Tanggal Praktikum 16 Maret 2015Praktikum 2.2 TEKNIK ISOLASI, KULTIVASI dan PRESERVASI KULTUR

A. PRELAB1. Mengapa dalam teknik isolasi goresan kuadran, cawan petri harus dibagi menjadi

beberapa kuadran ? Jelaskan.Untuk mendapatkan kultur murni berupa koloni tunggal. Daerah inokulasi awal dan hasil gores pertama tumuh padat. Luas beruntun kedua dari daerah 1 hasil memberikan pertumbuhan yang kurang padat. Luas beruntun ketiga dari area 2 yang menghasilkan pertumbuhan yang lemah atau sedikit. Luas beruntun keempat dari area 3 yang menghasilkan koloni tunggal (Alfred, 2011).

2. Apa tujuan dari teknik isolasi dalam dunia mikrobiologi ?Pengertian dari isolasi adalah proses pemisahan mikroba dari kultur mikroba campuran sehingga diperoleh kultur murni dengan kata lain, tujuan dari teknik isolasi adalah untuk memperoleh mikroba dari kultur murni (Gandjar, 2006).

3. Apa tujuan transfer kultur pada agar miring ? JelaskanDigunakan untuk membiakan mikroba yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif. Ciri-ciri kultur termasuk pembentukan warna dan bentuk pertumbuhannya dapat segera diamati di agar miring (Alfred, 2011).

4. Apa tujuan dari sub kultur dalam transfer kultur ?Memindahkan mikroorganis,e biakan atau kultur secara aman dan mencegah terjadinya kontaminasi eksternal yang dapat mempengaruhi hasil eksperimen oleh mikroogranisme bebas (Gandjar, 2006).

5. Ada berapa macam teknik Isolasi? Sebutkan dan Jelaskan masing-masing teknik tersebut.Metode Streak Plate atau metode gores adalah dengan cara menggoreska ose kultur pada media padat. Tujuannya adalah untuk mendapatkan koloni terisolasi dari inokulum dengan menciptakan bidang peningkatan cairan di piring tunggal. Koloni terisolasi merupakan tiruan dari sel, yang berasal dari sel prekursor tunggal. Ketika media kultur yang diinokulasi menggunakan koloni terisolasi tunggal, kultur yang dihasilkan tumbuh dari klon tunggal kultur murni (Katz, 2008).Metode Pour Plate atau metode tuang dapat digunakan untuk menentukan jumlah mikroba/mL atau mikroba/gram pada spesimen. Kelemahan dari metode ini adalah bahwa koloni yang tertanam akan jauh lebih kecil daripada mereka yang kebetulan berada di permukaan, dan harus secara hati-hati sehingga tidak ada yang diabaikan. Juga, wajib anaerob sehingga bakteri dapat tumbuh jika tertanam dalam agar-agar (Fankhauser, 2005).Metode Spread Plate atau metode permukaan adalah metode penyebaran suspensi bakteri secara merata di atas permukaan agar-agar menggunakan batang kaca steril atau spreader sebagai perangkat penyebar (Wise, 2006).

6. Bagaimana cara transfer kultur dari medium cair ke agar tegak ? Jelaskan. Masukkan ose ke dalam tabung yang berisi media cair dan ambil satu ose kultur dan pastikan ada media yang terambil pada loop ose. Masukkan ose yang mengandung media ke dalam tabung yang berisi media agar tegak. Ose yang mengandung mikroba ditusukkan

pada media agar tepat pada bagian tengah hingga 14 dasar media, lalu tariklah ose dari

media agar secara tegak ke atas (Pommerville, 2011).

7. Faktor apa sajakah yang perlu diperhatikan dalam proses kultivasi mikroba? Jelaskan.Kultivasi Mikroba bertujuan untuk mengetahui atau mempelajari sifat pertumbuhan , morfologi, dan sifat fisiologis mikroba. Kultur mikroba digunakan untuk menentukan jenis organisme, dengan kelimpahan dalam sampel yang diuji, atau keduanya. Lingkungan fisik yang perlu diperhatikan dalam menumbuhkan mikroba yaitu temperatur atau suhu , kadar oksigen, pH dan tekanan osmosis (Gandjar, 2006).

8. Sebutkan dan jelaskan teknik-teknik preservasi mikroba yang digunakan dalam pembuatan stok kultur!Freezing atau pembekuan merupakan metode preservasi mikroorganisme yang paling sederhana dan paling umum. Untuk pembekuan biasa tidak diperlukan alat khusus. Meskipun perlu ditambahkan cryoprotective agent untuk mendapatkan hasil yang memuaskan dengan metode pembekuan tersebut. Selain itu, suhu penyimpanan harus tetap dijaga dibawah -20°C (Reece, 2005).Freeze – drying meliputi pemindahan air dari larutan sel yang beku dengan sublimasi dengan tekanan rendah. Cara ini merupakan metode paling efektif untuk preservasi mikroorganisme dalam waktu lama. Media yang digunakan adalah skim milk powder 20% (wt/vol) atau sukrosa 12% (wt/vol). Sebagian besar mikroba dapat bertahan dalam media preservasi liofilisasi selama 10 tahun, selain itu untuk pemindahan tidak perlu untuk ditumbuhkan lagi dalam agar miring atau dicairkan (Reece, 2005).Subculturing yaitu dengan cara memindahkan kultur ke media agar segar secara periodik, kemudian diinkubasikan pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhannya. Metode ini tidak menyusahkan dan tidak mahal, serta tidak memerlukan peralatan khusus. Kultur pada agar miring harus disimpan dalam lemari pendingin (5°C) dalam wadah tertutup untuk menghindarkan dari kekeringan dan meminimalkan aktivitas metabolismenya. Cara ini tidak sesuai untuk pemeliharaan strain dalam waktu lama (Reece, 2005).Immersion in Mineral Oil: Cara sederhana untuk preservasi strain mikroba adalah dengan mencelupkan kultur (agar miring atau kultur cair) kedalam minyak mineral dan menyimpannya dengan posisi tegak lurus pada suhu 25 C. Minyak disterilisasikan dalam oven dengan suhu 170 C selama 1 – 2 jam. Kultur direndam dibawah minyak dan dengan mudah dapat ditumbuhkan kembali pada media segar memakai jarum inokulasi (Reece, 2005).

Paraf Asisten

Nama:B. DIAGRAM ALIR1. Metode Streak Plate Goresan Kuadran

Dibuat pembagian sektor 4 kuadran

Dipijarkan ose

Diambil 1 ose kultur dari agar miring (aseptis)

Digoreskan secara zig-zag dari sektor 2 ke 3 dan 3 ke 4

Cawan petri diberi label

Diinkubasi suhu 30°C 48 jam

2. Metode Spread Plate

Diencerkan

Diambil suspensi sampel 0,1 ml

Diinokulasikan pada cawan yang berisi media agar padat

Diratakan sampel pada permukaan agar dengan spreader

Cawan petri diberi label

Diinkubasi suhu 30°C 48 jam

Cawan berisi media

Hasil

Sampel Mikroba

Hasil

3. Metode Pour Plate

Diambil suspensi sampel 1 ml

Diinokulasikan pada cawan petri kosong

Dituangkan medium agar steril bersuhu 40-50°C

Diputar cawan mengikuti pola angka delapan

Diinkubasi suhu 30°C 48 jam

4. Transfer Kultur dari Tabung Reaksi ke Tabung Reaksia. Medium Agar Miring ke Medium Agar Miring

Ose dipijarkan

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi media agar miring

Diinokulasikan pada tabung reaksi berisi agar miring secara zig-zag dari bawah ke atas

Diinokulasi suhu 30°C 48 jam

Sampel Mikroba

Hasil

Sampel

Hasil

b. Medium Agar Miring ke Medium Agar Tegak

Ose dipijarkan

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi media agar miring

Diinokulasikan pada tabung reaksi berisi agar tegak dengan menusuk tepat ¼ bagian dasar media

Diinokulasi suhu 30°C 48 jam

c. Medium Agar Miring ke Medium Broth

Ose dipijarkan

Diambil 1 ose kultur dari tabung reaksi berisi media agar miring

Diinokulasikan ke dalam tabung berisi media broth

Diinkubasi suhu 30°C 48 ajm

Sampel

Hasil

Sampel

Hasil

5. Teknik Preservasi Kriogenik

Dibuat larutan stok gliserol konsentrasi 60%

Dimasukan 0,5 ml kultur dan 0,5 ml gliserol ke dalam tube steril

Divortex

Dibekukan suhu (-80°C)

Alat dan Bahan

Hasil

C. DATA HASIL PENGAMATAN1. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar miring!

Asal Isolat : S. Aureus Agar Miring Asal Isolat : E. Coli Agar MiringKeterangan : Isolasi ke agar miring, Keterangan : Isolasi ke agar miring,

Terdapat kontaminasi Terdapat kontaminasi

2. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar tegak!

Asal Isolat : S. Aureus Agar Miring Asal Isolat : E. Coli Agar MiringKeterangan : Kontaminasi, Villose, Keterangan : Tidak kontaminasi, abore

Diisolasi ke NA tegak Diisolasi ke NA tegak

3. Gambarlah bentuk pertumbuhan kultur yang saudara transfer pada agar cair!

Asal Isolat : S. Aureus Agar Miring Asal Isolat : E. Coli Agar MiringKeterangan : Tidak kontaminasi, Mengendap Keterangan : Diisolasi ke NB, Menge-

Diisolasi ke NB ndap, Tidak kontaminasi

4. Bandingkan pertumbuhan kultur yang anda lakukan pada agar tegak, agar miring, dan media cair.

Nama Mikroorganisme : S. AureusTipe media yang

digunakanNama Media Karakteristik Pertumbuhan

(+) atau (-)Kontaminasi(+) atau (-)

Agar Tegak Nutrient Agar Villose + +Agar Miring Nutrient Agar Spreading - +Broth Nutrient Broth Mengendap + -

Nama Mikroorganisme : E. ColiTipe media yang

digunakanNama Media Karakteristik Pertumbuhan

(+) atau (-)Kontaminasi(+) atau (-)

Agar Tegak Nutrient Agar Aborescent + -Agar Miring Nutrient Agar Echinulate - +Broth Nutrient Broth Mengendap + -

5. Gambar bentuk sel-sel mikroba yang saudara isolasi pada cawan petri dengan pensil warna!

Asal Isolat : S. Aureus Asal Isolat : E. Coli

6. Pilihlah salah satu koloni yang terpisah, jelaskan ciri-ciri nya (lihat Gb.2.7 dan 2.8) dan identifikasi bakteri tersebut.

Nama Mikroorganisme : S. AureusMorfologi Koloni Mikroorganisme Keterangan

Bentuk Medium KontaminasiElevasi Irregular KontaminasiPermukaan Kasar KontaminasiMargin Lobate Kontaminasi

Nama Mikroorganisme : E. ColiMorfologi Koloni Mikroorganisme Keterangan

Bentuk Large, point KontaminasiElevasi Irregular, circular, rhizoid KontaminasiPermukaan Halus mengkilap KontaminasiMargin Lobate, serate, filamentus Kontaminasi

D. ANALISA PROSEDURPercobaan yang dilaksanakan pada praktikum ini adalah memindahkan kultur dari

tabung reaksi medium agar miring ke medium agar miring, medium agar miring ke medium agar tegak, medium agar miring ke medium broth, kemudian pengenceran sampel dan dilanjutkan dengan penyebaran kultur dengan menggunakan metode streak plate goresan kuadran, metode pour plate dan metode spread plate, selanjutnya teknik preservasi kultur jangka panjang yaitu kriogenik.

Percobaan pertama adalah memindahkan kultur dari tabung reaksi medium agar miring ke medium agar miring. Alat dan bahan yang dibutuhkan antara lain tabung reaksi medium agar miring yang telah ditumbuhi kultur, tabung reaksi medium agar miring yang masih steril atau belum terdapat kultur didalamnya, ose dengan loop, rak tabung, bunsen, alkohol 70% dan tisu. Langkah pertama adalah aseptis lingkungan dengan menyemprotkan alkohol 70% ke meja kerja secukupnya kemudian diratakan dan dibersihkan dengan menggunakan tisu, setelah aseptis lingkungan kemudian mengaseptiskan diri sendiri dengan menyemprotkan alkohol 70% ke telapak tangan dan kemudian diratakan dengan cara digosok-gosokkan lalu disemprotkan ke punggung tangan dan diratakan juga. Jika sudah aseptis, maka selanjutnya adalah memindahkan kultur. Menyalakan bunsen. Memegang tabung reaksi yang berisi kultur di tangan kiri dan ose ditangan kanan, saat memegang ose seperti memegang pensil, kemudian mensterilisasi ose dengan cara mencelupkan ose ke dalam alkohol 70% dan dipanasi diatas bunsen hingga alkoholnya menghilang, dilakukan sebanyak tiga kali, jika sudah selanjutnya adalah membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan, dipastikan saat membuka selalu di dekat dengan bunsen. Memanasi mulut tabung reaksi kultur dengan menggunakan api bunsen, kemudian secara cepat mengambil satu loop ose kultur, memastikan bahwa diloop terdapat kultur, kembali memanasi mulut tabung reaksi kultur dan kemudian menutupnya kembali dengan kapas yang dijepit di jari kelingking dan jari manis tangan kanan. Selanjutnya memegang tabung reaksi yang akan ditanami kultur di tangan kiri dan ose yang mengandung kultur di tangan kanan, membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara yang sama seperti sebelumnya, memanasi mulut tabung reaksi secukupnya kemudian memasukkan ose yang mengandung kultur dan menggoreskannya diatas dipermukaan agar miring dengan cara zig-zag rapi dan berjarak sehingga tidak terlalu rapat, mengeluarkan ose dari tabung reaksi dan langsung dipanasi diatas bunsen, kembali memanasi mulut tabung reaksi dan selanjutnya menutupnya kembali. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Percobaan kedua adalah memindahkan kultur dari tabung reaksi medium agar miring ke medium agar teguk. Alat dan bahan yang dibutuhkan antara lain sama seperti percobaan sebelumnya namun media agar miring yang akan ditanami kultur diganti medium agar tegak dan ose yang semula loop diganti menjadi tanpa loop. Langkah pertama dan yang paling penting adalah aseptis diri dan lingkungan. Jika sudah aseptis, maka selanjutnya adalah memindahkan kultur. Menyalakan bunsen. Memegang tabung reaksi yang berisi kultur di tangan kiri dan ose ditangan kanan, saat memegang ose seperti memegang pensil, kemudian mensterilisasi ose dengan cara mencelupkan ose ke dalam alkohol 70% dan dipanasi diatas bunsen hingga alkoholnya menghilang, dilakukan sebanyak tiga kali, jika sudah selanjutnya adalah membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan, dipastikan saat membuka selalu di dekat dengan bunsen. Memanasi mulut tabung reaksi kultur dengan menggunakan api bunsen, kemudian secara cepat mengambil satu loop ose kultur, memastikan bahwa diloop terdapat kultur, kembali memanasi mulut tabung reaksi kultur dan kemudian menutupnya kembali dengan kapas yang dijepit di jari kelingking dan jari manis tangan kanan. Selanjutnya memegang tabung reaksi medium agar tegak yang akan ditanami kultur di tangan kiri dan ose yang mengandung kultur di tangan kanan, membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara yang sama seperti sebelumnya, memanasi mulut tabung reaksi secukupnya kemudian memasukkan ose yang mengandung kultur dan menusukannya kedalam agar tegak hinga ¼ bagian dasar

media, mengeluarkan ose dari tabung reaksi dan langsung dipanasi diatas bunsen, kembali memanasi mulut tabung reaksi dan selanjutnya menutupnya kembali. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Percobaan ketiga adalah memindahkan kultur dari tabung reaksi medium agar miring ke medium broth. Alat dan bahan juga hampir sama namun medium agar miring tempat akan ditanami diganti medium broth. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan. Jika sudah aseptis, maka selanjutnya adalah memindahkan kultur. Menyalakan bunsen. Memegang tabung reaksi yang berisi kultur di tangan kiri dan ose ditangan kanan, saat memegang ose seperti memegang pensil, kemudian mensterilisasi ose dengan cara mencelupkan ose ke dalam alkohol 70% dan dipanasi diatas bunsen hingga alkoholnya menghilang, dilakukan sebanyak tiga kali, jika sudah selanjutnya adalah membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara menjepitnya dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan, dipastikan saat membuka selalu di dekat dengan bunsen. Memanasi mulut tabung reaksi kultur dengan menggunakan api bunsen, kemudian secara cepat mengambil satu loop ose kultur, memastikan bahwa diloop terdapat kultur, kembali memanasi mulut tabung reaksi kultur dan kemudian menutupnya kembali dengan kapas yang dijepit di jari kelingking dan jari manis tangan kanan. Selanjutnya memegang tabung reaksi medium broth yang akan ditanami kultur di tangan kiri dan ose yang mengandung kultur di tangan kanan, membuka tutup kapas tabung reaksi dengan cara yang sama seperti sebelumnya, memanasi mulut tabung reaksi secukupnya kemudian memasukkan ose yang mengandung kultur dan menggoyang-goyangkan ose perlahan hingga kultur terlepas, mengeluarkan ose dari tabung reaksi dan langsung dipanasi diatas bunsen, kembali memanasi mulut tabung reaksi dan selanjutnya menutupnya kembali. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Setelah percobaan transfer kultur, selanjutnya adalah penyebaran kultur. Namun sebelum penyebaran kultur terdapat tahapan pengenceran sampel. Alat dan bahan yang dibutuhkan adalah dua buah tabung reaksi berisi medium broth 10 ml yang masih belum terdapat kultur, satu buah tabung reaksi medium broth dengan sampel didalamnya, vortex, mikrotip 1 ml, mikropipet 1 ml, dan bunsen. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan, setelah mengaseptis diri dan lingkungan selanjutnya adalah mengencerkan sampel dengan cara mikropipet 1 ml disterilisasi dan diujung telah terdapat mikrotip, tutup kapas tabung reaksi sampel dibuka dan mulut tabung dipanaskan diatas bunsen, tombol pada ujung mikropipet dengan tekan penuh, mikropipet dimasukkan kedalam tabung reaksi hingga setengah medium, tombol dilepas dan mikropipet dikeluarkan, mulut tabung dipanaskan kembali sekali lagi kemudian tabung ditutup, tabung reaksi tempat sampel diencerkan 10-1 dibuka tutup kapasnya, mulut tabung dipanaskna, mikropipet dimasukkan dan tombol pada ujung ditekan lagi hingga penuh untuk mengeluarkan sampel, mikropipet dikeluarkan dan mikrotipnya dilepaskan, mulut tabung reaksi tempat pengenceran sampel 10-1 dipanaskan sekali lagi dan kemudian ditutup dengan menggunakan kapas, sampel didalam tabung reaksi dihomogenisasikan dengan menggunakan vortex dengan vortex dihidupkan atau pada posisi on, kemudian tabung reaksi dipegang dengan kuat dan ditekankan pada permukaan vortex secara hati-hati dan perlahan hingga terbentuk pusaran air di dalam tabung reaksi, jika sudah terbentuk, selanjutnya adalah pengenceran kedua, caranya sama seperti pengenceran pertama namun sampel diambil 1 ml dari tabung reaksi pengenceran 10-1 dan diencerkan didalam tabung reaksi pengenceran 10-2. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Setelah pengenceran, selanjutnya adalah percobaan penyebaran kultur dan yang pertama adalah menggunakan metode spread. Alat dan bahan yang disiapkan antara lain spreader atau penyebar, cawan petri yang telah berisi media agar padat dan masih belum terdapat kultur, tabung reaksi berisi kultur pengenceran 10-1 dan 10-2, mikrotip 0,1 ml, mikropipet 0,1 ml, alkohol 70% dan bunsen. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan, setelah aseptis, kemudian mengambil kultur didalam tabung reaksi dengan menggunakan mikropipet 0,1 ml, terlebih dahulu mensterilisasikan mikropipet dengan menyemprotkan alkohol lalu dibersihkan dengan menggunakan tisu. Menekan tombol pada

bagian ujung mikropipet hingga tertekan penuh, tutup kapas pada tabung reaksi pengenceran 10-1 dibuka, mulut tabung dipanasi, mikropipet dimasukkan hingga ½ bagian medium, tombol pada bagian ujung dilepas, mikropipet dikeluarkan dan mulut tabung reaksi dipanasi sekali lagi dan kemudian ditutup dengan menggunakan kapas. Cawan petri yang telah berisi media agar, disekelilingnya dipanaskan sebentar diatas bunsen, tutup cawan petri dibuka sedikit, ujung mikropipet dimasukkan ke dalam celah yang terbentuk antara bagian dasar cawan petri dengan bagian tutupnya, tombol pada bagian ujung satunya ditekan hingga penuh hingga semua sampel kultur keluar, mikropipet dikeluarkan dan cawan petri ditutup sebentar dan disekelilingnya dipanasi sekali lagi, spreader disterilisasi dengan cara dicelupkan pada alkohol 70% kemudian dipanasi diatas bunsen hingga alkohol menghilang, dilakukan sterilisasi hingga tiga kali, cawan petri dipanasi kembali sekelilingnya dan tutupnya dibuka sedikit, spreader dimasukkan dan sampel diratakan menyeluruh diseluruh permukaan agar, spreader dikeluarkan dan langsung dipanasi diatas bunsen, cawan petri ditutup dan sekelilingnya dipanasi kembali sebentar. Mengulangi kembali cara penyebaran permukaan diatas untuk sampel pengenceran 10-2. Kemudian cawan petri dibungkus dengan menggunakan kertas payung dan diberi label nama kelompok, nama mikroba dan metode yang dilakukan. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Percobaan penyebaran kultur yang kedua adalah menggunakan metode tuang. Alat dan bahan yang disiapkan antara lain cawan petri yang masih kosong dan steril, tabung reaksi berisi kultur pengenceran 10-1 dan 10-2, mikrotip 1 ml, mikropipet 1 ml, alkohol 70%, media agar cair bersuhu 47-50°C di dalam erlenmeyer dan bunsen. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan, setelah aseptis, kemudian mengambil kultur didalam tabung reaksi dengan menggunakan mikropipet 1 ml, terlebih dahulu mensterilisasikan mikropipet dengan menyemprotkan alkohol lalu dibersihkan dengan menggunakan tisu. Menekan tombol pada bagian ujung mikropipet hingga tertekan penuh, tutup kapas pada tabung reaksi pengenceran 10-1 dibuka, mulut tabung dipanasi, mikropipet dimasukkan hingga ½ bagian medium, tombol pada bagian ujung dilepas, mikropipet dikeluarkan dan mulut tabung reaksi dipanasi sekali lagi dan kemudian ditutup dengan menggunakan kapas. Cawan petri yang masih kosong, disekelilingnya dipanaskan sebentar diatas bunsen, tutup cawan petri dibuka sedikit, ujung mikropipet dimasukkan ke dalam celah yang terbentuk antara bagian dasar cawan petri dengan bagian tutupnya, tombol pada bagian ujung satunya ditekan hingga penuh hingga semua sampel kultur keluar, mikropipet dikeluarkan dan cawan petri ditutup sebentar dan dipanasi disekelilingnya sekali lagi, Erlenmeyer yang berisi media agar cair bersuhu 47-50°C dibuka tutup kapasnya, mulut erlenmeyer dipanasi diatas bunsen, tutup cawan petri dibuka sedikit kemudian media agar cair didalam erlenmeyer dituangkan secukupnya ke atas sampel, mulut erlenmeyer dipanasi sekali lagi diatas bunsen dan ditutup dengan menggunakan kapas, cawan petri ditutup dan sekelilingnya dipanasi kembali sebentar. Kemudian dicampurkan antara sampel dengan media agar dengan cara menggoyangkan cawan diatas meja membentuk angka delapan. Mengulangi sekali lagi cara metode tuang diatas untuk pengenceran 10-2. Kemudian cawan petri dibungkus dengan menggunakan kertas payung dan diberi label nama kelompok, nama mikroba dan metode yang dilakukan. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Percobaan penyebaran kultur yang ketiga adalah menggunakan metode streak. Alat dan bahan yang disiapkan antara lain ose berloop, cawan petri yang berisi media agar dan steril, tabung reaksi kultur medium agar miring, alkohol 70% dan bunsen. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan, setelah aseptis, kemudian menggambar pembagian sektor kuadran dibalik dasar cawan petri, mengambil kultur didalam tabung reaksi dengan menggunakan ose, terlebih dahulu mensterilisasikan ose dengan cara mencelupkan ose pada alkohol dan dibakar, mengulangi cara tersebut sebanyak tiga kali. Tutup kapas tabung reaksi dibuka, ose yang telah steril dimasukkan dan kultur diambil, ose dikeluarkan dan tabung reaksi ditutup, cawan petri dipanaskan sebentar sekelilingnya, tutup cawan petri dibuka sedikit dan ose yang telah terdapat kultur digoreskan pada sektor I dengan cara zig-zag, ose

dikeluarkan dan dipanaskan, cawan petri ditutup sebentar kemudian dibuka lagi, ose dimasukkan kembali ke cawan petri dan melanjutkan goresan dari sektor I ke sektor II dengan cara zig-zag, kembali ose dikeluarkan dan dipanasi, cawan petri ditutup sebentar dan dibuka kembali, melanjutkan goresan dari sektor II ke sektor III, dan melakukan cara yang sama seperti sebelumnya untuk melanjutkan goresan dari sektor III ke sektor IV. Cawan petri ditutup, dipanaskan kembali sekelilingnya, dibungkus dengan menggunakan kertas payung dan diberi label nama kelompok, nama mikroba dan metode yang dilakukan. Selanjutnya diinkubasikan pada suhu 30°C selama 48 jam.

Percobaan terakhir adalah preservasi kultur kriogenik dengan menggunakan gliserol 60% sebagai media. Alat dan bahan yang dibutuhkan adalah tube steril, gliserol 60% yang berfungsi untuk menyediakan nutrisi bagi mikroba, tabung reaksi berisi sampel kultur mikroba dengan pengenceran 10-1, vortex, bunse, alkohol 70%, tisu, mikrotip 0,1 ml dan mikropipet 0,1 ml dan lemari freezing suhu hingga -80°C. Langkah pertama adalah aseptis diri dan lingkungan. Setelah aseptis, mengambil 0,5 ml sampel kultur mikroba dengan menggunakan mikropipet 0,1 ml. Caranya adalah mensterilisasi mikropipet terlebih dahulu dengan disemprotkan alkohol 70% kemudian dilap dengan menggunakan tisu, kemudian tabung reaksi yang berisi sampel dipegang ditangan kiri, tutup tabung reaksi dibuka dengan menggunakan jari kelingking dan jari manis tangan kanan. Mulut tabung reaksi dipanasi sebentar, selanjutnya tombol pada ujung atas mikropipet ditekan hingga penuh, mikropipet dimasukkan hingga setengah larutan sampel kultur, tombol dilepaskan, mikropipet dikeluarkan, dan sampel dipindahkan ke dalam tube steril, dilakukan sebanyak lima kali. Jika sudah, kemudian ditambahkan dengan gliserol sebanyak 0,5 ml sehingga perbandingan antara sampel kultur dengan gliserol adalah 1:1, cara yang dilakukan adalah sama seperti saat mengambil sampel namun mulut botol gliserol tidak perlu dipanasi. Setelah ditambahkan dengan gliserol, tube dimasukkan pada lemari freezing suhu -80°C.

E. ANALISA HASILHasil pada percobaan pertama yaitu pemindahan kultur dari medium agar miring ke

medium agar miring dengan asal isolat mikroorganisme yang digunakan adalah S. Aureus agar miring NA, telah terjadi kontaminasi sehingga menyebabkan kultur tidak tumbuh, hal ini ditunjukan dengan adanya bakteri kontaminan atau bakteri penggangu lainnya berupa warna putih dan totol-totol disekitaran agar dan didalam agar, bentuk dari bakteri yang ada dipermukaan adalah spreading. Hasil percobaan yang sama dari kelompok pembanding yaitu pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium agar miring dengan asal isolat mikroorganisme yang digunakan adalah E. Coli agar miring NA, juga telah terjadi kontaminasi sehingga menyebabkan kultur tidak tumbuh, hal ini ditunjukan dengan adanya bakteri kontaminan atau bakteri penggangu lainnya berupa warna putih dan totol-totol disekitaran agar dan didalam agar, bentuk dari bakteri yang tumbuh dipermukaan adalah echinulate. Kontaminasi dapat disebabkan karena seringnya praktikan berbicara didalam laboratorium tanpa mengenakan masker, kesalahan dalam meletakkan kapas penutup tabung reaksi, percobaan yang dilakukan tidak dilakukan didekat sekitaran bunsen (api), kurang sterilnya ose yang digunakan sehingga tumbuh bakteri penggangu atau bakteri kontaminan.

Hasil pada percobaan kedua yaitu pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium agar tegak dengan asal isolat mikroorganisme yang digunakan adalah S. Aureus agar miring NA, juga masih mengalami kontaminasi sehingga namun kultur tumbuh ditunjukan dengan adanya pertumbuhan seperti akar yang berbentuk villose, kontaminan ditunjukan dengan adanya bakteri kontaminan atau bakteri penggangu lainnya berupa warna putih dan totol-totol disekitaran agar dan didalam agar. Kontaminasi dapat disebabkan karena seringnya praktikan berbicara didalam laboratorium tanpa mengenakan masker, kesalahan dalam meletakkan kapas penutup tabung reaksi, percobaan yang dilakukan tidak dilakukan didekat sekitaran bunsen (api), kurang sterilnya ose yang digunakan sehingga tumbuh bakteri penggangu atau bakteri kontaminan. Hasil yang berbeda ditunjukkan oleh kelompok pembanding, pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium agar miring dengan asal isolat mikroorganisme yang digunakan adalah E. Coli agar miring NA, tidak terjadi kontaminasi, pada agar ditunjukkan hasil yang bersih tanpa totol-totol baik didalam maupun dipermukaan, bentuk dari bakteri yang tumbuh adalah aborescent.

Pada percobaan yang ketiga yaitu pemindahan kultur dari medium agar miring ke medium broth namun dalam percobaan ini menggunakan pepton, kedua kelompok baik pengguna S. Aureus maupun E. Coli menunjukan hasil yang sama, bakteri mengalami pertumbuhan tanpa adanya kontaminasi dan dibagian dasarnya terdapat seperti endapan-endapan.

Percobaan selanjutnya yang diamati adalah penumbuhan kultur dengan metode streak plate kuadran dengan alas isolat berupa bakteri S. Aureus pengeceran 10-1, bentuk dari bakteri yang tumbuh adalah medium dengan elevasi irregular, memiliki permukaan yang kasar dan margin lobate, namun pada percobaan ini juga masih kontaminasi dengan adanya bakteri kontaminan. Pada percobaan kelompok pembanding yang menggunakan E. Coli pengenceran 10-1, juga terdapat bakteri kontaminan. Bentuk dari bakteri yang tumbuh large dan point dengan elevasi yang bermacam-macam seperti irregular, circular dan rhizoid, memiliki permukaan yang halus mengkilap dan margin yang bermacam-macam seperti lobate, serate dan filamentus. Bentuk yang bermacam-macam dapat disebabkan oleh adanya bakteri kontaminan yang tumbuh bersamaan didalam agar dengan bakteri kultur.

F. PEMBAHASAN1. Pada teknik isolasi, apa perbedaan koloni mikroba yang tumbuh pada masing-masing

kuadran ? Mengapa demikian ? Jelaskan.Pada kuadran pertama, mikroba yang tumbuh masih berasal dari kolonn beragam dan memiliki bermacam-macam bentuk dengan pertumbuhan yang sangat padat. Pada kuadran kedua, jumlah pertumbuhan semakin berkurang dari pertama namun tetap padat. Pada kuadran ketiga, jumlah pertumbuhan semakin sedikit dan pada keempat didapatkan koloni tunggal. Ini dikarena setiap akan digorekan ke sektor/kuadran lain, loop ose terlebih dahulu dibakar, mematikan mikroba yang menempel sehingga saat menggeser dari kuadran satu ke yang lain, jumlah mikroba semakin sedikit dan didapatkan koloni tunggal yang diharapkan (Black, 2008).

2. Apa yang dimaksud dengan ”selective media” ? Mengapa media tersebut digunakan dalam teknik isolasi ? Jelaskan. Sebutkan contoh ”selective media” sebanyak 2.Selective media adalah media atau subtrat atau senyawa kimia tertentu yang menghambat kelompok bakteri tertentu atau tidak menghambat kelompok bakteri tertentu. Media tersebut banyak digunakan untuk teknik isolasi karena sesuai dengan tujuan isolasi yaitu untuk mendapat kultur murni dari kultur campuran sehingga akan didapatkan bakteri murni yang dapat bertahan hidup sesuai dengan kondisi yang telah ditetapkan dan bakteri lain akan terhambat pertumbuhannya dan mati (Adnan, 2009).Contohnya: Kaldu selenit, Brilliant Green Agar, Mac Conkey Agar, EMB (Eosyn Methylene Blue) Agar, Sallmonella Shigella Agar, Endo Agar, Gram Negative Broth dan Deoxychocolate (Adnan, 2009).

3. Apakah koloni yang terpisah pada teknik isolasi merupakan pertumbuhan dari satu sel mikroba ? Apakah koloni tersebut dapat dikatakan sebagai kultur murni ? Jelaskan.Koloni tersebut didapat dikatakan sebagai kultur murni karena tumbuh dari satu sel mikroba yang terpisah dari lainnya dan telah diisolasikan terlebih dahulu (Walker, 2005).

4. Apa keunggulan metode Streak Plate dan Spread Plate pada teknik isolasi mikroba? Jelaskan pula tentang Loop Dilution.

Streak plate lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh. Koloni yang dihasilkan adalah single koloni atau 1 koloni hanya dari 1 spesies saja. Selain itu kontaminan mudah dibedakan. Karena pada metode ini ose digoreskan dengan pola tertentu, maka koloni yang tumbuh diluar pola tersebut dapat dinyatakan sebagai kontaminan (Suriawiria 2005).

Metode surface plate dapat dilakukan untuk memisahkan mikrobia aerob dengan mikroba yang lain. Karena jika dituangkan pada permukaan medium, bakteri yang paling diuntungkan adalah bakteri aerob (Waluyo, 2007).

5. Apa kegunaan penambahan gliserol pada proses preservasi kultur? Jelaskan.Gliserol dapat digunakan sebagai media karena gliserol dapat melindungi aktivitas antimikroba dengan cara meningkatkan stabilitas struktur protein asli dari mikroba sehingga dapat mencegah protein dari proses termal dan agregasi. Selain itu gliserol dapat meningkatkan energi bebas dari kompleks yang diaktifkan dan mengeser kesetimbangan energo tersebut. Gliserol ini dapat menyerap air pada permukaan protein yang dapat mengakibatkan hidrasi yang dapat melindungi protein dari kerusakan. Oleh karena itu giserol dapat memperpanjang penyimpanan mikroorganisme (Black, 2008).

G. KESIMPULANIsolasi adalah proses pemisahan mikroba dari kultur mikroba campuran untuk

mendapatkan kultur murni. Kultur murni yaitu biakan yang terdiri dari sel-sel dari satu spesies atau satu galur mikroba.

Teknik isolasi yang dapat dilakukan pada agar cawan antara lain adalah metode goresan (Streak plate), Metode tuang (Pour plate), dan Metode permukaan (Spread plate).

Hasil yang didapatkan dari percobaan untuk metode goresan dengan alat isolat adalah S. Aureus pengenceran 10-1 adalah mikroba terkontaminasi, bentuk yang didapatkan adalah large dengan elevasi yang kasar, permukaannya kasar dan marginnya adalah lobate sedangkan dari kelompok pembanding dengan asal isolat adalah E. Coli pengenceran 10-1, mikroba juga terkontaminasi dengan bentuk yang didapatkan adalah Large dan point, elevasinya irregular, circular dan rhizoid, bentuk halus mengkilap dan marginnya adalah lobate, serate dan filamentus

Teknik preservasi mikroba adalah upaya penyimpanan dan pemeliharan mikroba dalam jangka waktu tertenu dan jika mikroba tersebut dibutuhkan dapat diperoleh dengan mudah. Tujuan dari teknik preservasi adalah untuk mereduksi atau mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme sekecil mungkin dan menjaganya sebaik mungkin.

Preservasi sub-kultur adalah penyimpanan mikroba dalam jangka waktu pendek sehingga harus dilakukan peremajaan mikroba dalam waktu tertentu.

Transfer kultur adalah pemindahan kultur dari media satu ke media lainnya dengan cara sub-kultur. Hasil yang diperoleh dari transfer kultur dengan teknik sub-kultur adalah sebagai berikut :

a) Medium agar miring ke medium agar miringAsal isolat bakteri adalah S. Aureus agar miring, terkontaminasi karena terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain, karakteristik dari mikroba adalah spreading. Kelompok pembanding menggunakan asal isolat bakteri adalah E. Coli agar miring, terkontaminasi karena terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain, karakteristik dari mikroba adalah echinulate.

b) Medium agar miring ke medium agar tegakAsal isolat bakteri adalah S. Aureus agar miring, terkontaminasi karena terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain, karakteristik dari mikroba adalah villose. Kelompok pembanding menggunakan asal isolat bakteri adalah E. Coli agar miring, tidak terkontaminasi karena tidak terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain, karakteristik dari mikroba adalah arborescent.

c) Medium agar miring ke medium peptonAsal isolat bakteri adalah S. Aureus agar miring, tidak terkontaminasi karena tidak terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain namun terdapat endapan dibagian bawahnya. Kelompok pembanding menggunakan asal isolat bakteri adalah E. Coli agar miring, tidak terkontaminasi karena tidak terdapat bintil atau totol yang menandakan tumbuhnya bakteri lain namun terdapat endapan dibawahnya.

DAFTAR PUSTAKA

Alfred, Brown E. 2011. Benson's Microbiological Applications 9th Ed. New York: McGraw Hill

Fankhauser, David B. 2005. Pour Plate Technique. http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs /Microbiology/Meat_Milk/Pour_Plate.htm. Diakses 15 Maret 2015 pada jam 15:42 (24 Juni 2005)

Gandjar, Indrawati. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta: Yayasan Obor IndonesiaKatz, D. Sue. 2008. The Streak Plate Protocols. http://www.microbelibrary.org/library/

laboratory-test/3160-the-streak-plate-protocol. Diakses 15 Maret 2015 pada jam 15:34 (8 September 2008)

Pommerville, J.C. 2011. Alcamo’s Laboratory Fundamental of Microbiology. Burlington: Jones and Bartlett Learning

Reese, Jane B. 2005. Biologi Jl. 3 Ed. 5. Jakarta: ErlanggaWise, Kathryn. 2006. Preparing Spread Plate Protocols. http://www.microbelibrary.org/

component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols. Diakses 15 Maret 2015 pada jam 15:24 (9 Oktober 2006)

DAFTAR PUSTAKA TAMBAHAN

Adnan, Kunta. 2009. Cara pengambilan sampel yang steril. http://www.fedcosierra.com/ 2007/06/cara-pengambilan-sampel-yang-steril.html. Diakses pada 21 Maret 2015 jam 23:55. (4 Oktober 2009)

Black, Jacquelyn G. 2008. Microbiology: Principles Explorations. New York: John Wiley & Sons

Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar SinantiWalker, T. Stuart. 2005. Microbiology. Philadelphia: W.B. Saunders Company Waluyo, L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press