ISOLASI DAN SELEKSI MIKROBA PENGHASIL ENZIM PENGGUMPAL SUSU (MILK-CLOTTING)DARI PANGAN FERMENTASI SEBAGAI PENGGANTI RENIN DALAM

PEMBUATAN KEJU

SKRIPSI

YANA NURITASARI F24070059

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2012

ISOLATION AND SELECTION OF MICROBES PRODUCE MILK CLOTTING ENZYME FROM FERMENTED FOOD AS AN

ALTERNATIVE RENNIN-SUBSTITUTE IN CHEESE PROCESSING

Yana Nuritasari 1, Nurheni Sri Palupi 1, and Nanik Rahmani 2

1Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO Box 220,

Bogor,WestJava, Indonesia Phone: +62 856 9977418, e-mail: yananuritasari@gmail.com

2Biocatalyst and Fermentation Laboratorium, Biotecnology Research Center, The Indonesian

Institutes of Sciences, Cibinong, West Java, Indonesia

ABSTRACT

Cheese is one of the favorite food used as topping or filling ingredient in desserts and bakery products. Basic process in cheese processing is milk coagulation using renin activity, a milk-clotting enzyme from calf stomach. The difficulties to obtain rennin encourage to find other alternatives rennin-sustitute. The objectives of this research were to obtain isolate produces milk clotting enzyme from fermented food and determine the isolate which has high ratio of milk-clotting enzyme activity toward protease. The methods of this research were enrichment, isolation, measurement of milk-clotting activity, measurement of protease activity, and determination of ratio of milk clotting activity toward protease, respectively. This isolation resulted three isolates from tauco (TCN 1, TCN 2, TCN 3) and one isolate from fermented vegetable (DSN 1).The isolate which has the highest ratio of milk-clotting toward protease is TCN 2 with the ratio 175,000 and potentially used as an alternative rennin-substitute in cheese processing.

Keywords: milk-clotting enzyme, milk-clotting activity, rennin-substitute

YANA NURITASARI. F24070059. Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu (Milk-Clotting) Dari Pangan Fermentasi Sebagai Pengganti Renin dalam Pembuatan Keju. Di bawah bimbingan Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, M.Si dan Nanik Rahmani, M.Si. 2012

RINGKASAN

Keju merupakan produk pangan olahan susu yang cukup digemari oleh masyarakat. Rasa keju yang khas menjadikan keju banyak digunakan sebagai taburan (topping) atau pengisi (filling) dari suatu produk pangan. Prinsip dasar pada pembuatan keju adalah koagulasi atau penggumpalan susu oleh aktivitas enzim renin sehingga whey terpisah dan terbentuk massa padat dan kompak. Enzim renin berasal dari abomasum anak sapi. Produksi enzim renin ini menjadi permasalahan karena untuk memenuhi kebutuhan renin terutama pada industri keju memerlukan penyembelihan anak sapi yang tidak sedikit. Hal ini mendorong perlunya pencarian alternatif enzim renin dari sumber lain seperti mikroba.

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh isolat penghasil enzim penggumpal susu (milk-clotting) dari produk pangan hasil fermentasi sebagai alternatif pengganti rennet dalam pembuatan keju dan menentukan isolat terpilih yang memiliki rasio aktivitas enzim penggumpal susu terhadap protease yang paling tinggi. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong, pada bulan Februari hingga Juli 2012.

Tahapan penelitian yang dilakukan yaitu persiapan sampel pangan fermentasi, pengayaan mikroba; yaitu menumbuhkan dan memperbanyak mikroba pada medium pertumbuhan umum sebelum diinokulasikan pada medium selektif, isolasi mikroba dengan medium selektif susu skim, pengukuran aktivitas enzim penggumpal susu, pengukuran aktivitas protease dengan metode Lowry, dan perhitungan rasio aktivitas enzim penggumpal susu terhadap protease. Pengukuran aktivitas enzim penggumpal susu ditentukan berdasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan susu pertama kali akibat penambahan enzim, sehingga peubah yang diperhatikan adalah waktu penggumpalan.

Pada penelitian ini diperoleh empat isolat dari dua sampel pangan fermentasi, yakni tiga isolat dari tauco (TCN 1, TCN 2, TCN 3) dan satu isolat dari asinan sawi (DSN 1). Isolat proteolitik tersebut kemungkinan merupakan mikroba yang berperan dalam proses fermentasi bahan pangan itu sendiri. Baik tauco maupun asinan sawi, keduanya memanfaatkan bakteri asam laktat dalam proses fermentasi, sehingga diduga mikroba yang diisolasi merupakan BAL. Isolat TCN 1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas 70.00 U/mL yang seluruhnya dicapai pada lama inkubasi jam ke-24. Isolat TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas yang paling tinggi, artinya semakin tinggi aktivitas penggumpalannya semakin singkat waktu yang dibutuhkan enzim tersebut untuk menggumpalkan susu hingga whey terpisah. Selanjutnya keempat isolat diukur aktivitas proteasenya untuk memperoleh rasio aktivitas penggumpalan terhadap protease. Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolat TCN 1, TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas protease pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 U/mL. Dari nilai aktivitas penggumpalan susu dan protease yang diperoleh, maka rasio untuk isolat TCN 1, TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 secara berturut-turut adalah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolat TCN 2 mampu menghasilkan enzim penggumpal susu dengan aktivitas penggumpalan yang tinggi namun aktivitas proteolitiknya rendah serta dapat digunakan sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju

ISOLASI DAN SELEKSI MIKROBA PENGHASIL ENZIM PENGGUMPAL SUSU (MILK-CLOTTING) DARI PANGAN FERMENTASI SEBAGAI

PENGGANTI RENIN DALAM PEMBUATAN KEJU

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh YANA NURITASARI

F24070059

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2012

Judul Skripsi : Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu (Milk-Clotting) dari Pangan Fermentasi Sebagai Pengganti Renindalam Pembuatan Keju Nama : Yana Nuritasari NIM : F24070059

Menyetujui,

Pembimbing I, Pembimbing II, (Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, M.Si) (Nanik Rahmani, M.Si) NIP 1961082.198703.2.002 NIP 19761215.200312.2.004

Mengetahui: Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan,

(Dr. Ir Feri Kusnandar, M.Sc) NIP 19680526.199303.1.004

Tanggal lulus : 6 November 2012

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu Milk-Clotting dari Pangan Fermentasi Sebagai Pengganti Renin dalam Pembuatan Keju adalah hasil karya saya dengan Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, November 2012 Yang membuat pernyataan

Yana Nuritasari F24070059

©Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, tahun 2012 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari

Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya

BIODATA PENULIS

Yana Nuritasari. Lahir di Malang, 22 September 1989 dari ayah Djoko Soejono dan ibu Anziati Nuratni, sebagai anak pertama dari tiga bersaudara. Penulis menamatkan SMA pada tahun 2007 dari SMA Negeri 39 Jakarta dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Teknologi Pangan, Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan termasuk menjadi asisten praktikum mata kuliah Evaluasi

Sensori pada tahun 2011. Selain itu, penulis juga aktif dalam kegiatan yang diadakan oleh Himitepa seperti Food Processing Club 2011 dan Kapangan (Ksatria Peduli Pangan) 2009-2010, serta acara kepanitiaan yang diadakan oleh BEM-KM 2008-2009; International Scholarship Education Expo 2009, BEM-Fateta 2010; SEREAL 2009, dan Himitepa seperti BAUR 2009, dan Seminar dan Pelatihan HACCP 2010 dan 2011. Sebagai tugas akhir, penulis melakukan magang penelitian di Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, bagian Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi dengan judul skripsi “Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu (Milk-Clotting) dari Pangan Fermentasi Sebagai Pengganti Renin dalam Pembuatan Keju”.

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur dipanjatkan pada Allah SWT atas limpahan nikmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul Isolasi dan Seleksi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu (Milk-Clotting) dari Pangan Fermentasi Sebagai Pengganti Renin dalam Pembuatan Keju. Penelitian ini didanai oleh Proyek DIPA-PN Meat Pro LIPI tahun 2012.

Dengan telah selesainya penelitian hingga tersusunnya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, MSi, sebagai dosen pembimbing akademik I yang selalu memberikan

arahan dan bimbingan selama penyusunan skripsi. 2. Nanik Rahmani, MSi, sebagai pembimbing lapang di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi,

Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, sekaligus pembimbing akademik kedua atas arahan dan bimbingan selama berjalannya penelitian.

3. Ibu Antung Sima Fierlieyanti, STP, MSc yang telah bersedia menjadi dosen penguji dan memberikan saran perbaikan terhadap skripsi saya.

4. Dr. Yopi, selaku Kepala Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian.

5. Bapak Djoko Soejono dan Ibu Anziati Nuratni sebagai orang tua atas kasih sayang, dukungan, dan doa yang selalu dipanjatkan kepada Allah agar penulis selalu diberi kelancaran dan kemudahan dalam setiap menjalakan urusan.

6. Mbak Ade, mbak Lia, mas Alex, mas Diki atas bantuan dan arahannya selama penulis menjalankan penelitian

7. Yufi, Viska, Rohanah, Dewi, Widyo, mas Ashif, mbak Yos, yang selalu menemani, membantu dan memberi semangat selama penelitian.

8. Bangun, Atikah, Eka, Nurul, Gita, dan Arum Puspa yang selalu mengingatkan dalam kebaikan serta memberi dukungan dan semangat selama menjalani perkuliahan hingga penelitian.

9. Aditya Adikusumo, atas perhatian, dukungan, dan semangat yang selalu diberikan kepada penulis 10. Seluruh dosen pengajar, teknisi, dan teman-teman di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

yang selama ini banyak membantu penulis dalam masa perkuliahan. Penulis berharap semoga skipsi ini dapat bermanfaat dan memberikan kontribusi yang nyata

terhadap perkembangan ilmu pengetahuan terutama di bidang teknologi pangan.

Bogor, November 2012

Yana Nuritasari

DAFTAR ISI

Halaman KATA PENGANTAR ................................................................................................................... viii DAFTAR TABEL ............................................................................................................................ ix DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................................ x DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................................... xi I. PENDAHULUAN ................................................................................................................... 1

1.1. LATAR BELAKANG ................................................................................................... 1 1.2. TUJUAN ....................................................................................................................... 1

II. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................................................... 2 2.1. ISOLASI DAN SELEKSI MIKROBA ........................................................................... 2 2.2. PANGAN FERMENTASI ............................................................................................. 2

2.2.1. KEJU ................................................................................................................. 3 2.2.2. TEMPE ............................................................................................................. 3 2.2.3. TAPE ................................................................................................................ 4 2.2.4. TAUCO ............................................................................................................ 4

2.3. ENZIM DALAM PEMBUATAN KEJU ...................................................................... 5 2.3.1. ENZIM PENGGUMPAL SUSU DARI HEWAN (RENIN) ............................ 5 2.3.2. ENZIM PENGGUMPAL SUSU DARI TANAMAN ...................................... 6 2.3.3. ENZIM PENGGUMPAL SUSU DARI MIKROBA ....................................... 6

2.4. PROTEASE ................................................................................................................... 7 III. METODE PENELITIAN ........................................................................................................ 8

3.1. BAHAN DAN ALAT ..................................................................................................... 8 3.2. METODE PENELITIAN ............................................................................................... 8 3.3. PROSEDUR ANALISIS .............................................................................................. 12

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................................. 15 4.1. ISOLASI MIKROBA DARI PANGAN FERMENTASI .............................................. 15 4.2. PENGUKURAN AKTIVITAS ENZIM DAN SELEKSI ISOLAT

4.2.1. KURVA PERTUMBUHAN ISOLAT ............................................................ 17 4.2.2. AKTIVITAS ENZIM PENGGUMPAL SUSU ............................................... 19 4.2.3. AKTIVITAS PROTEASE ............................................................................... 21 4.2.4. RASIO AKTIVITAS PENGGUMPALAN SUSU TERHADAP

PROTEASE ..................................................................................................... 21 V. SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................................... 23

5.1. SIMPULAN ................................................................................................................. 23 5.2. SARAN ......................................................................................................................... 23

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................... 24 LAMPIRAN .................................................................................................................................... 27

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Komposisi medium pengayaan mikroba dan isolasi ........................................................... 9 Tabel 2. Ciri morfologi koloni isolat .............................................................................................. 16 Tabel 3. Indeks protease isolat ...................................................................................................... 17 Tabel 4. Rasio aktivitas penggumpalan terhadap protease ............................................................. 22 Tabel 5. Perbandingan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease isolat TCN 2

dengan beberapa enzim penggumpal susu dari mikroba lain ........................................... 22 .

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Keju camembert ............................................................................................................. 3 Gambar 2. Tempe ............................................................................................................................. 4 Gambar 3. Tape singkong (a) ............................................................................................................ 4 Gambar 3. Tape Ketan (b) ................................................................................................................ 4 Gambar 4. Tauco .............................................................................................................................. 5 Gambar 5. Tahapan penelitian ........................................................................................................ 8 Gambar 6. Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat ............................. 15 Gambar 7. Zona bening dari isolat TCN 2 pada medium agar susu skim ....................................... 17 Gambar 8. Kurva pertumbuhan isolat ............................................................................................. 18 Gambar 9. Aktivitas enzim penggumpal susu isolat ....................................................................... 20 Gambar 10. Pembentukan gumpalan susu pertama oleh aktivitas enzim isolat .............................. 20 Gambar 11. Aktivitas protease isolat ............................................................................................. 21

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Kurva standar konsentrasi Bovin Serum Albumin .................................................... 28 Lampiran 2. Hasil pembacaan absorbansi pertumbuhan sel isolat ................................................ 29 Lampiran 3. Waktu dan aktivitas penggumpalan susu isolat .......................................................... 30 Lampiran 4. Hasil pembacaan absorbansi pengukuran aktivitas protease ....................................... 32 Lampiran 5. Konsentrasi protease dan aktivitas protease isolat ..................................................... 34 Lampiran 6. Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease .............................................. 36

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Keju merupakan produk pangan olahan susu yang cukup digemari oleh masyarakat. Rasa keju yang khas menjadikan keju banyak digunakan sebagai taburan (topping) atau pengisi (filling) dari suatu produk pangan, misalnya roti manis isi keju, pizza, pasta, wafer, biskuit, kue, martabak manis, dan beberapa makanan lain.

Prinsip dasar pada pembuatan keju adalah koagulasi atau penggumpalan susu oleh aktivitas enzim sehingga whey terpisah dan terbentuk massa padat dan kompak. Enzim yang berperan pada penggumpalan susu tersebut adalah enzim renin.

Selama ini dalam industri keju, renin yang digunakan berasal dari lambung keempat anak sapi. Sumber renin yang berasal dari lambung anak sapi menjadi permasalahan karena untuk memperoleh renin harus dilakukan penyembelihan anak sapi yang tidak sedikit. Hal ini menyebabkan harga renin menjadi sangat mahal sehingga perlu untuk mencari alternatif pengganti renin dari sumber lain.

Indonesia memiliki berbagai jenis makanan fermentasi. Iklim Indonesia yang hangat membuat berbagai jenis makhluk hidup termasuk mikroba tumbuh dan berkembang. Beberapa mikroba sering digunakan dalam pembuatan makanan, misalnya tempe, tape, oncom, keju, dan lain-lain. Bahkan beberapa daerah di Indonesia memiliki makanan fermentasi khas masing-masing, sehingga semakin meningkatkan keragaman pangan di Indonesia. Mikroba yang berperan dalam pembuatan pangan fermentasi dapat terus dikembangkan manfaatnya dalam hal lain, misalnya metabolit yang dihasilkan seperti enzim, dapat dimanfaatkan tidak hanya untuk fermentasi makanan, tetapi juga untuk industri lain seperti pektinase yang berperan sebagai penjernih sari buah. Pemanfaatan mikroba yang luas dapat meningkatkan nilai tambah mikroba. Produksi enzim oleh mikroba telah banyak dikembangkan untuk keperluan industri, baik dalam industri pangan maupun non-pangan.

Beberapa penelitian telah dilakukan untuk mencari alternatif pengganti renin anak sapi. Beberapa literatur menyatakan bahwa selain dari anak sapi, renin juga dapat diekstrak dari mikroba, terutama kapang dan bakteri. Biaya untuk memproduksi renin dari mikroba tentu akan lebih murah dibandingkan renin anak sapi karena kondisi proses fermentasi mikroba tersebut dapat dikendalikan dan dioptimalkan. 1.2 Tujuan

Penelitian ini bertujuan untuk (1) memperoleh isolat penghasil enzim penggumpal susu (milk-clotting) dari produk pangan hasil fermentasi sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju dan (2) memilih isolat yang memiliki rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease yang paling tinggi.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Isolasi dan Seleksi Mikroba Isolasi mikroba adalah memisahkan satu mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Cara mengisolasi mikroba umumnya dilakukan dengan cara menumbuhkan mikroba dalam medium padat. Dalam mengisolasi mikroba ada beberapa hal yang harus diperhatikan, yakni: (1) sifat spesies mikroba yang akan diisolasi, (2) tempat hidup atau asal mikroba, (3) medium untuk pertumbuhan yang sesuai, (4) cara menginokulasi mikroba tersebut, (5) lama inkubasi mikroba, (6) cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni, dan (7) cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni (Waluyo 2008).

Menurut Suprihatin (2010), terdapat tiga jenis isolasi mikroba yaitu isolasi pada agar cawan, isolasi dalam medium cair, dan isolasi sel tunggal. Isolasi pada agar cawan dilakukan dengan cara goresan kuadran. Pada bagian agar tempat dimulainya goresan, populasi mikroba biasanya terlalu pekat sehingga koloni akan berkumpul menjadi satu. Dengan semakin banyaknya goresan atau penyebaran yang dilakukan akan semakin sedikit sel-sel mikroba yang terbawa oleh loop, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni-koloni secara terpisah. Isolasi pada medium cair dilakukan dengan metode pengenceran. Dalam metode ini, inokulum diencerkan didalam medium steril, dan sejumlah tabung yang berisi medium diinokulasi dengan suspensi inokulum dari masing- masing pengenceran. Sedangkan untuk mengisolasi sel mikroba yang ukurannya besar dan tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau pengenceran, ada suatu cara isolasi yang disebut isolasi sel tunggal. Sel mikroba yang dapat dilihat dengan pembesaran 100 kali atau kurang, setiap selnya dapat dipisahkan dan diambil menggunakan pipet kapiler yang sangat halus, kemudian dicuci beberapa kali didalam medium steril yang jumlahnya relatif besar untuk menghilangkan mikroba kontaminan yang ukurannya lebih kecil.

Faktor penting yang perlu dilakukan setelah mendapatkan beberapa isolat mikroba adalah melakukan seleksi mikroba. Hal-hal yang perlu mendapat perhatian dalam seleksi mikroba antara lain: (1) kemudahan tumbuh dari mikroba tersebut, (2) konsentrasi enzim yang diinginkan, (3) ada atau tidak adanya faktor-faktor lain yang tidak diinginkan seperti patogenisitas, (4) pembentukan produk yang beracun, adanya enzim lain yang tidak diinginkan, stabilitas dari mikroba sehingga tidak mengalami mutasi, dan (5) kemudahan untuk memisahkan enzim dari massa sel (Muchtadi et al 1989).

2.2 Pangan Fermentasi

Fermentasi dapat diartikan sebagai perubahan oleh enzim beberapa bakteri, kapang, dan khamir. Contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon dioksida, serta oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat et al 2006). Produk fermentasi pangan baik dari sumber hewani maupun nabati sudah dikenal luas oleh masyarakat. Pada zaman dahulu, fermentasi pangan umumnya terjadi secara spontan, misalnya pada

pembuatan bir. Saat ini industri pangan fermentasi sudah banyak dikembangkan dengan sistem yang lebih terkontrol agar dihasilkan produk yang lebih bermutu. Beberapa produk fermentasi pangan yang sudah dikenal masyarakat antara lain yogurt, keju, tempe, oncom, tape, tauco, dan bir.

2.2.1 Keju

Keju merupakan salah satu produk olahan dari susu yang dibuat dengan cara fermentasi. Bahan baku pembuatan keju dapat berasal dari susu murni, susu skim, atau susu yang telah dikurangi kadar lemaknya. Komponen utama keju adalah kasein dan mengandung sedikit lemak, peptida, dan komponen susu lainnya, juga air. Secara umum, prinsip pembuatan keju adalah menghilangkan air, laktosa, dan beberapa mineral dari susu untuk menghasilkan suatu massa padat protein dan lemak (Hidayat et al 2006). Jenis keju sangat bermacam-macam tergantung dari bahan baku, komposisi, karakteristik pemeraman, dan kadar air (Daulay 1990). Beberapa keju yang terkenal antara lain keju cheddar, mozarella, gouda, camembert, dan parmesan.

Gambar 1. Keju camembert (Fadilla 2011)

2.2.2 Tempe

Tempe merupakan salah satu pangan fermentasi yang banyak digemari masyarakat Indonesia. Tempe dapat dibuat dari berbagai bahan, namun pada umumnya tempe dibuat dari kacang kedelai. Tempe memiliki rasa yang khas. Melalui proses fermentasi, kedelai menjadi lebih enak dan meningkat nilai nutrisinya. Tempe yang terbuat dari kacang kedelai dibuat melalui tiga tahap, yakni: (1) Hidrasi dan pengasaman biji kedelai dengan direndam beberapa lama (untuk daerah tropis kira-kira semalam), (2) Sterilisasi terhadap sebagian biji kedelai, dan (3) Fermentasi oleh jamur tempe yang diinokulasikan segera setelah sterilisasi. Jamur tempe yang banyak digunakan ialah Rhizopus oligosporus (Hidayat et al 2006).

Gambar 2. Tempe (Winneke 2008)

2.2.3 Tape Secara umum tape dikenal ada dua macam, yaitu tape singkong dan tape ketan. Tape memiliki rasa yang manis dan sedikit mengandung alkohol, memiliki aroma yang menyenangkan, bertekstur lunak dan berair. Tape merupakan pangan fermentasi yang cepat rusak karena adanya fermentasi lanjut setelah kondisi optimum tercapai, sehingga harus segera dikonsumsi. Hasil fermentasi lanjut dari tape adalah produk yang asam beralkohol sehingga tidak enak dikonsumsi lagi. Mikroba yang berperan dalam pembuatan tape adalah Amylomyces rouxii. Kapang Amylomyces rouxii dapat menghidrolisis pati menjadi gula. Untuk mendapatkan aroma tape ketan yang baik biasanya digunakan tiga mikroba sekaligus yaitu Amylomyces rouxii, Endomycopsis fibuliger, dan Hansenula anoma, sedangkan untuk tape singkong menggunakan Amylomyces rouxii dan Endomycopsis fibuliger (Hidayat et al 2006).

(a) (b)

Gambar 3: (a ) Tape singkong (Nurani 2012), (b) Tape ketan (Ghazam 2011)

2.2.4 Tauco

Tauco merupakan pangan fermentasi yang terbuat dari kacang kedelai. Tauco biasa digunakan sebagai penambah cita rasa pada masakan. Pembuatan tauco terdiri dari dua tahapan fermentasi yaitu fermentasi kapang dan fermentasi dalam larutan garam sehingga terdapat lebih dari satu jenis mikroba yang berperan selama proses fermentasinya. R. oligosporus, A. oryzae dan R. oryzae berperan pada

awal fermentasi (dikenal sebagai fermentasi kapang), selanjutnya jika kedelai yang telah berkapang kemudian direndam dalam larutan garam, maka yang dominan tumbuh adalah bakteri asam laktat dan khamir halofilik. Beberapa jenis mikroba yang tumbuh selama fermentasi garam dalam pembuatan tauco adalah L. delbrueckii, Hansenula sp, dan Zygosaccharomyces (Nurwitri et al 2007).

Gambar 4. Tauco (Dinas Perhubungan Komunikasi dan Informatika Kabupaten Cianjur 2005) 2.3 Enzim dalam Pembuatan Keju

Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis reaksi kimia pada sel makhluk hidup. Kata enzyme atau enzim berasal dari istilah Yunani yang artinya “di dalam sel” (Winarno 2010). Enzim dapat ditemukan pada tanaman, hewan, maupun mikroba. Sebagai biokatalis, enzim memiliki sifat-sifat yang unik, antara lain: dapat aktif dalam jumlah yang sangat kecil, aksi katalitiknya spesifik dan merupakan katalis sejati karena tidak terpengaruh reaksi dan mempercepat reaksi dengan menurunkan energi aktivasi reaksi tanpa mempengaruhi kesetimbangan reaksi yang bersangkutan. Enzim telah banyak digunakan dalam industri, terutama industri pangan, misanya industri gula cair, bir, keju, sari buah, roti, dan kue.

Pada pembuatan keju, enzim yang digunakan adalah enzim pengumpal susu. Enzim penggumpal susu (milk-clotting enzyme) merupakan agen aktif utama pada pembuatan keju. Enzim tersebut memecah k-kasein pada ikatan peptida Phe 105–Met 106 yang menyebabkan misel kasein tidak stabil dan terbentuk agregat yang menghasilkan gumpalan dan gel setelahnya (Silva et al 2003). Enzim penggumpal susu yang umum digunakan dalam pembuatan keju adalah renin, yaitu enzim proteolitik yang diperoleh dari ekstrak kasar lambung anak sapi.

2.3.2 Enzim Penggumpal Susu dari Hewan (Renin)

Renin adalah enzim yang banyak digunakan pada proses pembuatan keju. Berdasarkan tatanama yang diberikan oleh International Enzyme Nomenclature Comitee, enzim renin kini dinamai khimosin (chymosin, EC 3.4.4.3) (Muchtadi et al 1989). Renin termasuk enzim protease asam, yaitu enzim yang pada lokasi aktifnya mengandung dua gugus karboksil. Keaktifan enzim ini dapat dihambat atau dicegah oleh p-bromofenasil bromida (Muchtadi et al 1989).

Enzim tersebut dihasilkan dari lambung keempat anak sapi, anak domba, atau anak kambing. Renin dibentuk dari calon renin yang disebut prorenin, yaitu bentuk inaktif dari renin. Untuk menjadi renin, prorenin harus mengurangi bobot molekulnya dari 36,000 menjadi 31,000 dengan cara hidrolisis sebagian pada pH asam. Proses aktivasi prorenin menjadi renin dipengaruhi oleh pH dan konsentrasi garam. Prorenin stabil pada pH 5.3-9.0, sedangkan renin stabil pada pH 5.3-6.3 dan masih memiliki kestabilan pada pH 2.0 (Winarno 1980).

Renin bekerja pada substrat k-kasein yang berfungsi sebagai koloid yang merupakan lapisan luar, sehingga dengan hidrolisis k-kasein lebih mudah menggumpal secara sempurna selama ion kalsium tersedia pada larutan tersebut (Winarno 1980).

2.3.1 Enzim Penggumpal Susu dari Tanaman

Enzim penggumpal susu juga ditemukan pada tanaman. Beberapa tanaman yang telah dilaporkan penggunaannya pada pembuatan keju adalah getah dari pohon Ara (Ficus carica) (Daulay 1990). Ekstrak ini telah digunakan di daerah yang terdapat pohon Ara. Selain tanaman tersebut, terdapat beberapa tanaman yang dapat menggumpalkan susu namun aktivitas proteolitiknya sangat tinggi sehingga menghasilkan cita rasa yang pahit pada keju, misalnya papain dari pohon pepaya, bromelin dari nanas, dan rezin dari biji jarak.

2.3.3. Enzim Penggumpal Susu dari Mikroba

Enzim dari mikroba terdapat dua jenis, yaitu enzim intraseluler dan enzim ekstraseluler. Ekstraksi enzim intraseluler memerlukan proses perusakan sel dan volume yang didapatkan lebih kecil dibandingkan ekstraksi enzim ekstraseluler. Produksi enzim dari mikroba lebih menguntungkan karena biaya relatif murah, cepat, mudah dikontrol dan dengan tingkat produksi yang tinggi (Darwis dan Sukara 1989). Produksi enzim oleh mikroba dapat ditingkatkan dengan menambahkan suatu zat kimia ‘inducer’ ke dalam medium lingkungan atau dengan cara mengubah komposisi substrat. Kecepatan produksi enzim dari mikroba akan meningkat dengan berkembangnya seleksi jenis mikroba, induksi mutan, dan perbaikan kondisi kultur pertumbuhan (Muchtadi et al 1989).

Enzim penggumpal susu yang banyak digunakan sebagai pengganti renin anak sapi adalah enzim penggumpal susu dari mikroba terutama kapang dan bakteri. Enzim pengumpal susu dari mikroba bersifat seperti enzim tripsin dan memiliki pH optimum aktivitasnya pada kisaran 7-8 (Daulay 1990). Beberapa kapang yang telah diketahui memiliki potensi sebagai pengganti renin anak sapi adalah Aspergillus niger, Mucor meihei, Rhizomucor pusillus var, Aspergillus oryzae, dan Amylomyces rouxii, (Osman et al 1969, Birkjacer dan Jonk 1985, Crawford 1985, Ayhan et al 2001, Yu dan Chou 2005). Sedangkan beberapa bakteri yang telah diketahui memiliki potensi sebagai renin adalah Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus sphaericus, Enterococcus faecalis (Sato et al 2004, Ageitos et al 2007, Magda et al 2007, Dutt et al 2008).

2.4 Protease

Protease merupakan enzim proteolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan peptida pada protein. Menurut Bergman dan Futon (1941) dan Bergman (1942) dalam Winarno (2010), enzim proteolitik dapat digolongkan menjadi dua kelompok besar, yaitu eksopeptidase dan endopeptidase. Golongan ekspeptidase dapat dibagi lagi menjadi karboksi (ekso) peptidase dan amino (ekso) peptidase yang berturut-turut memotong peptida dari arah gugus karboksil terminal dan gugus amino terminal. Beberapa klasifikasi lain juga dikemukakan oleh Hartley (1960) dalam Winarno (2010) yaitu pengelompokkan berdasarkan sifat kimia dari lokasi sisi aktif. Menurut Hartley, enzim protease dapat dibagi menjadi empat golongan, yaitu: (1) golongan pertama, enzim protease serin yang artinya mempunyai residu serin dalam lokasi aktifnya, contohnya tripsin, kimotripsin, elastase, dan subtilin; (2) golongan kedua, enzim protease sulfihidril yang artinya mempunyai residu sulfihidril pada lokasi aktif, contohnya ialah protease dari tanaman dan mikroba seperti papain, fisin, dan bromelin; (3) golongan ketiga, protease metal, yaitu enzim yang keaktifannya tergantung pada adanya metal, contohnya karboksipeptidase A untuk beberapa aminopeptidase; (4) golongan keempat, protease asam, yaitu enzim yang pada lokasi aktifnya terdapat dua gugus karboksil, contohnya pepsin, renin, dan protease kapang.

Protease telah dimanfaatkan dan digunakan secara komersial dalam industri pangan, seperti pada industri keju. Dalam industri keju, protease yang digunakan adalan renin, yaitu enzim yang berperan dalam penggumpalan susu. Renin yang digunakan pada pembuatan keju umumnya berasal dari lambung anak sapi sehingga harganya sangat mahal, oleh karena itu produksi renin memiliki kendala pada penyembelihan anak sapi.

III. METODE PENELITIAN

3.1. Bahan dan Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah tabung reaksi, eppendorf 1,5 mL, erlenmeyer 300 mL, erlenmeyer 500 mL, cawan petri, mikropipet (5 mL, 1 mL, 200 μL), tips (5 mL, 1 mL, 200 μL), bunsen, rak tabung reaksi, seal, meja kaki tiga, alat spreader, UV laminar, laminar kapang, autoklaf, shaker incubator, waterbath, neraca analitik, jarum ose, vorteks, kertas pH, Micro Ultracentifuge “Hitachi CS150NX”, Spektrofotometer “Hitachi U-3900H”, stopwatch.

Bahan yang digunakan pada penelitian ini antara lain tauco, tempe, tape ketan, oncom, sawi asin, susu skim pro analysis “Merck”, pepton, yeast extract, beef extract, malt extract, agar for microbiology “Merck”, NaCl, CaCl2, HCl 1 N, NaOH 1 N, Bovin Serum Albumin, bufer phosphat pH 6 20 mM, TCA 0,4 M, kasein “Oxone”, Na

2CO

3 0,4 M, folin ciocalteau, akuades, kapas, plastik

tahan panas, kertas timbang, alumunium foil.

3.2. Metode Penelitian

Pada penelitian ini dilakukan beberapa tahap penelitian, yakni (1) persiapan sampel dan medium, (2) pengayaan mikroba, (3) isolasi mikroba, (4) pengukuran aktivitas enzim penggumpal susu (milk-clotting)dan (5) pengukuran aktivitas protease. Tahapan penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Tahapan Penelitian

3.2.1. Persiapan Sampel dan Medium

Sampel Pangan Fermentasi

Pengayaan Mikroba

Isolasi Mikroba

Isolat penghasil zona bening

Pengukuran aktivitas enzim penggumpal susu (MCA)

Pengukuran aktivitas enzim protease (PA)

Perhitungan rasio MCA/PA

Isolat dengan rasio MCA/PA paling tinggi

Persiapan sampel. Sampel yang digunakan sebagai sumber isolat adalah produk pangan

fermentasi antara lain sawi asin, oncom, tauco, tempe, dan tape ketan. Sampel dihancurkan hingga homogen, lalu diukur pHnya untuk menentukan pH medium. Masing-masing sampel yakni tape ketan, tauco, tempe, daun sawi asin dan oncom ditimbang sebanyak 0.25 g dan disimpan pada suhu refrigerator. Untuk sawi asin, diambil juga sampel airnya untuk isolasi mikroba sebanyak 0.25 mL. Proses persiapan sampel dilakukan secara aseptis.

Pembuatan medium. Masing-masing bahan penyusun medium ditimbang sesuai panduan pembuatan medium. Untuk menumbuhkan bakteri menggunakan medium Nutrient Broth, kapang menggunakan medium Malt Extract Broth, dan isolat penghasil enzim penggumpal susu menggunakan skim milk agar. Komposisi untuk pembuatan medium dapat dilihat pada Tabel 1.

Tabel 1. Komposisi medium pengayaan mikroba dan isolasi Medium Volume (mL) Bahan Penyusun Jumlah (g)

Nutrient Broth 200 Peptone 1.00

NaCl 1.00

Yeast extract 0.40

Beef extract 0.08

Malt extract Broth 200 Malt extract 4.00

Skim milk agar 300 Susu skim 9.00

Agar 4.50

Setelah ditimbang, seluruh bahan dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian dilarutkan dengan akuades sesuai volume stok yang dibutuhkan. Setelah larut, medium disterilisasi pada suhu 121oC selama 15 menit. Medium yang telah steril kemudian dituang ke dalam cawan petri dengan ketebalan kira-kira 4-5 mm secara aseptis dan dibiarkan hingga membeku. Setelah membeku, medium dibiarkan pada suhu ruang selama 24 jam untuk melihat apakah terjadi kontaminasi pada medium. Medium yang steril (tidak terkontaminasi) dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba pada sampel.

3.2.2 Pengayaan Mikroba

Pengayaan mikroba (enrichment) merupakan upaya yang dilakukan untuk menumbuhkan dan memperbanyak mikroba pada medium pertumbuhan umum sebelum diinokulasikan pada medium selektif.

3.2.2.1 Kapang

Sebanyak 0.25 mL/0.25 g sampel diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 2.5 mL medium Malt Extract Broth. Inkubasi selama 48 jam pada suhu ruang menggunakan shaker incubator (150 rpm).

3.2.2.2 Bakteri

Sebanyak 0.25 mL/0.25 g sampel diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 2.5 mL medium Nutrient Broth. Inkubasi selama 24 jam pada suhu ruang menggunakan shaker incubator (150 rpm).

3.2.3 Isolasi Mikroba Penghasil Enzim Penggumpal Susu 3.2.3.1 Kapang

Masing-masing 0.1 mL suspensi dari medium pengayaan mikroba diambil secara aseptis lalu masukkan ke dalam larutan tabung reaksi yang berisi 0.9 mL larutan pengencer lalu dihomogenkan. Larutan tersebut merupakan pengenceran 10-1. Untuk pengenceran berikutnya, ambil sebanyak 0.1 ml larutan dari pengenceran 10-1 dan masukkan ke dalam tabung reaksi berisi 0.9 mL larutan pengencer kemudian dihomogenkan. Larutan tersebut merupakan pengenceran 10-2. Langkah tersebut dilakukan hingga pengenceran 10-5. Selanjutnya, sebanyak masing-masing 0.01 mL suspensi diambil dari pengenceran 10-4 dan10-5 secara aseptis lalu dimasukkan ke dalam medium skim milk agar yang telah dibekukan pada cawan petri. Inkubasi terbalik dilakukan selama 48 jam pada suhu ruang.

3.2.3.2 Bakteri

Masing-masing 0.1 mL suspensi dari medium pengayaan mikrobadiambil secara aseptis lalu masukkan ke dalam larutan tabung reaksi yang berisi 0.9 mL larutan pengencer lalu dihomogenkan. Larutan tersebut merupakan pengenceran 10-1. Untuk pengenceran berikutnya, ambil sebanyak 0.1 ml larutan dari pengenceran 10-1 dan masukkan ke dalam tabung reaksi berisi 0.9 mL larutan pengencer kemudian dihomogenkan. Larutan tersebut merupakan pengenceran 10-2. Langkah tersebut dilakukan hingga pengenceran 10-5. Selanjutnya, sebanyak masing-masing 0.01 mL suspensi diambil dari pengenceran 10-4 dan10-5 secara aseptis lalu dimasukkan ke dalam medium skim milk agar yang telah dibekukan pada cawan petri. Inkubasi terbalik dilakukan selama 24 jam pada suhu ruang.

3.2.4 Pembuatan Kurva Pertumbuhan

Pola pertumbuhan atau kurva pertumbuhan diperoleh dengan metode turbidimetri, yaitu melihat jumlah bakteri dengan mengukur kekeruhan inokulum menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm (OD

660). Prinsip dasar metode turbidimetri adalah jika cahaya mengenai

sel, maka cahaya dipantulkan dan cahaya yang tidak mengenai sel akan diteruskan. Jumlah cahaya yang diteruskan proporsional (berbanding lurus) dengan transmitan, sedangkan cahaya yang dipantulkan berbanding terbalik dengan transmitan atau berbanding lurus dengan absorbansi (Kosim dan Putra 2009).

Pembuatan kurva pertumbuhan pada penelitian ini hanya dilakukan pada isolat bakteri. Isolat bakteri yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Nutrient Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi nutrient broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 24 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi nutrient broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling kemudian diukur pertumbuhan selnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 660 nm. Nilai absorbansi setiap pengukuran dicatat sebagai indikator pertumbuhan sel inokulum.

3.2.5 Produksi Enzim

3.2.5.1 Kapang

Produksi enzim dilakukan dengan metode fermentasi cair. Isolat kapang yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Malt Extract Agar dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi Malt Extract Broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 48 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi Malt Extract broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling tersebut disentrifugasi kemudian diambil supernatannya untuk memperoleh ekstrak enzim yang akan dianalisis. Ekstrak enzim disentrifugasi dengan paling sedikit dua kali sebelum dianalisis untuk mencegah adanya padatan yang masih terbawa pada saat pemisahan ekstrak. Ekstrak enzim disimpan dalam eppendorf pada suhu 4oC untuk menjaga stabilitasnya sebelum pengukuran. Ekstrak enzim tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya.

3.2.5.2 Bakteri

Produksi enzim dilakukan dengan metode fermentasi cair. Isolat bakteri yang menghaslkan zona bening pada medium skim milk agar dikulturkan pada medium Nutrient Agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose isolat diinokulasikan ke dalam medium prekultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein dan diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 24 jam pada suhu ruang. Selanjutnya, kultur tersebut dimasukkan ke dalam medium kultur berisi Nutrient Broth yang telah ditambahkan kasein lalu diinkubasi menggunakan shaker incubator (150 rpm) selama 5 hari pada suhu ruang dan dilakukan sampling setiap 24 jam. Hasil sampling tersebut disentrifugasi kemudian diambil supernatannya untuk memperoleh ekstrak enzim yang akan dianalisis. Ekstrak enzim disentrifugasi dengan paling sedikit dua kali sebelum dianalisis untuk mencegah adanya padatan yang masih terbawa pada saat pemisahan ekstrak. Ekstrak enzim disimpan dalam eppendorf pada suhu 4oC untuk menjaga stabilitasnya sebelum pengukuran. Ekstrak enzim tersebut selanjutnya dianalisis aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya.

3.3 Prosedur Analisis 3.3.1 Pengukuran Aktivitas Penggumpalan Susu (Arima et al 1970)

Aktivitas penggumpalan susu ditentukan berdasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan susu pertama kali akibat penambahan enzim yang dinotasikan dalam Soxhlet Unit (SU). Satu SU didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menggumpalkan 1 ml campuran yang mengandung 0.1 g susu skim dan 0.00111 g CaCl2 dalam 40 menit pada suhu 35oC.

Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5 ml susu skim (10 g susu skim/100 mL 0.01 M CaCl2) yang telah diinkubasi ada suhu 40oC selama 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim milk-clotting menggunakan rumus perhitungan pada persamaan 1.

Aktivitas enzim milk-clotting (MCA)= (1)

Keterangan: MCA = aktivitas enzim milk-clotting (SU) T = waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu (detik) D = faktor pengenceran

3.3.2 Pengukuran Aktivitas Protease (Lowry 1951)

Aktivitas protease ditentukan melalui metode standar Lowry yang dimodifikasi (Meloan dan Pomeranz 1973). Prinsip kerja metode ini adalah reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry et al 1951). Warna biru yang terbentuk kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm menggunakan spektrofotometer. Pada pengukuran ini digunakan larutan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai standar. Standar BSA dibuat menjadi beberapa konsentrasi dan direaksikan dengan Na

2CO

3 0.4 M dan

0.1 ml fenol folin. Hasil reaksi diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit, kemudan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Hasil absorbansi beberapa konsentrasi BSA dibuat persamaan garis lurus yang kemudian digunakan sebagai persamaan garis kurva standar.

Untuk pengukuran aktivitas protease sampel, sebanyak 0,2 ml substrat kasein 0,1% direaksikan dengan enzim sebanyak 0,1 mL, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi di shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi selama 20 menit, campuran tersebut ditambahkan dengan TCA 0,4 M sebanyak 0,25 mL kemudian dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu 37°C. Setelah diinkubasi, campuran tersebut dipindahkan ke dalam ependorf 1,5 mL kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Setelah disentrifugasi, sebanyak 0,1 ml supernatan diambil dan dimasukkan pada tabung reaksi baru. Supernatan yang baru ditambahkan dengan 0,5 ml Na

2CO

3

0.4 M dan 0.1 ml fenol folin, dihomogenkan dengan vorteks dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Setelah diinkubasi, campuran tersebut diukur absorbansinya pada panjang gelombang 660 nm. Pengukuran aktivitas protease menggunakan rumus pada persamaan 2. Satu unit (U) aktivitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi pelepasan 1 μmol tirosin per menit.

Aktivitas protease (PA) = X x FP x (2)

Keterangan : PA = Protease activity (U/mL) X = Konsentrasi enzim (mg/mL) FP = Faktor pengenceran V = Volume enzim yang dianalisis (mL) T = waktu inkubasi (menit) 3.2.3 Rasio Aktivitas Penggumpalan Susu terhadap Protease

Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease merupakan faktor yang menentukan apakah mikroba tersebut dapat digunakan sebagai penghasil alternatif enzim penggumpal susu. Isolat yang terpilih merupakan isolat yang memiliki aktivitas penggumpalan tinggi dengan aktivitas protease rendah sehingga menghasilkan rasio yang tinggi. Perhitungan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease menggunakan rumus perhitungan pada persamaan 3.

R = (3)

Keterangan : MCA : Milk Clotting Activity ; Aktivitas penggumpalan susu (SU/mL) PA : Protease Activity ; Aktivitas protease (U/mL)

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi Mikroba dari Pangan Fermentasi

Teknik isolasi pada penelitian ini menggunakan cara pengenceran bertingkat dengan metode cawan permukaan agar setelah inkubasi terlihat koloni-koloni tunggal tersebar pada permukaan medium agar. Medium isolasi untuk memperoleh koloni tunggal menggunakan medium selektif skim milk agar. Skim milk agar merupakan medium selektif yang umum digunakan untuk memperoleh mikroba penghasil protease pada medium agar. Koloni mikroba akan membentuk zona bening sebagai hasil perubahan kasein menjadi senyawa nitrogen yang larut (Hidayat et al 2006). Beberapa genus mikroba penghasil protease antara lain Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Proteus, Streptococcus, Micrococcus, berbagai jamur, khamir (Hidayat et al 2006).

Isolasi diakukan terhadap lima sampel pangan fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape ketan, dan asinan sawi. Sampel diperoleh dari pasar serba ada yang bersih dan higienis sehingga diharapkan sampel terhindar dari kontaminasi mikroba luar dan mikroba yang diisolasi benar-benar berasal dari sampel.

(a) (b) (c)

(d) (e)

Gambar 6. Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat: oncom merah (a), tempe (b), tape ketan (c), tauco (d), asinan sawi (e)

Dari kelima sampel diperoleh 4 isolat bakteri dengan ciri koloni berbeda. Penentuan ciri koloni untuk bakteri umumnya berdasarkan pengamatan morfologi yaitu bentuk, ukuran, warna, dan tepian (margin). Beberapa isolat yang berhasil diisolasi dapat dilihat pada Tabel 2. Isolat tersebut merupakan hasil isolasi dari tauco dan asinan sawi yang kemungkinan merupakan mikroba yang berperan dalam proses fermentasi bahan pangan itu sendiri. Proses fermentasi tauco ada dua tahap, yaitu fermentasi oleh kapang dan fermentasi dalam larutan garam oleh bakteri asam laktat dan khamir. Nurwitri et al (2007) menjelaskan bahwa dalam bakteri yang tumbuh selama fermentasi garam pada pembuatan

tauco adalah L. delbrueckii. Pada pangan fermentasi berbasis sayuran seperti asinan sawi proses fermentasi umumnya dilakukan dalam larutan garam dan fermentasi berlangsung secara spontan dengan memanfaatkan mikroba-mikroba yang telah ada pada sayuran itu sendiri. Beberapa jenis bakteri yang berperan dalam fermentasi sayuran antara lain Leuconostoc mesenteroides, L. brevis dan Pediococcus cerevisiae (Nurwitri et al 2007).

Mikroba penghasil zona bening yang diperoleh pada saat isolasi tersebut kemungkinan merupakan bakteri asam laktat (BAL). Beberapa BAL yang diketahui memiliki aktivitas proteolitik antara lain Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus and Lactobacillus casei (Shin 2004), L. bulgaricus (Courtin et al 2002), Lactobacillus rhamnosus (Pastar et al 2003), Lactobacillus paracasei (Bintsis et al 2003), Lactobacillus helveticus (Oberg et al 2002), L. delbrueckii (Germond et al 2003), Lactobacillus brevis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum (Mugula et al 2003). Dari beberapa jenis BAL proteolitik tersebut, jenis BAL yang terdapat pada tauco dan asinan sawi antara lain L. delbrueckii, Lactobacillus brevis, Lactobacillus fermentum dan Lactobacillus plantarum. Untuk mengetahui isolat tersebut merupakan bakteri asam laktat maka diperlukan identifikasi berdasarkan pada karakteristik morfologi (bentuk sel), uji katalase, pewarnaan Gram, motilitas, tipe fermentasi (Rahayu dan Margino 1997 dalam Yusmarini et al 2009), dan pengujian pada medium MRS. Isolat murni yang menunjukkan kriteria katalase negatif (-), Gram positif (+), dan non motil diidentifikasi sebagai BAL. Selain itu, identifikasi molekuler menggunkan PCR (16S rDNA) juga dapat dilakukan untuk mengetahui dengan pasti jenis bakteri tersebut.

Tabel 2. Ciri morfologi koloni isolat

No. Isolat Sumber Ciri Koloni

1 TCN 1 Tauco bentuk bulat, ukuran medium, berwarna putih opaque, tepian entire

2 TCN 2 Tauco bentuk tidak beraturan, ukuran large, berwarna putih opaque, tepian undulate

3 TCN 3 Tauco bentuk tidak beraturan, ukuran large, berwarna translusens, tepian undulate

4 DSN 1 Asinan sawi bentuk bulat, ukuran large, berwarna putih opaque, tepian undulate

Isolat yang menghasilkan zona bening selanjutnya diukur diameter koloni dan diameter zona beningnya untuk memperoleh indeks protease. Indeks protease adalah perbandingan diameter zona bening koloni dengan diameter koloni isolat. Semakin besar zona bening yang dihasilkan berarti semakin besar pula kemampuan isolat tersebut untuk menghasilkan enzim protease (Yusmarini et al 2009). Pada penelitian ini, isolat yang memiliki indeks protease paling tinggi adalah isolat TCN 2 yakni sebesar 4.00. Indeks proteolitik masing-masing isolat dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Indeks Protease Isolat

No. Isolat Diameter isolat (cm)

Diameter zona bening (cm) Indeks Protease

1 TCN 1 0.40 1.30 3.25 2 TCN 2 0.40 1.60 4.00 3 TCN 3 0.40 1.20 3.00 4 DSN 1 0.40 1.40 3.50

Zona bening

Koloni isolat

Gambar 7. Contoh zona bening dari isolat TCN 2 pada medium skim milk agar 4.2 Pengukuran Aktivitas Enzim dan Seleksi Isolat 4.2.1 Kurva Pertumbuhan Isolat Isolat yang digunakan untuk menghasilkan enzim harus diketahui terlebih dahulu kurva pertumbuhannya agar dapat ditentukan waktu pemanenan enzimnya. Umumnya mikroba yang digunakan untuk menghasilkan enzim berada pada saat fase log/eksponensial. Dalam kurva pertumbuhan mikroba terdapat empat fase pertumbuhan, yaitu fase adaptasi (lag phase), fase log/eksponensial, fase stationer, dan fase kematian. Fase log atau eksponensial merupakan fase di mana kecepatan pembelahannya paling tinggi, waktu generasinya pendek dan konstan. Selama fase ini,metabolisme sangat pesat sehingga sintesis bahan sel sangat cepat dan konstan. Keadaan ini berlangsung terus hingga salah satu atau beberapa nutrien habis atau telah terjadi penimbunan atas hasil metabolisme yang bersifat racun yang menyebabkan terhambatnya pertumbuhan (Hidayat et al 2006).

Dari kurva pertumbuhan pada Gambar 8 diperoleh bahwa pada jam ke-0 belum terlihat adanya kekekeruhan pada medium yang berisi inokulum. Pada tahap ini terjadi fase adaptasi. Suatu mikroba yang dimasukkan ke dalam medium baru umumnya tidak segera membelah diri melainkan menyesuaikan diri dengan medium terlebih dahulu. Setelah mikroba mampu menyesuaikan diri dengan medium kultur, sel mikroba secara perlahan akan mulai membelah diri hingga kemudian selnya bertambah dengan kecepatan pertumbuhan yang semakin meningkat. Suatu keadaan di mana pertumbuhan mikroba sangat pesat disebut fase log atau eksponensial. Pada pengamatan ini, terlihat

(a)

(b)

(c)

(d)

Gambar 8. Kurva pertumbuhan isolat TCN 1 (a), TCN 2 (b), TCN 3 (c), dan DSN 1 (d)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 24 48 72 96 120A

bsor

bans

i

Lama inkubasi (jam)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 24 48 72 96 120

Abs

orba

nsi

Lama inkubasi (jam)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 24 48 72 96 120

Abs

orba

nsi

Lama inkubasi (jam)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

0 24 48 72 96 120

Abs

orba

nsi

Lama inkubasi (jam)

bahwa semua isolat memiliki kekeruhan inokulum yang paling tinggi pada jam ke-24. Pada tahap ini diduga bahwa isolat sudah mencapai fase log sehingga untuk pemanenan enzim dilakukan pada jam ke-24. Pada fase log jumlah sel mikroba sangat banyak dalam menghasilkan metabolit utama seperti enzim. Setelah sel mikroba mencapai kecepatan pertumbuhan yang paling tinggi, selanjutnya jumlah sel tersebut akan konstan yang disebut fase stationer. Hal ini disebabkan adanya penurunan kadar nutrisi dan penimbunan zat-zat racun yang menghambat kecepatan pembelahan sel, sehingga jumlah mikroba yang hidup dengan mikroba yang mati akan sama. Fase ini kemudian dilanjutkan dengan fase kematian di mana kecepatan kematian semakin meningkat sedangkan kecepatan pertumbuhannya menjadi nol. Penurunan jumlah sel ini mulai terjadi setelah inkubasi jam ke-24 hingga jam ke-120. Hal ini disebabkan karena nutrisi pada medium sudah semakin berkurang dan banyak sel mikroba yang telah mati. 4.2.2 Aktivitas Enzim Penggumpal Susu

Isolat yang menghasilkan zona bening pada medium isolasi agar susu skim kemudian diuji aktivitas enzim penggumpal susu. Penggumpalan susu merupakan prinsip dasar pada pembuatan keju. Umumnya, penggumpalan susu dalam pembuatan keju melibatkan enzim renin atau renet, yaitu ekstrak kasar dari lambung anak sapi. Dalam pembuatan keju, renet biasanya ditambahkan ke dalam susu setelah penambahan kultur starter.

Kalsium memiliki peranan yang penting dalam proses koagulasi dengan menggunakan renet, oleh karena itu dalam pembuatan keju biasanya dilakukan penambahan CaCl2. Begitu juga pada pengukuran aktivitas penggumpalan susu, larutan CaCl2 digunakan sebagai pelarut susu skim. Penambahan CaCl2 bertujuan memperbaiki tekstur dari curd yang dihasilkan (Daulay 1990).

Pada Gambar 9 ditunjukkan bahwa keempat isolat memiliki aktivitas penggumpalan susu yang paling tinggi pada waktu inkubasi jam ke-24. Beberapa penelitian melaporkan bahwa waktu fermentasi optimum untuk beberapa mikroba penghasil enzim penggumpal susu antara 1-8 hari; 1 hari untuk Bacillus subtilis (Shieh et al 2009), 4 hari intuk Mucor miehei (Escobar dan Barnett 1990), 3 hari untuk M.pusillus (Arima et al 1970), 3 hari untuk Amylomyces rouxii (Yu dan Chou 2005), 3-4 hari untuk M. Baciliformis (Areces et al 1992), dan 8 hari untuk P. Oxalicum (Hashem 1999). Mulai pada jam ke-48 aktivitas penggumpalan susu mulai menurun hingga jam ke-120. Hal ini disebabkan oleh penurunan jumlah substrat sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat juga ikut menurun.

Pada Gambar 9 ditunjukkan bahwa isolat TCN 1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas 70 U/mL. Isolat TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas yang paling tinggi, artinya semakin tinggi aktivitas penggumpalannya semakin singkat waktu yang dibutuhkan enzim tersebut untuk menggumpalkan susu hingga whey terpisah.

Proses penggumpalan susu oleh renin terjadi melalui dua tahap. Tahap pertama merupakan perubahan kappa-kasein menjadi para-kasein oleh enzim dan tahap kedua para-kasein digumpalkan oleh proses pemanasan dengan adanya ion kalsium. Renin bekerja pada substrat kappa-kasein yang berfungsi sebagai koloid yang merupakan lapisan luar kasein, sehingga dengan menghidrolisis kappa-kasein kasein lebih mudah tergumpalkan secara sempurna dengan syarat ion kalsium tersedia dalam larutan tersebut (Winarno 2010).

Gambar 9. Aktivitas enzim penggumpal susu isolat

Dalam penggunannya, renin dapat digunakan dalam dua bentuk yakni renet cair dan renet dalam bentuk padatan seperti bubuk atau pelet. Bentuk renet yang ditambahkan dapat mempengaruhi aktivitas enzim penggumpal susu. Renet dalam bentuk cair memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 9600 U/mL (Thakur et al 1990) sedangkan dalam bentuk padatan memiliki aktivitas 6200 U/mg (Nerud et al 1989). Selain itu, enzim penggumpal susu dari mikroba juga memiliki aktivitas penggumpalan susu yang berbeda tergantung bentuk penggunaannya. Enzim penggumpal susu dari Mucor pusillus var. Lindt dalam bentuk cair memilki aktivitas penggumpalan susu sebesar 800 U/mL sedangkan dalam bentuk padatan memiliki aktivitas 100 U/mg (Winarno 2010). Hal ini menunjukkan bahwa proses pembuatan dan pemurnian enzim mempengaruhi aktivitas enzim tersebut.

Berdasarkan literatur, aktivitas penggumpalan susu oleh isolat pada penelitian ini jauh lebih rendah dibandingkan aktivitas penggumpalan susu oleh renin dalam bentuk renet. Untuk mengetahui efektifitas penggunaan enzim penggumpal susu dari isolat tersebut maka dilakukan pengukuran aktivitas protease supaya diperoleh rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease yang digunakan sebagai indeks penentu kemampuan suatu ekstrak enzim sebagai pengganti renin.

Secara umum, aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu dan pH. Suhu yang digunakan selama reaksi penggumpalan adalah 40oC. Penentuan suhu ini berdasarkan suhu optimum agar terbentuk gel yang baik akibat penambahan renin adalah 40oC (Winarno 2010) dan pada umumnya pembuatan keju dilakukan pada suhu 40oC. Hampir semua enzim memiliki aktivitas optimum pada suhu 30-40oC dan mulai terdenaturasi pada suhu 45oC (Winarno 2010). Medium susu skim yang digunakan sebagai substrat memiliki pH 6. Renin termasuk ke dalam golongan protease asam, yakni aktif pada pH rendah, maka pengujian aktivitas penggumpalan susu dilakukan pada kisaran pH 5.5-7.0.

Gumpalan susu

Gambar 10. Pembentukan gumpalan susu pertama oleh aktivitas enzim isolat

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 24 48 72 96 120Akt

ivit

as P

engg

umpa

lan

susu

(U/m

L)

Lama Inkubasi (jam)

Isolat TCN 1

Isolat TCN 2

Isolat TCN 3

Isolat DSN 1

4.2.3 Aktivitas Protease

Isolat yang mampu menggumpalkan susu selanjutnya diuji aktivitas proteasenya. Pengukuran aktivitas protease ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan isolat dalam memecah protein menjadi peptida dan asam amino. Kemampuan protease dalam memecah protein akan mempengaruhi flavor atau citarasa akibat terbentuknya peptida dan asam amino tersebut. Pada pengukuran aktivitas ini diharapkan isolat terpilih memiliki aktivitas protease yang rendah, hal ini dikarenakan aktivitas protease yang tinggi dapat menimbulkan citarasa yang pahit pada produk keju yang akan dihasilkan.

Aktivitas protease masing-masing isolat dapat dilihat pada Gambar 11. Hasil pengukuran aktivitas protease pada keempat isolat menunjukkan bahwa isolat TCN 1, TCN 3, dan DSN 1 memiliki aktivitas protease paling tinggi pada jam ke-48 yakni berturut-turut 0.0117 U/mL; 0.0150 U/mL; 0.0200 U/mL, sedangkan isolat TCN 2 memiliki akivitas protease paling tinggi pada jam ke-96 yakni sebesar 0.0021 U/mL. Aktivitas protease ini tergolong sangat rendah. Hal ini sesuai dengan harapan bahwa isolat yang diinginkan memiliki aktivitas protease yang rendah sehingga tidak menimbulkan cita rasa yang pahit pada keju yang dihasilkan. Sama halnya dengan aktivitas enzim penggumpal susu, tinggi rendahnya aktivitas protease juga dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, suhu, dan pH.

Gambar 11. Aktivitas enzim protease isolat

4.2.4 Rasio Aktivitas Penggumpalan Susu terhadap Protease

Isolat yang telah diuji aktivitas penggumpalan susu dan proteasenya kemudian dihitung rasio aktivitas penggumpalannya terhadap protease. Nilai rasio ini akan menentukan isolat mana yang akan dipergunakan selanjutnya untuk menghasilkan enzim penggumpal susu. Isolat terpilih yang selanjutnya akan diproduksi enzimnya adalah isolat yang memiliki aktivitas penggumpalan susu yang paling tinggi dengan aktivitas protease yang paling rendah. Aktivitas enzim yang dipilih adalah aktivitas enzim pada jam ke-24 karena pada waktu tersebut semua isolat menunjukkan aktivitas penggumpalan susu yang paling tinggi dengan aktivitas protease yang rendah.

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0 24 48 72 96 120 144

Akt

ivit

as P

rote

ase

(U/m

L)

Lama inkubasi (jam)

Isolat TCN 1

Isolat TCN 2

Isolat TCN 3

Isolat DSN 1

Hasil perhitungan rasio enzim penggumpal susu terhadap protease dari keempat isolat dapat dilihat pada Tabel4. Pada tabel tersebut ditunjukkan bahwa isolat TCN 2 memiliki nilai yang paling tinggi sebesar 175000. Pada penelitian ini, isolat TCN 2 merupakan isolat terpilih yangdapat dimanfaatkan enzimnya sebagai alternatif pengganti renin anak sapi.

Tabel 4. Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease

Isolat

Aktivitas penggumpalan

susu (U/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

Rasio

TCN 1 29.17 0.0054 5402 TCN 2 70.00 0.0004 175000 TCN 3 70.00 0.0096 7292 DSN 1 70.00 0.0021 33333

Beberapa penelitian yang dilaporkan menunjukkan bahwa isolat TCN 2 memiliki rasio aktivitas penggumpalan yang lebih tinggi dibandingkan beberapa enzim penghasil penggumpal susu dari mikroba lain. Selain itu, ketiga isolat lain juga memiliki rasio penggumpalan susu terhadap protease yang juga lebih tinggi dibandingkna beberapa sumber lain. Hal ini menunjukkan bahwa isolat lain seperti TCN 1, TCN 3, dan DSN 1 juga memiliki potensi untuk menjadi alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju. Rasio ini dapat meningkat apabila dilakukan optimasi kondisi fermentasi isolat selama produksi enzim. Oleh karena itu, untuk kelanjutan penelitian sebaiknya dilakukan optimasi terhadap kondisi fermentasi seperti konsentrasi substrat, suhu inkubasi, pH medium, kecepatan agitasi, dan pengaruh penambahan mineral seperti kalsium agar aktivitas penggumpalan susu dan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease lebih maksimal. Perbandingan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease isolat TCN 2 dengan beberapa sumber enzim yang telah dikomersialkan dapat dilihat pada Tabel 5.

Tabel 5. Perbandingan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease isolat TCN 2 dengan beberapa enzim penggumpal susu dari mikroba lain

Sumber enzim

Aktivitas penggumpalan

susu (U/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

Rasio

Isolat TCN 2 70 0.0004 175000

Aspergillus niger MC4 (Channe dan Shewale 1998)

400 0.01 40000

Mucor rennin 511 0.11 4650

B. Subtilis natto (Shieh et al 2009) 685 0.23 2981

Pfizer mikrobial rennin 750 0.29 2590

Thermomucor indicae-seudaticae N31 (Dini et al 2010)

56 0.6 93

V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Pada penelitian ini diperoleh empat isolat proteolitik dari dua sampel pangan fermentasi, yakni tiga isolat dari tauco (TCN 1, TCN 2, TCN 3) dan satu isolat dari asinan sawi (DSN 1). Isolat TCN 1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas 70.00 U/mL yang seluruhnya dicapai pada jam ke-24 inkubasi. Isolat TCN 1, TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas protease pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 U/mL.

Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease untuk isolat TCN 1, TCN 2, TCN 3 dan DSN 1 secara berturut-turut adalah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Hasil tersebut menunjukkan bahwa enzim dari isolat TCN 2 dapat digunakan sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju. 5.2 Saran

Pada tahapan isolasi sebaiknya digunakan medium isolasi yang dimodifikasi, misalnya Nutrien Agar dengan penambahan susu skim untuk memperoleh bakteri dan Potato Dextrose Agar dengan penambahan susu skim untuk memperoleh kapang, sehingga dimungkinkan isolat yang diperoleh menjadi lebih banyak. Pembuatan kurva pertumbuhan sebaiknya dilakukan tiap beberapa jam sehingga terlihat fase stationernya pada kurva pertumbuhan isolat.

DAFTAR PUSTAKA

Ageitos JM, Vallejo VA, Sestelo ABF, Pozaand M, Villa TG. 2007. Purification and characterization

of a milk clotting protease from Bacillus licheniformis strain USC13. J. Appl. Microbiol. 103:2205-2213.

Areces LB, Biscoglio de Jiménez Bonino MJ, Parry MAA, Fraile ER, Fernandez HM, Cascone O. 1992. Purification and characterization of a milk-clotting protease from Mucor baciliformis, Appl. Biochem. Biotechnol. 37: 283– 294.

Arima K, Yu J, Iwasaki S. 1970. Milk-clotting enzyme from Mucor pusillus var. Lindt. Methods in Enzymology 19:446-459

Ayhan F, Celebi SS, Tanyolac A. 2001. The effect of fermentation parameters on the production of Mucor meihei acid protease in a chemically defined medium. J. Chem, Technol. Biotechnol. 76:153-160.

Bergmann M, Fruton JS. 1941. The specificity of proteinases. Adv. Enzymol. 1:63-98

Bergmann M. 1942. Classification of proteolytic enzymes. Adv. Enzymol. 2:49-68

Bintsis T, Vafopoulou-Mastrojiannaki A, Litopouloutzanetaki E, Robinson RK. 2003. Protease, pep- tidase and esterase activities by Lactobacilli and yeast isolates from feta cheese brine. J. Appl. Microbiol. 95(1): 68–77.

Brikkjacer H, Jonk P. 1985. Technological suitability of calf renet substitutes. Int. Dairy Fed. Bull. 194:8-13.

Channe PS, Shewale JG. 1998. Influence of culture conditions in the formation of milk clotting protease by Aspergilus niger MC4. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 14:11-15.

Courtin P, Nardi M, Wegmann U, Joutsjoki V, Ogier JC, Gripon JC, Palva A, Henrich B, Monnet V. 2002. Accelerating cheese proteolysis by encheriching Lactobacillus lactis proteolytic system with Lactobacillus peptidases. Int. Dairy J. 12: 447-454.

Crawford RJM. 1985. Future development in rennet calf and its use in the cheese factory. Int. Dairy Fed. Bull. 194:14-23.

Darwis AA, Sukara E. 1989. Penuntun Praktikum Isolasi, Purifikasi, dan Karakterisasi Enzim. Laboratorium Bioindustri, Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor.

Daulay D. 1990. Buku/Monograf Fermentasi Keju. Depdikbud. Dirjen Pendidikan Tinggi. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor.

Dinas Perhubungan Komunikasi dan Informatika Kabupaten Cianjur. 2005. Tauco. http://cianjur.kab.go.id [ 1 Sept 2012] Dini CB, Gomes E, Boscolo M, Silva R. 2010. Production and characterization of a milkclotting protease in the crude enzymatic extract from the newly isolated Thermomucor indicae- seudaticae N31. Food Chemistry 120: 87-93

Dutt K, Meghwanshi GK, Gupta P, Saxena RK. 2008. Role of casein on induction and enhancement of production of a bacterial milk clotting protease from indigenously isolated Bacillus subtilis. Lett. Appl. Microbiol. 46:513-518.

Escobar J, Barnett S.1993. Effect of agitation speed on the synthesis of Mucor mieheiacid Prote- ase, Enzyme Microb. Technol. 15:1009–1013.

Fadilla DC. 2011. Cammembert. http://dinacahyafadilla.blogspot.com [ 1 Sept 2012] Germond JE, Delley M, Gilbert C, Atlan D. 2003. Determination of the domain of theLactobacillus

delbrueckii subsp. bulgaricus cell surface proteinase Prtb involved in attachment to the cell wall after heterologous expression of the Prtb gene in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 69(6): 3377-3384.

Ghazam 2011. Tape Ketan Mak Nyess. http://mamah-ella.blogspot.com [ 1 Sept2012] Hartley BS. 1960. Proteolytic enymes. Annu. Rev. Biochem. 29:45-72

Hashem AM. 1999. Optimization of milk-clotting enzyme productivity by Penicillium oxalicum, Biores. Technol. 70:203–207.

Hidayat N, Padaga MC, Suhartini S. 2006. Mikrobiologi Industri. Yogyakarta: Andi

Kosim M, Putra SR. 2009. Pengaruh Suhu Pada Protease dari Bacillus subtilis.Jurusan Kimia FMIPA ITS Surabaya .

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Magda A, El-Bendary, Masya E, Moharam, Ali TH. 2007. Purification and characterization of milk clotting enzyme produced by Bacillus sphaericus. Journal of Applied Sciences Researceh 3(8):695-699.

Marathe MY, Ghosh JS. 2009.Study of proteinase activity of Lactobacillus plantarum NCIM 2083. International Journal of Genetics and Molecular Biology Vol 1 (1): 001-005.

Meloan CE, Pomeranz Y. 1973. Food Analysis Laboratory Experiments. NewYork : The AVI Publishing Company Muchtadi D, Palupi N.S, Astawan M. 1989. Enzim Dalam Industri Pangan. Pusat Antar Universitas

Pangan dan Gizi, Institut Pertanian Bogor.

Mugula JK, Sorhaug T, Stepaniak L. 2003. Proteolytic activities in Togwa, a tanzanian fermented food. Int. J. Food Microbiol. 84(1): 1-12. Nerud F, Misurcova Z, Musilek V. 1989.Productionofmilk-clottingenzymesby Basidiomycetes. Folia microbial 34: 310-315

Nurani A. 2012. Kandungan Vitamin dan Manfaat Tape Singkong. http://www.makanansehat. web.id

Nurwitri CC, Rahayu WP, Kusumaningrum HD, Nurjanah S. 2007. Prinsip Fermentasi Pangan. E-Learning Mikrobiologi Pangan. Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB.

[ 1 Sept 2012]

Oberg CJ, Broadbent JR, Strickland M, Mcmohan DJ. 2002. Diversity in the Specificity of the Extracellular Proteinases In Lactobacillushelveticus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Lett. Appl. Microbiol. 34(6): 455-460.

Osman HG, Abdel-Fattah AF, Abdel-Samie M, Mabrouk SS. 1969. Production of a milk clotting enzyme preparation by Aspergillus niger and the effect of various factors on its activity. J. Gen Micribiol 59: 125-129.

Pastar I, Tonic I, Golic N, Kojic M, Van Kranenburg R, Kleerebezem M, Topisirovic L, Jovanovic G. 2003. Identification and genetic characterization of Novel Proteinase, Prtr, from the

human isolateLactobacillus rhamnosus bgt10. Appl. Environ. Microbiol. 69(10): 5802- 5811.

Rahayu ES, Margino S. 1997. Baktri asam laktat: isolasi dan identifikasi. Materi Workshop yang diselengarakan oleh PAU Pangan dan Gizi, Universitas Gajah Mada, 13-14 Juni 1997, Yogyakarta.

Sato S, Hiroharu T, Takeo K, Kotoyoshi N. 2004. Purification and characterization of an extracellular proteinase having milk clotting activity from Enterococcus faecalis TUA2495. Food Sci. Technol. Res. 10:44-50.

Shieh CJ, Thi LAP, Shih L. 2009. Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto. Biochemical Engineering Journal 43:85–91.

Shin JY, Jeon WM, Kim GB, Lee BH. 2004. Purification and Characterization of Intracellular Proteinase from Lactobacillus caseissp. casei LLG. J. Dairy Sci. 87: 4097-4103.

Silva SV, Allmere T, Malcata FX, Andren A. 2003. Comparative studies on the gelling of cardosins extracted from Cynara cardulunculus and chymosin on cow’s skim milk. Int Dairy J. 13:559-564

Srinivasan RA, Iyengar MKK, Babbar IJ, Chakravorty SC, Dudani AT, Iya KK. 1964. Milk clotting enzyme from microoorganisms. Applied Microbiology 12(6):475-478

Suprihatin. 2010. Teknologi Fermentasi. UNESA Press. http://eprints.upnjatim. ac.id

[11 Sept 2012]

ThakurMS, Karanth NG, Nand K. 1990. Production of fungal rennet by Mucor miehei using solid state fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 32: 409-413

Waluyo L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang : UMM Press.

Winarno FG. 1980. Enzim Pangan. Pusbangtepa. Food Technology Development Center, Institut Pertanian Bogor.

Winarno FG. 2010. Enzim Pangan. Bogor : Mbrio Press

Winneke O. 2008. Awas Ada Tempe ‘Aspal’. http://food.detik.com [ 1 Sept 2012]

Yu PJ, Chou CC. 2005. Factors affecting the growth and production of milk clotting enzyme by Amylomyces rouxii in rice liquid medium. Food Technol. Biotechnol 43(3):283-288.

Yusmarini, Indarti R, Utami T, Marsono Y. 2009. Isolasi dan identifikasi bakteri asam laktat proteolitik dari susu kedelai yang terfermentasi spontan. Jurnal Natur Indonesia 12(1):28-33

LAMPIRAN

Lampiran 1. Kurva standar konsentrasi Bovin Serum Albumin

Konsentrasi (ppm) Absorbans 0 0,000

20 0,062 40 0,130 80 0,236 160 0,478

y = 0,003x + 0,003R² = 0,999

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 50 100 150 200

Abs

orba

ns

Konsentrasi BSA (ppm)

Lampiran 2. Hasil pembacaan absorbansi pertumbuhan sel isolat

Isolat Lamainkubasi

(jam) Sampel 1 Sampel 2 Rata-rata SD TCN 1 0 0,037 0,051 0,044 0,010

24 1,888 1,906 1,897 0,013

48 1,285 1,281 1,283 0,003

72 1,180 1,216 1,198 0,025

96 1,087 1,097 1,092 0,007

120 1,020 1,043 1,032 0,016

TCN 2 0 0,097 0,058 0,078 0,028

24 1,819 1,831 1,825 0,008

48 1,138 1,387 1,263 0,176

72 1,078 1,397 1,238 0,226

96 0,864 0,953 0,909 0,063

120 0,829 0,885 0,857 0,040

TCN 3 0 0,094 0,068 0,081 0,018

24 1,649 1,651 1,650 0,001

48 1,570 1,699 1,635 0,091

72 1,700 1,746 1,723 0,033

96 1,789 1,659 1,724 0,092

120 1,811 1,568 1,690 0,172

DSN 1 0 0,076 0,077 0,077 0,001

24 1,766 1,913 1,840 0,104

48 1,301 1,288 1,295 0,009

72 1,058 1,084 1,071 0,018

96 0,897 0,932 0,915 0,025

120 0,834 0,830 0,832 0,003

Lampiran 3. Waktu dan aktivitas penggumpalan susu

Isolat Lama inkubasi

(jam) Menit Detik MCA

(U/mL) Rata-Rata SD TCN 1 0 - - 0.0000 0,00 0,00

- - 0.0000

24 12 720 29,1667 29,17 0,00

12 720 29,1667

48 12 720 29,1667 29,17 0,00

12 720 29,1667

72 13 780 26,9231 26,92 0,00

13 780 26,9231

96 22 1320 15,9091 15,91 0,00

22 1320 15,9091

120 22 1320 15,9091 15,91 0,00

22 1320 15,9091

TCN 2 0 - - 0.0000 0,00 0,00

- - 0.0000

24 5 300 70,0000 70,00 0,00

5 300 70,0000

48 5 300 70,0000 70,00 0,00

5 300 70,0000

72 10 600 35,0000 35,00 0,00

10 600 35,0000

96 13 780 26,9231 26,92 0,00

13 780 26,9231

120 16 960 21,8750 21,88 0,00

16 960 21,8750

TCN 3 0 40 2400 8,7500 8,75 0,00

40 2400 8,7500

24 5 300 70,0000 70,00 0,00

5 300 70,0000

48 7 420 50,0000 50,00 0,00

7 420 50,0000

72 10 600 35,0000 33,41 2,25

11 660 31,8182

96 14 840 25,0000 25,00 0,00

14 840 25,0000

120 18 1080 19,4444 17,33 2,99

23 1380 15,2174

(Lanjutan) Lampiran 3

Isolat Lama inkubasi

(jam) Menit Detik MCA (U/mL) Rata-Rata SD

DSN 1 0 26 1560 13,4615 13,46 0,00

26 1560 13,4615

24 5 300 70,0000 70,00 0,00

5 300 70,0000

48 7 420 50,0000 44,44 7,86

9 540 38,8889

72 9 540 38,8889 38,89 0,00

9 540 38,8889

96 18 1080 19,4444 20,02 0,81

17 1020 20,5882

120 26 1560 13,4615 13,46 0,00

26 1560 13,4615

Lampiran 4. Hasil pembacaan absorbansi pengukuran aktivitas protease

ISOLAT FP

Lama inkubasi

(jam) Sampel 1 Sampel 2 Rata-Rata Kontrol S-K TCN 1 10 0 0,204 0,210 0,2070 0,219 -0,0120

0,193 0,185 0,1890 0,219 -0,0300

24 0,174 0,187 0,1805 0,175 0,0055

0,175 0,175 0,1750 0,168 0,0070

48 0,185 0,187 0,1860 0,174 0,0120

0,188 0,192 0,1900 0,182 0,0080

72 0,160 0,158 0,1590 0,160 -0,0010

0,160 0,161 0,1605 0,153 0,0075

96 0,172 0,163 0,1675 0,168 -0,0005

0,165 0,167 0,1660 0,175 -0,0090

120 0,160 0,155 0,1575 0,162 -0,0045

0,160 0,160 0,1600 0,156 0,0040

TCN 2 10 0 0,209 0,206 0,2075 0,204 0,0035

0,209 0,192 0,2005 0,222 -0,0215

24 0,179 0,174 0,1765 0,173 0,0035

0,173 0,177 0,1750 0,173 0,0020

48 0,157 0,158 0,1575 0,155 0,0025

0,189 0,184 0,1865 0,185 0,0015

72 0,155 0,167 0,1610 0,162 -0,0010

0,152 0,159 0,1555 0,152 0,0035

96 0,178 0,171 0,1745 0,174 0,0005

0,175 0,176 0,1755 0,170 0,0055

120 0,158 0,159 0,1585 0,163 -0,0045

0,150 0,159 0,1545 0,160 -0,0055

TCN 3 10 0 0,180 0,171 0,1755 0,174 0,0015

0,216 0,217 0,2165 0,220 -0,0035

24 0,169 0,177 0,1730 0,164 0,0090

0,187 0,156 0,1715 0,163 0,0085

48 0,213 0,197 0,2050 0,193 0,0120

0,208 0,196 0,2020 0,190 0,0120

72 0,170 0,169 0,1695 0,166 0,0035

0,166 0,162 0,1640 0,161 0,0030

96 0,172 0,169 0,1705 0,180 -0,0095

0,169 0,173 0,1710 0,184 -0,0130

120 0,163 0,163 0,1630 0,162 0,0010

0,149 0,145 0,1470 0,171 -0,0240

(Lanjutan) Lampiran 4

ISOLAT FP

Lama inkubasi

(jam) Sampel 1 Sampel 2 Rata-Rata Kontrol S-K DSN 1 10 0 0,215 0,229 0,2220 0,238 -0,0160

0,22 0,213 0,2165 0,213 0,0035

24 0,180 0,173 0,1765 0,171 0,0055

0,181 0,174 0,1775 0,175 0,0025

48 0,206 0,201 0,2035 0,189 0,0145

0,195 0,196 0,1955 0,180 0,0155

72 0,166 0,168 0,1670 0,175 -0,0080

0,167 0,169 0,1680 0,162 0,0060

96 0,193 0,189 0,1910 0,189 0,0020

0,170 0,169 0,1695 0,169 0,0005

120 0,159 0,159 0,1590 0,169 -0,0100

0,154 0,159 0,1565 0,162 -0,0055

Lampiran 5. Konsentrasi protease dan aktivitas protease isolat

ISOLAT FP Lama

inkubasi (jam)

Konsentrasi enzim (ppm)

Konsentrasi enzim

(mg/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

Rata-rata SD

TCN 1 10 0 -5,0000 -0,0050 0,0000 0,0000 0,0000

-11,0000 -0,0110 0,0000

24 0,8333 0,0008 0,0042 0,0054 0,0018

1,3333 0,0013 0,0067

48 3,0000 0,0030 0,0150 0,0117 0,0047

1,6667 0,0017 0,0083

72 -1,3333 -0,0013 0,0000 0,0038 0,0053

1,5000 0,0015 0,0075

96 -1,1667 -0,0012 0,0000 0,0000 0,0000

-4,0000 -0,0040 0,0000

120 -2,5000 -0,0025 0,0000 0,0008 0,0012

0,3333 0,0003 0,0017 TCN 2 10 0 0,1667 0,0002 0,0008 0,0004 0,0006

-8,1667 -0,0082 0,0000

24 0,1667 0,0002 0,0008 0,0004 0,0006

-0,3333 -0,0003 0,0000

48 -0,1667 -0,0002 0,0000 0,0000 0,0000

-0,5000 -0,0005 0,0000

72 -1,3333 -0,0013 0,0000 0,0004 0,0006

0,1667 0,0002 0,0008

96 -0,8333 -0,0008 0,0000 0,0021 0,0029

0,8333 0,0008 0,0042

120 -2,5000 -0,0025 0,0000 0,0000 0,0000

-2,8333 -0,0028 0,0000 TCN 3 10 0 -0,5000 -0,0005 0,0000 0,0000 0,0000

-2,1667 -0,0022 0,0000

24 2,0000 0,0020 0,0100 0,0096 0,0006

1,8333 0,0018 0,0092

48 3,0000 0,0030 0,0150 0,0150 0,0000

3,0000 0,0030 0,0150

72 0,1667 0,0002 0,0008 0,0004 0,0006

0,0000 0,0000 0,0000

96 -4,1667 -0,0042 0,0000 0,0000 0,0000

-5,3333 -0,0053 0,0000

120 -0,6667 -0,0007 0,0000 0,0000 0,0000

-9,0000 -0,0090 0,0000

(Lanjutan) Lampiran 5

ISOLAT FP Lama

inkubasi (jam)

Konsentrasi enzim (ppm)

Konsentrasi enzim

(mg/mL)

Aktivitas protease (U/mL)

Rata-rata SD

DSN 1 10 0 -6,3333 -0,0063 0,0000 0,0004 0,0006

0,1667 0,0002 0,0008

24 0,8333 0,0008 0,0042 0,0021 0,0029

-0,1667 -0,0002 0,0000

48 3,8333 0,0038 0,0192 0,0200 0,0012

4,1667 0,0042 0,0208

72 -3,6667 -0,0037 0,0000 0,0025 0,0035

1,0000 0,0010 0,0050

96 -0,3333 -0,0003 0,0000 0,0000 0,0000

-0,8333 -0,0008 0,0000

120 -4,3333 -0,0043 0,0000 0,0000 0,0000

-2,8333 -0,0028 0,0000

Lampiran 6. Rasio aktivitas penggumpalan terhadap protease

Isolat Lama Inkubasi (jam)

MCA (U/mL)

PA (U/mL)

Rasio (MCA/PA)

TCN 1 0 0,00 0,0000 -

24 29,17 0,0054 5385

48 29,17 0,0117 2500

72 26,92 0,0038 7179

96 15,91 0,0000 -

120 15,91 0,0000 -

TCN 2 0 0,00 0,0004 0

24 70,00 0,0004 168000

48 70,00 0,0000 -

72 35,00 0,0004 84000

96 26,92 0,0021 12923

120 21,88 0,0000 -

TCN 3 0 8,75 0,0000 -

24 70,00 0,0096 7304

48 50,00 0,0150 3333

72 33,41 0,0004 80182

96 25,00 0,0000 -

120 17,33 0,0000 -

DSN 1 0 13,46 0,0004 32308

24 70,00 0,0021 33600

48 44,44 0,0200 2222

72 38,89 0,0025 15556

96 20,02 0,0000 -

120 13,46 0,0000 -