laporan rekgen isolasi cdna (2)

7/26/2019 Laporan Rekgen Isolasi CDNA (2)

1/11

LAPORAN PRAKTIKUM

REKAYASA GENETIKA

ISOLASI RNA GEN mmPMa PADA TANAMAN TEMBAKAU TRANSGENIK

Oleh:

HANNI TSAAQIFAH

P051150071

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASASAR!ANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

"01#


2/11

PENDAHULUAN

La$a% Bela&a'(

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein

(Moeljopawiro dkk, 1992). RNA total dapat di isolasi dari sel dengan menambakan

en!im "Nase yang ber#ungsi untuk mendegradasi "NA. $solat RNA yang baik

merupakan syarat untuk penelitian yang berkaitan dengan ekspresi gen. %aris et al.

(2&&') dalam penelitiannya menyebutkan bawa analisis ekspresi dari suatu tanaman

baik identi#ikasi maupun pengujian pola ekspresinya merupakan taapan penting untuk

mendapatkan in#ormasi tentang #ungsi gen.

"alam entral dogma dikatakan bawa in#ormasi biologi bermula dari "NA ke

RNA kemudian ke protein. emakaian *"NA dalam beberapa kegiatan molekular

*enderung lebi aman dibandingkan RNA (mRNA) se*ara langsung. %al ini dikarena

kestabilan dari RNA itu sendiri yang muda sekali terdegradasi ole RNase. +eingga

untuk berkerja dengan RNA se*ara langsung menjadi kurang e#isien karena

membutukan tingkat keatiatian yang *ukup tinggi. -le karena itu, *ara yang

dianggap paling e#ekti# dan e#isien ketika ingin berkerja dengan RNA, yaitu dengan

menggunakan sekuens komplemen dari mRNA tersebut yang selanjutnya dalam

prosesnya mengasilkan *"NA. ustaka *"NA anya mengandung sekuen yang

terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi tertentu menjadikan suatu

kelebian tersendiri. Aplikasi analisis *"NA tela dilaporkan pada penelitian en

(2&12) dalam mengetaui ekspresi gen dari irus /M0 pada tanaman tembakau.

ebi lanjut, pada konstruksi pustaka *"NA memerlukan RNA dependent DNA

polymeraseberupa R/ R atauReverse TranscriptaseR, dimana merupakan teknik

yang digunakan untuk membuat *"NA (complementary DNA) dengan RNA sebagai

templatenya. roses ini adala kebalikan dari transkripsi "NA menjadi RNA yangumum terjadi pada makluk idup, seingga dinamakan reverse transcription

(transkripsi terbalik) (ang, et al., 2&1&). "i alam proses ini anya terjadi pada irus

irus tertentu ketika menyisipkan materi genetiknya yang berupa RNA ke dalam genom

inangnya. Mengingat pentingnya teknik analisis ekspresi gen tersebut maka praktikum

kali ini dilakukan isolasi RNA, serta analisis ekspresi gen pada daun tembakau

transgenik yang mengandung genMmpma.


3/11

/anaman tembakau merupakan tanaman dikotil dan inang alami untuk A.

tumi#a*iens (Mayo et al., 2&&3). /anaman tembakau transgenik yang dipakai pada

praktikum ini mengandung gen Mmpma, merupakan gen +-" yang awalnya disandi

ole Melastoma malabathricum . yang terlibat dalam *ekaman asam dan kadar Al

yang tinggi, menyandi %4A/ase membrane plasma (Mu!uni, 2&11). 5eberadaan

protein ini banyak terlibat pada proses *ekaman, yang bekerja dengan mengaktiasi

serangkaian transporter sekunder. 6ntuk itu penting mempelajari isolasi RNA serta

analisis ekspresi dari gen mMpma.

T)*)a' P%a&$+&)m

raktikum ini bertujuan untuk mengetaui dan memaami prinsip bagaimana

mengisolasi suatu gen dari asil ekspresinya (pada jaringan tanaman).

METODOLOGI

Tem,a$ -a' .a&$)

raktikum ini dilakukan di aboratorium 7iorin, +%7, $nstitut ertanian

7ogor ($7) pada tanggal 28 Maret 2&13.

Ala$ -a' Baha'

Alat yang digunakan pada praktikum ini adala mortar, microtube sentrifuge,

mikropipet, mikrotip, inkubator, sentri#uge, spektro#otometer, dan mi*rowae.

+edangkan alat yang digunakan untuk deteksi RNA dan *"NA adala mesin

termo*y*ler dan elektro#oresis gel agarose.

7aan yang digunakan adala daun tembakau, ntirogen *air, /ri!ol, , kloro#orm,

isopropanol, etanol " :';, dd%2- " &,1;, 2&< M-+ ,#ormamid,

#ormaldeid, bu##er "NAse, "NAse, en!imreverse transcriptase, primer a*tin, dd%2-,

gel agarose, /A 1< t7r, alkool, dan es.

a%a Ke%*a

I/la/+ RNA -e'(a' Rea(e' T%+l

embaran daun tembakau digerus menggunakan mortar dengan ditambakan

nitrogen *air. +erbuk daun tembakau yang diperole kemudian dimasukkan kedalam


4/11

microtubeyang berisi =&& >l /ri!ol, kemudian diomogenisasi menggunakan otrte?

dan diinkubasi selama ' menit pada suu ruang. arutan ditambakan dengan 2&& >l

kloro#orm, diinert (dibolakbalik) dan diinkubasi kembali selama 8 menit pada suu

ruang. 5emudian disentri#ugasi dengan ke*epatan 1&&&& rpm dengan suu @ selama

1' menit. 7agian supernatan diambil dan dipindakan dalam mi*rotube baru kemudian

ditambakan '&& >l isopropanol. Mi*rotube dibolakbalik kembali dan diinkubasi pada

suu ruang selama 1& menit, kemudian disentri#uge pada suu @, 1& menit.

+upernatan dibuang dan pelet ditambakan '&& >l etanol " :';. "ilakukan

sentri#ugasi dengan ke*epatan ':&& rpm, pada suu @ selama ' menit. ellet

kemudian dikeringkan dengan a*um dry dan ditambakan dengan RNAse dalam

" water &,1 ; sebanyak 8&l.

Pe'()&)%a' K)a'$+2+&a/+ -a' 3+/)al+/a/+ RNA

engukuran kuantitas RNA dilakukan dengan menggunakan spektro#otometer

pada panjang gelombang A23&BA2=& dengan *ampuran '>l sampel ditamba dengan

39' >l ", dimasukkan dalam kuet, dan diukur absorbansinya.

+etela diukur menggunakan spektro#otometer, sebanyak 1& >g RNA

ditambakan dengan premi? kemudian diinkubasi dengan suu 3' selama 1& menit

dan selanjutnya diinkubasi kembali didalam es selama ' menit. 5omposisi premi? yang

digunakan adala sebagai berikutC

2&< M-+ C 1,2' >l

Dormamid C 12,' >l

Dormaldeid C @,8:' >ldd%2- " &,1; C 3,=:' >l

0isualisasi RNA dilakukan dengan memindakan RNA pada gel agarosa 1;

(wB) selama 8& menit dengan tegangan 1&& 0olt. Eel agarosa 1; dibuat dengan

menimbang &,8' gram agarose kemudian ditambakan 1,:' ml 2&< M-+ dan dd% 2-

" 81,83 ml. +elanjutnya dipanaskan dalam mi*rowae, didinginkan, dan

ditambakan 1,=9 ml #ormaldeyde. +ebanyak 1& >l sampel ditambakan dengan 2 >l

loading dye kemudian dimigrasikan ke dalam gel agarose.

Rumus F -" 23& ? pengen*eran ? konstanta

5onstanta RNA F @&


5/11

Pe'(h+la'(a' DNA -a%+ /am,el RNA

+ejumla d%2- " dan ' >g total RNA di*ampurkan ingga men*apai olume

1& >l, kemudian ditambakan dengan 1,1 >l bu##er "NAse dan &,2 >l "NAse. alu

*ampuran larutan tersebut diinkubasi dalam R selama '1& menit untuk aktiasi

en!im pada suu 2'. +etela itu ditambakan "/A 1 >l dan diinkubasi kembali

pada R dengan suu 3' selama 1& menit. arutan kemudian disimpan dalam es

selama ' menit.

S+'$e/+/ 4DNA

+intesis *"NA dilakukan dengan men*ampurkan '< i +*ript rea*tion mi?

sebanyak 2>l, &,' >l i +*ript reerse trans*riptase, 1 >l RNA template (1&& #g menjadi 1

>g total RNA), dan 3,' >l nu*lease#ree water. ampuran diinkubasi pada mesin

termo*y*ler dengan suu 2' selama ' menit, @2 selama 8& menit, dan ='

selama ' menit. *"NA yang diperole kemudian disimpan dalam suu @ sebelum

digunakan untuk analisis.

"alam konstruksi pustaka *"NA, "NA polimerase yang memerlukan RNA

(RNA dependent DNA polymerase) yakni reverse transcriptase (R/) digunakan

untuk mengcopy messenger RNA (mRNA) menjadi molekul *"NA utas ganda.

7erbeda dengan mRNA yang dengan muda terdegradasi dan menggambarkan

proses transkripsi dari gengen yang akti# pada suatu jaringan atau sel tertentu,

*"NA merupakan molekul yang lebi stabil seingga sesuai untuk disisipkan ke

dalam ektor kloning, baik berupa plasmid, *osmid, atau bakterio#age. opulasi

mRNA yang tela di copy menjadi *"NA apabila diklon akan mengasilkan

pustaka *"NA yang bersi#at permanen. 5euntungan pustaka *"NA adala anya

mengandung sekuen yang terekspresi dalam bentuk mRNA dalam suatu kondisi

atau waktu tertetu (5leinsmit G 5is, 199').PR a&$+'

+etela taapan transkripsi balik, maka untuk memeriksa apaka transkripsi balik

berasil, maka dilakukan R dengan menggunakan gen aktin. /otal olume *ampuran

R aktin adala 1& Hl yang terdiridari *"NA template1 Hl, mastermi? ' Hl, primer

aktin actF (A/EEAEA/EEAEEA/A/) sebagai primer forward dan actR

(AE//E/EEAA//EA) sebagai primer reverseyang spesi#ik untuk ekson1


6/11

ekson2 aktin dari tembakau masingmasing primer yang digunakan sebanyak &.2' Hl

dan dd%2- sebanyak 8.' Hl. 5ondisi R terdiridari1: siklus.

Real T+me PR

+ampel yang tela diukur dengan menggunakan nanodrop untuk mengetaui

konsentrasi *"NA sampel yang didapat kemudian di sesuaikan seingga menjadi '&

ngBHl. ampuran berisi 1Hl sampeldan 9Hl mi? Real /ime R, yang kemudian di R

ingga 1: siklus.

HASIL DAN PEMBAHASAN

rosedur isolasi RNA arus dilakukan dalam kondisi RNase#ree. +ampel daun

tembakau yang diisolasi RNAnya arus bebas dari kontaminasi dengan ribonucleases

(RNase). Ada beberapa al yang dapat dilakukan untuk meminimalkan risiko

mengekspos sampel dari "nases eksternal dan Rnases. eralatan yang dipergunakan

arus terlebi daulu diautokla# atau ditreatment (disemprot etanol :&;) untuk

men*ega kontaminasi RNase. erlakuan dengan larutan &,1; diethyl pyrocarbonate

(") yang ber#ungsi menginaktiasi nuklease juga dapat dilakukan.

I/la/+ RNA -e'(a' Rea(e' T%+l

ada praktikum ini digunakan daun tembakau yang dialuskan menggunakan

mortar. +e*ara garis besar, isolasi RNA melalui ' taapan yaituC 1). %omogenisasi, 2).

+eparasi, 8) resipitasi RNA, @). en*u*ian RNA, '). Redissoling RNA. /aap

omogenisasi, sampel serbuk daun tembakau ditamba reagen /ri!ol. roses separasi

dilakukan dengan penambaan *loro#orm ke dalam sampel yang tela diomogenisasi.

+etela disentri#uge, sampel akan terpisa menjadi 2 bagianC bagian atas adala #ase air

(bening) G bagian bawa adala sel yang rusak (*oklat tua), diantara kedua #ase

tersebut terdapat padatan berwarna puti susu. Dase air mempunyai olume sebesar :&;dari olume reagen /ri!ol yang digunakan. RNA berada dalam #ase air tersebut.

Memasuki taap presipitasi, #ase air diambil kemudian ditamba dengan isopropanol.

Dungsi isopropanol adala untuk membantu presipitasi RNA. ellet RNA baru akan

terliat, setela dilakukan sentri#uge. ellet RNA berwarna puti susu. +etela itu pellet

RNA di*u*i dengan menggunakan ".


7/11

Pe'()&)%a' K)a'$+2+&a/+ -a' 3+/)al+/a/+ RNA

ellet RNA kemudian dianalisis konsentrasinya dengan menggunakan

spektro#otometer. Analisis dilakukan dengan panjang gelombang 23& nm. emba*aan

23& nm memungkinkan untuk mengitung konsentrasi asam nukleat. -" yang

diperole dari panjang gelombang tersebut kemudian dimasukkan dalam rumus untuk

mengitung konsentrasi RNAnya.

Rasio -"23&B-"2=& dari RNA total pada penelitian ini adala berkisar antara 1.1

dan 1.' yang menunjukkan bawa RNA total yang diisolasi mempunyai kemurnian

yang masi renda diaman masi terdapat kontaminan protein.

/abel 1. %asil pengukuran absorbansi RNA total daun tembakau

5el A 23& A 2=& 5emurnian5onsentrasi

(>gBml)

1 &,89& 21=@

2 &,=9: @9=@

8 &,2=1 &,212 1,82 1':8,3

@ &,@38 &,82& 1,@@ 2'92,=

' &,@82 &,2=@ 1,'2 2@19,23 &,832 &,2'@ 1,@2 2&2:,2

: &,1&@ &,&== 1,1= '=2,@

= &,8': &,8&8 1,1: 1999,2

9 &,33= &,@:8 1,@1 8:@&,=

1& &,29' &,22: 1,8& 13'2

%asil elektro#oresis RNA total menunjukkan adanya pita RNA yang semir puti

tipis pada 9 kelompok. %asil yang semir menunjukkan bawa RNA total yang diisolasi

mempunyai kemurnian yang masi renda (menga*u pada tabel 1), kondisi tersebut

masi kurang bagus digunakan sebagai *etakan untuk sintesis *"NA total. ita RNA

total pada daun tembakau kemungkinan adala rRNA yang terdapat pada mitokondria

dan kloroplas yang berukuran 28+, 13+, dan '+. untuk kelompok : migrasi RNA tidak

terliat, kemungkinan disebabkan karena proses isolasi RNA kurang berasil seingga

jumla RNA sangat renda. %al ini menga*u menga*u pada tabel 1, dimana kelompok :

kuantitas RNAnya anya '=2,@ >gBml. /entu berbeda jau dengan kelompok lain yang

men*apai angka ribuan.

Rumus F -" 23& ? pengen*eran ? konstanta F ...HgBml

5onstanta RNA F @&


8/11

Eambar 1. %asil isualisasi RNA total daun tembakau menggunakan elektro#oresis gel

agarosa 1; (11&C sampel kelompok 11&)

S+'$e/+/ 4DNA

ada taap ini asil isolat RNA selanjutnya akan dipakai untuk pembentukan

*"NA. "alam entral dogma dikatakan bawa in#ormasi biologi bermula dari "NA ke

RNA kemudian ke protein.ada praktikum ini *"NA total tela berasil disintesis

melalui transkripsi balik dengan menggunakan RNA total sebagai *etakan (tabel 2).

"engan primer oligod/, anya mRNA yang dapat disintesis menjadi *"NA karena

mempunyai poliA pada ujung 8I sedangkan rRNA dan tRNA tidak mempunyai

/erampli#ikasinya *"NA dengan primer ActF danActR menunjukkan bawa sintesis

*"NA total melalui proses transkripsi balik tela berlangsung dengan baik. %asil dari

sintesis *"NA dapat diliat pada tabel 2.

/abel 2. %asil uji *"NA menggunakan nanodrop.

5elompok5onsentrasi

*"NA

1 =83.9

2 :='.=

8 =29.:

@ 1&&3.=

' =8@

3 ::=.:

: :93.:

= =1'.'

9 =1=.9

1& [email protected]


9/11

PR a&$+' -a' Real T+me PR

+etela terbentuk *"NA, maka dilakukan R untuk mendapatkan gen

+-". 6ntuk mendapatkan gen tersebut diperlukan primer spesi#ik yang dapat

menempel dan mengampli#ikasi gen tersebut se*ara spesi#ik seingga *"NA

tersebut dapat diketaui mengandung gen +-" dan dapat dijadikan sebagai

pustaka *"NA. RNA yang tela diisolasi kemudian digunakan sebagai template untuk

mensintesis "NA dalam proses R. -le karena R tidak dapat dilakukan dengan

menggunakan RNA sebagai *etakan maka terlebi daulu dilakukan proses transkripsi

balik (reverse transcription) teradap molekul mRNA seingga diperole molekul

*"NA (complementary DNA). Molekul *"NA tersebut kemudian digunakan sebagai

*etakan dalam proses R. /eknik R/R memerlukan en!im transkriptase balik

(reverse transcriptase). n!im transkriptase balik adala en!im "NA polimerase yang

menggunakan molekul RNA sebagai *etakan untuk menyintesis molekul "NA (*"NA)

yang komplementer dengan molekul RNA tersebut (Juwono, 2&&3).

RT-!Rdipakai untuk reaksi transkripsi balik untuk mengkonersi RNA menjadi

*"NA dan reaksi R untuk mengampli#ikasi gen tertentu yang ingin kita ketaui

ekspresinya dilakukan dalam satu rangkaian reaksi dan dalam satu tabung reaksi yang

sama. +edangkan pada two step RT-!R, reaksi transkripsi balik dan reaksi R

dilakukan se*ara terpisa dan melibatkan beberapa tabung reaksi.

Eambar 2. Era#ik Real /imeBK R, A. gra#ik aktin tanaman tembakau, b. gra#ik

sampel *"NA /embakau transgenik.

BA


10/11

/abel 8. "ata asil Real /ime R sampel daun tembakau.

ha''e

l

Sam,l

e

Name

$

a4$+'

F+$$+'(

a4$+'

$

/am,e

l

F+$$+'(

/am,e

l

E&/,%e/

+

/am,el

1 1 0 0 0

" " 0 0 0

6"

" 17 0

0

0 0 0

5 5 0 0 0

# # 0 0 0

7 706#

0 108 0

0

8 8 0 0 0

9 9 0 0 0

10 10568

#0 0

0

7erdasarkan data pada tabel 8, 6ntuk mengetaui apaka gen +-" terekspresi

atau tidak, maka dilakukan pengitungan 4$ dengan merasiokan antara *t sampel B *t

aktin, dimana asil akir menujukkan angka &. Artinya pada praktikum ini ekspresi dari

gen +-" pada tanaman tembakau transggenik tidak berasil. %asil tersebut menga*u

pada gra#ik maupun data dimana *"NA pada semua sampel tidak mun*ul. %asil ini

berkaitan dengan asil isolat RNA pada taap awal yang masi kurang murni seingga

bis ajadi berdampak pada taap berikutnya.

KESIMPULAN

ada saat melakukan isolasi RNA perlu keatiatian karena si#at dari RNA yang

single strand sangat rentan dan muda terdegradasi. +e*ara umum isolasi RNA

dilakukan dengan taapan 1). %omogenisasi, 2). +eparasi, 8) resipitasi RNA, @).

en*u*ian RNA, '). Redissoling RNA. ada praktikum isolasi RNA ini digunakan

reagen tri!ol.

ada praktikum ini berasil melakukan isolasi RNA meskipun asil yang

diperole semir, namun al tersebur menunjukkan bawa terdapat RNA dengan

kemurnian yang renda. %asil ini sebenarnya belum begitu baik sebagai template

sintesis *"NA. ustaka *"NA dapat diperole dari mengisolasi mRNA dari suatu

jaringan tanaman sebagai asil ekspresi dari sebua gen target6


11/11

6ntuk analisis ekspresi dari tanaman tembakau transgenik, tidak berasil.

5esimpulan ini menga*u pada data kyang menunjukkan rasio antara *t sampelB*t aktin

yang nilainya &.

"AD/AR 6+/A5A

en Ronging, iu ie, Lan iuKing, Kiu nian, Lang unun, +ong 7ao

Eang, Jan eiKiang, and Jang /ieao. 2&12. *"NAAD Analysis o#

"i##erentially ?pressed Eenes in /oba**o $n#e*ted by Tobacco Mosaic "irus.

A!TA A#R$N$M%!A &%N%!A, 8=(1)C 32:&.

%aris, N., Aswidinnoor, %., +uwanto A., +uartono, M., Matius, N. /., urwantara, A.

2&&'. 5onstruksi pustaka *"NA dari daun klon karet A0R-+ 2&18: yang

diin#eksi patogen !orynespora cassiicola.Menara er'ebunan, :8(2)C @@32.

Mayo, 5. ., 7. . Eon!ales dan %. +. Mason. 2&&3. Eeneti* trans#ormation o# toba**o

N/1 *ell witAgrobacterium tumefaciens,Nat. rot.( 1C 11&'1111.

Moeljopawiro, +., +udjadi, $smadi, +. +odoadisewoyo, %. %artiko, L. Asmara,

/.Juwono dan +isimindari. 1992. #eneti'a Mole'uler. Reviewer) *oedoro

&oedarsono. usat Antar 6niersitas7ioteknologi, 6niersitas Eadja Mada,

Jogyakarta.

Mu!uni. 2&11. $olasi, engklonan, dan5onstruksi RNAi Een enyandi %4A/ase

Membaran lasma dariMelastomamalabathricum. Disertasi+iologi(

%ntitutertanian +ogor.7ogor.

Juwono /.2&&3.+iote'nologiertanian. EadjaMada 6niersity ress. Jogyakarta.

ang E, "ong J , ia N, ang J, Lang , Ku , i J M, %uang , 5ang +.

2&1&. *"NAAD analysis reeals di##erential gene e?pression in weat adult

plant resistan*e to stripe rust.Acta Agron &in, 83C @&1O@&9

laporan rekgen isolasi cdna (2)

Documents