LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA

Untuk memenuhi tugas Praktikum Biologi Molekuler

Tanggal Praktikum : 10 Oktober 2014

Disusun oleh :

Ana Mawarni 4411411019

Alfiatus Z. 4411412022

Darmawati 4411412059

Saeful Anhari 44114120

Ulin Nikhmatul A. 4411412074

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2014

A. TUJUAN

- Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA dari jaringan tumbuhan dan hewan

dengan metode Dixit dan PCI

B. DASAR TEORI

Langkah awal setiap percobaan di bidang biologi molekuler adalah

memperoleh DNA yang dapat berasal dari berbagai jaringan atau sel makhluk hidup.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik berfungsi untuk

mengatur keseimbangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler . DNA

terdapat pada nukleus, mitokondira dan kloroplas (Ridwan, 2010).

DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel dengan

komponen-komponenya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan

basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter

pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah sel lengkap dari materi genetik (DNA)

yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom (Ridwan, 2010)

Prinsip dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding dan membran sel,

pemisahan DNA dari debris sel dan purifikasi DNA (Nita, 2013). Dalam menentukan

metode ekstraksi DNA yang digunakan sangat bergantung pada sumber DNA-nya.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu

supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah. Presipitasi merupakan

langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran

(Alberts dkk. 1994: 254).

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida

dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavoid. Sedangkan DNA

dari hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari

tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini

disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada

beberpa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sukit dipisahkan dari ekstrak asam

nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim (Diah,

2010).

Tujuan isolasi DNA menggunakan metode PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl

Alcohol) adalah untuk memisahkan antara DNA dan komponen lainnya. Phenol-

Chloroform berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid.

Dengan dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi

terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA

berada, protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-

Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya

besar.

C. ALAT DAN BAHAN

1. Alat :

- Botol kecil

- Label

- Bekerglass

- Tube dan Tip

- Inkubator

- Sentrifus

- Mikropipet

- Mortar dan pestle

- Neraca analitik

- Vortex

- Waterbath

- Freezer

2. Bahan :

- Daging sapi

- Buah Strowberry

- Larutan buffer ekstraksi

- Pottasium asetat 5 M

- Chloroform Isoamyl alcohol (CIAA)

- SDS 20 %

- Ethanol 70 %

- Isopropanol

- Buffer TE

- Proteinase K

- NaCl 5 M

- Phenol

- Ethanol Absolute dingin

D. METODE

a. Isolasi DNA dengan metode Dixit

1. Menggerus 0.5 g sampel dengan menambahan 3ml buffer ekstraksi

2. menambahkan 600µl 20% SDS, kocok kuat

3. Menginkubasi pada suhu 65 °C selama 30 menit, mengocok perlahan tiap 5 menit

4. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit

5. Memindah supernatant ke tube baru, menambahkan 1 ml Potassium asetat

6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit

7. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit

8. Memindahkan supernatant ke tube baru, menambahkan isopropanol sebanyak 2/3

volume supernatant

9. Mengocok perlahan membentuk angka 8

10. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2menit

11. Membuang supernatant, cuci pellet menggunakan 1 ml ethanol 70%

12. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit

13. Mengeringkan pellet pada suhu37 °C selama 60 menit

14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpan pada suhu -20 °C

b. Isolasi DNA dengan metode PCI

1. Mnggerus 30 mg sampel dengan mortar hingga halus, menambahkan 500 µl

buffer ekstraksi

2. Menambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex

3. Menginkubasi dalam waterbath 55 °C selama 60 menit, kocok perlahan tiap

10menit

4. Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putar pelan selama

60 menit pada suhu ruang

5. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 3,000 rpm selama 5menit

6. Memindahkan supernatant ke tube baru, Menambahkan 50 µl 5 M NaCl dan 1 ml

ethanol absolute dingin, kocok perlahan

7. Menginkubasi di freezer selama 60 menit

8. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit

9. Membuang supernatant

10. Menambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet

11. Sentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit

12. Membuang supernatant dan meniriskan sampai tidak ada sisa ethanol yang

tertinggal

13. Mengeringkan sisa ethanol padasuhu 37 °C selama 60 menit

14. Menambahkan 50-100 µl buffer TE pada pellet dan simpan pada freezer

E. HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode dixit

Gambar Hasil

Warna larutan kemerahan.

Agak berlendir dan keruh

Larutan homogen setelah

di sentrifuse

Hasil Isolasi DNA menggunakan Metode PCI

Warna agak keruh

tekstur agak berlendir

larutan homogen

supernatan yang telah di

pindahkan ke tub yang

baru. Dan pallet di buang

supernatan tidak berwarna

Pallet setelah yang telah di

keringkan menggunakan

microwave

Pada praktikum isolasi DNA ini menggunakan sumber jaringan dari tanaman

strawberry dan hewan yaitu daging sapi. Tanaman yang digunakan menggunakan

jaringan tanaman yang mengandung sedikit kontaminan di atas, misalnya

menggunakan daging buah. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan

tersebut dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim

endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris,

EDTA, CTAB dan buffer lisis yang mengandung potasium asetat dan SDS. Proteinase

K digunakan untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan.Senyawa CTAB

dan SDS merupakan detergen yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi

protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat

menghambat aktivitas enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat

berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks

dengan CTAB-Potasium asetat-protein-debris sel. Kloroform isoamyl alkohol (CIAA)

digunakan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom,

sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan ethanol 70%. DNA dalam

ethanol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi

protein tidak dapat larut dalam air.

Dengan menggunakan kedua bahan tersebut yaitu daging sapi dan buah

strawberry, kami melakukan isolasi DNA dengan dua metode. Metode yang pertama

menggunakan metode PCI ( Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol ) metode yang

kedua menggunakan metode dixit.

Pada kedua Metode Penambahan buffer ekstarksi pada kedua bahan tersebut

dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer dan

menjaga struktur DNA ketika proses penggerusan. Bahan yang telah di tambahkan

buffer ekstraksi di gerus untuk mempermudah dan mempercepat proses melisiskan

membran sel. Sama halnya dengan pada metode dixit penambahan buffer ekstraksi

juga dimaksudkan untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid. Terjadinya

proses lisis ditandai dengan adanya tekstur lendir.

Kedua metode menggunakan SDS dimaksudkan untuk melisiskan dinding dan

membran sel. Untuk PCI ditambahkan proteinase-K untuk mendegradasi protein

globuler dan membantu melarutkan lipid dan membran sel.

Inkubasi dimaksudkan membantu proses denaturasi pada suhu optimum lipid

atau protein dapat terdenaturasi. Pengocokan dimaksudkan supaya denaturasi merata

pada seluruh bagian. Pada metode PCI dilakukan di waterbath dan inkubasi pada

metode dixit dilakukan di oven. Kemudian pengocokan setiap 10 dan 5 menit.

Sebelum di sentrifuse isolasi DNA yang menggunakan metode PCI

ditambahkan NaCl, CIAA, dan phenol. NaCl berfungsi untu menghilangkan

polisakarida. Tujuan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) untuk memisahkan

antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform berfungsi sebagai

pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan dilakukannya ekstraksi

menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3 fase dimana terdiri dari

fase air yang ada di paling atas tempat DNA berada, protein yang terkoagulasi di fase

yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform yang ada di paling bawah karena sifat

chloroform yang berat jenisnya besar.

Fase air yang diambil kemudian diendapkan. untukmenciptakan kondisi netral

dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat pada DNA sehingga DNA

mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat kemudian dimurnikan dengan

penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi lagi untuk didapatkan pelet.

Sentrifus pada kedua metode dimaksudkaan supaya larutan dapat homogen

lebih cepat. Pada metode PCI setelah sentrifus pertama supernatan ditambahkan

larutan NaCl dan absolute dingin kemudain di kocok perlahan selama 60 menit. Hal

tersebut di maksdukan agar larutan dapat homogen namun tidak merusak struktur

DNA.

F. KESIMPULAN

Dari praktikum isolasi DNA dapat disimpulkan bahwa DNA dapat diisolasi,

baik pada hewan maupun pada tumbuhan. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi

DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Isolasi DNA memiliki beberapa

tahapan, yaitu isolasi jaringan, dinding dan membran sel dilisiskan, ekstraksi dalam

larutan, purifikasi, dan presipitasi.

DAFTAR PUSTAKA

Mulyani, Yanuar dkk. 2010. Perbandingan Beberapa Metode Isolasi DNA untuk

Deteksi Dini Koi Herpes Virus (KHV ) pada Ikan Mas ( Cyprinus carpio L.) .

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran Jatinangor,

UBR 40600.

Kusumawaty, Diah. 2010. Isolasi DNA Skala Kecil. Program Studi Biologi Jurusan

Pendidikan Biologi UPI

Maulana, Ridwan dkk. 2010. Isolasi DNA Tanaman dan Elektroforesis DNA.

http://www.academia.edu/6610678/Laporan_isolasi_DNA. Diakses pada 10

Oktober 2014.