LAPORAN PRAKTIKUM ISOLASI MIKROBA

LAPORAN PRAKTIKUMAPLIKASI BIOTEKNOLOGI PANGAN

ISOLASI MIKROBA

NAMA                 : HASRAH HARIS

N I M                    : G311 13 005

KELOMPOK       : VI (ENAM)

ASISTEN             : SHEEKHAN DINI PUTRI

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI DAN BIOTEKNOLOGI PANGAN

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

JURUSAN TEKNOLOGI PERTANIAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

2015

I.                   PENDAHULUAN

I.1. Latar Belakang

Mikroorganisme merupakan mahluk hidup yang populasinya sangat besar dan kompleks.

Spesiesnya yang berjumlah ratusan terdapat di bagian-bagian tubuh manusia, makanan,

hewan  dan lain-lain. Bukan hanya terdapat pada mahluk hidup, mikroorganisme juga terdapat

ditanah, air dan udara. Dalam kehidupan terkadang kita membutuhkan suatu mikroorganisme

tertentu untuk diisolasi atau dibiakkan. Misalnya, bila hendak mengisolasi bakteri dari tanah/

benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan serangkaian

pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda yang liat

atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Tehadap bakteri

yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat tersebut

dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan membuka

cawan petri yang berisi media agar steril beberapa saat. Di dalam laboratorium mikrobiologi,

populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat

dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.

Isolasi merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan atau memindahkan

mikroba tertentu dari suatu lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni.

Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.

Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi mikrooraganisme antara cara goresan (streak

plate), cara taburan/tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), cara pengenceran (dilution

plate) serta micromanipulator. Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukanlah praktikum

mengenai Isolasi Mikroba ini.

I.2. Tujuan dan Kegunaan

            Tujuan dari praktikum isolasi mikroba ini adalah sebagai berikut :

1. Untuk mengetahu cara pembuatan media tumbuh mikroba.

2. Untuk mengetahui cara isolasi mikroba dari berbagai jenis bahan yang berbeda.

            Kegunaan dari praktikum ini adalah agar kita dapat mengetahui cara membuat media

serta isolasi mikroorganisme dari bahan-bahan tertentu dengan baik dan benar serta dapat

membedakan mikroorganisme sesuai dengan pertumbuhan pada tiap-tiap media yang berbeda.

II.                TINJAUAN PUSTAKA

II.1. Nira

Komposisi nira dari suatu jenis tanaman dipengaruhi beberapa faktor yaitu antara lain

varietas tanaman, umur tanaman, kesehatan tanaman, keadaan tanah, iklim, pemupukan, 

dan pengairan. Demikian pula setiap jenis tanaman mempunyai komposisi nira yang 

berlainan dan umumnya terdiri dari air, sukrosa, gula reduksi, bahan organik lain, dan bahan

anorganik. Air dalam nira merupakan bagian yang terbesar yaitu antara 75 – 90 %. 

Sukrosa merupakan bagian zat padat yang terbesar berkisar antara 12,30 – 17,40 %. Gula reduksi

antara 0,50 – 1,00 % dan sisanya merupakan senyawa organik serta anorganik. Gula reduksi

dapat terdiri dari heksosa, glukosa, dan fruktosa, serta mannosa dalam jumlah 

yang rendah sekali. Bahan organik terdiri dari karbohidrat (tidak termasuk gula), protein, asam

organik, asam amino, zat warna, dan lemak. Bahan anorganik terdiri dari garam 

mineral (Gautara dan Soesarsono W, 1981).

Kerusakan Nira ditandai oleh penurunan pH disebabkan adanya perombakan gula

menjadi asam organik oleh mikroba seperti khamir (Saccharomyces sp.) serta bakteriAcetobacter

sp. Nira sangat mudah terkontaminasi karena mengandung nutrisi yang lengkap seperti gula,

protein, lemak dan mineral yang sangat baik untuk pertumbuhan mikroba. Pertumbuhan khamir

optimal pada pH 4,0-4,5 (Fardiaz, 1992). Khamir tumbuh dengan 

baik pada suasana aerob namun untuk khamir fermentatif dapat tumbuh pada suasana anaerob

(Jutono dkk, 1972). Menurut Said (1987) kadar gula yang optimal untuk pertumbuhan khamir

adalah 10%, tapi kadar gula yang optimal untuk permulaan fermentasi adalah 16% .

Nira kelapa ini mudah mengalami fermentasi, karena mengandung ragi liar yang amat

aktif. Bila nira terlambat dimasak, biasanya warna nira berubah menjadi keruh dan kekuning-

kuningan, rasanya masam, dan baunya menyengat. Hal ini disebabkan terjadi pemecahan sukrosa

menjadigula reduksi (Hieronymus. B. S, 1993). Adapun proses perubahan itu adalah sebagai

berikut :

Sukrosa      Glukosa & Fruktosa       Alkohol      Asam Asetat

(cuka)      Karbondioksida &air

         A                      B                            C                      D                                     E

Untuk perubahan dari A sampai C terlibat kegiatan ragi, dari C ke D terlibat kegiatan bakteri dan

hasilnya berupa  cuka berasa asam. Karena proses inimembutuhkan alkohol, sehingga alkohol

yang diperoleh menjadi berkurang. Untuk memperoleh gula yang baik maka harus  dilakukan

proses penghambatan terhadap kegiatan mikroorganisme (Suhardiyono, 1988).

II.2. Saccharomyces cereviceae

Saccharomyces cereviceae merupakan khamir sejati tergolong eukariot yang secara

morfologi hanya membentuk blastospora berbentuk lonjong, silindris, oval atau bulat telur yang

dipengaruhi oleh strainnya. Dapat membelah diri melalui “budding cell”. Reproduksinya dapat

dipengaruhi oleh keadaan lingkungan serta jumlah nutrisi yang tersedia bagi pertumbuhan sel.

Penampilan makroskopik mempunyai koloni berbentuk bulat, warna kuning muda, permukaan

berkilau, licin, tekstur lunak dan memiliki sel bulat dengan askospora 1-8 buah (Nikon,

2004;Landecker, 1972;Lodder, 1970).

Saccharomyces cerevisiae memiliki sel berbentuk ellipsoid atau  silindris. Ukuran sel

antara 5 - 20 mikron, biasanya 5 - 10 kali lebih besar dari ukuran bakteri dan merupakan

mikroorganisme bersel tunggal, Saccharomyces cerevisiae termasuk khamir uniseluler. Khamir

ini bersifat nonpatogenik dan nontoksik, sehingga sejak dahulu banyak digunakan dalam

berbagai proses fermentasi seperti pada pembuatan roti dan alkohol. Saccharomyces

cerevisiae` tahan terhadap kadar gula yang tinggi dan tetap aktif melakukan aktivitasnya 

pada suhu 4-32 °C. Saccharomyces cerevisiae memerlukan kondisi lingkungan yang 

cocok untuk pertumbuhannya, yaitu nutrisi sebagai sumber energi terutama gula, 

pH optimum 4-5, temperatur optimum 28-30ºC serta kebutuhan akan oksigen terutama

pada awal pertumbuhan (Hidayat et.al, 2006).

Klasifikasi Sacharomyces cerevisiae menurut Yarow (1984) adalah sebagai berikut :

Kingdom : Fungi

Filum       : Ascomycota

Kelas       : Saccharomycetes

Ordo        : Saccharomycetales

Famili      : Saccharomycetaceae

Genus     : Saccharomyces

Spesies    : Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces merupakan khamir fermentatif kuat. Apabila ada oksigen S.

cerevisiae juga dapat melakukan respirasi yaitu mengoksidasi gula menjadi karbon dioksida dan

air. Oleh karena itu tergantung dari kondisi pertumbuhan, S. cerevisiae dapat mengubah 

sistem metabolismenya dari fermentatif menjadi oksidatif (respirasi). S. cerevisiae adalah khamir

yang bersifat anaerob yang mampu mengubah asam piruvat menjadi alkohol melalui proses

fermentasi. S. cerevisiae juga merupakan khamir yang paling sering digunakan dalam produksi

alkohol karena memenuhi syarat sebagai khamir untuk fermentasi alkohol. 

S. cerevisiae mampu menghasilkan enzim yang diperlukan dalam proses fermentasi. Khamir

selain dapat menghasilkan alkohol dan karbon dioksida juga memproduksi metabolit-metabolit

lain dalam jumlah kecil yaitu, gliserol, asam suksinat, alkohol rantai panjang, 

2,3-butana-diol, dan sedikit aldehid, asam asetat dan asam laktat (Fardiaz, 1992).

II.3. Laruran Fisiologis

Larutan garam fisiologi merupakan larutan isotonis yang memiliki banyak kegunaan

dalam bidang medis dan laboratorium, dan umumnya larutan garam fisiologi memiliki kisaran

konsentrasi 0.9% (b/v) NaCl. Dalam menghitung jumlah mikrob seperti bakteri, perlu dilakukan

pengenceran. Sesuai dengan perhitungan CFU (Colony Forming Unit) yaitu 30 ≤ jumlah bakteri

≤300. Bila jumlah bakteri < 30 maka tidak dapat dihitung secara statistik, bila >300 akan sangat

sulit untuk dihitung secara manual (Lay Bw, 1994).

NaCl fisologis digunakan sebagai pengencer agar suspense sampel tetap steril dan

menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis juga dapat

mempertahankan kondisi pH. Sebagaimana kita ketahui bahwa pertumbuhan mikroorganisme

sangat peka terhadap perubahan pH, sehingga diperlukan suatu larutan pengencer yang tidak

mempengaruhi kondisi pH (Trigiantoro, 2014)

II.4. Media Yeast Extract Agar

Media yeast extract agar merupakan media yang digunakan untuk kultivasi 

kapang dan khamir yang berasal dari berbagai macam material, khususnya dari susu atau 

produk susu. Media ini merupakan quality control bagi keberadaan S. aereus, E. coli,

Candida albicans, Geotrichum candidum, Aspergillus niger, Penicilium commune, Rhodotoruls

mucilaginosa. Penimbangan media yaitu dengan perbandingan 35 gram media dalam 1000 ml

H2O (Anonim, 2015).

II.5. Pengenceran

Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke dalam air

sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan

bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk

menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam

larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007).

Di dalam keadaan yang sebenarnya dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara

tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama-

sama dengan bakteri saprob. Untuk menyendirikan suatu spesies dikenal beberapa cara, salah

satunya yaitu dengan pengenceran. Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865.

Ia berhasil memelihara Streptococcus lactis dalam piaraan murni yang diisolasi dari sampel susu

Yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam

spesies diencerkan dalam suatu tabung yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian di

ambil kira- kira 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. 

Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu 

medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni yang akan

tumbuh dalam medium tersebut, akan tetapi mungkin juga kita hanya akan memperoleh 

satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini dapat kita jadikan piaraan murni. Jika 

kita belum yakin, Bahwa koloni tunggal yang kita peroleh tersebut merupakan koloni yang

murni, maka kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel

(Dwidjoseputro, 1990).

II.6. Sterilisasi

Sterilisasi adalah kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari semua bentuk

kehidupan semua mikroorganisme, termasuk spora bakteri, yang sangat resisten (Ratna 2008).

Menurut Ratna (2008) sterilisasi terdiri dari sebagai berikut :

a.       Pemanasan kering

                  Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai

kering dan selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya

mati. Digunakan pada benda/bahan yang tidak mudah menjadi rusak, tidak menyala, tidak

hangus atau tidak menguap pada suhu tinggi. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa

yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak, minyak mineral,

gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil dengan

uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah. Contohnya alat ukur dan

penutup karet atau plastik. Selain itu bahan/alat harus dibungkus, disumbat atau ditaruh dalam

wadah tertututp untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven. Waktu dan suhu

yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering adalah:

Tabel 01. waktu dan suhu untuk sterilisasi

Suhu (0C) Waktu (jam)

170 1,0

160 2,0

150 2,5

140 3,0

b.      Pemanasan basah

            Prinsipnya adalah dengan cara mengkoagulasi atau denaturasi protein penyusun tubuh

mikroba sehingga dapat membunuh mikroba. Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave

dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi

biasanya 121 ℃, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1

atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1

jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan.

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang

menggunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 1210C. Suhu dan tekanan tinggi yang

diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk

membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk mesterilkan media digunakan

suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa) selama 15 menit. Alasan digunakan suhu

1210C atau 249,8 0F adalah karena air mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15

psi. Untuk tekanan 0 psi pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu

1000C, sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan tekanan 15

psi maka air akan mendidih pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini hanya berlaku untuk sea level,

jika di laboratorium terletak pada ketinggian tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting

ulang. Misalnya autoklaf diletakkan pada ketinggian

2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi supaya tercapai suhu 1210C untuk

mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan

tekanan 15 psi selama 15 menit (Dwidjoseputro 2012).

II.7. Metode Isolasi

Metode cawan sebar (spread plate) Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu

teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan

stok kultur bakteri atau mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya

dengan pour plate adalah, pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar

memadat sedangkan pour plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat).

Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian

permukaan media agar Hadioetomo (2013).

Isolasi mikroba dengan cara penggoresan (spred plate) Tujuan utama dari penggoresan

ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang  terpisah dengan baik dari suspensi sel

yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila  ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi

memerlukan keterampilan yang diperoleh  dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan

menghasilkan koloni yang terpisah.  Cara penggresan dapat dilakukan dengan cara ujung kawat

imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada

permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh permukaan. Untuk memperoleh

hasil yang  baik diperlukan keterampilan, yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode

cawan gores yang dilakukan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya

mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah

tidak memanfaatkan  permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores sehingga

pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan

inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan 

sel-sel yang digores (Suriawiria,2005).

II.8. Metode Agar Miring

Biakan Agar Miring dan Agar Tegak Dapat dilakukan dengan cara menggoreskan secaa

zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose yang bagian atasnya

dilengkungkan. Cara ini juga dilakukan pada agar tegak untuk meminimalisir pertumbuhan

mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen. Usah mencegah masuknya mikroorganisme yang

tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies terdapat baberapa cara, yaitu: Penanaman

dengan penggoresan Penanaman lapangan Biakan agar tabung (Rusdimin, 2003).

III.             METODOLOGI PRAKTIKUM

III.1.  Waktu dan Tempat

Praktikum Aplikasi Bioteknologi Pangan yang berjudul Isolasai Mikroorganisme

dilaksanakan pada hari Selasa tanggal 1 dan 8 September 2015 di laboratorium Mikrobiologi dan

Keamanan Pangan, Program Studi Ilmu dan Teknologi Pangan, Jurusan Teknologi Pertanian,

Fakultas Pertanian, Universitas Hasanuddin, Makassar.

III.2.  Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah pipet volum, erlemeyer,

bulb,autoclave,cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, hocky steak, shaker, laminar flow, Bunsen,

incubator, hotplate, magnetic stirrer, botol semprot, rak tabung dan timbangan analitik.

Sedangkan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kapas, aluminium foil, label,

kertas, tempe, nenas, yoghurt, yakult, nira, kulit jeruk, kubis, biang nata, ragi tape, NA (Nutrient

Agar), PDA (Potato Dextrose Agar),  YEG (Yeast Extract Granuliet), glukosa, kalipton, NaCl,

GPB (Glucose Peptone Broth),  aquades dan alkohol.

III.3.  Prosedur Praktikum

Prosedur praktikum yang dilakukan dalam praktikum isolasi mikroba terdiri dari tujuh

tahap yaitu preparasi, sterilisasi, pembuatan media, isolasi mikroorganisme, inkubasi, pembuatan

agar miring dan penggoresan mikroorganisme.

III.3.1. Preparasi

Preparasi dilakukan dengan dua tahap yaitu pembuatan larutan fisiologis dan preparasi

bahan.

III.3.1.1 Pembuatan larutan fisiologis

Pembuatan larutan fisiologis dilakukan dengan cara menimbang NaCl sebanyak

0,98 gram dengan menggunakan timbangan analitik. NaCl yang telah ditimbang dimasukkan ke

dalam erlemeyer dan ditambahkan aquades sebanyak 1 liter. Larutan dihomogenkan. Sebanyak 1

erlemeyer dan 4 tabung reaksi disiapkan. Larutan fisiologis dipipet sebanyak 45 ml kedalam

erlemeyer dan masing-masing tabung reaksi diisi dengan larutan fisiologis sebanyak 9,9 ml dan

ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil. Setelah itu, disterilisasi

dalam autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit.

III.3.1.2 Pengenceran

Pengenceran dilakukan sesuai dengan jenis bahan. Bahan padat seperti tempe dan jeruk

dipreparasi dengan cara memisahkan bagian bahan yang diduga merupakan tempat tumbuhnya

mikroorganisme contohnya bagian hitam pada jeruk dan kubis atau hifa pada tempe kemudian

ditimbang sebanyak 5 gram dan dilarutkan dalam larutan fisiologis 45 ml dan dihomogenkan.

Sedangkan pada sampel cair seperti yoghurt dan yakult preparasi dilakukan dengan langsung

dipipet sebanyak 5 ml dengan pipet volume dan dilarutkan dalam larutan fisiologis 45 ml dan

dihomogenkan. Larutan fisiologis  dipipet sebanyak 

0,1 ml ke dalam tabung reaksi berisi 9,9 ml larutan fisiologis dan dihomogenkan. Pipet sebanyak

0,1 ml sampel dari tabung reaksi pertama ke tabung reaksi kedua yang berisi 

9,9 ml larutan fisiologis dan homogenkan. Lakukan prosedur tersebut sampai mendapatkan

pengenceran 10-9.

III.3.2. Strerilisasi

Sterilisasi alat dilakukan dengan cara ujung pada pipet volum ditutupi dengan kapas serta

aluminium foil. Pipet volum kemudian dibungkus dengan menggunakan kertas. Cawan petri juga

dibungkus dengan kertas. Setelah semua alat telah dibungkus, autoclave diisi dengan

menggunakan air. Pipet volum, dan cawan petri dimasukkan ke dalam autoclavedan dilakukan

proses sterilisasi dengan suhu 121oC selama 15 menit.

III.3.3. Pembuatan Media

Media yang digunakan dalam praktikum ada empat jenis yaitu NA, PDA, YEG, dan GPB.

Bembuatan media masing-masing dijelaskan sebagai berikut:

1.      Nutrient Agar

Sebanyak 50 gram Nutrient Agar (Na) ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik.

Hasil timbangan dimasukkan ke dalam erlemeyer dan ditambahkan aquades hingga 100 ml.

Larutan dihomogenkan dan ditutup dengan kapas serta aluminium foil. Latutan yang telah

ditutup disterilisasi dalam autoclave pada suhu 121oC.

2.       Potato Dextrin Agar

Media PDA (Potato Dextrin Agar) dibuat dengan menimbang bubuk PDA sebanyak 5,35

gram. Larutan yang telah ditimbang dimasukkan kedalam erlemeyer dan ditambahkan aquades

sebanyak 150 ml. Larutan dihomogenkan dan ditutup dengan kapas dan aluminium foil. Setelah

ditutup larutan disterilkan.

3.      Yeast Extract Granuliet

Media YEG (Yeast Extract Granuliet) dibuat dengan menimbang yeast sebanyak 3,25

gram dan agar sebanyak 2 gram dengan menggunakan timbangan analitik. Bahan yang telah

ditimbang dimasukkan kedalam erlemeyer dan ditambahkan aquades sebanyak 250 ml. Larutan

dihomogenkan dan ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil. Larutan kemudian

disterilisasi.

4.      Glucose Peptone Broth

Media GPB (Glucose Peptone Broth) dibuat dengan cara menimbang 1,25 gram kalipton

dan glukosa sebanyak 2,5 gram. Hasil timbangan dimasukkan ke dalam erlemeyer dan

ditambahkan aquades sebanyak 250 ml. Larutan dihomogenkan dan ditutup dengan

menggunakan kapas dan aluminium foil. Larutan kemudian disterilisasi.

III.3.4. Isolasi Mikroorganisme

Media yang telah disterilisasi dituang ke dalam cawan petri hingga 3/4. Media disimpan

hingga mengeras. Pipet sampel sebanyak 0,1 ml dari tabung reaksi hasil pengenceran dan

lakukan penyebaran ke media yang telah disiapkan. Semua kegiatan yang dilakukan dalam

isolasi mikroorganisme dilakukan dalam ruang isolasi.

III.3.5. Inkubasi

Mikroorganisme yang telah diisolasi dalam media tumbuh kemudian diinkubasi selama

dua hari dalam kondisi optimal. Seluruh hasil isolasi diinkubasi pada suhu ruang sedangkan

bakteri asam laktat yang diisolasi dari yoghurt diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37oC

selama tiga hari.

III.3.6. Pembuatan Agar Miring

Agar miring digunakan sebagai media dalam proses metode gores. Media yang telah

disterilkan dipepet sebanyak 12 ml ke dalam tabung reaksi. Tabung reaksi berisi media diberi

label sesuai dengan jenis media. Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan aluminium foil.

Tabung reaksi disterilisasi dengan autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit. Tabung yang

telah disterilisasi diposisikan dengan posisi miring hingga mengeras.

III.3.7. Penggoresan Mikroorganisme

Mikroorganisme yang tumbuh dalam cawan petri yang telah diinkubasi dipilih sesuai

dengan kebutuhan. Mikroorganisme diambil dengan menggunakan jarum ose. Jarum ose yang

digunakan adalah jarum ose yang telah steril. Jarum ose disterilkan dengan cara memanaskan

ujung jarum dengan bunsen. Mikroorganisme digores kedalam agar miring yang telah mengeras

secara zig-zag dan hati-hati. Tabung reaksi yang telah digores dengan mikroorganisme ditutup

dengan kapas dan aluminium foil dan diinkubasi hingga tumbuh isolat murni.

III.4.  Diagram Alir

Gambar 01. Diagram alir proses sterilisasi alat

Gambar 02.  Diagram Alir Proses Pembuatan Media

Gambar 03. Diagram Alir Isolasi Mikroba

IV.             HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1. Hasil

Hasil yang diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut :

Gambar 01. Hasil Isolasi Mikroba dari Nira Pengenceran 10-7

Gambar 02. Hasil Isolasi Mikroba dari Nira Pengenceran 10-9

IV.2. Pembahasan

Berdasarkan gambar diatas, dapat dilihat bahwa pada cawan petri tumbuh mikroba yang

berkoloni. Pada pengenceran 10-7 terdapat dua koloni dan pada pengenceran 10-9hanya terdapat

satu koloni. Semua koloni yang tumbuh pada cawan petri ini bukan merupakan koloni mikroba

yang diinginkan. Tidak tumbuhnya mikroba yang ingin diisolasi disebabkan karena sampel

“nira” yang digunakan untuk mengisolasi mikroba telah rusak atau terkontaminasi. Nira yang

akan diisolasi ini berubah menjadi asam asetat (cuka) 

karena adanya pemecahan sukrosa menjadi gula reduksi yang disebabkan oleh adanya kegiatan

bakteri yang mengkontaminasi nira. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hieronymus.B.S (1993)

yang menyatakan bahwa nira mudah mengalami fermentasi, karena mengandung ragi liar yang

amat aktif. Bila nira terlambat dimasak, rasanya masam dan baunya menyengat. Hal ini

disebabkan terjadi pemecahan sukrosa menjadi gula reduksi dan didukung oleh pernyataan L.

Suhardiyono (1998) bahwa untuk perubahan dari sukrosa sampai alkohol terlibat kegiatan ragi,

dari alkohol ke asam asetat (cuka) terlibat kegiatan bakteri dan hasilnya berupa  cuka berasa

asam.

Saccharomyces cerevisiae merupakan khamir dengan karakter fisik yaitu selnya

berbentuk ellipsoid atau silindris, mempunyai koloni berbentuk bulat, berwarna kuning muda,

permukaan berkilau, licin, tekstur yang lunak dan sel bulat dengan askospora 1-8

buah.Saccharomyces cerevisiae mampu hidup pada pH optimum 4-5 dengan tempratur 28-30°C. 

S. cerevisiae bersifat nonpatogenik dan berfungsi sebagai fermentatif kuat, karena jika khamir ini

mendapatkan oksigen maka Saccharomyces cerevisiae mampu mengoksidasi gula menjadi

karbondioksida dan air. Hal ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992) yang menyatakan

bahwa Saccharomyces merupakan khamir fermentatif kuat. Apabila ada oksigen S.

cerevisiae juga dapat melakukan respirasi yaitu mengoksidasi gula menjadi karbon dioksida dan

air dan didukung oleh pernyataan Hidayat et.al (2006) bahwa s. cerevisiae memerlukan kondisi

lingkungan yang cocok untuk pertumbuhannya, yaitu nutrisi sebagai sumber energi terutama

gula, pH optimum 4-5, temperatur optimum 28-30ºC serta kebutuhan akan oksigen terutama

pada awal pertumbuhan

Bahan yang digunakan pada praktikum isolasi mikroba ini adalah Nira. Nira merupakan

cairan manis yang terdapat pada aren, kelapa dan lontar. Nira tergolong cairan yang sangat

mudah terkontaminasi oleh mikroba seperti khamir atau yang lebih spesifik

adalah Saccharomyces sp. Mudahnya nira terkontaminasi oleh khamir ini di sebabkan karena

nira mengandung nutrisi yang lengkap seperti sukrosa, gula reduksi, lemak, protein dan mineral.

Hal ini sesuai dengan pernyataan Fardiaz (1992) yang menyatakan bahwa nira sangat mudah

terkontaminasi karena mengandung nutrisi yang lengkap seperti gula, protein, lemak dan mineral

yang sangat baik untuk pertumbuhan mikroba.

Berdasarkan metode praktikum yang dilakukan, larutan fisiologis dibuat dengan

menggunakan NaCl sebanyak 0,98 gram yang dilarutkan dengan aquades sebanyak 1 liter.

Sebelum digunakan, larutan fisiologis dimasukkan ke dalam beberapa erlenmeyer 

sebanyak 45 mL dan disterilisasi dengan autoclave dengan suhu 121°C selama 15 menit. Larutan

fisiologis yang sudah jadi tersebut kemudian diisi dengan nira yang akan diisolasi. Larutan

fisiologis merupakan larutan yang terbuat dari garam NaCl yang umumnya memiliki kisaran

konsetrasi 0.9% b/v NaCl. Larutan fisiologis digunakan untuk pengenceran suatu sampel agar

sampel tetap berada dalam keadaan steril dan menghindari kontaminan. Karena pertumbuhan

mikroba peka terhadap kondisi pH, maka larutan fisiologis diperlukan karena larutan fisiologis

mampu mempertahankan kondisi pH pada sampel. Hal ini sesuai dengan pernyataan Trigiantoro

(2014) yang menyatakan bahwa NaCl fisologis digunakan sebagai pengencer

agar suspense sampel tetap steril dan menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu,

NaCl fisiologis juga dapat mempertahankan kondisi pH

Beradasarkan metode praktikum yang dilakukan, nira sebanyak 5 ml yang menjadi

sampel untuk isolasi terlebih dulu diencerkan dengan menggunakan larutan fisiologis 45 ml yang

telah dibuat sebelumnya kemudian dipipet sebanyak 0,1 ml kedalam tabung reaksi yang telah

diisi dengan larutan fisiologis 9,9 ml, dan diencerkan lagi sebanyak empat kali dengan

pengenceran 10-3, 10-5, 10-7 dan 10-9. Pengenceran tersebut sebuah metode yang digunakan untuk

mengurangi konsentrasi suatu larutan. Didalam mengisolasi mikroba, pengenceran bertujuan

untuk mengurangi kepadatan mikroba yang di tanam. Hal ini sesuai dengan pernyataan Faiz

(2009) yang menyatakan bahwa tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi kepadatan bakteri

yang ditanam.

Sterilisasi merupakan salah satu proses pemusnahan mikroorganisme maupun spora

mikroba yang ada pada suatu benda, umumnya fungsi dari sterilisasi ini adalah memusnahkan

bakteri patogen. Dalam praktikum, sebelum melakukan isolasi mikroba, cawan petri, pipet dan

peralatan lain yang akan digunakan untuk isolasi mikroba terlebih dulu dibungkus dengan kertas

kemudian disterilisasi pada suhu 121°C selama 15 menit dengan menggunakan autoklaf.

Sterilisasi menggunakan autoklaf ini pada prinsipnya menggunakan panas uap untuk mematikan

mikroorganisme pada peralatan laboratorium. Hal ini sesuai dengan pernyataan Walton dan

Torabinejad (2008) yang menyatakan bahwa metode sterilisasi yang biasa dilakukan untuk

semua kirgi dan instrumen genggam adalah menggunakan autoklaf uap 

atau kimia. Instrument yang telah dibungkus kasa diautoklafkan selama 20 menit pada 

suhu 121ºC dan tekanan 15 psi. Ini akan membunuh semua bakteri, spora, dan virus.

Yeast extract agar merupakan salah satu media yang digunakan dalam menumbuhkan

khamir saccharomyces cereviceae yang dibuat dengan menggunakan yeast extract dan agar.

Selain untuk menumbuhkan khamir, media ini juga digunakan untuk menumbukan kapang yang

berasal dari berbagai material. Hal ini sesuai dengan pernyatan Anonim (2013) yang menyatakan

bahwa media yeast extract agar merupakan media yang digunakan untuk kultivasi kapang dan

khamir yang berasal dari berbagai macam material.

Isolasi mikroba dilakukan dengan dua tahapan. Tahapan pertama yaitu pengenceran dan

tahapan kedua yaitu penggoresan pada permukaan media. Isolasi mikroba dengan metode spread

plate atau penggoresan dilakukan untuk menghasilkan koloni bakteri yang terpisah dari suspensi

sel yang pekat. Metode gores atau spread plate dilakukan dengan cara ujung kawat inokulasi

yang membawa mikroba digoreskan dengan bentuk zigzag pada permukaan media dalam cawan

petri. Hal ini sesuai dengan pernyataan Suriawiria (2005) yang menyatakan bahwa cara

penggresan dapat dilakukan dengan cara ujung kawat imokulasi yang membawa bakteri

digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri

sampai meliputi seluruh permukaan.

Agar miring merupakan salah satu metode yang digunakan dalam menumbuhkan

mikroba, pada praktikum ini, media yang sudah dibuat dipipet ke dalam tabung reaksi kemudian

disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah steril baru media

dimiringkan hingga media pada tabung reaksi mengeras. Setelah media pada agar miring jadi,

mikroba yang ingin diisolasi diambil dari cawan petri dengan jarum ose yang kemudian digores

pada permukaan agar miring dengan bentuk zig-zag, media yang telah digores ini baru kemudian

disimpan hingga menjadi isolat murni. Penggunaan agar miring ini bertujuan unuk

meminimalisir adanya pertumbuhan mikroba lain yang tidak diinginkan. Hal ini sesuai dengan

pernyataan Rusdimin (2013) yang menyatakan bahwa biakan agar miring dapat dilakukan

dengan cara menggoreskan secara zig-zag pada permukaan agar miring menggunakan jarum ose

yang bagian atasnya dilekungkan. Cara ini juga dilakukan ada agar tegak guna meminimalsir

pertumbuan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen.

V. PENUTUPV.1. Kesimpulan

            Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum ini adalah

sebagai berikut :

1.      Untuk membuat media tumbuh mikroba, terlebih dulu perlu

diketahui jenis mikroba 

apa yang akan ditumbuhkan misalnya saja untuk mengisolasi

khamir, maka salah 

satu media yang dapat digunakan adalah YEG. Untuk membuat

media YEG dibutuhkan yeast sebanyak 3,35 gram dan bacto

agar sebanyak 2 gram dan kemudian dilarutkan dalam 250 ml

aquades. Selanjutnya media di sterilisasi menggunakan autoklaf

dengan suhu 121°C selama 30 menit.

2.      Untuk mengisolasi mikroba tahap pertama sampel di larutkan dengan

larutan dengan larutan fisiologis kemudian dilakukan pengenceran lalu

dilakukan penggoresan pada permukaan media dan diinkubasi selama 2-

5 hari.V.2. Saran 

            Saran untuk praktikum ini adalah agar selalu berada

dalam keadaan yang steril dan lebih berhati-hati agar dalam

mengisolasi mikroba, mikroba lain yang tidak diinginkan tidak

tumbuh di dalam media pertumbuhan.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka

Utama. Jakarta.

Fardiaz, S., 1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.Jutono. 1972. Dasar-dasar Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi Fakultas Pertanian UGM.

Yogyakarta.Gautara dan Soesarsono Wijardi, 1981. Dasar Pengolahan Gula I. Jurusan Teknologi Industri

FATEMETA IPB, Bogor.Hadioetomo. Ratna Siri. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta: P.T. Gramedia Pustaka

Utama

Landecker, E. M. 1982. Fundamentals of The Fungi. Prentice Hall Inc. New Jersey.Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. JakartaLodder, J., 1970 , The Yeast : A Taxonomic Study Second Revised and Enlarged Edition . The

Netherland,Northolland Publishing Co, AmsterdamHidayat. N. et al. 2006. Mikrobiologi Industri. Edisi Pertama. YogyakartaNikon. 2004. Saccharomyces Yeast Cell: Nikon Microscopy. Phease

ContrastImageGalerry.http://www.microscopyu.com/galleries/phasecontrast/saccharomycessmall.html

Nurohaianah et al, 2007. Media . UI Press. JakartaPelczar, Michael, J., E.C.S Chan. 1988. Dasar – Dasar Mikrobiologi.UI Press.Jakarta

Ratna, Sri. 2008. Sterilisasai dan cara Penggunanya. Jakarta : Gramedia.Rusdimin. 2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia. JakartaSaid. 1987. Bioiindustri:Penerapan Teknologi Fermentasi. PT. Melton Putra. Jakarta.Suhardiyono,L. 1988. Tanaman Kelapa Budidaya dan Pemanfaatannya. Yogyakarta: Penerbit Kanisius.Trigiantoro. 2014.  Isolasi Bakteri, Kapang dan Khamir.http://www.scribd.com/doc/87162559/mikro-

4#scribd. Diakses pada tanggal 13 September 2015. MakassarYarrow, D. 1984. The Yeast. A Taxonomic Studi. 3rd ed. Elsevier Science Publishers B. V. Amsterdam.