Sekuensing DNA & RNASekuensing asam nukleat atau pengurutan asam nukleat adalah proses penentuan

urutan nukleotida pada suatu fragmen DNA atau RNA.

a.) Kegunaan sekuensing asam nukleatSekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup

untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan ‘murni’ mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitian biologi manapun. Sebagai contoh, dalam ilmu pengobatan sekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatan penyakit genetik. Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatan penyakit menular. Bioteknologi, yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna.

Karena RNA dibentuk dengan transkripsi dari DNA, informasi yang dikandung RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun demikian, sekuensing RNA dibutuhkan khususnya pada eukaryota, karena molekul RNA eukaryot tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena pemotongan intron setelah proses transkripsi.

b.) Sekuensing DNADewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan

menggunakan metode terminasi rantai yang dikembangkan oleh Frederick Sanger dan rekan-rekannya [1]. Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNA in vitro yang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

Metode Sanger

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebut primer yang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut. Primer tersebut diperpanjang menggunakan DNA polimerase, enzim yang mereplikasi DNA. Bersama dengan primer dan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basa deoksinukleotida (satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminator rantai) dalam konsentrasi rendah (biasanya di-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya dengan elektroforesis gel poliakrilamida, atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.

Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.

Metode Sanger asli

Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (labelling) primer yang digunakan dengan fosfor radioaktif sebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesis pada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macam primer yang ditandai dengan pewarna berpendar (fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahan radioaktif; selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metode dye primer sequencing.

Sekuensing dye terminator

Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metode dye terminator.

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaan primer berwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal primer.

Automatisasi dan penyiapan sampel

Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens sekaligus dalam sekali batch (elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalam larutan penyangga yang sesuai harus dilakukan secara terpisah.

Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode “sekuensing daur” (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelan primer (primer annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan atau melting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu seperti hairpin loop atau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler) PCR. Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95°C).

Metode Maxam-Gilbert

Pada waktu yang kira-kira hampir bersamaan dengan dikenalkannya metode sekuensing Sanger, Maxam dan Gilbert mengembangkan metode sekuensing DNA yang didasarkan pada modifikasi kimiawi DNA yang dilanjutkan dengan pemotongan DNA [2]. Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukan kloning untuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalam scale-up.

Sekuensing DNA skala besar

Metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek DNA sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan metode Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap sekuensing [3]. Keterbatasan ini disebabkan oleh probabilitas terminasi rantai yang menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.

Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai contoh, genom bakteri sederhana dapat mengandung jutaan pasang basa, sedangkan genom manusia terdiri atas lebih dari 3 milyar pasang basa. Berbagai strategi telah dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategi primer walking dan shotgun sequencing. Kedua strategi tersebut melibatkan pembacaan banyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metode shotgun sequencing merupakan metode yang paling praktis untuk sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.

Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi. Hal ini dapat dilakukan dengan metode reaksi berantai polimerase bila primer yang dibutuhkan untuk

mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat. Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu memanfaatkan bakteri untuk “menumbuhkan” salinan DNA yang diinginkan sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek sekuensing DNA skala besar memiliki persediaan pustaka hasil kloning semacam itu.

Sekuensing RNA

RNA lebih tidak stabil daripada DNA di dalam sel dan lebih rentan terhadap penguraian oleh enzim nuklease secara laboratorium. Seperti yang telah disebutkan di atas, kadang kala sekuensing RNA diperlukan walaupun informasi yang dikandung RNA sudah terdapat di dalam DNA, khususnya pada eukaryota. Dalam sekuensing RNA, metode yang umum digunakan adalah mula-mula membentuk fragmen DNA dari RNA tersebut dengan enzim transkriptase balik. Misalnya, DNA dapat disintesis dari cetakan mRNA dan disebut sebagai DNA komplementer (cDNA). Fragmen DNA tersebut kemudian dapat disekuensing dengan cara-cara seperti yang disebutkan di atas.

1. EKSPRESI GEN

Gen merupakan satuan unit informasi genetika. Dalam makalah ini, kami memusatkan perhatian pada proses konversi informasi di dalam gen menjadi molekul-molekul yang menentukan sifat-sifat sel dan virus.  Hal ini dilakukan melalui sejumlah kejadian dimana informasi dalam sekuen DNA akan digandakan menjadi molekul RNA dan kemudian digunakan untuk menentukan sekuen asam amino dari suatu molekul protein.

Protein adalah molekul-molekul yang memiliki fungsi berikut:

a. Bertanggungjawab untuk katalis dalam sebagian besar reaksi kimia (enzim)

b. Pengaturan ekspresi gen (protein pengatur)

c. Membentuk struktur sel, jaringan dan virus (protein struktur)

Protein tersusun atas satu atau beberapa asam amino yang tergabung secara kovalen. Rantai asam-asam amino ini disebut polipeptida, yang dapat disusun dalam berbagai macam urutan. Karena jumlah asam amino dalam polipeptida dapat mencapai ribuan, maka dapat dibentuk molekul protein yang beraneka macam.

Ekspresi gen merupakan proses bagaimana informasi yang ada di dalam DNA bisa di copy melalui proses traskripsi dalam organisme eukariot.  Hasil proses transkripsi adalah hn RNA (transkrip primer).  Di dalam organisme eukariot ada tahapan proses tertentu sebelum menghasilkan RNA, yaitu RNA processing.  Kemudian diikuti tahap translasi yang akhirnya menghasilkan polypeptida.  Jika dalam proses tersebut ada tahapan yang tidak terjadi, maka dalam hal ini tidak termasuk dalam kategori bahwa gen tersebut telah terekspresi atau dengan akta lain tidak terjadi ekspresi gen.

Langkah-langkah utama dalam ekspresi gen adalah sebagai berikut.

1. Sintesis molekul RNA oleh RNA polymerase, yang menggunakan sekuen basa-basa dari satu utas DNA sebagai cetakan dalam reaksi polimerisasi, seperti pada replikasi DNA. Proses ini disebut transkripsi.

2. Molekul-molekul protein kemudian disintesis melalui penggunaan sekuen basa dari molekul RNA untuk mengarahkan penggabungan asam-asam amino menurut urutan tertentu. Proses ini disebut translasi.

Secara umum, rantai informasi genetik atau DNA merupakan pusat pengendali jalannya metabolisme di dalam sel, yaitu dengan cara menyandikan protein.  Proses tersebut dilaksanakan melalui penentuan susunan nukleotida molekul RNA, yang selanjutnya susunan nukleotida tersebut diterjemahkan ke dalam susunan asam amino dari rantai polinukleotida protein.  Proses penyusunan polinukleotida RNA berdasarkan pola DNA disebut transkripsi.  Sedangkan proses penyusunan asam amino menurut pola molekul RNA disebut translasi.

2. TRANSKRIPSI

Tahapan pertama dalam ekspresi gen adalah sintesis penggandaan sebuah molekul RNA dari segmen DNA yang berisi gen.

Tahapan-tahapan transkripsi DNA adalah sebagai berikut.

1. 50 protein yang berbeda terikat pada tempat promoter, biasanya pada ujung 5’ dari gen yang akan ditranskripsi

2. Enzim polimerase RNA mengikat pada kompleks faktor transkripsi. Dua langkah pertama ini membuka ikatan ulir DNA.  Tahap 1 dan 2 disebut inisiasi.

3. Polimerase RNA bergerak menelusuri satu rantai dalam arah 3’ à 5’

4. Dalam gerakan ini, terbentuklah ribonukleotida (sebagai trifosfat seperti ATP) dalam rantai baru RNA. Setiap ribonukleotida disisipkan ke dalam rantai DNA dengan mengikuti aturan pasangan basa sebagai berikut.

C <-->G

G <-->C

T <-->A

A <--> U (Uridine Trifosfat, UTP)

5. Sintesis RNA berlangsung dalam arah 5’ à 3’

6. Saat transkripsi selesai, hasilnya dilepaskan dari polimerase dan kemudian polimerase dilepaskan dari DNA (Tahap terminasi). Tahapan 3-6 disebut elongasi.

Suatu gen tertentu dari tanaman dapat diatur gen ekspesinya, yaitu dengan mengatur proses translasinya atau mengatur proses tranksripsi.  Apabila yang diatur adalah proses translasinya, sedang proses lainnya bebas terjadi, maka disebut translation level control.  Apabila kondisi translation level control dalam keadaan permisif, maka proses translasi akan berjalan, tetapi apabila kondisinya tidak permisif maka proses translasi tidak terjadi.  Akibatnya, terjadi penumpukan (degradasi) mRNA, atau disebut RNA turn over, yaitu mRNA akan terdegradasi sebelum terjadi akumulasi yang berlebihan. 

3. TIPE-TIPE RNA

mRNA (Messenger RNA), adalah RNA yang akan ditranslasikan menjadi polipeptida.  Sebagian besar sel memproduksi sejumlah kecil dari beribu ribu molekul molekul mRNA yang berbeda dimana masing-masing ditranslasikan menjadi peptida yang diperlukan oleh sel. Kebanyakan mRNA berupa “housekeeping“ protein yang dibutuhkan oleh semua sel (misal enzim glikolisis). mRNA lain adalah berupa “ spesifik” protein hanya untuk tipe-tipe tertentu dari sel (misal hemoglobin pada sel darah merah).

2.      rRNA (Ribosomal RNA), yang akan digunakan untuk membangun ribosom sebagai mesin sintesis protein.

Ada 4 jenis rRNA pada organisme eukariot, yakni:

a.       18S rRNA, satu dari molekul molekul ini, bersama dengan 30 molekul protein yang berbeda digunakan untuk membuat subunit kecil dari ribosom.

b.      285, 5.8S, dan 5S rRNA, masing-masing molekul molekul bersama dengan 45 molekul protein yang berbeda digunakan untuk membuat subunit besar dari ribosom.

c.       28S, 18S, dan 5.8S molekul diproduksi dengan proses sebuah trankrip utama dari penggandaan sebuah gen.

3.      tRNA (Transfer RNA), adalah molekul yang membawa asam-asam amino menuju polipeptida yang sedang dirakit.

Ada 32 jenis tRNA yang berbeda pada organisme eukariot, dimana masing-masing produk adalah dari gen yang terpisah; kecil, berisi 79-93 nukleotida-nukleotida; basa-basa  berpasanagan satu dengan lainnya membentuk doubel helix; masing-masing dari tRNA membawa satu dari 20 asam amino (ujung 3’); pada loop 1 3 pasang basa yang tidak berpasangan dari antikodon; pasang basa antara antikodon dan komplementnya pada mRNA membawa asam-asam amino yang benar menuju rantai polipeptida.

Gambar 9.  tRNA processing.

4.      snRNA (Small Nuclear RNA), adalah mediator dalam langkah-langkah pemrosesan transkripsi gen-gen mRNA, rRNA dan tRNA.

5.      snoRNA (Small Nucleolar RNA).

6.      miRNA (Micro RNA), adalah RNA yang mengatur ekspresi molekul mRNA.

7.      XIST RNA, yang melakukan deaktivasi satu dari dua kromosom X pada vertebrata betina.

II.     RNA POLIMERASE

RNA polimerase adalah subunit protein multi komplek. Ada 3 jenis RNA polimerase yang ditemukan pada organisme eukariote, diantaranya:

1.      RNA polimerase I, mencatat gen rRNA untuk pendahuluan pada molekul-molekul 28S, 18S, dan 5.8S

2.      RNA polimerase II, mencatat gen-gen pengkode protein menjadi mRNA

Gambar 10 .  RNA polimerase II yang mencatat gen-gen pengkode protein

    menjadi mRNA.

3.      RNA polimerase III, mencatat gen-gen 5S rRNA dan seluruh gen-gen tRNA.

III.       RNA PROCESSING

Tahapan-tahapan RNA prosesing adalah sebagai berikut.

1.      Sintesis cap, dimana guanine (G) ditempelkan pada ujung 5′. Cap berfungsi: melindungi RNA dari pencopotan oleh enzim yang mencopot RNA dari ujung 5’, bertindak sebagai titik perakitan bagi protein yang diperlukan untuk mengumpulkan subunit kecil ribosom untuk memulai translalsi.

2.      Tahap demi tahap menghilangkan introns pada pre-mRNA dan menyisipkan exons.

3.      Sintesis poly(A) tail. Ini adalah proses pembentangan nukleotida adenine(A). Saat satu site pada pre-mRNA yang menempel poly(A) muncul dari RNAP II, transkrip dipotong kemudian poli A tertempel pada ujung 5’. mRNA yang telah komplit siap keluar ke sitosol (sisa-sisa transkripsi dilepas dan RNA polimerase meninggalkan DNA).

Ada beberapa tanaman yang proses transkripsi berjalan terus, tetapi RNA processing hanya terjadi pada kondisi permisif tertentu.  Hasil dari transkripsi DNA yang tidak mengalami RNA processing ini dikenal dengan post transcription level control.  Pada kondisi yang tidak permisif, mRNA tidak akan berfungsi, sehingga selalu dalam bentuk hn dan tidak dapat di translasi.  Zhang et al. (2007) menyebutkan bahwa post transcriptional modificasion dapat mengurangi stabilitas protein Okt-4 dan kapasitas regenerasi pada sel ES pada tikus.

C.        TRANSLASI

Translasi adalah proses penerjemahan RNA menjadi suatu barisan asam-asam amino yang menyusun protein. Translasi RNA messenger menjadi protein. Adalah suatu proses dimana mRNA terikat dengan tRNA pasangannya untuk kemudian terikat dengan ribosom (RNA ribosom). Setelah pembentukan protein di ribosom selesai, maka protein tersebut kemudian dibebaskan dan keseluruhan proses tersebut dikenal dengan translasi.

Keberadaan suatu transgen pada tanaman belum menunjukkan bahwa gen tersebut dapat terekspresi. Untuk mengekspresikan dirinya, gen memerlukan seperangkat sistem untuk memulai proses ekspresi tersebut. Gen atau DNA di dalam nukleus harus dapat ditranskrip menjadi mRNA. Selanjut- nya mRNA ini harus dapat keluar dari nukleus ke sitoplasma yang kemudian mengadakan proses translasi untuk menghasilkan protein sesuai dengan template DNA-nya.Dalam proses ekspresi ini banyak hal yang dapat terjadi sehingga gen tidak dapat menghasilkan protein yang dimaksud. Hal ini dikenal dengan istilah gene silencing, suatu kasus di mana ditemukan keberadaan sekuen DNA transgen dalam tanaman transgenic tetapi gen tersebut tidak dapat membentuk protein yang diinginkan. Beberapa faktor yang diduga men-jadi penyebabnya adalah terjadinya metilasi DNA dan co-suppressing dari sekuen yang homolog (Meyer1995).

Bila molekul mRNA kontak dengan ribosom, maka akan dibentuklah molekul protein disepanjang ribosom. Proses pembentukan protein ini disebut translasi. Jadi pada ribosom terjadi proses kimia penyusunan asam amino untuk membentuk protein.

Translasi merupakan tahap akhir dari ekspresi gen, yaitu penterjemahan runtunan nukleiotida mRNA menjadi runtunan asam amoni polipeptida.  Translasi pada proses ekspresi gen diperlihatkan pada eukariotik yang dimulai dengan pembentukan mRNA atau transkripsi di dalam inti sel dan selanjutnya mRNA keluar dari inti untuk menjadi model cetakan dalam translasi didalam sitoplasma.

 

Terdapat 3 jenis RNA yang dibentuk oleh DNA dimana tiap jenis RNA mempunyai fungsi yang berbeda, yaitu :

1.  Messenger RNA (mRNA), berfungsi membawa kode genetik ke sitoplasma untuk mengatur sintesa protein. Fungsi ini dilaksanakan dengan cara mRNA menjadi cetakan dalam penyusunan rangkaian asam amino dalam translasi. Informasi genetik yang dibawa oleh mRNA terdapat pada runtunan basa yang dikandungnya. Dalam satu rantai mRNA hanya bagiantertentu yang menjadi pola cetakan dalam sintesis protein, yaitu ruas yang diapit oleh kodon awal dan kodon akhir. Dalam sandi genetic umum yang menjadi kodon awal ialah rangkaian tiga basa AUG, sedangkan sebagai kodon akhir terdapat tiga kombinasi basa yaitu UAA, UAG dan UGA. Dalam satu mRNA prokariotik dapat ditemukan lebih dari satu ruas penyandi, sedangkan pada mRNA eukariotik hanya terdapat satu ruas. Ruas penyandi protein inilah yang setara dengan satu gen, dalam kasus gen penyandi protein.

2. Transfer RNA (tRNA) untuk transport asam amino menuju ribosom untuk digunakan menyusun molekul protein. tRNA mempunyai fungsi sebagai pengangkut asam amino kedalam kompleks translasi serta membaca sandi-sandi (kodon-kodon) mRNA. Kesanggupan tRNA menjalankan tugas tersebut ialah berkat adanya simpul anti kodon dan kemampuan membentuk satu kompleks dengan asam amino, yang disebut aminoasil-tRNA.

            Perpautan tRNA dengan asam amino terjadi berkat adanya enzim sintetase aminoasil- tRNA, yang dapat mengaitkan asam amino kepada ujung 3 tRNA. Dengan cara mengenali struktur tRNA atau untuk asam amino sintetase-aminoasil- tRNA mampu bekerja memasangkan satu jenis tRNA dengan satu jenis asam amino. Untuk 20 asam amino yang dikenali dalam sandi genetic sekurang-kurangnya ada 31 jenis tRNA.

3.  Ribosomal RNA (rRNA) untuk membentuk ribosom bersama dengan 75 protein lainnya. Ribosom merupakan tempat berlangsungnya translasi. Dengan komponen penyusunnya yang terdiri dari rRNA dan protein ribosom mampu mengenali mRNA dan sejumlah enzim yang protein yang berperanan dalam proses translasi.

Ribosom terdiri dari dua sub unit, yaitu sub unit kecil dan subunit besar. Sub unit kecil mengandung sekitar sepertiga masa ribosom dan sisanya terdapat pada sub unit besar. Dalam keadaan bebas kedua sub unit ribosm terpisah satu dari yang lain, dan mereka akan bersatu pada saat proses translasi akan dimulai. Ukuran ribosme Eukariotik adalah 80 S atau setara

dengan 4.420.000 dalton lebih besar dibandingkan dengan ribosom pada prokariotik seperti bakteri 70 S atau setara dengan 2.520.000 dalton.

            Di dalam ribosom, terdapat satu situs untuk mRNA dan dua situs untuk tRNA dan satu situs untuk enzim transferase peptidil.  Transferase peptidil adalah enzim yang berperan dalam merangkaikan satu asam amino dengan asam amino yang lain. Situs mRNA terdapat pada sub unit kecil dan sedangkan situs tRNA, yaitu situs A dan P, terdapat pada sebagian kecil pada sub unit kecil dan bagian terbesar pada sub unit besar. Situs tranferase peptidil terdapat pada sub unit besar. Adanya rRNA pada ribosom memberikan kemampuan pada ribosom untuk mengenali tRNA dan mRNA.

            Sebagian besar ribosom terletak pada sitoplasma, dan dalam sel eukariotik sejumlah ribosom terdapat dalam organel intraseluler seperti mitokondria dan kloroplas. Ribosom-ribosom ini berfungsi untuk memsintesis protein yang khusus berfungsi di dalam organel-organel tersebut.

I.          TAHAPAN TRANSLASI

Translasi memilik tiga proses, yaitu inisiasi protein, perpanjangan rantai polipeptida, dan proses akhir translasi. 

A.   Inisiasi translasi

       Inisiasi protein memiliki 3 tahapan, yaitu :

1.      Penempelan mRNA pada subunit kecil ribosom dengan cara pengenalan situs Shine Dalgarno oleh rRNA 16S;

2.      Penempelan tRNA inisiator pada situs P subunit kecil ribosom

3.      Subunit besar ribosom dengan kompleks subunit kecil ribosom-tRNA-mRNA, membentuk ribosom sempurna yang siap membaca kodon-kodon mRNA.

Pada E. coli proses inisiasi dibantu oleh tiga faktor inisiasi. Ketiga protein tersebut diberi sandi IF1, IF2 dan IF3 (IF singkatan dari inisiasi factor). Sel eukariotik mengandung faktor inisiasi yang lebih kompleks dibandingkan dengan prokariotik. Terdapat dua faktor Eif2 yang mempunyai fungsi sama dengan gabungan IF1 dan IF2; dan IF3 mempunyai fungsi sama dengan IF3.

B.  Perpanjangan rantai polipeptida

Proses ini merupakan kejadian yang lain dari proses inisiasi dengan perangkat reaksi yang berbeda. Dalam proses perpanjangan akan terlibat sejumlah protein faktor perpanjangan EF

(elongation factor), enzim transferase peptidil, serta GTP. Pada akhir proses insiasi dihasilkan satu ribosom sempurna yang berasosiasi dengan aminoasil-tRNA inisiator dan mRNA.

Pada bakteri masuknya aminoasil-tRNA kedua dan selanjutnya ke dalam situs A akan dibantu oleh protein faktor perpanjangan EF-Tu serta GTP yang membentuk kompleks EF-Tu-GTP-aminoasil-tRNA. Kompleks ini baru terbentuk jika, dan hanya jika, anti kodon dari aminoasil-tRNA dapat berinteraksi dengan kodon yang terdapat pada situs A.  Setelah dua aminoasil-tRNA berada pada ribosom transferase peptidil akan mengkatalisis reaksi pembentukan ikatan peptide antara dua asam amino.

C.  Akhir proses translasi

Bila ribosom menemui salah satu kodon akhir : UAA, UAG atau UGA, maka tidak akan ada aminoasil-tRNA yang dapat menempel pada situs A, karena tidak ada anti kodon yang cocok, sehingga proses perpanjangan rantai polipeptida akan berakhir. Ini menyebabkan ribosom tRNA, mRNA dan polipeptida dipisahkan satu dari yang lainnya. Proses pemisahan ini dibantu oleh protein RF yang merupakan faktor pembebas (RF=release factor). Pada E. coli dikenal tiga RF, yaitu :

1.      RF1 : tanggap terhadap kodon UAA dan UAG

2.      RF2 : tanggap terhadap kodon UAA dan UGA

3.      RF3 : tidak mempunyai kegiatan pembebasan itu sendiri tetapi merangsang reaksi yang dikatalisis oleh RF1 dan RF2.

Faktor-faktor pembebas dapat mengenali kodon-kodon akhir. Ini terbukti dengan menempelnya protein-protein tersebut pada kodon akhir walaupun dalam keadaan tanpa ribosom. Pada kodon akhir akan menempel salah satu dari RF1 atau RF2. faktor-faktor ini akan merubah aktivitas transferase peptidil (mekanisme masih belum diketahui), sehingga bukan mereaksikan polipeptida dengan aminoasil-tRNA melainkan dengan air (H2O).

Tahapan-tahapan translasi dibagi menjadi 3 bagian utama, yaitu inisiasi, elongasi dan terminasi.  Tahapan tersebut adalah sebagai berikut.

a.    Inisiasi

1.            Sebuah subunit kecil dari ribosom terikat pada bagian awal pesan (di 5’)

2.      Subunit kemudian menelusuri alur menuju 3’ sampai mendapatkan codon

      AUG.

3.            Di sini subunit akan bergabung dengan subunit besar dan sebuah inisiator

tRNA.

4.            Inisiator tRNA mengikat pada P Site pada ribosom.

b.       Elongasi:

5.      Sebuah aminoacyl-tRNA (sebuah tRNA yang terikat kovalen pada asam aminonya) yang dapat berpasangan basa dengan codon selanjutnya pada mRNA tiba di A site

6.      Asam amino sebelumnya (Met di awal translasi) terhubung pada asam amino yang datang dengan ikatan peptida.

7.            Inisiator tRNA dilepaskan dari P site.

8.      Ribosom berpindah menuju codon selanjutnya. Pergeseran ini memindahkan tRNA yang baru tiba, bersama peptida yang dibawanya, menuju P site dan membuka A site untuk kedatangan aminoacyl-tRNA yang baru.

c.     Terminasi

9.      Akhir translasi terjadi saat ribosom mencapai satu atau lebih codon STOP (UAA, UAG, UGA).

II.        PENGATURAN TRANSLASI

Ekspresi sebagian besar gen dikendalikan pada transkripsi. Faktor-faktor transkripsi mengikat pada promotor yang akan menentukan gen-gen yang akan ditranskripsi. Namun, ekspresi gen juga dapat dikendalikan pada tingkat translasi.  Molekul mRNA yang rusak dapat dihasilkan dari mutasi pada gen dan kesalahan selama transkripsi dan translasi (meskipun sangat jarang).

Permesinan Degradasi RNA Umum adalah:

1.      Tubuh P

Cytosol dari eukariot mengandung kompleks protein yang bersaing dengan ribosom untuk akses pada mRNA. Sementara molekul-molekul ini meningkatkan aktivitasnya, hal ini mengurutkan mRNA dalam kumpulan besar yang disebut tubuh P (Processing Bodies).  Protein-protein penekan ini memecah mRNA dengan membuang ’kepala’, kemudian membuang ekor poly(A), dan menurunkan sisa pesan (dalam arah 5’à3’.

2.      Exosome

Adalah kompleks makromolekul dengan dua bukaan. Molekul ini mengambil molekul RNA takterlipat dan menurunkan pada arah 3’à5’

3.           Dengan MicroRNA (miRNA)

Adalah molekul RNA kecil yang mengikat pada bagian komplemen dari 3’-UTR dari mRNA dan mencegah translasi oleh ribosome serta mencegah kehancurannya.

4.           Dengan Riboswitch

Regulasi beberapa metabolisme dikendalikan oleh riboswitch. Suatu riboswitch adalah bagian dari molekul mRNA dengan situs ikatan spesifik untuk metabolit.

5.           Dengan Protein Spesifik Gen

Translasi satu mRNA pada manusia ditekan oleh sebuah protein : aminoacyl tRNA syntetase.

D.        KODE GENETIK

Kode genetik terdiri dari 64 riplet nukleotida. Triplet ini disebut codon. Dengan tiga pengecualian, setiap codon mengkodekan untuk satu dari 20 asam amino yang digunakan dalam sintesis protein. Ini menghasilkan beberapa redundansi dalam kode yang sebagian besar asam amino dikodekan oleh lebih dari satu codon.

Sebuah kodon (AUG) memberi dua fungsi yang berkaitan:

1.      Memberi sinyal dimulainya translasi

2.      Mengkodekan dimasukkannya asam amino methionine (Met) ke dalam rantai polipeptida yang sedang dirakit.

Struktur tRNA alanin di atas mempunyai molekul yang terdiri atas satu jalur tunggal 77 ribonukleotida. Rantai ini melipat pada dirinya sendiri, dan sebagian besar basa penyusunnya berpasangan saling berpasangan untuk membentuk empat wilayah heliks.  Paling sedikit terdapat satu jenis tRNA untuk setiap 20 asam amino dalam sintesis protein. Setiap jenis tRNA memiliki suatu barisan tiga nukleotida takberpasangan (anticodon) yang dapat terikat mengikut aturan pasangan basa pada triplet komplementer pada nukleotida (codon) pada mRNA.

Anticodon       :           3’ CGA 5’

Codon             :           5’ GCU 3’

Tabel 2. Kode genetik DNA

TTT Phe TCT Ser TAT Tyr TGT Cys

TTC Phe TCC Ser TAC Tyr TGC Cys

TTA Leu TCA Ser TAA STOP TGA STOP

TTG Leu TCG Ser TAG STOP TGG Trp

CTT Leu CCT Pro CAT His CGT Arg

CTC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg

CTA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg

CTG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg

ATT Ile ACT Thr AAT Asn AGT Ser

ATC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser

ATA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg

ATG Met* ACG Thr AAG Lys AGG Arg

GTT Val GCT Ala GAT Asp GGT Gly

GTC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly

GTA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly

GTG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

Tabel 1.  Kode Genetik (codon) RNA

U C A G

U

UUUPhenilalanine(Phe)

UCU Serine(Ser)

UAU Tyrosine(Tyr)

UGU Cysteine(Cys)

U

UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys C

UUA Leucine(Leu)

UCA Ser UAA Stop UGA Stop A

UUG Leu UCG Ser UAG StopUGGTryptophan (Trp)

G

C

CUU Leucine(Leu)

CCU Proline(Pro)

CAU Histidine(His)

CGU Arginine(Arg)

U

CUC Leu CCC Pro CAC CGC Arg C

CUA Leu CCA Pro CAA CGA Arg A

CUG Leu CCG Pro CAG CGG Arg G

A AUU Isoleucin AC AA AGU Serine (Se U

e(Ile)UThreonine(Thr)

UAsparagine( ِِِِAsn)

r)

AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser C

AUA Ile ACA Thr AAA Lysine(Lys)AGA Arginine(Arg)

A

AUG Methione(Met) atau Start

ACG Thr AAG Lys AGG Arg G

G

GUU Valine (Val)

GCU Alanine(Ala)

GAU Aspartic Acid (Asp)

GGU Glycine(Gly)

U

GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly C

GUA Val GCA AlaGAA Glutamic Acid (Glu)

GGA Gly A

GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly G