312

KINERJA FERMENTASI RAGI Saccharomyces cerevisiae PADA

MEDIA VHG DENGAN VARIASI KONSENTRASI EKSTRAK RAGI

SEBAGAI SUMBER NITROGEN UNTUK PRODUKSI BIOETANOL

Safri Ishmayana, Alfitri, Sadiah Djajasoepana, Saadah D. Rachman, Agus Safari

Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjadjaran

Jln. Raya Bandung-Sumedang km. 21 Jatinangor, 45363, Sumedang

e-mail: ishmayana@unpad.ac.id

Abstrak

Salah satu upaya untuk meningkatkan perolehan etanol pada akhir proses fermentasi adalah dengan

meningkatkan konsentrasi gula pada awal proses fermentasi sampai konsentrasi di atas 27% (b/v), yang

dikenal sebagai kondisi very high gravity (VHG). Namun kondisi ini menyebabkan terjadinya cekaman

osmotik pada sel ragi. Pada penelitian ini dilakukan penambahan ekstrak ragi yang kaya akan nitrogen

sehingga dapat meningkatkan toleransi ragi terhadap cekaman osmotik. Galur ragi yang digunakan yaitu

Saccharomyces cerevisiae A12, konsentrasi gula yang digunakan 30% (b/v) sedangkan media YEP

digunakan 1/10, 1/5, 1 dan 2 kali dari formula acuan serta YNB sebagai kontrol. Fermentasi dilakukan

dengan sistem batch pada kondisi aerob, suhu 30C, dan kecepatan pengocokan 150 opm. Kurva

pertumbuhan dengan pengukuran kerapatan optik pada 600 nm (OD600nm) menunjukkan bahwa YEP dengan

konsentrasi yang paling tinggi membantu pertumbuhan sel ragi dengan nilai OD600nm tertinggi. Parameter

pertumbuhan menujukkan bahwa sel yang tumbuh pada media YNB memiliki viabilitas paling baik,

meskipun penggunaan glukosa dan produksi etanol oleh sel yang tumbuh pada media YNB tidak

memberikan hasil yang baik. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami fenomena ini. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi media YEP sangat berpengaruh terhadap kinerja fermentasi ragi

S. cerevisiae. Semakin tinggi konsentrasi YEP yang digunakan, maka semakin baik kinerja fermentasi.

Kata Kunci : bioetanol, cekaman osmotik, sel ragi, media fermentasi

Abstract

One of the efforts to increase ethanol recovery at the end of fermentation process is by increasing sugar concentration at the initial stage of the fermentation process above 27% (w/v), which is known as very high gravity (VHG) condition. However this condition expose yeast cell to osmotic stress. In the present study, we investigate the addition extra YEP into media on fermentation performance. Saccharomyces cerevisiae strain

A12 was used in the present study, sugar concentration used were 30% (w/v) whereas YEP media was 1/10, 1/5, 1 and 2 fold of reference formula and YNB as control. Fermentation was conducted in aerobic batch culture, at 30C and shake speed at 150 opm. Growth curve by measuring optical density at 600 nm

(OD600nm) indicate that the highest YEP concentration give the best support for yeast cell growth as indicated by the highest OD600nm. Growth parameters indicate that yeast cell grown in YNB has the best viability (~90%) until the end of fermentation, although it showed poor glucose utilization and ethanol production.

Further investigation is required to understand this phenomenon. The results of the present study suggest that YEP concentration is very important in determining fermentation performance of the yeast cell. Higher YEP concentration promote fermentation performance.

Keywords: bioethaol, osmotic stress, yeast cell, fermentation media

1. Pendahuluan

Bioetanol dihasilkan melalui proses fermentasi gula sederhana dengan bantuan mikroorganisme.

Mikroorganisme utama yang digunakan dalam fermentasi etanol adalah ragi [1]. Saccharomyces

cerevisiae merupakan spesies ragi yang digunakan secara luas dalam fermentasi bioetanol skala

besar. Hal ini karena S. cerevisiae dapat memproduksi etanol dalam jumlah besar dan mempunyai

toleransi yang relatif tinggi terhadap etanol [2].Dalam industri fermentasi, ragi terpapar terhadap

berbagai faktor lingkungan seperti konsentrasi gula, konsentrasi etanol, sumber nitrogen, pH, dan

tekanan osmosis yang menyebabkan terjadinya berbagai cekaman [3].

Ragi memerlukan sumber karbon, nitrogen, mineral, dan vitamin [4]. Kombinasi nutrien ini

diformulasikan dalam media fermentasi untuk mendukung pertumbuhan dan viabilitas sel ragi.

Ragi dari genus Saccharomyces mampu memanfaatkan berbagai gula dengan jumlah enam atom

313

karbon sebagai sumber karbon dan energi [5]. Galur ragi umumnya mempunyai ketahanan terhadap

konsentrasi glukosa sampai 22% (b/v) [6].

Peningkatan efisiensi produksi bioetanol dapat dicapai dengan memilih bahan baku yang tepat,

optimasi praperlakuan bahan baku dan tahap fermentasi etanol, serta pemanfaatan produk samping

secara optimal. Optimasi dalam fermentasi etanol dapat dilakukan dengan mengendalikan

parameter utama pada tahap tesebut. Kondisi-kondisi yang mempengaruhi fermentasi etanol antara

lain konsentrasi gula, konsentrasi etanol, suhu kultur dan pH media [7].

Berbagai penelitian mengenai optimasi media fermentasi telah dilakukan untuk meningkatkan

kinerja fermentasi. Suplementasi media menggunakan ekstrak ragi, dinding sel, glisin, tepung

kedelai, dan tepung finger millet (Eleusine coracana L.) dapat meningkatkan produksi etanol dan

mempersingkat waktu fermentasi [8, 9]. Jumlah gula yang difermentasi meningkat dengan

suplementasi media menggunakan glisin, prolin dan glisin betain [10].

Penerapan teknologi very high gravity (VHG) sangat potensial untuk diterapkan dalam

pembuatan bioetanol. Teknologi VHG pada produksi bioetanol didefinisikan sebagai media

fermentasi yang mengandung 27 g atau lebih padatan terlarut (gula) /100 g bubur [11]. Hal yang

perlu dipertimbangkan dalam fermentasi kondisi VGH adalah ragi mengalami cekaman osmotik

yang dapat mengurangi pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel secara signifikan [11]. Adapun

kadar gula yang tinggi dalam media fermentasi menyebabkan peningkatan tekanan osmosis yang

mengganggu viabilitas sel ragi yang menyebabkan rendahnya etanol yang dihasilkan. S. cerevisiae

dapat memfermentasi gula yang jumlahnya ditingkatkan ketika semua nutrien yang diperlukan

tersedia dalam jumlah yang cukup [8]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini akan dipelajari

bagaimana pengaruh ketersediaan nutrisi, khususnya nitrogen dari YEP, terhadap kinerja

fermentasi pada kondisi VHG.

2. Metode Penelitian

Galur ragi dan pemeliharaan

Ragi yang digunakan dalam proses fermentasi adalah S. cerevisiae A12, suatu galur ragi toleran

etanol yang digunakan dalam pembuatan roti. Ragi ditumbuhkan pada agar miring dengan media

YEP yang terdiri dari (b/v) 0,5% ekstrak ragi; 0,5% pepton bakteriologis; 0,3% amonium sulfat;

0,3% kalium dihidrogen fosfat; 1% glukosa; dan 1,5% agar. Media disimpan pada suhu 4oC dan

ditumbuhkan kembali setiap enam bulan sekali.

Media tumbuh dan kondisi kultur

Ragi ditumbuhkan pada empat media YEP variasi konsentrasi dengan komposisi pada Tabel 1

dan satu media YNB (0,67 g/L) sebagai kontrol.

Tabel 1 Komposisi media YEP dalam gram per 100 mL pelarut.

Komponen Konsentrasi YEP

1/10* 1/5* 1* 2* Ekstrak ragi 0,05 0,1 0,5 1

Pepton 0,05 0,1 0,5 1

(NH4)2SO4 0,03 0,06 0,3 0,6

KH2PO4 0,03 0,06 0,3 0,6 * kali konsentrasi yang digunakan oleh Ishmayana [12]

Masing-masing media ditambahkan dengan glukosa sampai konsentrasi akhir glukosa mencapai

30% (b/v). Media disterilisasi pada suhu 121oC dan tekanan 15 psi selama 15 menit.menggunakan

autoklaf sebelum digunakan.

Pembuatan kultur biang dilakukan dengan mengambil beberapa ose kultur dari agar miring

kemudian diinokulasi ke dalam media inokulum steril. Kemudian media ini dinkubasi selama 16

jam pada suhu 30oC dan dikocok dengan kecepatan 150 opm. Media inokulum yang digunakan

merupakan media YEP yang terdiri dari 0,5 gram ekstrak ragi; 0,5 gram pepton bakteriologis; 0,3

314

gram amonium sulfat; 0,3 gram kalium dihidrogen fosfat per 100 mL volume media dengan

konsentrasi glukosa akhir 2%. Rasio ukuran labu erlenmeyer terhadap volume kultur dijaga pada

4:1 untuk menjaga ketersediaan oksigen terlarut. Kultur biang digunakan untuk menginokulasi

media produksi dengan jumlah sel hidup awal sebanyak ~106 sel/mL.

Kondisi eksperimen dan pencuplikan

Kultur aerobik dibuat dengan memasukkan media cair YEP dan YNB ke dalam labu erlenmeyer

yang sudah disterilisasi, kemudian ditutup dengan kapas. Konsentrasi sel hidup pada awal

fermentasi dikondisikan sebanyak ~106 sel/mL. Sampel diambil dari media eksperimen dengan

menggunakan mikropipet aseptik setiap 6 jam pada 36 jam pertama kemudian setiap 12 jam

sampai mencapai 144 jam. Parameter yang diukur pada setiap pengambilan sampel adalah kurva

pertumbuhan dengan cara mengukur kerapatan optis pada panjang gelombang 600 nm, jumlah sel,

laju pertunasan sel, konsentrasi etanol dan konsentrasi glukosa.

Kurva pertumbuhan Pertumbuhan ragi ditentukan dengan mengukur kerapatan optis pada panjang gelombang 600

nm (OD600nm) menggunakan spektrofotometer. Sampel dapat diencerkan dengan akuades bila

diperlukan.

Perhitungan sel ragi

Sel dihitung dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x dengan bantuan

hemasitometer setelah diwarnai menggunakan metilen violet seperti dijelaskan oleh Smart et al.

[13].

Analisis residu glukosa dan produk etanol

Kadar glukosa ditentukan dengan menggunakan metode kalium ferisianida basa sebagimana

dijelaskan oleh Walker & Harmond [14], sedangkan kadar etanol ditentukan dengan metode

enzimatik menggunakan enzim alkohol dehidrogenase seperti dijelaskan oleh Amerine & Ough

[15] dengan modifikasi pada aktivitas enzim yang digunakan menjadi sebesar 4000 Unit/mL.

3. Hasil dan Pembahasan

Parameter pertumbuhan sel ragi Kurva pertumbuhan ragi ditentukan dengan mengukur turbiditas media pada panjang

gelombang 600 nm. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sel ragi yang ditumbuhkan pada

media YEP2 memberikan nilai turbiditas yang paling tinggi, diikuti oleh YEP1, YEP1/5, dan YEP1/10.

Sel ragi yang ditumbuhkan pada media YNB sebagai kontrol memberikan nilai yang hampir sama

dengan sel ragi yang ditumbuhkan pada media YEP1/10 seperti ditunjukkan pada Gambar 1(a). Fase

adaptasi teramati pada 6 jam pertama setelah kultur biang dimasukkan ke dalam media fermentasi,

diikuti oleh fase eksponensial. Sel ragi yang ditumbuhkan pada media YEP2 mengalami fase

eksponensial yang paling lama (sampai jam ke 18) dibandingkan sel ragi yang ditumbuhkan pada

media lainnya (sampai jam ke 12). Hal ini menunjukkan bahwa media fermentasi dapat

mempengaruhi pertumbuhan sel ragi, semakin tinggi konsentrasi YEP yang digunakan, maka

semakin baik pertumbuhan sel. Hal ini sesuai dengan hasil yang diungkapkan oleh Bafrncov et al.

[8] yang menunjukkan adanya peningkatan jumlah biomassa setelah penambahan ekstrak ragi pada

media fermentasi. Hal ini dimungkinkan terjadi karena penambahan ekstrak ragi ke dalam media

fermentasi meningkatkan nitrogen alfa amino bebas (free alpha amino nitrogen / FAN), yang

merupakan salah satu nutrisi yang diperlukan pada proses biosintesis komponen sel ragi [16].

Untuk menentukan fase kematian pada proses fermentasi ini, dilakukan penghitungan sel hidup

dan sel mati dengan menggunakan hemasitometer dan pewarnaan menggunakan metilen violet

untuk membedakan sel yang hidup dan sel yang mati [13]. Gambar 1(b) menunjukkan kurva

jumlah sel hidup selama proses fermentasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa sel ragi yang

ditumbuhkan pada media YEP pada umumnya mengalami kematian sel lebih cepat dibandingkan

dengan sel yang ditumbuhkan pada media YNB. Meskipun demikian, jumlah sel paling banyak

diperoleh pada media yang menggunakan YEP2. Fenomena yang teramati pada media YNB

315

berhubungan dengan viabilitas sel. Penentuan viabilitas sel menunjukkan bahwa sel yang

ditumbuhkan pada media YNB menunjukkan viabilitas yang paling baik dibandingkan sel yang

ditumbuhkan pada media YEP mencapai ~90% viabilitas sepanjang proses fermentasi (Gambar

2(a)). Fenomena ini merupakan hal yang tidak terduga, karena YNB merupakan media yang

memiliki nutrisi yang lebih miskin dibandingkan YEP, namun ternyata dapat mempertahankan

viabilitas sel lebih baik dibandingkan YEP. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan

untuk memahami fenomena ini.

(a) (b)

Gambar 1 (a) Kurva pertumbuhan dan (b) jumlah sel hidup S. cerevisiae A12 dalam variasi

konsentrasi media sesuai keterangan dengan konsentrasi glukosa 30% berdasarkan

OD600nm. Kultur ditumbuhkan pada kondisi aerob pada suhu 30oC.

(a) (b)

Gambar 2 (a) Viabilitas sel dan (b) persentase sel bertunas ragi S. cerevisiae A12 pada variasi

media sesuai keterangan dengan konsentrasi glukosa 30%. Kultur ditumbuhkan dalam

kondisi aerob pada suhu 30oC.

Kecepatan pertumbuhan sel ditentukan dengan menentukan laju pertunasan sel. Gambar 2(b)

menunjukkan persentase sel bertunas selama proses fermentasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan

bahwa sel yang ditumbuhkan pada media YEP memiliki presentase sel bertunas yang lebih tinggi

selama proses fermentasi, meskipun pada akhir fermentasi sel yang ditumbuhkan pada media

YEP1/10 memiliki nilai presentase sel bertunas yang hampir sama dengan sel yang ditumbuhkan

pada media YNB. Hal ini membuktikan bahwa YEP merupakan sumber nutrisi yang lebih baik

dibandingkan YNB dalam hal pembentukan sel baru, sesuai dengan hasil kurva pertumbuhan

(Gambar 1(a)) yang menunjukkan lebih tingginya turbiditas sel yang ditumbuhkan pada media

YEP. Hal ini juga menunjukkan bahwa meskipun dalam hal viabilitas sel YNB memberikan hasil

lebih baik, namun sel hidup yang ditumbuhkan pada media YNB tidak memiliki pertumbuhan sel

yang baik, atau dengan kata lain, jumlah sel selama proses fermentasi relatif konstan.

0

2

4

6

8

10

12

0 24 48 72 96 120 144

OD

60

0nm

Waktu (jam)

0

10

20

30

40

0 24 48 72 96 120 144

Sel

hid

up (

10

6/m

L)

Waktu (jam)

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120 144

Via

bil

itas

(%

)

Waktu (jam)

0

20

40

60

80

100

0 24 48 72 96 120 144

Sel

ber

tunas

(%

)

Waktu (jam)

316

Penggunaan substrat dan pembentukan produk

Kadar glukosa yang tersisa dan etanol yang dihasilkan selama proses fermentasi ditentukan

untuk menentukan efisiensi fermentasi. Gambar 3(a) menunjukkan sisa glukosa selama proses

fermentasi. Sel ragi yang ditumbuhkan pada media YEP2 menunjukkan penggunaan glukosa paling

baik, ditunjukkan dengan residu glukosa yang paling sedikit pada akhir proses fermentasi, diikuti

oleh media YEP1, YEP1/5, YEP1/10 dan YNB. Hal ini menunjukkan bahwa sel memerlukan nutrisi

yang cukup agar dapat menggunakan gula yang tersedia dalam media fermentasi. Jika nutrisi tidak

mencukupi, maka pada akhir proses fermentasi gula akan tersisa dan menurunkan efisiensi

fermentasi. Menurut Thomas et al. [17] sintesis enzim glikolisis serta enzim dari jalur heksosa

monofosfat pada kondisi stres osmotik akibat konsentrasi gula tinggi diatur oleh konsentrasi gula

dan ketersediaan nitrogen. Kekurangan nitrogen pada media dengan konsentrasi gula tinggi

merupakan salah satu penyebab fermentasi berjalan lamban atau terhenti. Penghambatan transpor

gula merupakan faktor utama yang menghambat metabolisme fermentasi. Transporter gula

menunjukkan afinitas tinggi terhadap substrat yang diatur oleh represi katabolik dan tidak

terdeteksi pada fermentasi dengan konsentrasi gula yang tinggi. Keterbatasan nitrogen menghambat

sintesis protein transporter sehingga sistem transpor gula menjadi tidak aktif meskipun masih

terdapat gula dalam media [18]. Dengan demikian, laju fermentasi meningkat dengan

meningkatnya konsentrasi nitrogen pada media ditandai dengan besarnya penurun residu glukosa.

Hasil pengukuran etanol ditunjukkan pada Gambar 3(b). Etanol yang dihasilkan sesuai

dengan sesuai dengan penggunaan glukosa yang telah dibahas sebelumnya. Etanol paling

banyak dihasilkan pada media yang menggunakan YEP2, dimana residu glukosa terdeteksi

paling sedikit. Meskipun demikian, etanol paling tinggi yang diperoleh hanya sebanyak

~5% yang terdeteksi pada jam ke 132. Jumlah ini masih dibawah hasil teoritis sebesar

~14%. Hal ini dapat terjadi karena adanya cekaman osmotik yang menurunkan efisiensi

fermentasi. Selain itu pada jam ke 144 terdeteksi penurunan kadar etanol yang dapat terjadi

karena adanya aktivitas sel ragi menggunakan kembali etanol yang dihasilkan karena

sudah memasuki fase diauksik [19].

(a) (b)

Gambar 3 (a) Residu glukosa dan (b) etanol yang dihasilkan oleh S. cerevisiae A12 pada media

fermentasi sesuai keterangan dengan konsentrasi awal glukosa 30%. Kultur

ditumbuhkan pada kondisi aerob dan suhu 30oC.

4. Simpulan

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ketersediaan nutrisi, terutama nitrogen, sangat

berpengaruh terhadap kinerja fermentasi ragi pada kondisi VHG. Penggunaan YEP pada fermentasi

VHG lebih baik dibandingkan YNB karena dapat meningkatkan kinerja fermentasi ragi yang

ditunjukkan dengan tingginya kadar etanol yang dihasilkan. Meskipun demikian, pada penelitian

ini ditemukan adanya fenomena yang tidak terduga, yaitu viabilitas sel yang tinggi pada sel yang

ditumbuhkan pada media YNB. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami fenomena ini.

0

20

40

60

80

100

120

0 24 48 72 96 120 144

Res

idu g

luko

sa (

%)

Waktu (jam)

0

1

2

3

4

5

6

0 24 48 72 96 120 144

Eta

no

l (%

)

Waktu (jam)

317

Ucapan Terima Kasih

Kami mengucapkan terima kasih kepada Prof. Robert P. Learmonth dari University of

Southern Queensland untuk pemberian kultur murni S. cerevisiae galur A12.

Referensi

[1] G.M. Walker, Bioethanol: science and technology of fuel alcohol. BookBoon.com.

Frederiksberg, Denmark, 2010.

[2] J. S Harrison dan J. C. J. Graham, Yeast in Distilery Practice, Academic Press. London,

England, 1970.

[3] B. R. Gibson, S. J. Lawrence, J. P. R. Leclaire, C. D. Powell dan K. A. Smart, Yeast

responses to stresses associated with industrial brewery handling FEMS Microbiology

Reviews, vol. 31, no. 5, hal 535569, 2007.

[4] C. W. Bamforth, Food, Fermentation and Microorganisms. Blackwell Publishing. USA,

2005.

[5] M. Carlson, Regulation of Sugar Utilization in Saccharomyces Species, Journal of

Bacteriology, vol. 169, no. 11, hal 4873-4877, 1987.

[6] B. Atkinson dan F. Mavituna, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, The

Nature Press, USA, 1983.

[7] M. L. Shuler dan F. Kargi, Bioprocess Engineering, Basic Concept, Prentice Hall Inc., USA,

1992.

[8] P. Bafrncov, D. mogroviov, I. Slvikov, J. Ptkov dan Z. Dmny, Improvement of

very high gravity ethanol fermentation by media supplementation using Saccharomyces

cerevisiae, Biotechnology Letters, vol. 21, hal 337341, 1999.

[9] L. V. A. Reddy dan O.V.S. Reddy, Rapid and enhanced production of ethanol in very high

gravity (VHG) sugar fermentation by Saccharomyces cerevisiae: Role of finger millet

(Eleusine coracana L.) flour, Process Biochemistry, vol. 41 hal. 726729, 2006.

[10] K. C. Thomas, S. H. Hynes dan W. M. Ingledew. Effects of particulate materials and

osmoprotectants on very-high-gravity ethanolic fermentation by Saccharomyces cerevisiae,

Applied and Environmental Microbiology, vol. 60, no. 5, hal 1519-1524, 1994.

[11] K. C. Thomas, S. H. Hynes, A. M. Jones dan W. M. Ingledew, Production of fuel alcohol

from wheat by VHG technology, Applied Biochemistry and Biotechnology, vol. 43, hal. 211-

226, 1993.

[12] S. Ishmayana, Investigation of growth medium supplementation and ethanol tolerance of the

yeast Saccharomyces cerevisiae. MSc Thesis. University of Southern Queensland, Australia,

2011.

[13] K. A. Smart, K. M. Chambers, I. Lambert, C. Jenkins dan C. A. Smart, Use of methylene

violet staining procedures to determine yeast viability and vitality, J. Am. Soc. Brew. Chem.,

vol. 57, no. 1, hal 18-23, 1999.

[14] J. A. Walker dan D.L. Harmon, Technical note: a simple, rapid assay for alpha-amylase in

bovine pancreatic juice, J. Anim. Sci., vol. 74, hal. 658-662, 1996.

[15] M. A. Amerine dan C. S. Ough, Wine and Must Analysis, John Wiley & Sons, New York,

USA, 1974.

[16] G. P. Casey, C. A. Magnus dan W. M. Ingledew, High-Gravity Brewing: Effects of Nutrition

on Yeast Composition, Fermentative Ability, and Alcohol Production, Appl. Env. Microbiol.,

vol. 48, no. 3, hal. 639-646, 1984.

[17] K. C. Thomas, S. H. Hynes dan W. M. Ingledew, Practical and theoretical considerations in

the production of high concentrations of alcohol by fermentation, Process Biochemistry, vol.

31, no. 4, hal. 321 331, 1996.

[18] J. Arrizon dan A. Gschaedler, Increasing fermentation efficiency at high sugar concentrations

by supplementing an additional source of nitrogen during the exponential phase of the tequila

fermentation process, Can. J. Microbiol., vol. 48, hal. 965-970, 2002.

[19] J. Pikur, E. Rozpdowska, S. Polakova, A. Merico dan C. Compagno, How did

Saccharomyces evolve to become a good brewer?, TRENDS in Genetics, vol. 22, no. 4, hal.

183-186, 2006.