MIKROBA INDUSTRIMIKROBA INDUSTRIISOLASI, SELEKSI & ISOLASI, SELEKSI &

IDENTIFIKASIIDENTIFIKASI

MIKROBA INDUSTRIMIKROBA INDUSTRI

Mikroba Mikroba kunci kegagalan atau keberhasilan suatu kultivasikunci kegagalan atau keberhasilan suatu kultivasi

Kriteria Mikroba Industri :Kriteria Mikroba Industri : Merupakan galur murniMerupakan galur murni Sifat genetiknya stabilSifat genetiknya stabil Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif Dapat menghasilkan sel vegetatif, spora atau unit-unit reproduktif

lainlain Mampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasiMampu tumbuh dengan cepat setelah diinokulasi Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam waktu yang Mampu menghasilkan produk yang diinginkan dalam waktu yang

pendek & tidak menghasilkan produk sampingan yang toksikpendek & tidak menghasilkan produk sampingan yang toksik Mampu melindungi diri dari kontaminasi (pH, suhu, inhibitor)Mampu melindungi diri dari kontaminasi (pH, suhu, inhibitor) Dapat disimpan dalam jangka waktu yang panjangDapat disimpan dalam jangka waktu yang panjang Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi), sehingga Galur dapat dikembangkan kualitasnya (mutasi), sehingga

produksinya meningkatproduksinya meningkat

Sumber MikrobaSumber Mikroba

Sumber mikroba industri : Sumber mikroba industri : sumber alamisumber alami atau atau lembaga koleksi kulturlembaga koleksi kultur Sumber alami : tanah, air, sayuran segar/busuk, tanaman/hewan,Sumber alami : tanah, air, sayuran segar/busuk, tanaman/hewan, limbah dll limbah dll jumlah dan dan jenis mikroba sangat beragam sangat beragam

Tahap pertama dalam seleksi mikroba yang akan digunakan untuk Tahap pertama dalam seleksi mikroba yang akan digunakan untuk industri adalah industri adalah isolasi mikroba, isolasi mikroba, sehingga diperoleh kultur murni sehingga diperoleh kultur murni (sifat morfologi & fisiologi seragam).(sifat morfologi & fisiologi seragam).

Setelah itu dilakukan Setelah itu dilakukan seleksiseleksi sehingga diperoleh galur dengan sehingga diperoleh galur dengan kinerja terbaik. kinerja terbaik.

Terakhir baru dilakukan Terakhir baru dilakukan identifikasiidentifikasi dengan menggunakan kunci- dengan menggunakan kunci-kunci yang sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba kunci yang sesuai, sehingga diketahui nama (klasifikasi) mikroba tersebuttersebut

Mikroba yang telah diperoleh sepatutnya Mikroba yang telah diperoleh sepatutnya disimpandisimpan dengan baik dengan baik dengan teknik penyimpana yang baik, sehingga kemurniannya dengan teknik penyimpana yang baik, sehingga kemurniannya terpelihara dalam jangka waktu yang panjang.terpelihara dalam jangka waktu yang panjang.

ISOLASIISOLASI Isolasi kulturIsolasi kultur : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari : kegiatan pemisahan suatu kultur mikroba dari

campuran biakan mikroba di alam campuran biakan mikroba di alam sel individu terpisah sel individu terpisah

Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan Sebelum mengisolasi, harus diketahui mikroba apa yang akan diisolasi dan habitatnya diisolasi dan habitatnya menentukan menentukan sampelsampel apa yang akan apa yang akan diambil dari alam dan diambil dari alam dan mediamedia apa yang akan digunakan apa yang akan digunakan

Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin Sampel biasanya segera dipakai atau disimpan pada suhu dingin (kulkas)(kulkas)

Teknik Isolasi Kultur MurniTeknik Isolasi Kultur Murni : : - 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)- 1. Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate) - 2. Penuangan (Pour-plate)- 2. Penuangan (Pour-plate) - 3. Kultur Yang Diperkaya- 3. Kultur Yang Diperkaya - 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution)- 4. Pengenceran Berseri (Serial-dilution) - 5. Isolasi Sel Tunggal - 5. Isolasi Sel Tunggal

1.1. Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)Teknik Penggoresan (Streak-plate) & Penyebaran (Spread-plate)

- Untuk bakteri paling sesuai- Untuk bakteri paling sesuai - Menggunakan agar cawan- Menggunakan agar cawan - Cara : - Cara :

Pengenceran berseri dg larutan garam Pengenceran berseri dg larutan garam fisiologis (0,85 %)fisiologis (0,85 %)

PenggoresanPenggoresan (jarum Ose) atau (jarum Ose) atau penyebaranpenyebaran (batang (batang gelas) pada media agar gelas) pada media agar , sehingga koloni tumbuh , sehingga koloni tumbuh menyebarmenyebar

Penggoresan dilakukan berulang, sehingga Diperoleh kultur murni

1 sel 1 koloni

Sampel

Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & Teknik ini merupakan prosedur rutin untuk isolasi bakteri & menggunakan peralatan yang sederhanamenggunakan peralatan yang sederhana

Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/Kelemahan : hanya sejumlah kecil contoh yang dapat digunakan/

disebarkan pada mediadisebarkan pada media Dua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloniDua sel dapat bergabung manjadi membentuk satu koloni

Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak Contoh : bakteri yang menghasilkan lendir & yang tidak

pencegahan dengan menambahkan deterjenpencegahan dengan menambahkan deterjen

2.2. Teknik Penuangan (Pour-plate)Teknik Penuangan (Pour-plate)

Prinsip : pengenceran contoh dengan media Prinsip : pengenceran contoh dengan media agar cairagar cair (+/- 45 (+/- 4500C) C)

dalam tabung reaksi, sehingga distribusi sampel meratadalam tabung reaksi, sehingga distribusi sampel merata

dituang ke petri dish & dibiarkan mengeras padadituang ke petri dish & dibiarkan mengeras pada

suhu ruang, lalu diinkubasi suhu ruang, lalu diinkubasi

Sampel +/- 1 g)

A

B

C

SuspensiBakteri

1 loop

Agar cair

PengenceranPenuanganDibiarkan mengeras

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. . . .

. .

. .

. .

Diperiksa

Koloni terisolasi

Media agar miring

Tahap I Tahap II Tahap III

Teknik Penuangan (Pour-plate)Teknik Penuangan (Pour-plate)

A

B

C

Inkubasi

Metode Penuangan Metode Penuangan Pengamatan dapat dilakukan secara Pengamatan dapat dilakukan secara kualitatif kualitatif (morfologi) & (morfologi) & kuantitatifkuantitatif (jumlah sel mikroba) (jumlah sel mikroba)

Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif Teknik penggoresan/penyebaran dan penuangan ini lebih efektif dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan dengan menggunakan media selektif/ diferensial atau dengan perlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawanperlakuan khusus sebelum penanaman pada agar cawan

Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora Contoh : Isolasi bakteri pembentuk spora contoh terlebih dulu contoh terlebih dulu

dipanaskan s.d 85dipanaskan s.d 8500C 5 menitC 5 menit

Media SelektifMedia Selektif : :

- Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi - Media dg NaCl 7,5 % unt mengisolasi StaphylococcusStaphylococcus dari faeces dari faeces

- Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : - Media BGLBB (brilliant green lactose bile broth) : SalmonellaeSalmonellae

Media DiferensialMedia Diferensial : :

- Media agar EMB (eosin-methylene blue agar) - Media agar EMB (eosin-methylene blue agar) terbentuk koloni terbentuk koloni

berbeda & mudah dikenaliberbeda & mudah dikenali

E. coliE. coli : hijau kehitaman/hijau metalik : hijau kehitaman/hijau metalik

Aerobacter aerogenesAerobacter aerogenes : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda : tengah ungu tua/coklat, tepi ungu muda

3. Kultur Yang Diperkaya3. Kultur Yang Diperkaya

Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus Untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai sifat fisiologis yang khusus ((jumlah kecil & tumbuh lambatjumlah kecil & tumbuh lambat))

Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi Prinsip : menggunakan komposisi media dan kondisi inkubasi tertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentutertentu, sehingga yang tumbuh hanya bakteri tertentu Cara :Cara :

1 2 3 4

(+) (-)

Media cair dgn substrat khususContoh : bakteri tanah : α-conidendrin

Verifikasi

4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)4. Teknik Pengenceran Berseri (Serial-dilution)

Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam Digunakan jika mikroba dlm kultur campuran terdapat dalam jumlah jumlah lebih besarlebih besar dari pada mikroba lain. dari pada mikroba lain.

Contoh : Contoh : S. lactisS. lactis dalam susu asam dalam susu asam

Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 Dengan tingkat pengenceran tinggi, sampel hanya mengandung 1 galur mikrobagalur mikroba

Perlu dicek kemurnian kulturPerlu dicek kemurnian kultur

5. Teknik Isolasi Sel Tunggal5. Teknik Isolasi Sel Tunggal

Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan Menggunakan alat Mikromanipulator yang digabung dengan mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari preparat mikroskop untuk mengambil suatu sel mikroba tunggal dari preparat tetes bergantungtetes bergantung

Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan Dengan Mikromanipulator, operator dapat mengontrol gerakan mikropipet di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel mikropipet di bawah lensa obyek, sehingga dapat diambil sel tunggal ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media tunggal ke dalam tabung dan selanjutnya dipindahkan ke media yang sesuaiyang sesuai

Lebih cepat, namun kelemahannya : alat mahal & operator harus Lebih cepat, namun kelemahannya : alat mahal & operator harus trampiltrampil

SELEKSISELEKSI

Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik Tujuan : mendapatkan galur dengan kinerja terbaik - rendemen lebih tinggi- rendemen lebih tinggi - tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak- tidak menghasilkan produk sampingan yang tidak dikehendakidikehendaki - peningkatan kemampuan penggunaan sumber C dan N- peningkatan kemampuan penggunaan sumber C dan N yang murah yang murah - Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang lebih- Perubahan morfologi sel menjadi bentuk yang lebih mudah dipisahkan dari produk mudah dipisahkan dari produk

Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba :Pendekatan genetika untuk memperbaiki kualitas mikroba : 1. Mutasi1. Mutasi 2. Rekombinasi2. Rekombinasi

SELEKSI & IDENTIFIKASISELEKSI & IDENTIFIKASI

Taksonomi (klasifikasi)Taksonomi (klasifikasi) : :

penataan teratur unitiunit ke dalam kelompok satuan yang lebih besarpenataan teratur unitiunit ke dalam kelompok satuan yang lebih besar

hierarkhi klasifikasi : hierarkhi klasifikasi :

spesies spesies genus genus familia familia orde orde kelas kelas filum atau divisi filum atau divisi

SpesiesSpesies : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem klasifikasi : satuan atau kelompok dasar dalam semua sistem klasifikasi

organisme organisme

NomenklaturNomenklatur : :

penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasipenamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi

IdentifikasiIdentifikasi : :

penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan nomenklatur penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan nomenklatur untuk mengidentifikasi mikroba dengan membandingkan dengan ciri-untuk mengidentifikasi mikroba dengan membandingkan dengan ciri-ciri/ karakteristik yang adaciri/ karakteristik yang ada

Menggunakan Menggunakan kunci-kuncikunci-kunci yang sesuai yang sesuai

Contoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative BacteriologyContoh : Bakteri : Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

Menggunakan Menggunakan kombinasi biner Latinkombinasi biner Latin, misalnya , misalnya Rhizopus oryzaeRhizopus oryzae

Contoh identifikasi bakteriContoh identifikasi bakteri : : - tidak terdapat bakteroklorofil- tidak terdapat bakteroklorofil - sel tidak berbentuk filamen- sel tidak berbentuk filamen - Gram positif- Gram positif - berbentuk batang- berbentuk batang - menghasilkan endospora- menghasilkan endospora - Katalase positif- Katalase positif - Aerobik- Aerobik - Nitrit negatif- Nitrit negatif - VP (Voges Proskauer) negatif- VP (Voges Proskauer) negatif Bacillus megateriumBacillus megaterium

Identifikasi KapangIdentifikasi Kapang : : a.l. berdasarkan spora dan miseliuma.l. berdasarkan spora dan miselium

Identifikasi khamirIdentifikasi khamir : : a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula sebagai a.l. berdasarkan spora & kemampuan memfermentasi gula sebagai sumber karbonsumber karbon

IDENTIFIKASIIDENTIFIKASI Setelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasiSetelah diperoleh kultur murni, dilakukan identifikasi

MetodeMetode untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan untuk identifikasi mikroba adalah dengan menggunakan ciri/karakteristik :ciri/karakteristik :

1. 1. MorfologisMorfologis Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, Pengamatan ukuran, bentuk dan susunan sel, adanya flagela, kapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengankapsul atau spora dengan bantuan mikroskop, baik dengan pewarnaan maupun tidakpewarnaan maupun tidak 2. 2. NutrisionalNutrisional Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya,Penentuan senyawa kimia dan kondisi fisik khusus (suhu, cahaya, gas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikrobagas) yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba 3. 3. KulturalKultural Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media,Penentuan tampilan pertumbuhan pada berbagai macam media, baik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepibaik cair maupun padat (bentuk koloni, permukaan koloni, tepi koloni, warna dll)koloni, warna dll)

4. 4. MetabolikMetabolik Identifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukanIdentifikasi & pengukuran perubahan kimiawi yang dilakukan mikroba (mikroba ( kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat kemampuan mikroba untuk mengubah karbohidrat menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll)menjadi asam organik; gula menjadi asam dan gas dll) Contoh : Contoh : E. coliE. coli dapat memfermentasi laktosa, sedangkan dapat memfermentasi laktosa, sedangkan Salmonella typhiSalmonella typhi tidak dapat tidak dapat5. 5. Susunan KimiawiSusunan Kimiawi Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel, Penentuan susunan kimiawi berbagai komponen sel (dinding sel,

nukleus, membran dll)nukleus, membran dll)6. 6. Susunan antigenSusunan antigen Penelaahan sifat antigen – antibodi yang khasPenelaahan sifat antigen – antibodi yang khas * Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi * Antigen : substansi (sel mikroba) yang menstimulasi produksi antibodi saat diinjeksikan ke hewan antibodi saat diinjeksikan ke hewan 7. 7. PatogenikPatogenik Penentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakitPenentuan potensi suatu mikroba untuk menimbulkan penyakit8. 8. GenetikGenetik Kajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA ProbeKajian berdasarkan untaian DNA mikroba menggunakan DNA Probe

Contoh 1. Contoh 1. Karakteristik MorfologisKarakteristik Morfologis

Aspergillus E. coli

Streptomyces Penicillium

Contoh 3. Contoh 3. Karakteristik KulturalKarakteristik Kultural Tampilan pertumbuhan pada media padat Tampilan pertumbuhan pada media padat (bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)(bentuk koloni, tepi koloni, permukaan koloni dll)

Sel Bakteri

Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam Tujuan : menjaga sampai periode tertentu mikroba tetap dalam kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & kondisi hidup (viable), mencegah terjadinya perubahan genetik & tidak terkontaminasi tidak terkontaminasi harus mampu melestarikan karakteristik harus mampu melestarikan karakteristik spesies mikroba selama diawetkanspesies mikroba selama diawetkan

Cara :Cara :

1. 1. Pemindahan Secara PeriodikPemindahan Secara Periodik

- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar- Kultur mikroba secara periodik dipindahkan ke media baru/segar

- Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus- Komposisi media & suhu serta interval waktu pemindahan harus

tepattepat

22. . Pelapisan Kultur dgn Minyak MineralPelapisan Kultur dgn Minyak Mineral

- Permukaan agar miring dilapisi dengan minyak mineral steril - Permukaan agar miring dilapisi dengan minyak mineral steril

(+/- 0,5 inci)(+/- 0,5 inci)

- Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah - Keuntungan : dapat memindahkan sebagian mikroba di bawah

minyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dgminyak mineral dg jarum Ose, lalu diinokulasi ke media segar dg

tetap mempertahankan kultur awal tetap mempertahankan kultur awal

PEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNIPEMELIHARAAN & PENGAWETAN KULTUR MURNI

3. Liofilisasi3. Liofilisasi

- Pengeringan beku (- Pengeringan beku (freeze-dryingfreeze-drying))

- Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kultur bakteri- Merupakan cara paling efektif untuk mengawetkan kultur bakteri

(dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 tahun)(dapat tetap hidup & tidak berubah lebih dari 20 tahun)

- - CaraCara : :

* media berisi senyawa pelindung : susu, serum, natrium glutamat dll * media berisi senyawa pelindung : susu, serum, natrium glutamat dll

* suspensi mikroba ditempatkan dalam ampul (vial)* suspensi mikroba ditempatkan dalam ampul (vial)

* Perendalam dalam es kering + alkohol (-78* Perendalam dalam es kering + alkohol (-780C) C) beku beku

* Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum * Ampul dihubungkan dengan kondensor & pompa vakum kering kering

* Ampul ditutup di bawah vakum* Ampul ditutup di bawah vakum

-- Keuntungan Keuntungan : :

* Tahan lama* Tahan lama

* Kemungkinan perubahan kecil* Kemungkinan perubahan kecil

* Wadah penyimpanan kecil* Wadah penyimpanan kecil

Freeze Dryer

4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah 4. Penyimpanan pada Suhu Sangat Rendah

- Menggunakan nitrogen cair (sekitar -176- Menggunakan nitrogen cair (sekitar -1760C)C)

- Sel dibekukan dengan diberi pelindung (gliserol atau dimetil- Sel dibekukan dengan diberi pelindung (gliserol atau dimetil

sulfoksida) sulfoksida)

- Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair- Contoh beku disimpan dalam lemari pendingin nitrogen cair

- Cocok untuk kapang- Cocok untuk kapang

- Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat- Kelebihan : hampir sama dgn liofilisasi & kultur yg tidak dapat

diawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara inidiawetkan dengan liofilisasi, dapat dengan cara ini

5. Penyimpanan pada Tanah Steril5. Penyimpanan pada Tanah Steril

- - Diterapkan untuk penyimpanan sporaDiterapkan untuk penyimpanan spora