cara pengaplikasian kromatografi size eksklusi ?

1.3 Tujuan

Berdasarkan rumusan masalah di atas, makalah tujuan makalah ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahui tentang kromatografi size eksklusi

2. Untuk mengetahui prinsip kerja dari kromatografi size eksklusi

3. Untuk mengetahui prosedur pengerjaan kromatografi size eksklusi

4. Untuk mengetahui instrument penyusun kromatografi size eksklusi

5. Untuk mengetahui Senyawa apa saja yang dapat dimurnikan oleh kromatografi size eksklusi

6. Untuk mengetahui cara pengaplikasian kromatografi size eksklusi

3

1.4 Manfaat

Makalah ini disusun dengan harapan memberikan kegunaan baik kromatgrafi size eksklusi

teoritis maupun kromatgrafi size eksklusif praktis. Kromatgrafi size eksklusi teoritis makalah ini

berguna sebagai pengembangan wawasan tentang kromatografi size eksklusi. Kromatgrafi size

eksklusi praktis makalah ini diharapkan bermanfaat bagi:

1. Penulis, sebagai sarana penambah wawasan dan pengetahuan khususnya tentang

kromatografi size eksklusi.

2. Pembaca, sebagai media informasi tentang kromatgrafi size eksklusi.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Kromatografi Size Eksklusi

Kromatgrafi size eksklusi adalah metode kromatografi molekul dalam larutan yang

dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Nama lain dari kromatgrafi size eksklusi yaitu gel

filtration chromatography (GFC), gel permeation chromatography (GPC), gel

chromatography, steric exclusion chromatography, dan exclusion chromatography. Kata

“gel” merupakan konotasi dari fase diam yang digunakan yaitu gel organik yang semirigid

dan nonrigid, sedangakan kromatgrafi size eksklusi fase diamnya yaitu gel yang organic atau

organic yang rigid.

Kromatgrafi size eksklusi biasa digunakan dalam pemisahan molekul yang besar atau

kompleks makromolekul seperti protein. Untuk pemisahan yang biasanya makromolekul

dalam fase gerak larutan disebut Gel Filtration Chromatography sedangkan ketika pemisahan

dilakukan di dalam fase gerak non-larutan disebut Gel Permeation Chromatography.

2.2 Prinsip Kromatografi Size Eksklusi

Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase diam. Solut dengan

ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-pori adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut

dengan ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu. Berikut gambar

proses pemisahan menggunakan kromatografi size eksklusi (Sastrohamidjojo, H. 1985).

4

5

Gambar 2.1 Proses pemisahan kromatografi size eksklusi (Mori, Sadao., 1999)

2.3 Prosedur Kromatografi Size Eksklusi

Sebelum melakukan pemisahan atau pemurnian zat dilakukan terlebih dahulu dilakukan

persiapan seperti pemilihan fase gerak dan fase diam, persiapan sampel yang akan dipisahkan

setelah itu barulah dilakukan proses pemisahan menggunakan kromatografi size Eksklusi.

Berikut ini tahapa-tahapan untuk melakukan pemisahan menggunakan kromatografi size

Eksklusi :

1. Pemilihan fase gerak

Fase gerak yang digunakan harus memenuhi kriteria sebagai berikut:

a. Harus mampu melarutkan sampel polimer pada fase diam

b. Memiliki viskositas yang cukup rendah untuk sistem kromatgrafi size eksklusi sehingga

dapat dijalankan dengan range tekanan yang normal.

c. Harus efektif untuk mencegah molekul polimer dari interaksi yang kuat dengan fase diam

(contoh: lewat adsorpsi).

Fase gerak yang digunakan dapat berupa fase gerak larutan, fase gerak organik atau

dalam larutan buffer.

6

2. Pemilihan fase diam

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga

solute dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam.. Fase

diam optimum yang digunakan memiliki kriteria sebagai berikut:

a. Packing material tidak berinteraksi dengan sampel

b. Fase diam harus terbasahi semua dengan fase gerak, tetapi tidak mengalami efek

pembengkakan.

c. Fase diam harus stabil pada temperatur yang diatur

d. Harus memiliki volume pori yang cukup dan berbagai ukuran pori sehingga dapat

melakukan distribusi berat molekul sampel yang memadai.

Fase diam yang digunakan biasanya terdiri dari dekstrosa, agarosa, poliakrilamid atau

silika yang memiliki sifat fisik yang berbeda. Jenis ukuran pori yang ada pada fase diam

ini berkisar 60-4000 Å dengan ukuran partikel berkisar 5-10 µm dengan efisiensi ribuan

theoritical plate setiap 15 cm kolom. Untuk fase gerak organik, kolom yang biasa

digunakan yaitu crosslinked (dengan difinilbenzen) gel polistiren atau trimetilsilane

turunan silika. Untuk fase gerak larutan yang digunakan yaitu crosslinked hidroksilat

polimetakrilat atau gel poli(propilen oksida) atau gliseril (diol) turunan silika. Contoh

fase diam yang dapat digunakan pada Size Exclusion Chromatography:

Sphadex, umumnya digunakan untuk pemisahan protein. Bahan disintesis dari

polisakarida seperti dekstran. Adanya residu gugus hidroksil menyebabkan dekstran

menjadi polar sehingga dapat direaksikan dengan epiklorhidrin CH2(O)CHCH2Cl.

Polimer yang terjadi dapat dikontrol dengan penambahan asam.

Bio-Gel, golongan yang bersifat inert dinamakan Bio-Gel P, yang dibuat dengan

kopolimerisasi dari akrilamida dan N-N’ metal-bis-akrilamid. Senyawa ini tidak

larut dalam air maupun beberapa pelarut organik.

7

Agarosa, digunakan untuk pemisahan senyawa berbobot molekul >500.000 ,

dinamakan juga Bio-Gel A. dibuat dari poligalaktopiranosa, sehingga agak lunak

dan tidak tahan tekanan tinggi.

Stiragel, digunakan untuk pemisahan senyawa yang tidak larut sama sekali dalam

air dan menggelembung (swelling) dalam pelarut organic. Stiragel dibuat dari

polistiren yang tahan pada suhu di atas 150 C. berat molekul senyawa yang dapat⁰

dipisahkan antara 16.000 – 40.000 dalton.

3. Penyiapan sampel

Sampel harus bebas dari patikel, terutama untuk partikel yang berukuran 34 mikrometer

atau kurang; kemudian dilakukan ekstraksi clean up, sentrifugasi dan filtrasi. Campuran

ekstrak sampel kemudian difiltrasi, dimana campuran sampel terbut melewati membran filter

yang memisahkan sampel padat dari solut. Kemudian pelarut mencuci sampel dari filter ke

bejana pengumpul. Dua atau tiga kali dicuci dapat mencegah pengurangan sampel. Kemudian

sampel disentrifugasi dan ekstras didecanter dan dipisahkan. Residual sampel dicuci 2 sampai

3 kali. Buffer sampel tidak sama dengan buffer kolom. Buffer sampel yang dipilih adalah

buffer yang membantu stabilitas dan aktivitas protein. Buffer harus mempertahankan

kapasitasnya dan pH yang konstan. Buffer yang dapat digunakan yaitu 0.05 M Natrium

fosfat, 0.15 M NaCl pH 7 atau buffer sampel dimana proteinnya dapat larut dan stabil. Hal-

hal yang perlu diperhatikan pada waktu preparasi sampel:

a. Sampel harus larut semuanya. Lakukan sentrifugasi atau filtrasi untuk memisahkan

partikel yang tidak larut.

b. Temperatur kolom dan buffer harus sama untuk menghindari masuknya udara ke dalam

kolom

c. Jika menggunakan sampel yang baru gunakan 0.55 mM Natrium Fosfat, 0.5 mM NaCl,

pH 7

8

d. Jika menggunakan konsentrasi yang tinggi, turunkan kecepatan sentrifugasi dan

perpanjang waktu.

4. Pemisahan Zat

Sampel diperlihatkan setelah injeksi pada kepala kolom, fase gerak melewati kolom

dengan laju aliran yang tetap, dengan tekanan gradient pada seluruh panjang kolom. Sampel

sudah masuk ke dalam kolom, partikel dari fase diam merupakan pori-pori dengan ukuran

pori yang dikontrol. Molekul yang lebih kecil mampu untuk menembus pori-pori ketika

melewati kolom, tetapi yang molekul lebih besar terlalu besar untuk masuk kedalam pori-

pori fase diam dan hanya berada di daerah interstitial. Molekul yang lebih kecil tertahan

sebentar pada pori yang dimasuki, hingga molekul yang lain masuk ke dalam pori. Molekul

yang lebih besar mengalir lebih cepat karena mereka tidak masuk ke dalam pori-pori fase

diam. Akhirnya dua molekul tersebut dipisahkan dan menjadi 2 peak kromatogram yang

berbeda.

2.4 Instrumentasi Kromatgrafi Size Eksklusi

Kromatgrafi size eksklusi umum instrumen kromatgrafi size eksklusi yang terdiri

dari sebuah pompa untuk mendorong pelarut melalui instrumen, port injeksi dilakukakan

untuk memasukkan sampel ke kolom, dan kolom berfungsi untuk menahan fase diam,

sedangkan detektor berfungsi untuk mendeteksi komponen ketika sampel meninggalkan

kolom, kemudian software akan berfungsi untuk mengontrol bagian-bagian yang berbeda

dari instrumen dan menghitung dan menampilkan hasil.

9

Gambar 2.2 Diagram sistematik perakitan khas kromatografi size eksklusi

Pengukuran kromatgrafi size eksklusi dapat dilakukan dengan pengukuran HPLC,

dimana sistem terdiri dari penghantar pelarut, sistem mekanisme, dan sistem deteksinya.

sistem penghantar pelarut adalah rangkaian reservoir pelarut, degasser dan pompa aliran

pelarut. Sistem pemisahan terdiri dari injector sampel dan kolom kromatgrafi size eksklusi.

Sistem deteksi terdiri dari detektor, perekam strip-chart dan tabung pembuangan. Sistem

penanganan data digunakan untuk menganalisis kromatgrafi size eksklusichromatogram dan

menghitung rata-rata berat molekul sampel. Pengukuran dapat digunakan di tempat perekam

strip-chart. Autosampler (autoinjector) yang digunakan untuk menyuntikkan sampel solusi

ke sistem pemisahan pada interval tertentu yang juga dapat digunakan dengan instrumen

HPLC.

Komponen yang digunakan dalam system kromatografi ini antara lain :

1.Kolom

10

Pemilihan ukuran pori kolom tergantung pada ukuran molekul zat yang akan dipisahkan.

Sampel yang ukurannya (bobot molekul) bermacam-macam tidak mampu  dipisahkan jika

digunakan satu ukuran pori-pori dari kolom.

Setiap kolom eksklusi dengan ukuran pori tertentu hanya memiliki satu kurva  kalibrasi

tertentu. Batas eksklusi dan rentang kerja BM tidak didefinisikan dengan  jelas karena

distribusi pori kolom tidak sempit. Jika distribusi pori lebar maka akan  dihasilkan kurva

dengan kemiringan yang tajam. Dengan demikian, senyawa-senyawa  yang memiliki ukuran

molekul hampir sama akan dihasilkan daya pisah yang rendah  jika rentang kerja BM-nya

besar. Sebaliknya, jika distribusinya sempit maka akan  didapat kurva yang lebih mendatar.

Sehingga, rentang kerja BM akan menjadi lebih  kecil tetapi daya pisah molekul yang

memiliki ukuran hampir sama akan meningkat.  Pemisahan optimum komponen-komponen

suatu senyawa sampel yang  memiliki distribusi bobot molekul lebar dapat diperoleh jika

kolom eksklusi memiliki  rentang kerja BM yang berbeda. Pada setiap rangkaian kolom dapat

dihasilkan kurva  kalibrasi tersendiri dimana perolehan kurva kalibrasi ini didapat dengan

menyuntikkan senyawa baku (standar baku) yang diketahui bobot molekulnya,  kemudian

menentukan VR masing-masing.  Dengan demikian, kromatgrafi size eksklusimerupakan

suatu metode cepat yang  dapat digunakan untuk memperoleh perkiraan harga bobot molekul

(BM) suatu  sampel dengan membandingkan empirisnya pada senyawa standar baku.

Untuk  memperoleh nilai perbandingan yang bagus, struktur antara sampel dengan

senyawa  standar baku haruslah sama.

2. Fase Gerak

Fase gerak dalam kromatgrafi size eksklusiharus merupakan pelarut polimer yang baik

untuk  menghindari efek noneksklusi. Sampel harus terdisolusi pada suhu yang sesuai

dan  bertahan cukup lama sebelum akhirnya disuntikkan. Hal tersebut bertujuan agar

pelipatan dapat mengembang dalam fase gerak atau dengan kata lain memecahkan  agregat.

11

Bila sampel hanya terlarut sebagian dalam fase gerak, maka dapat terjadi  peningkatan

tekanan pada kolom karena ukuran partikel yang terlalu besar. Efek  tersebut dapat diatasi

dengan cara memilih pelarut lain, atau meningkatkan temperatur kolom.

Pada beberapa kondisi, perlu adanya penambahan elektrolit agar terjadi  disagregasi,

sedangkan beberapa polimer seperti polyolefin, biasa digunakan untuk analisis  pada suhu

tinggi (140-1500 °C). Bila analisis dilakukan pada kondisi tersebut, maka  fase gerak yang

bersifat toksik tidak dapat digunakan (contoh: triklorobenzen),  sehingga perlu dipilih fase

gerak yang lain. Fase gerak dalam kromatgrafi size eksklusiterbagi menjadi  dua bagian

besar, yaitu:

a. Fase gerak untuk protein dan polimer larut air

kromatgrafi size eksklusisering digunakan untuk mengisolasi protein, menghilangkan

agregat,  desalting sampel protein, memisahkan fraksi asam nukleat, atau untuk

mengetahui  sifat polimer larut air yang digunakan dalam makanan, cat, sediaan farmasi,

dan  sebagainya. Fase gerak yang digunakan disesuaikan dengan fase diam, antara lain:

Silika

Jenis kolom SW, SWxI, dan Super SW digunakan untuk menganalisis protein dan asam

nukleat, menggunakan aqueous buffer sebagai fase gerak.

Polimetakrilat

Jenis kolom PW dan PWxI digunakan untuk menganalisis polimer karida, asam nukleat virus,

menggunakan fase gerak berupa larutan  buffer atau larutan garam. Kolom PWxI yang

digunakan untuk menganalisis  polimer kationik menggunakan fase gerak berupa larutan

garam encer.

3. Detektor

Setelah pemisahan sampel polimer, molekul dapat dideteksi dengan sistem  detektor yang

berbeda-beda, misalnya dengan refraktometer atau detektor UV-Vis.  Intensitas detektor

12

direkam sebagai fungsi volume pelarut eluen. Sistem dikalibrasi  dengan menggunakan

polimer sampel yang diketahui berat molekulnya, dapat  dilakukan dengan evaluasi berat

molekul dan distribusi berat molekul menggunakan  detektor sinar menyebar (light scatter

detector), berat molekul polimer dapat  ditentukan kromatgrafi size eksklusi langsung dan

tidak perlu dikaliberasi terlebih dahulu. 

Untuk mendapatkan data yang tepat dan akurat dapat digunakan kromatgrafi size

eksklusi, dimana terdapat sedikit perbedaan pada alat yang digunakan dalam HPLC

konvensional. Ada beberapa ketentuan yang perlu diperhatikan dalam kromatgrafi size

eksklusi. Pertama, perlu digunakan pompa kualitas tinggi yang membuat laju alir lebih

konstan dalam memompa pelarut yang digunakan. Kedua, katup loop harus digunakan untuk

menyuntikkan larutan sampel, dan ketiga, suhu kolom harus dijaga agar konstan.

2.5 Senyawa Yang Dapat Dimurnikan Oleh Kromatografi Size Eksklusi

Kromatgrafi size eksklusiumumnya diaplikasikan untuk kompleks makrom

olekuler seperti protein dan polimer industri terutama digunakan untuk

memisahkan molekul biologis, untuk menentukan bobot molekul dan distribusi bobot

molekul dari polimer (Mori, Sadao., 1999).

2.6 Aplikasi Kromatografi Size Eksklusi

Dalam jurnal karya Widyastuti W1., Agus Ariyanto1, Gina M1., Arina K2 , dan A.

Nawawi2, A. Mutalib yang berjudul Penandaan Falerin Dengan Iodium-131 Dan Uji

Biodistribusi Pada Mencit Yang Diinflamasi. Dalam jurnal ini dibahas tentang

pengaplikasian kromatografi size eksklusi untuk memisahkan senyawa falerin yang

terkandung dalam daun dan buah mahkota dewa. Berikut resume jurnal dalam

pengamplikasian kromatografi size eksklusi dalam memisahkan senyawa.

13

Falerin adalah senyawa aktif yang terkandung dalam daun dan buah mahkota

dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl) yang telah dibuktikan mempunyai efek anti

inflamasi. Penandaan falerin dengan radionuklida pemancar gama bertujuan untuk

mengamati perilaku farmakokinetika falerin di dalam tubuh khususnya untuk merunut

metabolitnya. Telah dilakukan penandaan pada falerin dengan 131I menggunakan

pereaksi iodogen. Hasil penandaan dikarakterisasi dengan kromatografi cair kinerja tinggi

(HPLC) menggunakan fasa gerak metanol 70% dan kromatografi lapis tipis (KLT)

dengan sistem pengembang kloroform-metanol (9:2) dan efisiensi penandaan ditentukan

dengan kromatografi lapis tipis menggunakan eluen yang sama. Produk dimurnikan

dengan kromatografi eksklusi ukuran menggunakan kolom sephadex G-25 dan fasa gerak

larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,4.

Serbuk sephadex G-25 disuspensikan dalam salin, kemudian dimasukkan ke dalam

kolom diameter 0,5 cm dan tinggi 2,5 cm yang bagian bawahnya telah ditutup dengan

kapas bebas lemak. Lapisan atas sephadex G-25 ditutup dengan kapas bebas lemak,

kemudian kolom dicuci dengan larutan dapar fosfat 0,05 M pH 7,4. Larutan falerin hasil

penandaan dimasukkan ke dalam kolom dan dielusi dengan larutan dapar fosfat. Tiap

200 µl eluat ditampung dalam tabung reaksi kecil dan tiap fraksi tersebut diukur

radioaktivitasnya dengan alat pencacah gamma. Fraksi yang memiliki radioaktivitas paling

tinggi kemudian dianalisis kemurnian radiokimianya menggunakan KLT dengan fase

diam strip TLC-SG dan eluen campuran kloroform–metanol (9:2), kemudian diukur

radioaktivitasnya dengan alat pencacah gamma.

Hasil penandaan falerin dengan 131I dimurnikan dengan kromatografi eksklusi

menggunakan kolom sephadex G-25 dan eluen larutan dapar fosfat pH 7,4 0,05 M untuk

memisahkan falerin bertanda 131I dari pengotor 131I bebas karena perbedaan berat

14

molekulnya. Sebagai pembanding dilakukan hal yang sama terhadap larutan Na131I, dan

falerin bertanda terelusi lebih dahulu dibandingkan dengan 131I bebas.

Gambar 2.3 Hasil Analisis Pemurnian Kromatografi Size Eksklusi.

Dari gambar diatas menunjukan hasil analisis pemurnian kromatografi size eksklusi,

dimana disebalah kiri adalah senyawa falerin dan sebelah kanan adalah NaI sebagai

pembanding. Hasil KLT falerin bertanda yang telah dimurnikan menunjukkan kemurnian

radiokimia 96,0 ± 0,4% dengan pengulangan sebanyak 3 kali.

15

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

kromatgrafi size eksklusi adalah metode kromatografi molekul dalam larutan yang

dipisahkan berdasarkan ukuran partikel. Prinsip kerja dari kromatgrafi size eksklusiadalah

Berdasarkan perbedaan ukuran partikel antara solut dengan fase diam. Solut dengan ukuran

kecil akan masuk ke dalam pori-pori adsorben sehingga tertahan, sedangkan solut dengan

ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben akan terelusi lebih dulu. Biasanya kromatgrafi size

eksklusidigunakan dalam pemisahan molekul yang besar atau kompleks makromolekul

seperti protein.